Summary
Akut hjerne traume er en alvorlig skade, der ikke har tilstrækkelig behandling til dato. Multifoton mikroskopi tillader at studere længderetningen processen akut hjernelæsion udvikling og sondering terapeutiske strategier i gnavere. To modeller af akut hjerne traumer undersøgt med in vivo to-foton billeddannelse af hjernen er påvist i denne protokol.
Abstract
Selv akut hjerne traumer ofte skyldes hoved skade i forskellige ulykker og påvirker en væsentlig del af befolkningen, er der ingen effektiv behandling for det endnu. Begrænsninger af tiden anvendte dyremodeller hindre forståelse af patologien mekanisme. Multifoton mikroskopi tillader at studere celler og væv i intakte dyrehjerner længderetningen under fysiologiske og patologiske tilstande. Her beskriver vi to modeller af akut hjerneskade undersøgt ved hjælp af to-foton-billeddannelse af hjernen celle adfærd under posttraumatisk forhold. Et udvalgt område af hjernen er skadet med en skarp kanyle til at producere et traume af en kontrolleret bredde og dybde i hjernen parenkym. Vores metode anvender stereotaktisk prik med en kanyle, som kan kombineres med samtidig lægemiddeltilførsel. Vi foreslår, at denne fremgangsmåde kan anvendes som et avanceret værktøj til at studere cellulære mekanismer patofysiologiske konsekvenser af akut traume i pattedyrs hjerne
Introduction
Akut hjerneskade er et væsentligt folkesundhedsproblem med høj forekomst af skade i motorkøretøj går ned, falder eller overfald, og høj forekomst af efterfølgende kronisk handicap. Terapeutiske metoder til behandling af hjerneskade forblive helt symptomatisk, hvilket begrænser effektiviteten af præhospitale, kirurgisk og intensivbehandling. Dette gør de sociale og økonomiske konsekvenser af hjerneskade særligt alvorlige. Af forskellige årsager, mislykkedes de fleste af de kliniske forsøg for at dokumentere en forbedring i bedring efter hjerneskade ved hjælp nye terapeutiske tilgange.
Dyremodeller er afgørende for at udvikle nye terapeutiske strategier over for en fase, hvor lægemiddeleffektivitet kan forudsiges hos patienter med hjerneskader. På nuværende tidspunkt flere veletablerede dyremodeller for hovedtraume findes, herunder kontrolleret kortikal effekt 1, væske slagtøj skade 2, dynamisk kortikal deformation 3, vægt-drop4 og foto skade 5.. En række af eksperimentelle modeller er blevet anvendt til at undersøge visse morfologiske, molekylære og adfærdsmæssige aspekter af hovedtraume patologi. Men intet dyremodel er helt vellykket i validere nye terapeutiske strategier. Udvikling af pålidelige, reproducerbare og kontrolleres dyremodeller af hjerneskade er nødvendigt at vurdere de komplekse patologiske processer.
Den ny kombination af de nyeste mikroskopiske imaging teknologier og genetisk kodede fluorescerende reportere giver en hidtil uset mulighed for at undersøge alle faser af hjerneskade, som omfatter primær skade, spredning af den primære skade, sekundær skade, og regeneration. Især in vivo to-foton mikroskopi er en unik lineær optisk teknologi, der tillader visualisering i realtid af cellulære og endda subcellulære strukturer i dybe corticale lag gnaverhjerne. Flere typer af celler og orgaNelles kan afbildes samtidigt ved at kombinere forskellige fluorescerende markører. Ved hjælp af dette kraftfulde værktøj, vi kan visualisere dynamiske morfologiske og funktionelle ændringer i levende hjerne under posttraumatisk forhold. Fordelene ved in vivo to-foton mikroskopi i at studere hjerneskade blev for nylig demonstreret af Kirov og kolleger 6. Ved hjælp af en mild fokal kortikale kontusion model viste disse forfattere, at akut dendritiske skade i pericontusional cortex gates af nedgangen i den lokale blodgennemstrømning. Desuden har de vist, at metabolisk kompromitteret cortex omkring blodudtraedning webstedet er yderligere beskadiget af spredning depolarisering. Denne sekundære skader påvirker synaptiske kredsløb, hvilket gør konsekvenserne af traumatisk hjerneskade mere alvorlige.
Her foreslår vi metoden til stereotaktisk pik med en sprøjte nål, der kunne kombineres med samtidig aktuelt drug applikation, som en avanceret model for lokale hjerneskade og som et redskab til at studere patofysiologiske konsekvenser af akut traume i pattedyrs hjerne in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle de procedurer, der præsenteres her blev udført i henhold til lokale retningslinjer for pleje af dyr (Den finske lov om dyreforsøg 62/2006). Animal licens (ESAVI/2857/04.10.03/2012) blev opnået fra kommunen (ELÄINKOELAUTAKUNTA-ELLA). Voksne mus af 1-3 måneder alder, vægt 24-38 g, blev holdt i individuelle bure i certificerede universitetets dyrefacilitet og forsynet med mad og vand ad libitum.
1.. Brain Injury Imaging Gennem en Cranial vindue
- Bedøve dyr og forberede driften felt
- Bedøver mus ved peritoneal injektion af en blanding af ketamin (Ketalar, 80 mg / kg) og xylazin (Rompun, 10 mg / kg) opløst i filtersteriliseret phosphatbuffer saltvand (PBS), pH 7,4. Kontrollér musens reflekser regelmæssigt (hale og tå knivspids sonde) at kontrollere dybden af anæstesi. Øg dosis, når det er hensigtsmæssigt, at opretholde en ordentlig anæstesi, men undgå OverdOSE.
- Bevar dyret ved 37,0 ° C ved hjælp af en varmepude under operation, billedbehandling session og første time efter genvinding fra anæstesi.
- For at beskytte musens øjne tørrer ud, gælder øjet smøremiddel.
- Administrere dexamethason (Rapidexon dyrlæge, 2 mg / kg) ved subkutan injektion for at reducere inflammation og hjerneødem.
- Administrere et analgetikum (f.eks Ketoprophene intraperitonealt) op til 30 min før eller umiddelbart efter kirurgi. Hvis dyret udviser nogen smerte symptomer, såsom modvilje mod at bevæge sig, æde eller drikke, eller vægttab, savlen, hårrejsning, eller unormal respiratorisk lyde efter operationen, gentage injektion af smertestillende.
- Barbere musen 'hoved med en barbering maskine (se Materialer og udstyr). Undgå at beskadige knurhår.
- Behandle huden på musens hoved med 70% ethanol-opløsning til at rense det barberede område.
- Ved hjælp af kirurgiske sakse (se Materialer ogUdstyr) og tang (se Materialer og udstyr), skære huden fra midten linje mellem ørerne til panden.
- Forsigtigt skrabe væk bindevævet fastgjort til kraniet med et stumpt microsurgical kniv.
- Skub temarammerne sidelæns og træk øre barer lidt ind fonetiske åbninger i kraniet for hoved-og hud fiksering.
- Rengør kranium med sterilt PBS og behandle operationsstedet på musens hoved med 0,5% chlorhexidindigluconat, tør kraniet overflade ved hjælp af en kombination af sterile vatpinde og trykluft.
- Påførelsen af pik skade
- Placer en lille dyr stereotaktisk instrument med et dyr holder (se Materialer og udstyr).
- Justere placeringen af kikkerten mikroskop siden stereotaktisk instrument til at fokusere på overfladen af dyrets kranium.
- Ved hjælp af en kikkert mikroskop, find bregma punkt på kraniet.
- Identificer region af interesse ved hjælp af stereotaksiske koordinater.
BEMÆRK: Undgå de områder af interesse, der er direkte placeret i overfladiske kortikale fartøjer. Ødelæggelse af disse kan kraftigt påvirke traumer progression. - Placer 30 G nål over det valgte område og markere målområdet ved at skrabe kraniet overflade.
- Bor kraniet med alle mulige forholdsregler for at undgå unødvendig udvidelse af berørte knogle overfladeareal. Brug et højhastigheds kirurgisk boremaskine (se Materialer og udstyr) under mikroskop. Stop boring hvis væsken vises i det borede område.
- Tryk på bunden af det borede godt med nålen.
- Dyp nålen gnidningsløst ind i hjernen (indsættelse rate 5-10 mm / min), til dybden af 0,5-2,0 mm i henhold til koordinaterne for pik påføringsstedet.
- Fjern nålen straks efter ankomsten til den ønskede dybde (udkørsel rate 5-10 mm / min) og tørre blodet vises efter pik med en lille tampon (see Materialer og udstyr).
- Udfør mikroinjektion af 100 uM Sulforhodamin 101 eller en anden forbindelse af interesse i læsionsstedet ved hjælp af en mikrosprøjte pumpe (WPI) og 10 pi Hamilton-sprøjte samles med glas pipette.
BEMÆRK: Under forberedelsen af glaspipette fra borosilikatglas kapillar, skærpe spidsen til en diameter på 10-20 um. - Indgyde 250-1,500 nl af injektionsopløsningen med en hastighed på 2-5 nl / sek.
BEMÆRK: Lad pipetten efter afslutningen af infusionen i mindst 5 min i hjerneparenkymet, derefter fjerne det langsomt og forsigtigt for at forhindre løsning udstrømning.
- Kraniotomi for kronisk kranie vindue
- Bor kraniet blidt og forsigtigt at gøre en cirkel vindue omkring skaden site. Bruge vinduet diameter på 3-3,5 mm.
- Påfør en dråbe cortex buffer (125 mM NaCl, 5 mM KCI, 10 mM glucose, 10 mM HEPES, 2 mM CaCl2 og 2 mM MgSO4 i destilleret H 2 O) til dækning window.
- Placer en runde dækglas (# 1.5 tykkelse) på kranie vindue.
- Fjern overskud af cortex puffer omkring dækglasset.
- Seal kanterne af dækglasset med polyacryl lim (se Materialer og udstyr).
BEMÆRK: Sørg for, at limen ikke påføres overfladen af dækglasset. Hvis dækslet glas er forurenet med lim, vente, indtil glasset er stabilt limet til kraniet og lim på glaspladen bliver tør, så forsigtigt fjerne forurenende lim med en mikroblad. - Vent i 5 minutter for at lade limen tørre op.
- Brug af øret bar højde skruer, justere hovedets stilling, så metalholder den kan placeres.
- Påfør en lille mængde af polyacryl lim på ringen indehaveren af stål (se Materialer og udstyr).
- Lim ringen indehaveren af stål til dækglas med metalholder håndtaget rettet bagud.
- Vent i 5 minutter for at lade limen tørre op.
- Mix dental cement (se Materialer og udstyr) med polyacryl lim i en 3,5 cm petriskål (eller analog) for at opnå tyktflydende forhold.
- Forsegl grænser kranie vinduet med cement + lim blandingen og dækker den eksponerede overflade af kraniet med den samme blanding op til huden grænse.
- Vent i 15 minutter for at lade cement + lim blanding tørre op og derefter fjerne øre barer.
- Udfør to-foton excitation mikroskopisk (TPEM) billeddannelse til regionen af interesse og et kontrolområde, som det er beskrevet i protokol 3.
- Efter billedbehandling, så dyret kan komme sig efter anæstesi på en varmepude og holde det i en individuel bur under observation, indtil fuld bedring. Kan gives vådfoder for at lette tygge og hydrering.
2. Brain Injury Imaging Gennem tyndet Skull
- Bedøve dyr og forberede driften felt
- Bedøver musen og forberede den til traumer induktionsom beskrevet i trin 1.1.
- Skull udtynding og påførelse af pik skade
- Placer en lille dyr stereotaktisk instrument med indehaveren af dyret (se Materialer og udstyr).
- Justere placeringen af en kikkert mikroskop siden stereotaktisk instrument til at fokusere på dyret kraniet overflade.
- Find bregma punkt på kraniet ved kikkerten mikroskop, identificere hjernen område, der skal afbildes på grundlag af stereotaktisk koordinater og markere det ved at ridse.
BEMÆRK: Skull udtynding position bør ikke placeres over eller nærliggende kranielle suturer, som skallen stabilitet er kompromitteret i disse områder. Desuden store kortikale eller meningeal fartøjer og meninges placeret under kraniet suturer kan forårsage billeddannelse artefakter. - Anbring metalholder belagt med lim over det område af renter på dyrets kranium, let tryk, og vent 5 min, indtil metal holderen er limet fast til kraniet. Bland dental cement (se Materialer og udstyr) med polyacryl lim i en 3,5 cm petriskål (eller analog) for at opnå tyktflydende forhold.
- Forsegl grænser metalholderen med cement + lim blandingen og dække den eksponerede overflade af kraniet med den samme blanding op til huden grænse.
- Vent i 15 minutter for at lade cement og lim blanding tørre op.
- Skyl den indsnævrede kraniet regionen og de omgivende dele af metal holder den flere gange med PBS, så resterne af nonpolymerized lim vaskes væk.
BEMÆRK: Det er afgørende at sikre en stabil fastgørelse af kraniet til indehaveren. Dette gør det muligt stabilitet forberedelse under billedbehandling. - Brug af høj forstørrelse modus dobbeltmikroskop fjerne øvre lag af kraniet med en højhastigheds-mikro-bore at skabe en indsnævrede kraniet område ~ 0,5-1,5 mm i diameter. Brug trykluft under boring at fjerne knoglen vragrester. Udfør boring intermittently under udtynding procedure for at undgå friktion-induceret overophedning. Afkøl boret ved hjælp af opløsning ved stuetemperatur og med jævne anvende buffer til den indsnævrede område til at absorbere varme.
BEMÆRK: For at undgå at beskadige cortex, Bor ikke over store områder (> 1,5 mm) ned til et tyndt lag (<50 um).
BEMÆRK: gnaver kraniet struktur består af to tynde lag af kompakt knogle adskilt af et tykt lag af svampet knogle. Tiny hulrum svampede knogle danner koncentriske cirkler og canaliculi, som indeholder blodkar. Brug mikroborehuller at fjerne både det ydre kompakt knogle lag og det meste af svampet lag. Forstyrrelse af blodkar i svampet knogle kan forårsage blødninger. Brug hæmostase collagensvamp at stoppe denne blødning. - Brug anden harmonisk generation (SHG) billeddannelse at undersøge, om størstedelen af den svampede knogle er blevet fjernet. Vær omhyggelig med at undgå overdreven udtynding, så sørg for, at den resterende knogle er thicker end 50 um i denne fase af præparatet.
- Put en dråbe varm puffer (35-37 ° C) på toppen af tyndet region. Brug en mikrokirurgisk kniv eller Micro Finishing Bur for yderligere at fjerne knogle lag og danne et jævnt område ~ 700 um i diameter med knogle tykkelse ~ 20 um. Under dette trin, er det nyttigt at udføre gentagne SHG billedbehandling og måle regelmæssigt knoglen tykkelse.
- Udføre TPEM billeddannelse til regionen af interesse og et kontrolområde.
- Justér hoved position ved hjælp af øret barhøjde skruer på en sådan måde, at tyndet region er placeret strengt vandret. Placer nålen over den indsnævrede område og sørg for, at der ikke er nogen store skibe beneath målrettet websted.
- Foretag en læsion ved at dyppe nålen ind i hjernen, til dybden af 0,5-2,0 mm fra fortyndede kraniet overflade og i henhold til koordinaterne for prik påføringsstedet.
- Fjern kanylen og undertrykke blødning optræder efter than en akut hjerneskade med hæmostatisk tampon (se Materialer og udstyr). Vent blodpropper form og beholder pulsering på skaden site stopper.
- Udfør mikroinjektion af 100 uM Sulforhodamin 101 eller en anden forbindelse af interesse i læsionsstedet, som beskrevet i afsnit 1.2.10.
- Udfør TPEM billeddannelse at overvåge skaden progression og nyttiggørelse, som er beskrevet i protokol 3.
- Efter billedbehandling, så dyret kan komme til bevidsthed fra anæstesi på en varmepude. Lad ikke dyret uden opsyn og returnere den til dens hjem bur efter en fuldstændig fysisk genopretning.
3. Imaging
- Placer dyret under mikroskopet ved at fastgøre metal holderen til specialbygget ramme.
- For billedbehandling, brug f.eks FV1000MPE to-foton mikroskop udstyret med Mai Tai DeepSee laser og XLPLN 25X 1,05 NA vand immersionsobjektivet optimeret til in vivo to-fotonbilleddannelse.
- Identificer læsion site under mikroskopet med wide-field fluorescens mode. Brug lange pass filtre til at visualisere hjernens vasculature og vælg kontrolområdet ifølge den observerede mønster af blodkar.
- Til billedet anden harmonisk generation (SHG) signal, tune femtosekundlaser til 800 nm bølgelængde og samle det udsendte lys ved hjælp af 380-410 nm bypass-filter. For fluorescensimagografi bruge band pass filter (515-560 nm) til at indsamle udsendte lys, og de følgende bølgelængder bruges til at hidse fluorescens: GFP-860 nm, YFP-950 nm.
- Brug FluoView software til billedoptagelse.
- Store koordinaterne for hver ROI for efterfølgende gentagne billeddannelse. Billede samme ROI'er over tid, og justere koordinaterne hver gang at maksimere billedet overlap.
- Analyser billeder med den relevante software (f.eks. ImageJ). Rekonstruktioner præsenteret her blev gjort ved hjælp af Imaris software.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har optimeret to driftscentre procedurer: 1) kronisk kraniel vindue og 2) kranium udtynding, for posttraumatisk hjernescanning i transgene mus. Skematisk afbildning af de eksperimentelle præparater er vist i figur 1. Traumatisk prik ved stålkanyle 0,3 mm OD (30 G) anvendes til boret brønd (figur 1A). En vellykket kraniel vindue forberedelse giver billeder på dybder på op til 650 um under pial overflade (figur 1B), mens kraniet udtynding tendens til at indføre en grænse på ca 300 m (figur 1C), som påvist i 3D rekonstruktion af Thy1-YFP- H mus corticale pyramideneuroner.
Pik traume resulterer i eliminering af dendritter og ødelæggelse af kapillære netværk i en kontrolleret mængde af hjernens cortex. I løbet af de første to dage, læsionsområdet steget, og traumer induceret dendritceller blebbing og dannelse af dendritiske tilbagetrækning bulbs i perilesion områder, som observeret ved anvendelse af in vivo multifotonexcitation mikroskopi (figur 2).
Vi udførte kranium udtynding til billede aktivering og migration af mikroglia i CX3CR1-EGFP mus umiddelbart efter skaden (figur 3A). SHG billedbehandling giver et værdifuldt redskab til at afgrænse præcist skaden site (figur 3B). Ekstracellulære matrixmolekyler, der producerer SHG signaler er stærkt beriget i hjerneparenkymet ved prik traumer. Først fine microglial processer hentet frem, så mikrogliaceller migrere til grænsen af skaden (figur 3A).
For at estimere de potentielle skader fremkaldt af tynd glaspipette indsættelse og levering af farvestof, vi udfører in vivo to-foton mikroskopi eksperimenter med Sulforhodamin 101 mikroinjektion i Thy1-YFP-H-mus uden hjerne traumer. Repræsentative billeder, der vises i figur 4 demonstrere microinjection hjemmeside 3 timer efter injektion. Spor pipette indsættelse kan ses i hjerne meninges visualiseret ved SHG (figur 4A). Astrocytter er mærket med Sulphorhodamine 101 indført ved injektion (figur 4B). Dendritter udtrykker YFP under Thy1 promotor ikke påvise nogen morfologiske tegn på skader som blebbing eller tilbagetrækningselementer pærer (Figur 4 C).
Figur 1. Fremgangsmåden af akut hjerneskade i kombination med kranie vindue eller tynde kranium præparater kombineret med in vivo to-foton mikroskopi. A. Traumatisk pik af stål nål på 0,3 mm OD (30G) anvendes på boret godt. Nålen kortvarigt nedsænket i hjernen 0,5-2 mm dyb fra bunden af brønden. B, C (C). D. Bright felt baggrund af de overfladiske blodkar gennem glasset vindue umiddelbart efter den akutte hjerneskade. E. Tyndet kraniet før ansøgningen skade. Det valgte område af interesse (hvid ramme), og pik applikationsstedet (rød cirkel). Et andet område (rød ramme) af den fortyndede region bør afbildes til at overvåge mulige kirurgi-induceret artefakter.
Figur 2.. Eksempel på langsgående multiphoton billeddannelse af hjernens traumer udvikling gennem den indsnævrede kraniet. A. Tilp baggrund af skaden site omgivet af YFP-mærkede dendritter af corticalneuroner 20 min efter traumer påførelse, som afbildet gennem den indsnævrede kraniet forberedelse. B. Forstørret billede af det område, der er skitseret i panel A. C. Det samme område af hjernen som i B, reimaged 5 dage efter traumer. Dendrite blebbing er vist med hvide pile, dendritiske tilbagetrækningselementer pærer - med røde pile.
Figur 3. Eksempler på overvågning inflammation og glia aktivering under udvikling af hjernelæsion hjælp af forskellige markører er egnede til in vivo multifotonexcitation imaging fx fluorescerende proteiner, farvestoffer og anden harmonisk generering af signal. Billederne blev opnået 3 timer efter hjerneskade.
Figur 4.. Undersøgelse af væv effektevaluering af opløsning indsprøjtning via en glasmikropipette. A. Et trace (shown med stiplet linie) i SHG visualisere hjernens meninges 3 timer efter injektion. B. Astrocytter mærket med sulphorhodamin indført ved injektion. C. Dendritter udtrykker YFP under Thy1 promotor. D. Kombineret billede af A (SHG - grå), B (astrocytter - rød), C (neuronale dendritter - gul).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hjernelæsion er en brat, uforudsigelig begivenhed. Her beskriver vi dyremodel, der gengiver et spektrum af patologiske ændringer, der observeres i humane patienter efter hjerneskade, såsom neurodegeneration, eliminering af dendritter, hjerneødem, glial ar, blødninger i hjernebarken kombineret med fokal subaraknoidal blødning og øget permeabilitet af blod-hjerne-barrieren. At studere primær og sekundær patogenese, samt bedring efter traumer, var denne skade model kombineret med langsgående in vivo visualisering af fine neuronal og glial strukturer. Transgene mus linjer blev anvendt som udtrykker fluorescerende proteiner i neuroner (Thy1-YFP-H) 7, astrocytter (GFAP-EGFP) 8 eller mikroglia (CX3CR1-EGFP) 9.. Derudover brugte vi anden harmonisk generation (SHG) billeddannelse og astrocyte belastning med Sulfarhodamine 101 10.
Den her beskrevne model sammenfatter penetrating type hjerneskade. Derfor er en begrænsning af den foreliggende model er, at det ikke giver information om mekanismer lukket hovedlæsion. For nylig Sword og medforfattere rapporterede multiphoton imaging resultater på celle adfærd i pericontusional cortex 6. Under hensyntagen til at lukket kvæstelser i hovedet er en hyppigere medicinsk tilfælde er metodiske tilgang rapporteret af forfatterne meget lovende at supplere de traditionelle forskningsmetoder inden for virkningen hjernetraume 11.
Vi brugte både den kroniske kranie vindue 12 og kraniet udtynding 13 forberedelser til at studere celle adfærd under posttraumatisk betingelser levende hjerne. Begge metoder har visse fordele og begrænsninger. Således kronisk kranie vindue giver bedre opløsning, dybere optisk indtrængen i hjernevævet og bekvemmelighed for flere billeddiagnostiske sessioner. Omvendt kraniet udtynding er mindre tilbøjelige til at fremkalde inflammation på the imaging site, og måske endnu vigtigere, det giver mulighed for gentagne anvendelser af stoffer og farvestoffer. Et par eksempler på farmakologiske midler, der skal anvendes i denne type eksperimenter er givet i tabel 1..
| Agent typen | Indsprøjtet agent | Områder i biologi / apotek forskning |
| Anti-inflammatorisk | Cyclosporin A | Traumatisk hjerneskade, sekundære skader, neurodegeneration |
| Toksiner | Tetrodotoxin | TBI - sekundære skader, excytotoxicity |
| Bicucullin | TBI - sekundær skade, klorid homeostase | |
| Hæmmere af signalveje | PD98059 (MAPKK inhibitor) | signalering mekanismer inflammation, sekundær skade, posttraumatisk celledød, neurodegeneration og regenerering |
| SU6656 (Src familien kinase inhibitor) | ||
| Neurotrofiske faktorer | Hjerne-afledt neurotrofisk faktor, BDNF | TBI - neuronal overlevelse efter skade, neuroprotektion i sekundær posttraumatisk hjerneskade |
| Vira | lentivirusvektorer til proteinekspression | molekylære mekanismer for posttraumatisk neurodegeneration og regenerering, differentieret mærkning af celletyper i beskadigede hjerne til in vivo billeddannelse |
| adenovirusvektorer til proteinekspression | ||
| Ca2 + fluorescerende indikatorer | Fluo-2, 4 | signalering mekanismer posttraumatisk inflammation, celledød, cellemigration, axonal / dendritiske regenerering |
Tabel 1.. Farmakologiske midler og farvestoffer til kortikal injektion i pik skade model.
En bred vifte af biokemiske hændelser, der er yderst vigtigt under fysiologiske og patologiske tilstande kan probes med kemiske inhibitorer, fluorescerende indikatorer og mutant-protein blev indført via virale konstruktioner. Fordele for at vælge bestemt tidsvindue, som præparatet kraniet udtynding kan være meget relevant for disse undersøgelser.
I den foreliggende undersøgelse anvendte vi anden harmonisk generation signal at afgrænse skaden site. Alternativt kunne skaden site grænser angives med en svagt diffuserende fluorescerende farvestof, for eksempel en høj molekylvægt dextran fluorescerende konjugat (2 mio Dalton).
For nylig Schaffer og kolleger 14 har brugt en kronisk præparatmed genoplukkelig kraniel vindue for gentagen levering af fluorescerende farvestoffer til at mus cortex. Det er sandsynligt, kraniel vindue genåbning negativt kan påvirke hjernevævet gennemsigtighed. Desuden er det vanskeligt at forudsige tidsforløbet for genåbning-induceret inflammation, hvilket kan påvirke bindevævet genvækst.
En væsentlig fordel ved den indsnævrede kraniet præparat er muligheden for at levere terapeutiske forbindelser (og andre materialer, der kræver topisk injektion i hjernevæv) flere gange under progression af traumer, uden at komplicere artefakter (f.eks uden kraniel vindue genåbning).
Hvis gentagne forbindelse levering direkte til skaden site ønskes, bør man overveje særlige midler til at forhindre kraniet udtørring og bakteriel infektion. Således anbefales at holde drives hoved-regionen under sterile forhold og anvendelse af antibiotika (såsom enrofloxacin). For at bevare thinned skalleparti fra tørring, fylde metalholder den med 1,5% agarose og dække det med runde dækglas. I de fleste tilfælde vil dette give opretholde den samme gennemsigtighed eller tyndet kraniet over en periode på op til 10 dage. Nogle ekstra bør tages hvis flere billeddiagnostiske sessioner i den indsnævrede kraniet forberedelse er planlagt over en længere periode. Umiddelbart før hver imaging session, forsigtigt fjerne det nydannede bindevæv fra tyndet region ved hjælp af en microsurgical kniv. Brug TPEM billeddannelse af SHG at kontrollere billedkvalitet og foranstaltning knogle tykkelse. Tissue genvækst kan kompromittere indtrængningsdybde og forårsage sløring ledsaget af en stigning i baggrunden fluorescens. Opdater kraniet tyndere forsigtigt med en microsurgical kniv til at genvinde høj billedkvalitet.
I de tilfælde, der ikke kræver direkte adgang til skaden site, kan vi varmt anbefale dækker tyndet region af kraniet med et glas coverslip som beskrevet i papir på poleret og forstærket fortyndet kraniet forberedelse af Kleinfeld og kolleger 15. Dette kan gøres ved hjælp af følgende valgfri procedure. Placer en lille dråbe agarose (1,5%) på den indsnævrede kraniet området, vente, indtil det bliver til en gel, fjerne alle unødvendige agarose, dvs lade det kun på skaden site. Agarose bør beskytte skaden site fra eksterne effekter. Tør tyndet skalleparti med trykluft. Drop en lille mængde af polyacryl lim på et lille stykke af # 0 dækglas og placere den på den indsnævrede kraniet regionen. Den polyacrylsyre lim forhindrer knogle-og bindevæv genvækst, og dermed holde den indsnævrede kraniet under vinduet bevaret.
En kombination af disse procedurer tillader studere akutte og kroniske posttraumatisk processer, levere medicin topisk eller systemisk og direkte overvågning af behandlingseffekt. Brug af dobbelt eller tredobbelt transgene mus linjer kan også være gavnligt, deltacularly til samtidig afbildning af flere posttraumatisk processer, såsom glial ardannelse og neuronal gren genvækst. Vi forventer, at vores modeller af akut hjerneskade undersøgt med intravital to-foton mikroskopi til at bevise frugtbart for lægemiddelkandidat testning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Vi er dybt taknemmelige for Dr. Frank Kirchhoff for at levere GFAP-EGFP og CX3CR1-EGFP musestammer. Arbejdet blev støttet af tilskud fra Center for International mobilitet Finland, Tekes, finsk Graduate School of Neuroscience (FGSN) og Finlands Akademi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2A-sa dumb Tweezers, 115 mm | XYtronic | XY-2A-SA | |
| 30 G ½ in needle | BD | REF 304000 | |
| Animal trimmer, shaving machine | Aesculap | Isis GT420 | |
| Binocular Microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Biological Temperature Controller with stainless steel heating pad | Supertech | TMP-5b | |
| Blunt microsurgical blade | BD | REF 374769 | |
| Borosilicate tube with filament | Sutter Instruments | BF120-69-10 | For glass pipette production |
| Carprofene | Pfizer | Rimadyl vet | |
| Chlorhexidine digluconate | Sigma | C9394 | |
| Dental cement | DrguDent, Dentsply | REF 640 200 271 | |
| Dexamethasone | FaunaPharma | Rapidexon vet | |
| Disposable drills | Meisinger | HP 310 104 001 001 008 | |
| Dulbeco’s PBS 10x | Sigma | D1408 | |
| Dumont #5 forceps, 110 mm | FST | 91150-20 | |
| Ealing microelectrode puller | Ealing | 50-2013 | Vertical puller for glass pipette production |
| Eye ointment | Novartis | Viscotears | |
| Foredom drill control | Foredom | FM3545 | |
| Foredom micromotor handpiece | Foredom | MH-145 | |
| Gas anesthesia platform for mice | Stoelting | 50264 | Assembled on stereotaxic instrument |
| Hemostasis Collagen Sponge | Avitene, Ultrafoam BARD | Ref 1050050 | |
| Imaris | Bitplane | ||
| Ketamine | Intervet | Ketaminol vet | |
| Mai Tai DeepSee laser | Spectra-Physics | ||
| Metal holder | Neurotar | ||
| Microdressing forceps, 105 mm | Aesculap | BD302R | |
| Microfil | WPI | MF34G-5 | Micro syringe filling capillaries |
| Mineral oil | Sigma | M8410 | |
| Multiphoton Laser Scanning Microscope | Olympus | FV1000MPE | |
| NanoFil Syringe 10 μl | WPI | NANOFIL | Hamilton syringe |
| Nonwoven swabs 5 x 5 | Molnlycke Health Care | Mesoft | Surgical tampons |
| Polyacrylic glue | Henkel | Loctite 401 | |
| Round glass coverslip | Electron Microscopy Sciences | ||
| 1.5 thickness | |||
| Small animal stereotaxic instrument | David Kopf Instruments | 900 | |
| Stoelting mouse and neonatal rat adaptor | Stoelting | 51625 | Assembled on stereotaxic instrument. |
| Student iris scissors, straight 11.5 cm | FST | 91460-11 | |
| Sulforhodamine 101 | Molecular Probes | S-359 | |
| UMP3 microsyringe pump and Micro 4 microsyringe pump controller | WPI | UMP3-1 | Microinjector and controller |
| Xylazine | Bayer Health Care | Rompun vet |
References
- Lighthall, J. W. Controlled cortical impact: A new experimental brain injury model. J. Neurotrauma. 5 (1), 1-15 (1988).
- Lindgren, S., Rinder, L. Experimental studies in head injury. Biophysik. 2 (5), 320-329 (1965).
- Shreiber, D. I., et al. Experimental investigation of cerebral contusion: histopathological and immunohistochemical evaluation of dynamic cortical deformation. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 58 (2), 153-164 (1999).
- Feeney, D. M., Boyeson, M. G., Linn, R. T., Murray, H. M., Dail, W. G. Responses to cortical injury: I. Methodology and local effects of contusions in the rat. Brain Res. 211 (1), 67-77 (1981).
- Bardehle, S., et al. Live imaging of astrocyte responses to acute injury reveals selective juxtavascular proliferation. Nat. Neurosci. 16 (5), 580-586 (2013).
- Sword, J., Masuda, T., Croom, D., Kirov, S. A. Evolution of neuronal and astroglial disruption in the peri-contusional cortex of mice revealed by in vivo two-photon imaging. Brain. 136 (5), 1446-1461 (2013).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Nolte, C., et al. GFAP promoter-controlled EGFP-expressing transgenic mice: a tool to visualize astrocytes and astrogliosis in living brain tissue. Glia. 33 (1), 72-86 (2001).
- Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol. Cell. Biol. 20 (11), 4106-4114 (2000).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Kerr, J. N. D., Helmchen, F. Sulforhodamine 101 as a specific marker of astroglia in the neocortex in vivo. Nat. Methods. 1 (1), 31-37 (2004).
- Carré, E., et al. Technical aspects of an impact acceleration traumatic brain injury rat model with potential suitability for both microdialysis and PtiO2 monitoring. J. Neurosci. Methods. 140, 23-28 (2004).
- Holtmaat, A., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat. Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. B. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nat. Protoc. 5, 201-208 (2010).
- Cianchetti, F. A., Kim, D. H., Dimiduk, S., Nishimura, N., Schaffer, C. B. Stimulus-evoked calcium transients in somatosensory cortex are temporarily inhibited by a nearby microhemorrhage. PloS one. 8 (5), (2013).
- Shih, A. Y., Mateo, C., Drew, P. J., Tsai, P. S., Kleinfeld, D. A polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain. J. Vis. Exp. 61, (2012).
