Tecnologia HaloTag è una tecnologia multifunzionale che ha mostrato un significativo successo in isolamento di piccole e grandi complessi proteici da cellule di mammifero. Qui si segnalano i vantaggi di questa tecnologia rispetto alle alternative esistenti e dimostrare la sua utilità per studiare numerosi aspetti della funzione delle proteine all'interno delle cellule eucariotiche.
La ricerca in proteomica è esploso negli ultimi anni con i progressi nella capacità di spettrometria di massa che hanno portato alla caratterizzazione di numerosi proteoma, comprese quelle da virus, batteri e lieviti. In confronto, l'analisi del proteoma umano resta indietro, in parte a causa del gran numero di proteine che devono essere studiati, ma anche la complessità delle reti e delle interazioni essi presenti. Per affrontare in modo specifico le sfide della comprensione del proteoma umano, abbiamo sviluppato la tecnologia HaloTag per l'isolamento delle proteine, particolarmente forte per l'isolamento di complessi multiproteici e permettendo la cattura più efficiente delle interazioni e / o proteine deboli o transitori in bassa abbondanza. HaloTag è un tag geneticamente codificato proteina di fusione, progettato per covalente, specifica e immobilizzazione o l'etichettatura delle proteine con vari ligandi rapido. Sfruttando queste proprietà, numerose applicazioni di cellule di mammiferi sono stati sviluppati a carattereize funzione delle proteine e qui vi presentiamo metodologie, tra cui: proteine pull-down utilizzati per la scoperta di nuove interazioni o test funzionali e la localizzazione cellulare. Troviamo vantaggi significativi nella velocità, specificità e covalente cattura di proteine di fusione di superfici per l'analisi proteomica rispetto ad altri approcci non-covalenti tradizionali. Dimostriamo questi e l'ampia utilità della tecnologia utilizzando due importanti proteine epigenetici come esempi, la proteina bromodomain umana BRD4, e istone deacetilasi HDAC1. Questi esempi dimostrano la potenza di questa tecnologia per consentire la scoperta di nuove interazioni e caratterizzare la localizzazione cellulare negli eucarioti, che sarà insieme una maggiore comprensione di proteomica funzionale umani.
Comprensione della funzione cellulare, la risposta agli stimoli, e le variazioni di sviluppo e / o malattia membri è strettamente legata alla de-convoluzione del proteoma in questi diversi stati dinamici 1,2. Molto è stato fatto per capire il proteoma di organismi inferiori, tuttavia, dato il numero di proteine e di tutte le interazioni possibili, questo è stato molto impegnativo per affrontare il proteoma umano 1,3-7. I progressi nella spettrometria di massa hanno notevolmente consentito la capacità di intraprendere questi studi, e qui vi presentiamo un progresso ulteriore e significativo con lo sviluppo della tecnologia HaloTag sia per la cattura efficiente di complessi proteici e la caratterizzazione funzionale delle proteine umane da cellule di mammifero 8-10. Questa tecnologia è stata recentemente dimostrato in diversi studi per essere un fattore critico per la scoperta di interazioni importanti, consentendo spaccato funzione nuova proteina e understanding di malattia 11-13.
La proteina di fusione HaloTag è stato inizialmente sviluppato per affrontare diverse sfide di tag tradizionali affinità e anticorpi relativi alla cattura proteina, la purificazione, l'etichettatura e 8-10. Da quasi tutti i metodi di cattura e purificazione della proteina, è prevista una fase di interazione non covalente che viene utilizzato per l'arricchimento di una particolare proteina 14. Durante questa fase, la proteina e / o complesso può dissociarsi per diffusione, soprattutto se il processo richiede ore anziché minuti. Per risolvere questo problema, la proteina di fusione è stato specificamente progettati per rapidamente ed irreversibilmente interagire con i suoi ligandi, che può essere sia particelle, superfici o fluorofori 9. Pertanto una volta che è legato al suo ligando, resta vincolato, che è uno dei fattori più differenziante rispetto ad altri tag di affinità. Anche dimostrato qui, è la capacitàaffrontare diverse questioni biologiche con un singolo costrutto, che è possibile alternando ligandi 9 (Figura 1). Ad esempio, per interrogare interazioni o funzione della proteina, ligandi di superficie sono utilizzati per la cattura di proteine o complessi (Figura 1). In un esperimento separato, la stessa proteina di fusione può essere fluorescente per studiare la localizzazione cellulare, il traffico, o ricambio proteico (Figura 1). È importante ricordare, tuttavia, che una volta ligando è vincolata, se si tratta di una superficie o un fluorocromo, è irreversibile e quindi altri ligandi non può quindi essere successivamente associato nello stesso esperimento.
Analisi delle tecnologie esistenti per mappare le interazioni proteina rivela la difficoltà di isolare efficacemente le interazioni specifiche, compresi quelli che sono più transitori o sono in abbondanza inferiori 1,6,7,14,15. Inoltre, un recente lavoro di numerosi gruppis mostra la preoccupazione che all'interno dei metodi di isolamento tradizionali, in particolare nel settore della proteomica umani, ci sono un numero significativo di contaminanti proteici che possono mascherare segnali da veri interattori in spettrometria di massa 16. Le proprietà sviluppati per la proteina HaloTag e il suo indirizzo resina co-sviluppato bene queste preoccupazioni. Nel protocollo per pulldowns complessi (Figura 1), il legame dei complessi può essere raggiunto in 15 min, sia promuovendo cattura complessa e riducendo i livelli di legame non specifico 8. Inoltre, permette irreversibilmente vincolante per la cattura efficace di proteine poco abbondanti e consente l'uso di molte meno cellule, riducendo ulteriormente sfondo 8. Una volta stabilita la cattura di complessi, il protocollo prevede condizioni di lavaggio miti per mantenere l'integrità complesso. Eluizione di complessi catturati può essere eseguita in due modi e scegliendo quale metodo è dettata dall'obiettivo di anale vallelisi. Se il desiderio è quello di analizzare o scoprire proteine interagenti mediante Western blot o spettrometria di massa, allora è consigliabile per eluire complessi con denaturanti come SDS o urea (Figura 1). Ciò è particolarmente vantaggioso per spettrometria di massa come la proteina originariamente fusa HaloTag, chiamata proteina esca, rimarrà dietro legato alla resina e quindi non dominerà la frazione di peptidi identificati nella spettrometria di massa. Questo significa anche però che la proteina esca probabilmente non sarà visibile in analisi mediante western blot, una differenza significativa rispetto ad altre purificazioni affinità non covalenti o co-immunoprecipitazione. Se l'obiettivo è quello di purificare una intatta complesso da utilizzare per studi funzionali, eluizione può essere effettuata utilizzando TEV (Tobacco Etch Virus) proteasi, che riconosce la sequenza di clivaggio cognate codificata tra la proteina di fusione e la proteina esca (Figura 1). Tueste campioni possono anche essere analizzati mediante spettrometria di massa, ma come mostrato in seguito, conterranno una quantità significativa di proteina esca che possono impedire il rilevamento di bassa abbondanza, interattori specifici.
Qui vi presentiamo i protocolli a tendina e di imaging applicate a due importanti proteine terapeutiche, la proteina bromodomain BRD4 e un istone deacetilasi, HDAC1 17. Abbiamo dimostrato con questi esempi, l'interazione con partner attesi come determinato mediante spettrometria di massa, l'attività enzimatica dopo l'isolamento complessa per HDAC1 e localizzazione cellulare adeguata per entrambi. Insieme, questi risultati dimostrano la multifunzionalità e la forza della tecnologia per la caratterizzazione delle interazioni proteina eucariotica e funzioni.
Presentato qui ci sono due proteine di fusione, Halo-BRD4 e Halo-HDAC1, caratterizzato in cellule di mammifero eucariote per l'espressione, proteina complessa isolamento e di attività, e la localizzazione cellulare. Nel lavoro attraverso questi diversi protocolli, ci sono diversi passi importanti per il successo di ogni esperimento. Come è il caso con qualsiasi proteina di fusione, livelli di espressione e la posizione del tag stesso può essere critico per il mantenimento fisiologia. E 'quindi importante considerare che fusioni C-terminale N-e / o dovranno essere progettato se non è stata dimostrata conoscenza o lavorare con un altro tag preliminare per la particolare proteina di scelta. Per quanto riguarda l'espressione, se il livello è troppo alto, la diluizione del DNA può essere eseguita durante la transfezione o l'utilizzo di vettori con promotori deboli sono possibili per raggiungere il livello appropriato. Il lavoro precedente è stato eseguito mostrando isolamento efficiente di complessi macromolecolari a endogeno levels di espressione 8, che consentono il lavoro a livelli molto bassi di espressione. Se possibile, studi localizzazione cellulare sarebbe anche in grado di fornire indicazioni circa la collocazione del tag ottimale così come il livello di espressione rispetto necessario per una corretta fisiologia.
Una volta che le proteine di fusione sono pronti per esperimenti pulldown, per ottenere il massimo successo con il protocollo è molto importante seguire i tempi consigliati nella lisi, l'associazione e sezioni di lavaggio, come uno dei maggiori vantaggi è la velocità dell'isolamento complesso processo. Se uno qualsiasi di questi passaggi sono allungate nel tempo, come è richiesto per un metodo di cattura a base di anticorpi, vi è il rischio di dissociazione complesso o aumentata vincolante 8 non specifico. Allo stesso modo se i tempi si accorciano durante la lisi cellulare o vincolante, le cellule non possono essere completamente lisati o efficiente catturati rispettivamente. Se il numero di lavaggi è dimalleviato o buona miscelazione della resina non si verifica durante i lavaggi vincolanti o, quindi saranno aumentati livelli di proteine non specifici di sfondo. Inoltre, i mezzi di lisi è molto importante in quanto correlata alla efficienza di legame alla resina. I tentativi di Sonicare i campioni, rimuovere il prodotto detergente raccomandato, aggiungere SDS o altre sostanze detergenti e / o includere il AEBSF inibitore della proteasi si tradurrà in riduzione o la perdita di legame delle proteine di fusione e dei loro complessi alla resina.
Metodi esistenti per l'isolamento complesso da cellule di mammifero e lotta analisi proteomica umana con la sfida di ridurre background in analisi mediante spettrometria di massa 16. Questo è stato così significativo che un deposito di proteine contaminanti è stata creata da numerosi gruppi di spettrometria di massa 16. Sfondo in campioni spettrometria di massa a tendina può essere definito come qualcosa che impedisce l'identificazione diveri interattori della proteina esca. Come tale, sfondo può derivare da proteine contaminanti non specifici o anche grandi concentrazioni di proteine esche o anticorpi utilizzati per precipitare le proteine esca. Lavoro significativo è stato fatto per ottimizzare sia il protocollo pulldown presentata qui, come la resina di minimizzare il livello delle proteine contaminanti non specifici nel processo pulldown. Questo è evidente nei gel macchia d'argento e analisi di spettrometria di massa di controllo (Figura 2). Per affrontare gli elevati livelli di proteina esche o di anticorpi che possono essere altrettanto dannosi come agenti inquinanti e con altre metodologie che lottano, si raccomanda il menu a discesa con SDS eluizione (Protocollo Sezione 2.4). A causa del legame covalente alla resina, questo processo lascerà la maggior parte della proteina di fusione partenza covalentemente alla resina. Una piccola percentuale di esca si osserva nella analisi di spettrometria di massa, che si ritieneche avvenga attraverso idrolisi, ma non presenta un problema per il rilevamento di altre interazioni deboli o transitori 8.
Come accennato nell'introduzione, progressi significativi nella proteomica sono stati abilitati da significativi progressi nella spettrometria di massa 1,7. Pertanto, è importante sottolineare parametri importanti della scelta di analisi di spettrometria di massa per deconvolute la miscela di proteine ottenuti nelle pulldowns. Strumentazione deve essere robusto e in grado di analizzare regolarmente ed efficiente campioni contenenti una piccola quantità di proteine, spesso inferiore <1 mg. Cromatografia nanoscala coinvolge 50-75 micron colonne HPLC diametro interno con portate nell'intervallo nl / min 100-300 è tipicamente impiegato per la compatibilità con i campioni di piccole dimensioni e per massimizzare la sensibilità dello spettrometro di massa. Per massimizzare le informazioni acquisite in uno Stato o singola analisif gli spettrometri di massa dell'arte in grado di acquisire spettri di massa ad alta risoluzione su una scala temporale compatibile con le suddette separazioni su scala nanometrica, ≥ 10 Hz, sono tipicamente impiegati. Questi strumenti hanno livelli attomolar di sensibilità e possono ordinariamente acquisire dati con sub precursore ppm e tolleranze di massa di ioni prodotto. Tali caratteristiche di rendimento servono per aumentare la resa del numero di proteine identificate e l'attendibilità associato tali identificazioni.
Con questi dati ci dimostrano la localizzazione fisiologico cellulare, la proteina corretta: interazioni proteina insieme con un potenziale per la scoperta di nuove interazioni, e l'isolamento di complessi attivi tutto utilizzando un unico costrutto. Infatti tecnologie alternative possono essere usate per ciascuno di questi diversi aspetti, ma probabilmente non per tutti 23,24. Con la tecnologia HaloTag, un approccio multifunzionale può essere utilizzato, avanzando proteomCI studi e ottenere una comprensione più completa della funzione della proteina in cellule di mammifero.
The authors have nothing to disclose.
Ringraziamo il Dott. Martin Rosenberg, il dottor Gary Tarpley, e il dottor Keith Wood per il supporto di questo lavoro, e il Dr. James Cali per la lettura critica del manoscritto. DLD, JM, HB, NM, AN, JC, e MU sono dipendenti di Promega Corporation. MF, RJ, RA, e DA sono dipendenti di MS Bioworks, LLC.
HeLa Cells | ATCC | CCL-2 | Adherent |
HEK293T Cells | ATCC | CRL-11268 | Adherent |
Cellular growth media | Invitrogen/Gibco | ||
PBS – tissue culture certified | Invitrogen/Gibco | ||
FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | |
HaloTag Control Vector | Promega | G6591 | |
HaloTag-BRD4 | Kazusa DNA Research Institute | FHC11882 | N-terminal HaloTag fusion |
HaloTag-HDAC1 | Kazusa DNA Research Institute | FHC02563 | N-terminal HaloTag fusion |
HaloTag Clones containing content | Promega | Various | http://www.promega.com/FindMyGene/ |
HaloTag Flexi Vectors for cloning (N- or C-terminal) | Promega | Various | Choose based upon expression level and HaloTag orientation |
HaloTag TMR Ligand | Promega | G8251 | |
IGEPAL CA-630 | Sigma | 18896 | |
HaloTag Mammalian Pull-Down and Labelling System | Promega | G6500 | Contains HaloTag TMR ligand |
HaloTag Mammalian Pull-Down System | Promega | G6504 | |
Protease Inhibitor Cocktail, 50X | Promega | G6521 | |
Mammalian Lysis Buffer | Promega | G9381 | |
HaloTag Monoclonal Antibody | Promega | G9211 | |
ProTEV Plus | Promega | V6101 | |
RQ1 Dnase | Promega | M6101 | |
HaloLink Resin | Promega | G1912 | |
HDAC-Glo | Promega | G6420 | |
PBS + 0.1% Triton X-100 | For optional imaging | ||
4% paraformaldehyde/0.2M sucrose/PBS | For optional imaging | ||
Ethanol | |||
Tissue culture vessels and dishes | |||
Cell culture incubator | |||
Disposable cell lifter | Thermo Fisher Scientific | 08-773-1 | |
Glass homogenizer such as Kontes Dounce Tissue Grinder | Thermo Fisher Scientific | K885300-0002 | 25-to 27- gauge needle could also be used |
Microcentrifuge | |||
Tube rotator such as Labquake | Thermo Fisher Scientific | 4002110Q | Ideal for binding and washing steps |
Shaking platform such as Eppendorf Thermomixer | Thermo Fisher Scientific | 05-400-200 | Ideal for SDS elution and TEV cleavage steps |
Chambered cover glass | Thermo Fisher Scientific | 155409 | For optional imaging |
Fluorescent Microscrope (555nm Ex/585nm Em) | For optional imaging |