Summary
급성 뇌 손상은 날짜에 더 적절한 치료가없는 심각한 부상입니다. 다 광자 현미경은 길이 방향으로 급성 뇌 손상 개발의 과정을 공부하고 설치류에 치료 적 전략을 프로빙 할 수 있습니다. 두뇌의 생체 내 두 광자 이미징 연구 급성 뇌 손상의 두 가지 모델이 프로토콜에 설명되어 있습니다.
Abstract
급성 뇌 손상은 종종 다른 사고 머리 손상의 결과 및 인구의 상당 부분 영향을 미치지 만, 그것에 대한 효과적인 치료법은 아직 없다. 현재 사용되는 동물 모델의 제한은 병리 메커니즘에 대한 이해를 방해. 다 광자 현미경은 길이 방향으로 생리적, 병리 적 조건에서 그대로 동물의 뇌 내에서 세포와 조직을 연구 할 수 있습니다. 여기서는 외상 조건 하에서 뇌 세포 행동의 이광자 촬상 의해 공부 급성 뇌 손상의 두 모델을 설명한다. 선택된 뇌 영역은 뇌 실질 조직의 제어 폭과 깊이의 외상을 생산하는 날카로운 바늘로 부상하고 있습니다. 우리의 방법은 동시 약 응용과 결합 될 수있는 주사기 바늘로 찌름 정위를 이용한다. 우리는이 방법은 포유류의 뇌에 급성 외상의 병태 생리 학적 결과의 세포 메커니즘을 연구하는 고급 도구로 사용될 수 있음을 제시한다
Introduction
급성 뇌 손상은 자동차 충돌에서 부상의 높은 발병률과 중요한 공중 보건 문제가 떨어지거나 공격, 이후 만성 장애의 높은 보급. 뇌 손상의 치료에 대한 치료 적 접근 따라서, 병원 전 수술 및 중환자 치료의 효과를 제한하는, 완전히 증상이 남아 있습니다. 이것은 뇌 손상의 사회 경제적 영향은 특히 심각합니다. 여러 가지 이유로, 임상 시험의 대부분은 새로운 치료 방법을 사용하여 뇌 손상 후 회복에 개선을 보여 못했습니다.
동물 모델은 약물 효능은 뇌 손상 환자에서 예상 할 수있는 무대를 향해 새로운 치료 전략을 개발하기 위해 매우 중요합니다. 현재, 두부 외상의 몇 가지 잘 설립 된 동물 모델은 제어 대뇌 피질의 영향 1, 유체 타악기 부상 2, 동적 대뇌 피질의 변형 3, 체중 저하 등의 존재4, 그리고 사진 부상 5. 실험 모델의 숫자는 두부 외상 관련 병리의 특정 형태 학적, 분자 및 행동 양상을 연구하는 데 사용되었습니다. 그러나, 하나의 동물 모델은 새로운 치료 전략을 검증하는 데 완전히 성공하지 않습니다. 뇌 손상, 신뢰성 및 재현성 제어 된 동물 모델의 개발은 복잡한 프로세스 병리학을 평가하기 위해 필요하다.
최신 현미경 이미징 기술과 유전자 인코딩 형광 기자의 신규 조합은 기본 상해, 차 상해, 및 재생의 확산, 차 상해를 포함 뇌 손상의 모든 단계를 조사 할 수있는 전례없는 기회를 제공합니다. 특히, 생체 이광자 현미경 설치류 뇌의 깊은 층의 피질 세포에서도 세포 내 구조물의 실시간 시각화를 허용하는 고유의 비선형 광학 기술이다. 세포와 ORGA 여러 종류의nelles 다른 형광 마커를 조합하여 동시에 영상화 할 수있다. 이 강력한 도구를 사용하여, 우리는 외상 후 조건에서 뇌 생활에 동적 인 형태 학적 및 기능적 변화를 시각화 할 수 있습니다. 뇌 손상 연구에서 생체 내 두 광자 현미경의 장점은 최근 키로프와 동료 6에 의해 입증되었다. 마일드 초점 피질 타박상 모델을 사용하여, 이들 저자들은 pericontusional 피질 급성 돌기 부상이 로컬 혈류의 감소에 의해 게이트 된 것으로 나타났다. 또한, 그들은 타박상 사이트 주위의 대사 저하 피질이 더 확산 탈분극에 의해 손상되는 것을 보여 주었다. 이 차 손상이 외상성 뇌 손상의 결과가 더 심각하고, 시냅스 회로에 영향을 미칩니다.
여기, 우리는 지역의 두뇌를위한 고급 모델로, 동시 국소 약물의 응용 프로그램과 결합 될 수있는 주사기 바늘로 정위 찌르기의 방법을 제안한다상해 및 생체 내에서 포유 동물의 뇌에 급성 외상의 병태 생리 학적 결과를 연구 도구로.
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Protocol
여기에 제시된 모든 절차는 동물 보호 (동물 실험 2,006분의 62에 핀란드 법)에 대한 현지 지침에 따라 수행 하였다. 동물 라이센스 (ESAVI/2857/04.10.03/2012)는 지방 자치 단체 (ELÄINKOELAUTAKUNTA-ELLA)로부터 얻은 것입니다. 1~3개월 세의 성인 마우스, 무게 24~38g은 인증 된 대학의 동물 시설에서 개별 케이지에 보관 음식과 물을 임의로 제공 하였다.
1. 두개골 창을 통해 뇌 손상 이미징
- 동물을 마취하고 연산 필드를 준비
- 필터 - 멸균 인산 완충 식염수 (PBS), pH를 7.4에 용해 케타민 (Ketalar, 80 ㎎ / kg)과 자일 라진 (Rompun, 10 ㎎ / kg)의 혼합물을 복강 내 주사하여 마우스를 마취. 마취의 깊이를 확인하기 위해 마우스의 반사 신경 정기적으로 (꼬리와 발가락 핀치 프로브를) 확인하십시오. 적절한 때 적절한 마취를 유지하기 위해 용량을 증가하지만 overd을 피하기OSE.
- 마취에서 회복 후 수술, 영상 세션 첫 번째 시간 동안 가열 패드를 사용하여 37.0 ° C에서 동물을 유지합니다.
- 마르지 마우스의 눈을 보호하기 위해 눈에 윤활제를 적용합니다.
- 염증과 뇌 부종을 줄이기 위해 피하 주사로 덱사메타손 (Rapidexon 수의사, 2 ㎎ / ㎏)을 관리 할 수 있습니다.
- 이전에 또는 즉시 수술 후 30 분까지 (Ketoprophene 복강 예를 들어,) 진통제를 관리 할 수 있습니다. 동물이 같은 이동, 식사를하거나 음료, 또는 체중 감소에 거부감 같은 통증 증상을 나타내는 경우, 타액 분비, 입모, 또는 비정상적인 호흡은 수술 후 진통제의 주입을 반복 소리.
- 면도 기계 (재료 및 장비를 참조) 마우스 '머리를 면도. 수염의 손상을 방지.
- 면도 영역을 청소하기 위하여 70 % 에탄올 용액으로 쥐의 머리에 피부를 치료.
- 외과 용 가위를 사용하여 (자료 참조장비) 및 집게는 (재료 및 장비를 참조), 이마에 귀 사이의 중간 선으로부터 피부를 잘라.
- 조심스럽게 무딘 미세 수술 칼날로 두개골에 부착 된 결합 조직을 쳤어요.
- 옆으로 피부의 경계를 밀어 약간 머리와 피부 고정 용 두개골의 청각 구멍에 귀 막대를 잡아 당깁니다.
- 멸균 PBS와 두개골을 청소하고 0.5 % 클로르헥시딘 디 글루코 네이트와 마우스의 머리에 수술 사이트를 치료 한 후 멸균 면봉 및 압축 공기의 조합을 사용하여 두개골 표면을 건조.
- 찌름 상해를 가하는
- 동물 홀더와 작은 동물 정위 악기 (재료 및 장비를 참조) 놓습니다.
- 동물의 두개골의 표면에 초점을 다음 정위 악기의 쌍안 현미경의 위치를 조정합니다.
- 쌍안 현미경을 사용하여 두개골의 브레 그마 포인트를 찾습니다.
- 레기를 확인정위 좌표를 사용하여 그 명.
참고 : 직접 표면 대뇌 피질의 혈관에있는 관심있는 지역을 피하십시오. 이러한 파괴는 강하게 외상의 진행에 영향을 줄 수 있습니다. - 선택 영역 위의 30 G 바늘을 배치하고 두개골 표면을 긁어서 대상 사이트를 표시합니다.
- 영향을받는 뼈 표면적 불필요한 넓히는을 피하기 위해 모든 가능한 조치와 두개골을 드릴. 현미경으로 고속 수술 드릴을 (재료 및 장비를 참조)를 사용합니다. 액체가 뚫고 영역에 나타나는 경우 드릴 중지합니다.
- 바늘로 뚫고 우물의 바닥을 터치합니다.
- 찌르기 응용 프로그램 사이트의 좌표에 따라 0.5 ~ 2.0 mm의 깊이로, 뇌 (삽입 속도 5~10밀리미터 / 분)로 원활하게 바늘을 찍어.
- 즉시 원하는 깊이 (후퇴 속도 5-10mm / 분)에 도달 한 후 바늘을 제거하고 작은 탐폰을 가진 찌름 후 나오는 피를 닦아 (SE전자 재료 및 장비).
- 또는 마이크로 펌프 (WPI) 10 μL 해밀턴 주사기 유리 피펫과 조립을 사용하여 병변 부위에 100 μM Sulforhodamine 101의 미세 주입 또는 관심의 다른 화합물을 수행합니다.
참고 : 붕규산 유리 모세관에서 유리 피펫의 준비를하는 동안, 10 ~ 20 ㎛의 직경 끝을 날카롭게. - 2-5 NL / 초의 속도로 주입 솔루션의 250-1,500 NL 달이다.
참고 : 뇌 실질 조직에서 적어도 5 분 동안 주입이 끝난 후 피펫을 남겨, 다음 솔루션의 유출을 방지하기 위해 천천히 조심스럽게 제거합니다.
- 만성 뇌 창 개두
- 부상 사이트의 주위에 원형 창을 부드럽게하고 신중하게 두개골을 드릴. 3 ~ 3.5 mm의 창 직경을 사용합니다.
- 위스콘신 다루 피질 버퍼의 드롭 (125 mM의 염화나트륨, 5 밀리미터의 KCl, 10 mM의 포도당, 10 mM의 HEPES, 증류수 H 2 O 2 ㎜ 염화칼슘 및 2 mM의 망초)을 적용ndow.
- 두개골 창에 둥근 유리 커버 슬립 (# 1.5 두께)를 배치합니다.
- 커버 슬립 주위 피질 버퍼의 초과를 제거합니다.
- 폴리 아크릴 접착제로 커버 슬립의 가장자리를 밀봉 (재료 및 장비를 참조).
참고 : 접착제가 커버 슬립의 상부면에 적용되지 않았는지 확인합니다. 커버 유리를 접착제로 오염되면, 정중 microblade로 오염 접착제 제거, 유리 안정적 두개골에 접착 될 때까지 대기하여 유리 표면에 접착제가 건조 얻는다. - 5 분은 접착제가 건조 할 때까지 기다립니다.
- 금속 홀더가 배치 될 수 있도록 귀 바 높이 나사를 사용하여 헤드의 위치를 조정한다.
- 스틸 홀더의 링 (재료 및 장비를 참조) 폴리 접착제의 작은 금액을 적용합니다.
- 거꾸로 감독 금속 홀더 손잡이와 유리 커버 슬립에 스틸 홀더 링 접착제.
- 5 분은 접착제가 건조 할 때까지 기다립니다.
- 엠점성 조건을 달성하기 위해 3.5 cm 배양 접시에 (또는 아날로그)의 폴리 아크릴 접착제를 가진 IX 치과 시멘트 (재료 및 장비를 참조).
- 시멘트 + 접착제 혼합물로 두개골 윈도우의 테두리를 밀봉하고, 피부의 경계까지 동일한 혼합물과 두개골의 노출 된 표면을 커버.
- 15 분은 시멘트 + 접착제 혼합물을 건조하게하고 귀 막대를 제거 할 때까지 기다립니다.
- 그것은 프로토콜 3에서 설명한 바와 같이 그 영역과 제어 영역을위한 두 개의 광자 여기 현미경 (TPEM) 촬상을 수행한다.
- 촬영 후, 동물 가열 패드에 마취에서 회복하고 완전 회복 될 때까지 관찰에서 개별 케이지에 보관 할 수 있습니다. 젖은 음식은 씹는 수분을 용이하게 제공 할 수 있습니다.
2. 뇌 손상 이미징 얇게 두개골을 통해
- 동물 Anaesthetizing 및 연산 필드를 준비
- 마우스를 마취 및 외상 유도 준비를단계 1.1에 기재된대로.
- 머리 숱 찌름 상해를 가하는
- 동물 홀더와 작은 동물 정위 악기 (재료 및 장비를 참조) 놓습니다.
- 동물의 두개골 표면에 초점을 다음 정위 기기에 쌍안 현미경의 위치를 조정합니다.
- 쌍안 현미경을 사용하여 두개골에 브레 그마 지점을 찾은 정위 좌표에 따라 이미지에 표시 할 뇌 영역을 식별하고 긁힘으로 표시합니다.
참고 : 두개골의 안정성이 그 지역에 손상과 두개골 숱이 위치, 두개골의 봉합을 통해 인근에 위치 할 수 없습니다. 또한, 큰 대뇌 피질 또는 수막 혈관과 두개골 봉합 아래에있는 수막 이미징 유물을 일으킬 가능성이 있습니다. - 동물의 두개골에 관심 영역에 접착제로 코팅 된 금속 홀더를 배치, 가벼운 압력을 적용하고 금속 홀더가 단단히 두개골에 붙어 될 때까지 5 분 동안 기다립니다. 점성 조건을 달성하기 위해 3.5 cm 페트리 접시 (또는 아날로그)의 폴리 아크릴 접착제로 치과 용 시멘트 (재료 및 장비를 참조) 섞는다.
- 시멘트 + 접착제 혼합물과 금속 홀더의 테두리를 봉인하고 피부 경계까지 동일한 혼합물과 두개골의 노출 된 표면을 커버.
- 15 분은 시멘트와 접착제의 혼합물을 건조 할 때까지 기다립니다.
- nonpolymerized 접착제 잔존물이 씻겨 지도록, 얇아진 두개골 영역 및 PBS와 금속 홀더의 주변 부분을 여러 번 씻어.
참고 : 홀더에 두개골의 안정적인 부착을 보장하기 위해 매우 중요합니다. 이 영상 중에 준비 안정성을 가능하게한다. - 쌍안 현미경 고배율 모드를 사용하여, 직경 ~ 0.5-1.5 mm의 얇아진 두개골 영역을 생성하기 위해 고속 마이크로 드릴 두개골 뼈의 상부 층을 제거한다. 뼈 파편을 제거하기 위해 드릴링 동안 압축 공기를 사용합니다. 드릴링 intermittentl를 수행마찰 - 유도 과열을 피하기 위하여 씨닝 절차 중에 Y. 실온 용액을 사용하여 드릴 비트 차게 주기적 열을 흡수하는 얇아진 영역에 버퍼를 적용한다.
참고 : 대뇌 피질의 손상을 방지하기 위해, 얇은 층 (<50 ㎛)까지 큰 지역 (> 1.5 mm)를 통해 드릴하지 않습니다.
주 : 쥐의 두개골 뼈 구조가 해면 뼈의 두꺼운 층으로 구분 된 컴팩트 뼈의 두 개의 얇은 층으로 구성되어 있습니다. 혈관을 포함하는 해면 뼈의 형태로 동심원과 눈물 소관의 작은 구멍. 외부 컴팩트 뼈의 층과 스폰지 층의 대부분을 모두 제거하는 microdrill를 사용합니다. 해면골 내의 혈관의 중단 출혈의 원인이 될 수 있습니다. 이 출혈을 멈추게하는 지혈 콜라겐 스폰지를 사용합니다. - 해면골의 대부분이 제거되었는지 여부를 검사하는 두 번째 고조파 발생 (SHG) 영상을 사용합니다. 남은 뼈는 일이 있는지 확인, 과도한 숱 않도록주의준비 단계에서 50 ㎛보다 icker.
- 얇게 영역의 상단에 따뜻한 버퍼의 드롭 (35 ~ 37 °의 C)를 넣습니다. 더 뼈 층을 제거하고 ~ 20 ㎛, 뼈 두께 직경 ~ 700 ㎛의 부드러운 영역을 형성하기 위해 부르 마무리 미세 수술 날 또는 마이크로를 사용합니다. 이 단계 동안, 반복적 SHG 촬상을 수행하고 정기적으로 뼈의 두께를 측정하는데 도움이된다.
- 관심의 영역과 제어 영역에 대한 TPEM 이미징을 수행합니다.
- 영역은 엄격히 수평 위치 박막화하는 방식으로 귀 바 높이 나사를 사용하여 헤드의 위치를 조정한다. 얇아진 지역 위의 바늘을 배치하고 대상 사이트 아래에 더 큰 용기가 없는지 확인합니다.
- 얇아진 두개골 표면에서 0.5 ~ 2.0 mm의 깊이로, 뇌에 바늘을 찍기 찌르기 응용 프로그램 사이트의 좌표에 따라하여 병변을 확인합니다.
- 바늘을 제거하고 t 후에 나타나는 출혈을 억제그는 지혈 혈전 (재료 및 장비를 참조) 뇌 손상을 급성. 부상 사이트에서 혈전의 형태와 혈관 맥박이 멈출 때까지 기다리십시오.
- 섹션 1.2.10에서 상술 한 바와 같이, 100 μM Sulforhodamine 101 또는 병변 사이트에 관심의 또 다른 화합물의 미세 주입을 수행합니다.
- 프로토콜 3에서 설명한 손상의 진행 및 회복을 모니터하는 TPEM 촬상을 수행한다.
- 촬영 후, 동물 가열 패드에 마취에서 의식을 회복 할 수 있습니다. 무인 동물을두고 만 전체 물리적 복구 후 자신의 홈 케이지에 반환하지 않습니다.
3. 영상
- 사용자 정의 내장 된 프레임에 금속 홀더를 부착하여 현미경으로 동물을 놓습니다.
- 이미징, 마이 타이 DeepSee 레이저와 생체 내 두 광자에 최적화 XLPLN 25X 1.05 NA 침수 목적으로 장착 예 FV1000MPE 두 광자 현미경을 사용하여영상.
- 광 시야 형광 모드를 사용하여 현미경으로 병변 사이트를 식별. 뇌 혈관을 시각화하고 혈관의 관찰 된 패턴에 따른 제어 영역을 선택하는 롱 패스 필터를 사용한다.
- 이미지의 두 번째 고조파 발생 (SHG) 신호, 800 nm 파장에 조정 펨토초 레이저와는 380-410 nm의 바이 패스 필터를 사용하여 방출되는 빛을 수집합니다. 형광 이미징의 경우, 방출 된 광을 수집하기 위해 대역 통과 필터 (515-560 나노 미터)를 사용하고, 다음과 같은 파장의 형광을 자극하기 위해 사용된다 : GFP-860 NM, YFP - 950 nm의.
- 이미지 수집을 위해 Fluoview 소프트웨어를 사용합니다.
- 상점은 이후 반복 이미징을위한 모든 투자 수익 (ROI)의 좌표. 이미지 시간에 동일한의 ROI를 코디네이터에게 이미지의 중첩을 극대화하기 위해 모든 시간을 조정합니다.
- 해당 소프트웨어 (예. ImageJ에) 이미지를 분석합니다. 여기에 제시된 복원은 Imaris 소프트웨어를 사용하여 수행 하였다.
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Representative Results
형질 전환 생쥐의 외상 후 뇌 영상 1) 만성 두개골 창 2) 머리 숱이, 우리는 두 가지 작업 절차를 최적화했다. 실험 준비의 개략도는 그림 1에 제시되어있다. 0.3 mm 외경 (30 G)의 스틸 바늘에 의한 외상 찌르기는 드릴 아니라 (그림 1A)에 적용됩니다. 머리 숱이 약 300 μm의 (그림 1C)의 제한을 적용하는 경향이있는 반면, 성공적인 두개골 창 준비 Thy1-YFP -의 3 차원 재구성에서와 같이, pial 표면 (그림 1B) 아래 650 μm의 최대 깊이에서 촬영을 할 수 있습니다 H 마우스 대뇌 피질의 피라미드 뉴런.
뇌 피질의 조절 볼륨있는 수상 돌기 모세 혈관 망의 파괴의 제거에서 사라지게 외상 결과. 제 이일 동안 병변 면적이 증가하고 외상 유도 수지상에 blebbing 및 수지상 후퇴 B의 형성perilesion 지역에서 ULBS, 생체 다 광자 현미경 (그림 2)를 사용하여 관찰.
우리는 바로 상해 (그림 3A) 후 이미지 활성화 및 CX3CR1-EGFP 마우스에있는 미세 아교 세포의 이동에 숱이 두개골을 수행 하였다. SHG 영상은 정확하게 부상 사이트 (그림 3B)를 묘사 할 수있는 유용한 도구를 제공합니다. SHG 신호를 생산하는 세포 외 기질 분자는 크게 찌르기 외상에서 뇌 실질에 충실. 첫째, 미세 미세 아교 프로세스는 다음 미세 아교 세포가 손상 사이트 (그림 3A)의 경계로 마이그레이션, 검색됩니다.
얇은 유리 피펫 삽입 및 염료의 전달에 의해 유도 된 잠재적 인 부상을 추정하기 위해, 우리는 생체 내에서 뇌 손상없이 Thy1-YFP-H 생쥐 Sulforhodamine 101 미세 주입 두 광자 현미경 실험을 수행합니다. 그림 4와 같이 대표 이미지는 마일을 보여주사 후 croinjection 사이트 3 시간. 피펫 삽입의 흔적은 SHG (그림 4A)에 의해 시각 뇌 수막에 볼 수 있습니다. 성상 세포는 주입 (그림 4B)에 의해 도입 Sulphorhodamine 101으로 표시됩니다. Thy1 프로모터에서 YFP을 표현하는 수상 돌기가에 blebbing 또는 후퇴 전구와 같은 부상의 형태 학적 징후 (그림 4 C)를 설명하지 않습니다.
그림 1. 두개 창 또는 생체 이광자 현미경과 결합 된 얇은 두개골 제제와 조합 급성 뇌 손상의 방법. 0.3 OD (30G)의 스틸 바늘로. 외상성 녀석이 잘 드릴에 적용. 바늘은 간단히 우물의 바닥에서 뇌의 깊은 0.5 mm에 침지한다. B, C에게 (C). D에 표시됩니다. 바로 급성 뇌 손상. E 후 유리 창을 통해 피상적 인 혈관의 시야보기. 부상 응용 프로그램 전에 두개골을 희석. 이자 (흰색 프레임)과 찌르기 응용 프로그램 사이트 (빨간색 원)의 선택 영역. 얇아진 지역의 다른 영역 (빨간색 프레임)이 가능 수술에 의한 아티팩트를 모니터링하는 몇 군데해야합니다.
얇아진 두개골을 통해 뇌 손상 개발의 길이 다 광자 이미징의 그림 2. 예. .에대뇌 피질의 신경 세포 20 분 외상 가하는 후 얇아진 두개골 준비를 통해 몇 군데로. B의 YFP - 라벨 수상 돌기에 둘러싸여 부상 사이트의 P보기. 패널에 설명 된 영역의 확대도. C. B에서와 같이 뇌의 같은 영역은 5 일 외상 후 이미지를 다시 만든. 빨간색 화살표와 함께 - 수상 돌기에 blebbing 흰색 화살표, 수지상 후퇴 전구로 표시됩니다.
그림 3. 생체 다 광자 이미징 예를 들어, 형광 단백질, 염료, 그리고 두 번째 고조파 발생 신호에 적합한 다른 마커를 사용하여 뇌 손상의 개발 기간 동안 모니터링 염증과 glia의 활성화의 예. 이미지는 뇌 손상 후 3 시간을 인수했다.
유리 마이크로 피펫을 통해 용액의 주입에 의해 조직에 미치는 영향 그림 4. 시험. . 추적 (웃음SHG 사출. B 후 뇌 수막에게 3 시간을 시각화 점선)와 WN. 주입에 의해 도입 sulphorhodamine으로 표시 성상. C. Thy1 프로모터에서 YFP을 표현하는 수상 돌기. D. (SHG - 회색)의 결합 이미지, B (성상 세포 - 적색), C (신경 세포의 수상 돌기 - 노란색).
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Discussion
뇌 손상은 갑작스러운, 예측할 수없는 이벤트입니다. 여기에서, 우리는 신경 변성, 수상 돌기의 제거, 뇌 부종, 아교 흉터, 초점 지주막 하 출혈과 함께 대뇌 피질의 출혈과 증가 투자율과 같은 뇌 손상 후에 인간의 환자에서 관찰 된 병리학 적 변화의 스펙트럼을 재현 동물 모델을 설명 혈액 - 뇌 장벽. 기본 및 보조 기전뿐만 아니라, 외상 후 회복을 연구하기 위해이 부상 모델은 미세 신경 세포와 신경 교세포 구조의 생체 내 시각화의 길이와 결합했다. 유전자 변형 마우스 라인은 (Thy1-YFP-H) 7, 성상 세포 (GFAP-EGFP) 8 신경 세포에 형광 단백질을 표현하거나, 미세 아교 세포 (CX3CR1-EGFP) 9이 사용되었다. 또한, 우리는 Sulfarhodamine 101 (10)와 두 번째 고조파 발생 (SHG) 이미징 및 성상 세포의 로딩을 사용했습니다.
여기에 설명 된 모델은 pene 되풀이되었습니다뇌 손상의 trating 유형. 따라서 본 모델의 한계는 폐쇄 머리 부상의 메커니즘에 대한 정보를 제공하지 않는다는 것입니다. 최근 검 및 공동 저자는 pericontusional 피질 6 세포 행동에 다 광자 이미징 결과를보고했다. 머리 부상 폐쇄를 고려하는 것이 더 자주 의료 경우이다, 저자에 의해보고 된 방법 론적 접근 방식은 매우 충격 뇌 손상 (11)의 분야에서 기존의 연구 방법을 보완하기 위해 약속합니다.
우리는 만성 뇌 창 (12)과 뇌 생활에서 외상 후 조건에서 세포의 행동을 연구하기 위해 13 준비를 얇게 두개골을 모두 사용했습니다. 두 가지 방법은 어떤 장점과 한계가있다. 따라서, 만성 뇌 창 해상도가 향상되고, 뇌 조직과 여러 영상 세션에 대한 편의에 깊은 광학 침투를 제공합니다. 반대로, 머리 숱이 일에 염증을 유도 할 가능성이 적습니다아마도 더 중요한 것은 전자 영상 사이트, 그리고, 그것은 마약과 염료의 반복 응용 프로그램을 할 수 있습니다. 실험이 유형에 적용되는 약학 제제의 몇 가지 예는 표 1에 나타낸다.
| 에이전트 유형 | 주입 제 | 생물학 / 약학 연구 분야 |
| 항 염증 | 사이클로스포린 | 외상성 뇌 손상, 차의 손상, 신경 변성 |
| 독소 | 테트로도톡신 | TBI - 차 손상, excytotoxicity |
| Bicuculline | TBI - 차 손상, 염화 항상성 | |
| 신호 전달 경로의 억제제 | PD98059 (MAPKK 억제제) | 염증, 차 손상, 외상 후 세포 사멸, 신경 변성과 재생의 메커니즘을 신호 |
| SU6656 SRC (가족 키나제 억제제) | ||
| 신경 영양 인자 | 뇌 유래 신경 영양 인자 BDNF | TBI - 신경 세포의 생존을 보조 외상 후 뇌 손상의 손상, 신경 보호 후 |
| 바이러스 | 단백질 발현을위한 렌티 바이러스 벡터 | 외상 후 신경 변성과 재생의 분자 메커니즘, 생체 내 이미징을위한 손상된 뇌 세포 유형의 차등 라벨링 |
| 단백질 발현을위한 아데노 바이러스 벡터 | ||
| 칼슘 2 + 형광 표시 | FLUO -2,4 | 외상 후 염증의 메커니즘을 신호, 세포 사멸, 세포 이동, 축삭 / 돌기 재생 |
표 1. 찌르기 손상 모델에서 대뇌 피질의 주입되는 약물 및 염료.
생리적 및 병리 적 조건에서 매우 중요한 생화학 적 사건의 광범위한 바이러스 성 구조를 통해 도입 된 화학적 억제제, 형광 표시기 및 돌연변이 단백질로 프로빙 할 수있다. 두개골이 얇아 준비에서 제공하는 특정 시간 창을 선택하는 장점은 그 연구에 매우 관련이있을 수 있습니다.
본 연구에서 우리는 부상 사이트를 묘사하기 위해 두 번째 고조파 발생 신호를 사용했습니다. 대안 적으로, 부상 사이트 테두리 인스턴스 고 분자량 덱스 트란 형광 결합체 (2000000 돌턴)을 위해, 약하게 확산 형광 염료에 의해 지시 될 수있다.
최근 샤퍼와 동료 (14)는 만성 준비를 사용했습니다마우스 피질에 형광 염료의 반복적 인 전달을위한 reopenable 두개골 창. 그것은 두개 창 재개 악영향 뇌 조직의 투명도에 영향을 미칠 수있는 가능성이있다. 또한, 결합 조직에 영향을 미칠 수 재성장 재개 유발 염증의 시간 코스를 예측하는 것은 곤란하다.
얇아진 두개골 준비의 하나의 큰 장점은 치료 화합물 (뇌 조직에 국소 주사를 필요로하는 기타 자료) (재개 두개골 창없이 예) 유물을 복잡하게하지 않고, 외상의 진행하는 동안 여러 번 제공 할 수있는 가능성이다.
직접 부상 사이트에 반복적 화합물 전달이 요구되는 경우, 하나는 두개골 드라이 아웃 및 세균 감염을 방지하기 위해 특별한 수단을 고려해야한다. 따라서, 멸균 조건 (예 : enrofloxacin 등) 항생제의 응용 프로그램에서 작동 머리 영역을 유지하는 것은 좋습니다. T를 유지하려면건조 두개골 영역을 hinned, 1.5 % 아가로 오스와 금속 홀더를 기입 둥근 유리 커버 슬립으로 커버. 대부분의 경우이 최대 10 일의 기간 동안 같은 투명하거나 얇게 두개골을 유지하실 수 있습니다. 얇아진 두개골 준비에 여러 이미지 세션이 오랜 기간 동안 계획하는 경우 몇 가지 추가는주의해야한다. 즉시 각 이미징 세션 전에, 부드럽게 미세 수술 블레이드를 사용하여 얇게 지역에서 새로 형성된 결합 조직을 제거합니다. 이미지 품질을 측정하고 뼈의 두께를 확인 SHG의 TPEM 이미징을 사용한다. 티슈 재성장은 배경 형광의 증가를 동반 치우침 침투 깊이 및 원인 이미지를 손상시킬 수. 높은 영상 품질을 회복하기 위해 미세 수술 칼날로 부드럽게 벗겨 두개골을 새로 고칩니다.
부상 사이트에 직접 액세스를 필요로하지 않는 경우에, 우리는 매우 유리 coversli와 두개골 얇게 피복 영역 권장광택과 강화의 용지에 설명 된대로 P는 클라인 펠트와 동료 (15)에 의해 두개골 준비를 얇게. 이것은 다음과 같은 선택적 절차를 사용하여 수행 할 수있다. , 얇아진 두개골 지역에 아가로 오스의 작은 방울 (1.5 %)을 놓고 젤이 될 때까지 기다린 불필요한 아가로 오스를 제거, 즉 만 부상 사이트에 둡니다. 아가로 오스는 외부 영향으로부터 부상 사이트를 보호해야합니다. 압축 공기를 사용 얇아진 두개골 영역 말린다. # 0 커버 글라스의 작은 조각에 폴리 아크릴 접착제의 작은 금액을 삭제하고 얇아진 두개골 영역에 놓습니다. 폴리 아크릴 접착제 따라서 보존 창에서 얇아진 두개골을 유지, 뼈와 결합 조직의 재성장을 방지 할 수 있습니다.
이러한 절차의 조합은, 급성 및 만성 외상 후 과정을 공부 국소 적 또는 전신적으로 약물을 전달하고 직접 치료 효과를 확인할 수 있도록 해줍니다. 이중 또는 삼중 유전자 변형 마우스 라인의 사용도 도움이, 이상적 상대가 될 수이러한 폐해 흉터 형성과의 연결 지점 재성장 여러 외상 후 프로세스의 동시 이미징 cularly. 우리는 급성 뇌 손상의 우리의 모델은 약물 후보 테스트를위한 유익한 증명의 intravital 두 광자 현미경으로 공부 기대합니다.
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Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
우리는 GFAP-EGFP와 CX3CR1-EGFP 마우스 균주를 제공하는 프랭크 박사 키르히 호프에 깊이 감사드립니다. 작품은 핀란드의 국제 이동성 센터, Tekes, 핀란드의 신경 과학 대학원 (FGSN), 핀란드의 아카데미에서 교부금에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2A-sa dumb Tweezers, 115 mm | XYtronic | XY-2A-SA | |
| 30 G ½ in needle | BD | REF 304000 | |
| Animal trimmer, shaving machine | Aesculap | Isis GT420 | |
| Binocular Microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Biological Temperature Controller with stainless steel heating pad | Supertech | TMP-5b | |
| Blunt microsurgical blade | BD | REF 374769 | |
| Borosilicate tube with filament | Sutter Instruments | BF120-69-10 | For glass pipette production |
| Carprofene | Pfizer | Rimadyl vet | |
| Chlorhexidine digluconate | Sigma | C9394 | |
| Dental cement | DrguDent, Dentsply | REF 640 200 271 | |
| Dexamethasone | FaunaPharma | Rapidexon vet | |
| Disposable drills | Meisinger | HP 310 104 001 001 008 | |
| Dulbeco’s PBS 10x | Sigma | D1408 | |
| Dumont #5 forceps, 110 mm | FST | 91150-20 | |
| Ealing microelectrode puller | Ealing | 50-2013 | Vertical puller for glass pipette production |
| Eye ointment | Novartis | Viscotears | |
| Foredom drill control | Foredom | FM3545 | |
| Foredom micromotor handpiece | Foredom | MH-145 | |
| Gas anesthesia platform for mice | Stoelting | 50264 | Assembled on stereotaxic instrument |
| Hemostasis Collagen Sponge | Avitene, Ultrafoam BARD | Ref 1050050 | |
| Imaris | Bitplane | ||
| Ketamine | Intervet | Ketaminol vet | |
| Mai Tai DeepSee laser | Spectra-Physics | ||
| Metal holder | Neurotar | ||
| Microdressing forceps, 105 mm | Aesculap | BD302R | |
| Microfil | WPI | MF34G-5 | Micro syringe filling capillaries |
| Mineral oil | Sigma | M8410 | |
| Multiphoton Laser Scanning Microscope | Olympus | FV1000MPE | |
| NanoFil Syringe 10 μl | WPI | NANOFIL | Hamilton syringe |
| Nonwoven swabs 5 x 5 | Molnlycke Health Care | Mesoft | Surgical tampons |
| Polyacrylic glue | Henkel | Loctite 401 | |
| Round glass coverslip | Electron Microscopy Sciences | ||
| 1.5 thickness | |||
| Small animal stereotaxic instrument | David Kopf Instruments | 900 | |
| Stoelting mouse and neonatal rat adaptor | Stoelting | 51625 | Assembled on stereotaxic instrument. |
| Student iris scissors, straight 11.5 cm | FST | 91460-11 | |
| Sulforhodamine 101 | Molecular Probes | S-359 | |
| UMP3 microsyringe pump and Micro 4 microsyringe pump controller | WPI | UMP3-1 | Microinjector and controller |
| Xylazine | Bayer Health Care | Rompun vet |
References
- Lighthall, J. W. Controlled cortical impact: A new experimental brain injury model. J. Neurotrauma. 5 (1), 1-15 (1988).
- Lindgren, S., Rinder, L.
- Shreiber, D. I., et al. Experimental investigation of cerebral contusion: histopathological and immunohistochemical evaluation of dynamic cortical deformation. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 58 (2), 153-164 (1999).
- Feeney, D. M., Boyeson, M. G., Linn, R. T., Murray, H. M., Dail, W. G. Responses to cortical injury: I. Methodology and local effects of contusions in the rat. Brain Res. 211 (1), 67-77 (1981).
- Bardehle, S., et al. Live imaging of astrocyte responses to acute injury reveals selective juxtavascular proliferation. Nat. Neurosci. 16 (5), 580-586 (2013).
- Sword, J., Masuda, T., Croom, D., Kirov, S. A. Evolution of neuronal and astroglial disruption in the peri-contusional cortex of mice revealed by in vivo two-photon imaging. Brain. 136 (5), 1446-1461 (2013).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Nolte, C., et al. GFAP promoter-controlled EGFP-expressing transgenic mice: a tool to visualize astrocytes and astrogliosis in living brain tissue. Glia. 33 (1), 72-86 (2001).
- Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol. Cell. Biol. 20 (11), 4106-4114 (2000).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Kerr, J. N. D., Helmchen, F. Sulforhodamine 101 as a specific marker of astroglia in the neocortex in vivo. Nat. Methods. 1 (1), 31-37 (2004).
- Carré, E., et al. Technical aspects of an impact acceleration traumatic brain injury rat model with potential suitability for both microdialysis and PtiO2 monitoring. J. Neurosci. Methods. 140, 23-28 (2004).
- Holtmaat, A., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat. Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. B. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nat. Protoc. 5, 201-208 (2010).
- Cianchetti, F. A., Kim, D. H., Dimiduk, S., Nishimura, N., Schaffer, C. B. Stimulus-evoked calcium transients in somatosensory cortex are temporarily inhibited by a nearby microhemorrhage. PloS one. 8 (5), (2013).
- Shih, A. Y., Mateo, C., Drew, P. J., Tsai, P. S., Kleinfeld, D. A polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain. J. Vis. Exp. 61, (2012).
