Summary
الصدمة الدماغ الحاد هو إصابة الشديدة التي لا يوجد لديه العلاج المناسب حتى الآن. Multiphoton المجهري يسمح دراسة طوليا عملية التنمية الصدمة الدماغ الحادة وسبر الاستراتيجيات العلاجية في القوارض. وأظهرت نموذجين من الصدمة الدماغ الحادة درس في الجسم الحي مع اثنين من الفوتون التصوير من الدماغ في هذا البروتوكول.
Abstract
على الرغم من الصدمة الدماغ الحادة غالبا ما ينجم عن تلف الرأس في حوادث مختلفة ويؤثر على جزء كبير من السكان، لا يوجد علاج فعال لذلك حتى الآن. القيود المفروضة على نماذج حيوانية المستخدمة حاليا تعيق فهم آلية الأمراض. Multiphoton المجهري يسمح دراسة الخلايا والأنسجة داخل أدمغة الحيوانات سليمة طوليا في ظل الظروف الفسيولوجية والمرضية. هنا، نحن تصف نموذجين من إصابات الدماغ الحادة درس عن طريق التصوير ثنائي الفوتون من السلوك خلايا الدماغ في ظل ظروف ما بعد الصدمة. وأصيب المنطقة من المخ اختيارها بإبرة حادة لإنتاج الصدمة بعرض للرقابة وعمق في لحمة الدماغ. يستخدم أسلوب لدينا وخز التجسيمي مع إبرة حقنة، والتي يمكن دمجها مع التطبيق المتزامن المخدرات. نقترح أن هذه الطريقة يمكن أن تستخدم أداة متقدمة لدراسة الآليات الخلوية من العواقب المرضية في جسم المريض من صدمة حادة في الدماغ في الثدييات
Introduction
إصابات الدماغ الحادة مشكلة صحية عامة كبيرة مع ارتفاع معدل الإصابة في حوادث السيارات، والسقوط أو الاعتداءات، وارتفاع معدل انتشار الإعاقة المزمنة لاحقة. يبقى النهج العلاجي لعلاج إصابات الدماغ أعراض تماما، مما يحد من فعالية الرعاية قبل دخول المستشفى والجراحية والحرجة. وهذا يجعل الأثر الاجتماعي والاقتصادي للإصابات الدماغ الحادة بشكل خاص. لمجموعة متنوعة من الأسباب، فإن معظم التجارب السريرية لم تثبت تحسنا في الانتعاش بعد إصابات الدماغ باستخدام أساليب علاجية جديدة.
النماذج الحيوانية ذات أهمية حاسمة لتطوير استراتيجيات علاجية جديدة نحو مرحلة حيث يمكن التنبؤ نجاعة الأدوية في المرضى الذين يعانون من إصابات في المخ. في الوقت الحاضر، العديد من النماذج الحيوانية راسخة من صدمات الرأس موجودة، بما في ذلك تأثير تسيطر القشرية 1، السائل إصابة قرع 2، تشوه القشرية ديناميكية 3، الوزن الإفلات4، وإصابة 5 الصورة. وقد استخدمت عدد من نماذج تجريبية لدراسة بعض الجوانب الشكلية والجزيئية والسلوكية للرئيس علم الأمراض المرتبطة الصدمة. ومع ذلك، لا يوجد نموذج حيوان واحد هو ناجحة تماما في التحقق من صحة استراتيجيات علاجية جديدة. تطوير نماذج حيوانية يمكن الاعتماد عليها، والتي تسيطر استنساخه من إصابات الدماغ هو ضروري لتقييم العمليات المرضية المعقدة.
مزيج رواية من أحدث تقنيات التصوير المجهري وصحفيين الفلورسنت المشفرة وراثيا يوفر فرصة غير مسبوقة لتحقيق في جميع مراحل إصابات الدماغ، والتي تشمل الإصابة الأولية، وانتشار الإصابة الأولية والإصابة الثانوية، والتجدد. على وجه الخصوص، في الجسم الحي اثنين من الفوتون المجهري هو التكنولوجيا البصرية غير الخطية الفريدة التي تسمح التصور في الوقت الحقيقي من الهياكل الخلوية وحتى التحت خلوية في الطبقات القشرية العميقة من الدماغ القوارض. عدة أنواع من الخلايا وورشولا يمكن تصوير nelles في وقت واحد من خلال الجمع بين علامات الفلورسنت مختلفة. باستخدام هذه الأداة القوية، يمكننا تصور التغيرات المورفولوجية والوظيفية الحيوية في الدماغ يعيشون في ظل ظروف ما بعد الصدمة. وقد أظهرت مزايا في الجسم الحي اثنين من الفوتون المجهري في دراسة إصابات الدماغ مؤخرا كيروف والزملاء 6. باستخدام نموذج كدمة خفيفة التنسيق القشرية، أظهر الباحثون أن هذه الإصابة شجيري الحاد في القشرة pericontusional وبوابات من انخفاض في تدفق الدم المحلية. وعلاوة على ذلك، فإنها أظهرت أن القشرة للخطر عملية الأيض حول الموقع كدمة تلف مزيد من الاستقطاب الانتشار. هذا الضرر الثانوي يؤثر الدوائر متشابك، مما يجعل عواقب إصابات في الدماغ أكثر شدة.
هنا، نقترح طريقة وخز التجسيمي مع إبرة حقنة، والتي يمكن أن تكون مجتمعة في وقت واحد مع تطبيق المخدرات الموضعية، كنموذج متقدم للدماغ المحليةإصابة وكأداة لدراسة العواقب المرضية في جسم المريض من الصدمة الحادة في الدماغ في الثدييات في الجسم الحي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم تنفيذ كافة الإجراءات المعروضة هنا وفقا لتوجيهات المحلية لرعاية الحيوانات (والقانون الفنلندي على التجارب على الحيوانات 62/2006). تم الحصول على رخصة الحيوان (ESAVI/2857/04.10.03/2012) من السلطة المحلية (ELÄINKOELAUTAKUNTA-إيلا). الفئران البالغة من 1-3 أشهر العمر والوزن 24-38 غرام، تم وضعهم في أقفاص الفردية في منشأة الحيوان الجامعة معتمدة وتوفير الغذاء والماء بالمال وبالشهرة أيضا الإعلانية.
1. الدماغ التصوير الإصابات من خلال نافذة القحف
- التخدير الحيوانات وإعداد مجال العملية
- تخدير الفئران عن طريق الحقن البريتوني من مزيج من الكيتامين (Ketalar، 80 ملغ / كلغ) وزيلازين (Rompun، 10 ملغ / كلغ) المذاب في فلتر تعقيم العازلة الفوسفات المالحة (PBS)، ودرجة الحموضة 7.4. تحقق ردود الفعل الماوس، بانتظام (الذيل وأخمص القدمين قرصة التحقيق) للتحقق من عمق التخدير. زيادة الجرعة عند الاقتضاء، للحفاظ على التخدير المناسب ولكن تجنب overdبيئة نظام التشغيل.
- الحفاظ على الحيوانات في 37.0 درجة مئوية باستخدام وسادة التدفئة أثناء العملية الجراحية، ودورة التصوير وساعة الأولى بعد التعافي من التخدير.
- لحماية العينين الماوس، من الجفاف، وتطبيق مواد التشحيم العين.
- إدارة ديكساميثازون (Rapidexon التعليم والتدريب المهني، 2 ملغ / كلغ) عن طريق الحقن تحت الجلد لتخفيف الالتهاب والوذمة الدماغية.
- إدارة مسكن (على سبيل المثال، Ketoprophene الغشاء البريتونى) ما يصل إلى 30 دقيقة قبل أو مباشرة بعد الجراحة. إذا يسلك الحيوان أي أعراض الألم، مثل عدم الرغبة في التحرك، وتناول الطعام أو الشراب، أو فقدان الوزن، واللعاب، انتصاب الشعر، أو غير طبيعية في الجهاز التنفسي يبدو بعد الجراحة، كرر حقن مسكنة.
- يحلق 'رئيس الماوس مع آلة الحلاقة (انظر المواد والمعدات). تجنب إتلاف شعيرات.
- علاج الجلد على الرأس الماوس، مع 70٪ محلول الإيثانول لتنظيف المنطقة حليق.
- باستخدام مقص جراحي (انظر المواد والمعدات) وملقط (انظر المواد والمعدات)، وقطع الجلد من خط الوسط بين الأذنين إلى جبهته.
- كشط بلطف بعيدا النسيج الضام تعلق على الجمجمة بشفرة حادة المجهرية.
- الشريحة حدود الجلد وسحب قضبان جانبية الأذن قليلا في فتحات أذني من الجمجمة لتثبيت الرأس والجلد.
- تنظيف الجمجمة مع برنامج تلفزيوني العقيمة وعلاج موقع الجراحة على رأس الفأر مع 0.5٪ الكلورهيكسيدين digluconate، ثم تجف على سطح الجمجمة باستخدام مزيج من مسحات القطن المعقم والهواء المضغوط.
- إلحاق إصابة وخز
- وضع وثيقة التجسيمي الحيوانات الصغيرة مع صاحب الحيوان (انظر المواد والمعدات).
- ضبط موضع المجهر مجهر بجانب أداة التجسيمي للتركيز على سطح الجمجمة الحيوان.
- باستخدام مجهر مجهر، تحديد موقع نقطة bregma على الجمجمة.
- تحديد الناحيةن الاهتمام باستخدام الإحداثيات التجسيمي.
ملاحظة: تجنب تلك المناطق من الفائدة التي تقع مباشرة على السفن القشرية السطحية. تدمير هذه يمكن أن تؤثر بشدة على تطور الصدمة. - وضع إبرة G 30 فوق المنطقة المختارة وبمناسبة الموقع المستهدف من قبل خدش سطح الجمجمة.
- حفر الجمجمة مع جميع الاحتياطات الممكنة لتجنب اتساع لا لزوم لها من المساحة العظام المتضررة. استخدام الحفر الجراحية بسرعة عالية (انظر المواد والمعدات) تحت المجهر. وقف الحفر إذا ظهر السائل في منطقة حفر.
- تلمس الجزء السفلي من حفر جيدا مع الإبرة.
- تراجع الإبرة بسلاسة في الدماغ (معدل الإدراج 5-10 ملم / دقيقة)، على عمق 0.5-2.0 ملم وفقا لإحداثيات موقع التطبيق وخز.
- إزالة الإبرة مباشرة بعد الوصول إلى العمق المطلوب (معدل التراجع 5-10 ملم / دقيقة) ويمسح الدم التي تظهر بعد وخز مع حشا الصغيرة (حد ذاتهاالمواد الإلكترونية والمعدات).
- أداء Microinjection من 100 ميكرومتر Sulforhodamine 101 أو مركب آخر من الاهتمام إلى موقع الآفة باستخدام مضخة محقنة مكروية (WPI) و 10 ميكرولتر حقنة هاميلتون التجمع مع الزجاج ماصة.
ملاحظة: أثناء إعداد ماصة الزجاج من الزجاج البورسليكات الشعرية، وشحذ طرف ليبلغ قطرها 10-20 ميكرون. - يبث 250-1،500 NL من الحل حقن بمعدل 2-5 NL / ثانية.
ملاحظة: اترك ماصة بعد نهاية التسريب لمدة 5 دقائق على الأقل في حمة الدماغ، ثم إزالته ببطء وبلطف لمنع تدفق الحل.
- حج القحف لنافذة الجمجمة المزمن
- حفر الجمجمة برفق وبعناية لجعل نافذة دائرة حول موقع الإصابة. استخدام قطرها 3-3.5 ملم من النافذة.
- تطبيق قطرة من العازلة القشرة (125 ملي مول كلوريد الصوديوم، 5 ملي بوكل، 10 ملي الجلوكوز، 10 ملي HEPES، 2 مم CaCl 2 و 2 ملي MgSO 4 في المقطر H 2 O) لتغطية واينداو.
- ضع ساترة الزجاج الجولة (# 1.5 سمك) على نافذة الجمجمة.
- إزالة الزائدة من العازلة القشرة حول ساترة.
- ختم حواف ساترة مع الغراء polyacrylic (انظر المواد والمعدات).
ملاحظة: تأكد من أن لا يتم تطبيق الغراء على السطح العلوي للساترة. إذا لوثت غطاء زجاجي مع الغراء، والانتظار حتى يتم لصقها على الزجاج ثابت في الجمجمة والغراء على سطح الزجاج يحصل الجافة، ثم إزالة بعناية الغراء تلويث مع microblade. - الانتظار لمدة 5 دقائق للسماح للالغراء تجف.
- باستخدام مسامير ارتفاع شريط الأذن، وضبط الموقف الرأس بحيث يمكن وضعها على حامل معدني.
- تنطبق على كمية صغيرة من الغراء polyacrylic على عصابة من حامل الصلب (انظر المواد والمعدات).
- الغراء حلقة حامل الصلب إلى ساترة الزجاج مع مقبض حامل معدني موجهة إلى الوراء.
- الانتظار لمدة 5 دقائق للسماح للالغراء تجف.
- Mالتاسع الاسمنت الأسنان (انظر المواد والمعدات) مع الغراء polyacrylic في طبق بيتري 3.5 سم (أو التناظرية) لتحقيق شروط لزج.
- ختم حدود النافذة في الجمجمة مع خليط الأسمنت الغراء + وتغطية السطح المعرض من الجمجمة مع نفس الخليط حتى الحدود الجلد.
- الانتظار لمدة 15 دقيقة للسماح للاسمنت + خليط الغراء تجف ثم قم بإزالة قضبان الأذن.
- أداء ثنائي الفوتون الإثارة المجهرية (TPEM) التصوير لمنطقة الفائدة ومنطقة التحكم كما هو موضح في البروتوكول 3.
- بعد التصوير، والسماح للحيوان للتعافي من التخدير على وسادة التدفئة والحفاظ عليه في قفص الفردية تحت الملاحظة حتى الشفاء التام. يمكن إعطاء الطعام الرطب لتسهيل المضغ والماء.
2. إصابات الدماغ من خلال التصوير ضعفت الجمجمة
- تخدير الحيوانات وإعداد مجال العملية
- تخدير الماوس ويكون جاهزا لصدمة الاستقراءكما هو موضح في الخطوة 1.1.
- ترقق الجمجمة وإلحاق إصابة وخز
- وضع وثيقة التجسيمي الحيوانات الصغيرة مع صاحب الحيوان (انظر المواد والمعدات).
- ضبط موضع المجهر مجهر بجانب أداة التجسيمي للتركيز على سطح الجمجمة الحيوان.
- تحديد موقع نقطة bregma على الجمجمة باستخدام مجهر مجهر، وتحديد منطقة الدماغ ليتم تصويرها على أساس الإحداثيات المجسم ووضع علامة عليه بواسطة الخدش.
ملاحظة: يجب أن لا يكون موجودا الجمجمة موقف رقيق فوق أو قريب الغرز الجمجمة، كما هو خطر على استقرار الجمجمة في تلك المناطق. علاوة على ذلك، السفن والسحايا تقع تحت الغرز الجمجمة القشرية أو سحائي كبير من المحتمل أن يسبب التحف التصوير. - وضع حامل معدني مغلف مع الغراء فوق منطقة الفائدة على جمجمة الحيوان، وتطبيق الضغط الخفيف والانتظار لمدة 5 دقائق حتى يتم لصقها على حامل معدني بحزم في الجمجمة. خلط الاسمنت الأسنان (انظر المواد والمعدات) مع الغراء polyacrylic في 3.5 سم طبق بتري (أو التناظرية) لتحقيق شروط لزج.
- ختم حدود حامل معدني مع خليط الأسمنت الغراء + وتغطية السطح المعرض من الجمجمة مع نفس الخليط حتى الحدود الجلد.
- الانتظار لمدة 15 دقيقة للسماح للخليط الأسمنت والغراء تجف.
- شطف المنطقة الجمجمة ضعيفة والأجزاء المحيطة بها من حامل معدني عدة مرات مع برنامج تلفزيوني، بحيث يتم غسلها بقايا الغراء nonpolymerized بعيدا.
ملاحظة: ومن الأهمية بمكان لضمان مرفق مستقرة من الجمجمة إلى حامل. وهذا يتيح استقرار الإعداد خلال التصوير. - باستخدام وضع التكبير عالية من المجهر مجهر، وإزالة الطبقات العليا من عظم الجمجمة مع سرعة عالية الحفر الصغيرة لإنشاء منطقة الجمجمة ضعيفة من 0.5-1.5 ملم ~ في القطر. استخدام الهواء المضغوط أثناء الحفر لإزالة حطام العظام. أداء intermittentl الحفرذ أثناء إجراء رقيق من أجل تجنب الاحتكاك الناجم عن ارتفاع درجة الحرارة. تبريد باستخدام مثقاب الحل درجة حرارة الغرفة وتطبيق دوري عازلة لمنطقة ضعيفة لامتصاص الحرارة.
ملاحظة: لتجنب إتلاف القشرة، لا حفر على مناطق واسعة (> 1.5 مم) وصولا الى طبقة رقيقة (<50 ميكرون).
ملاحظة: يتكون هيكل القوارض عظم الجمجمة اثنين من طبقات رقيقة من العظم المضغوط مفصولة طبقة سميكة من العظم الإسفنجي. تجاويف صغيرة من شكل العظام والدوائر متحدة المركز نفيق الاسفنجية، والتي تحتوي على الأوعية الدموية. استخدام microdrill لإزالة كل طبقة العظم المضغوط الخارجية ومعظم الطبقة الاسفنجية. اضطراب في الأوعية الدموية داخل العظم الإسفنجي قد يتسبب في حدوث نزيف. استخدام الارقاء الكولاجين الاسفنج لوقف هذا النزيف. - استخدام الجيل الثاني التوافقي (SHG) التصوير لدراسة ما إذا كان قد تم إزالة الغالبية العظمى من العظم الإسفنجي. كن حذرا لتجنب ترقق المفرطة، تأكد من أن العظام المتبقية هو الicker من 50 ميكرومتر في هذه المرحلة من التحضير.
- وضع قطرة من العازلة الدافئة (35-37 درجة مئوية) على رأس المنطقة ضعيفة. استخدام شفرة المجهرية أو مايكرو التشطيب بر لمزيد من إزالة طبقات العظم وتشكيل منطقة السلس لل~ 700 ميكرون في القطر مع سمك العظام من ~ 20 ميكرون. خلال هذه الخطوة، فإنه من المفيد لأداء التصوير SHG المتكررة بانتظام وقياس سماكة العظام.
- أداء التصوير TPEM للمنطقة من الفائدة ومنطقة التحكم.
- ضبط الموقف الرأس باستخدام مسامير ارتفاع شريط الأذن في مثل هذه الطريقة التي ضعفت يتم وضع المنطقة بدقة أفقيا. ضع إبرة فوق المنطقة ضعيفة وتأكد من أنه لا توجد السفن الكبيرة تحت الموقع المستهدف.
- جعل الآفة عن طريق غمس الإبرة في الدماغ، إلى عمق 0.5-2.0 مم من سطح الجمجمة ضعيفة وفقا لإحداثيات موقع التطبيق وخز.
- إزالة الإبرة وقمع نزيف تظهر بعد رانه إصابات الدماغ الحادة مع حشا مرقئ (انظر المواد والمعدات). الانتظار حتى تجلط الدم وشكل سفينة نبض في موقع الإصابة يتوقف.
- أداء Microinjection من 100 ميكرومتر Sulforhodamine 101 أو مركب آخر من الاهتمام إلى موقع الآفة، كما هو موضح أعلاه في القسم 1.2.10.
- أداء التصوير TPEM لمراقبة تطور الإصابة والانتعاش كما هو موضح في البروتوكول 3.
- بعد التصوير، والسماح للحيوان ليستعيد وعيه من التخدير على وسادة التدفئة. لا تترك الحيوان غير المراقب وإعادته إلى القفص وطنه إلا بعد التعافي البدني الكامل.
3. التصوير
- وضع الحيوان تحت المجهر عن طريق ربط حامل معدني للإطار العرف بنيت.
- التصوير، واستخدام مثل FV1000MPE المجهر ثنائي الفوتون مجهزة ماي تاي DeepSee الليزر وXLPLN 25X NA 1.05 هدف الغمر بالماء الأمثل لفي الجسم الحي اثنين الفوتونالتصوير.
- تحديد موقع الآفة تحت المجهر باستخدام الوضع مضان واسعة المجال. استخدام مرشحات تمرير طويلة لتصور الأوعية الدموية في الدماغ وتحديد المنطقة السيطرة وفقا للنمط لوحظ من الأوعية الدموية.
- لصورة الجيل الثاني التوافقي (SHG) إشارة، ضبط ليزر الفيمتو ثانية لطول الموجة 800 نانومتر وجمع الضوء المنبعث باستخدام 380-410 نانومتر تصفية الالتفافية. للتصوير مضان، استخدم مرشح تمرير النطاق (515-560 نانومتر) لجمع الضوء المنبعث، وتستخدم موجات التالية لإثارة مضان: GFP-860 نانومتر، YFP-950 نانومتر.
- استخدام البرمجيات Fluoview لاقتناء الصورة.
- متجر إحداثيات كل العائد على الاستثمار للتصوير المتكررة لاحقة. صورة نفس رويس مع مرور الوقت، وضبط الإحداثيات في كل مرة لتحقيق أقصى قدر من التداخل الصورة.
- تحليل الصور مع البرنامج المناسب (على سبيل المثال. يماغيج). وقد أجريت عمليات إعادة البناء المقدمة هنا باستخدام البرمجيات Imaris.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لدينا اثنين الأمثل الإجراءات العملية: 1) نافذة الجمجمة المزمن و2) ترقق الجمجمة، لتصوير الدماغ ما بعد الصدمة في الفئران المعدلة وراثيا. ويرد تخطيطيا من التحضيرات تجريبية في الشكل 1. يتم تطبيق وخز الصدمة بواسطة إبرة الصلب من 0.3 مم OD (30 G) إلى حفر (1A الشكل) أيضا. A الجمجمة إعداد إطار ناجحة يسمح التصوير في أعماق تصل إلى 650 ميكرون تحت سطح حنوني (الشكل 1B)، في حين أن الجمجمة رقيق يميل إلى فرض حدود حوالي 300 ميكرون (الشكل 1C)، كما هو موضح في إعادة الإعمار 3D من Thy1-YFP- H الماوس الخلايا العصبية الهرمية القشرية.
نتائج الصدمة وخز في القضاء على التشعبات وتدمير شبكات الشعرية في مجلد ورقابة من قشرة الدماغ. خلال اليومين الأولين، زادت المساحة الآفة والصدمة التي يسببها blebbing التغصنات وتشكيل شجيري تراجع بulbs في المناطق perilesion، كما لوحظ في الجسم الحي باستخدام multiphoton المجهري (الشكل 2).
أجرينا الجمجمة رقيق لتفعيل الصورة وهجرة الخلايا الدبقية الصغيرة في الفئران CX3CR1-EGFP مباشرة بعد الإصابة (الشكل 3A). التصوير مجموعات المساعدة الذاتية تقدم أداة قيمة لتحديد بدقة موقع الإصابة (الشكل 3B). يتم إثراء جزيئات المصفوفة خارج الخلية التي تنتج إشارات مجموعات المساعدة الذاتية إلى حد كبير في حمة الدماغ على الصدمة وخز. أولا، يتم استرداد العمليات دبقية يرام، ثم خلايا دبقية الهجرة إلى حدود موقع الإصابة (الشكل 3A).
لتقدير الإصابات المحتملة الناجمة عن الزجاج رقيقة ماصة الإدراج والتسليم من الصبغة، ونحن أداء في الجسم الحي اثنين من الفوتون المجهري التجارب مع حقن مكروي Sulforhodamine 101 في Thy1-YFP-H الفئران دون صدمات الدماغ. صور ممثل هو مبين في الشكل 4 تثبت ميلموقع croinjection 3 ساعة بعد الحقن. يمكن أن ينظر إلى أثر للماصة الإدراج في السحايا الدماغ تصور من قبل مجموعات المساعدة الذاتية (الشكل 4A). وصفت الخلايا النجمية مع Sulphorhodamine 101 قدم من قبل الحقن (الشكل 4B). التشعبات معربا عن YFP تحت Thy1 المروج لا تظهر أي علامات المورفولوجية للإصابة مثل blebbing أو تراجع المصابيح (الشكل 4 C).
الشكل 1. طريقة إصابات الدماغ الحادة في تركيبة مع نافذة الجمجمة أو مستحضرات الجمجمة رقيقة جنبا إلى جنب مع المجراة اثنين من الفوتون المجهري. A. وخز الصدمة بواسطة إبرة الصلب 0.3MM OD (30G) تطبيقها على حفر بئر. هي مغمورة الإبرة لفترة وجيزة في الدماغ 0.5-2 ملم العميقة من قاع البئر. B، C (C). د. عرض حقل مشرق في الأوعية الدموية السطحية من خلال زجاج النافذة مباشرة بعد إصابات الدماغ الحادة. E. ضعفت الجمجمة قبل تطبيق الاصابة. المنطقة المختارة من الاهتمام (إطار أبيض) وموقع التطبيق وخز (دائرة حمراء). وينبغي تصوير منطقة مختلفة (الإطار الأحمر) في المنطقة ضعيفة لرصد الآثار الناجمة عن عملية جراحية ممكن.
الشكل 2. مثال على التصوير multiphoton طولية التنمية الصدمة الدماغ من خلال الجمجمة ضعيفة. A. لعرض p من موقع الإصابة محاطة التشعبات YFP المسمى الخلايا العصبية القشرية 20 دقيقة بعد الصدمة إيقاع، وتصويرها من خلال إعداد الجمجمة ضعيفة. B. عرض تضخيم للمنطقة المذكورة في لوحة A. C. نفس المنطقة من الدماغ كما في B، reimaged بعد 5 أيام الصدمة. ويرد التغصنات blebbing مع السهام البيضاء، والمصابيح تراجع شجيري - مع السهام الحمراء.
الرقم 3. تم الحصول على أمثلة من رصد الالتهاب وتنشيط الخلايا الدبقية خلال تطوير الصدمة الدماغ باستخدام علامات مختلفة مناسبة لفي الجسم الحي التصوير multiphoton البروتينات مثل الفلورسنت، والأصباغ، والثانية إشارة الجيل التوافقي. الصور 3 ساعة بعد إصابات الدماغ.
الشكل 4. دراسة تأثير الأنسجة التي أدلى بها حقن حل عن طريق micropipette الزجاج. A. تتبع (شوسفل مع خط متقطع) في مجموعات المساعدة الذاتية تصور السحايا الدماغ 3 ساعة بعد الحقن. B. الخلايا النجمية المسمى مع sulphorhodamine التي أدخلتها الحقن. C. التشعبات معربا عن YFP تحت Thy1 المروج. د. الصورة مجتمعة من A (SHG - الرمادي)، B (الخلايا النجمية - أحمر)، C (التشعبات العصبية - أصفر).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الصدمة الدماغ هو، لا يمكن التنبؤ بها الحدث المفاجئ. هنا، نحن تصف نموذج الحيوان الذي يستنسخ مجموعة من التغيرات المرضية التي لوحظت في المرضى من البشر بعد إصابات الدماغ مثل التنكس العصبي، والقضاء على التشعبات، وذمة الدماغ، ندبة الدبقية، نزيف في قشرة الدماغ إلى جانب نزيف تحت العنكبوتية التنسيق وزيادة نفاذية حاجز الدم في الدماغ. لدراسة المرضية الابتدائية والثانوية، وكذلك الانتعاش بعد الصدمة، وجنبا إلى جنب مع هذا النموذج إصابة طولية في التصور المجراة من الخلايا العصبية الدقيقة والهياكل الدبقية. واستخدمت خطوط الماوس المعدلة وراثيا التي تعبر عن البروتينات الفلورية في الخلايا العصبية (Thy1-YFP-H) 7، النجمية (GFAP-EGFP) 8، أو الخلايا الدبقية الصغيرة (CX3CR1-EGFP) 9. بالإضافة إلى ذلك، استخدمنا الجيل الثاني التوافقي (SHG) التصوير ونجمية التحميل مع Sulfarhodamine 101 10.
نموذج الموصوفة هنا يلخص بينينوع trating من إصابات الدماغ. وبالتالي وجود قيود على النموذج الحالي هو أنه لا يوفر المعلومات حول آليات إصابة في الرأس المغلقة. مؤخرا السيف والمؤلفون المشاركون عن نتائج التصوير multiphoton على سلوك الخلية في القشرة pericontusional 6. مع الأخذ بعين الاعتبار أن أغلقت إصابة في الرأس هو حالة طبية أكثر تواترا، والأسلوب المنهجي ذكرت من قبل المؤلفين واعدة للغاية لتكمل طرق البحث التقليدية في مجال الصدمات النفسية تؤثر في الدماغ 11.
استخدمنا كل من النافذة في الجمجمة المزمنة 12 والجمجمة ترقق 13 الاستعدادات لدراسة سلوك الخلية في ظل ظروف ما بعد الصدمة في الدماغ الحية. كلتا الطريقتين لها مزايا وقيود معينة. وبالتالي، يوفر نافذة الجمجمة المزمن قرار أفضل وأعمق اختراق البصرية في أنسجة المخ والراحة للجلسات التصوير متعددة. على العكس، هو أقل احتمالا للحث على التهاب في الجمجمة ال ترققموقع التصوير الإلكترونية، وربما الأهم من ذلك، فإنه يسمح للتطبيقات المتكررة من الأدوية والأصباغ. يتم إعطاء بعض الأمثلة من وكلاء الدوائية ليتم تطبيقها في هذا النوع من التجارب في الجدول 1.
| نوع الوكيل | وكيل حقن | مجالات البحث البيولوجيا / الصيدلة |
| المضادة للالتهابات | السيكلوسبورين A | إصابات في الدماغ، والضرر الثانوي، تنكس عصبي |
| السموم | سم الأسماك الرباعية الأسنان | المصرف التجاري العراقي - الضرر الثانوي، excytotoxicity |
| Bicuculline | المصرف التجاري العراقي - الضرر الثانوي، وكلوريد التوازن | |
| مثبطات مسارات الإشارات | PD98059 (MAPKK المانع) | مما يشير آليات الالتهاب، والضرر الثانوي، موت الخلايا ما بعد الصدمة، تنكس عصبي والتجديد |
| SU6656 (الأسرة SRC المانع كيناز) | ||
| عوامل عصبية | الدماغ المستمدة عامل التغذية العصبية، BDNF | المصرف التجاري العراقي - بقاء الخلايا العصبية بعد الإصابة، العصبية في تلف في الدماغ ما بعد الصدمة الثانوية |
| الفيروسات | ناقلات lentiviral للتعبير البروتين | الآليات الجزيئية من تنكس عصبي ما بعد الصدمة والتجديد، ووضع العلامات التفضيلية من أنواع الخلايا في الدماغ التالفة في الجسم الحي التصوير |
| ناقلات الفيروسة الغدانية للتعبير البروتين | ||
| كا 2 + المؤشرات الفلورسنت | FLUO-2، 4 | مما يشير آليات التهاب ما بعد الصدمة، موت الخلايا، والهجرة الخلية، ومحور عصبي / تجديد شجيري |
الجدول 1. الوكلاء والأصباغ الدوائية للحقن القشرية في نموذج إصابة وخز.
وهناك مجموعة واسعة من الأحداث البيوكيميائية التي تعتبر مهمة للغاية في ظل الظروف الفسيولوجية والمرضية يمكن بحث مع مثبطات الكيميائية، المؤشرات الفلورسنت والبروتين متحولة أدخلت عبر بنيات الفيروسية. مزايا لاختيار نافذة زمنية معينة تقدمها إعداد الجمجمة ترقق قد تكون ذات صلة للغاية لتلك الدراسات.
في هذه الدراسة، كنا الثانية إشارة الجيل التوافقي لتحديد موقع الإصابة. بدلا من ذلك، يمكن الإشارة إلى حدود موقع الإصابة قبل نشرها ضعيفة صبغة الفلورسنت، على سبيل المثال الوزن الجزيئي ديكستران المكورات الفلورسنت عالية (2000000 دالتون).
في الآونة الأخيرة، وقد استخدمت شيفر وزملاؤه 14 إعداد المزمنةمع نافذة الجمجمة reopenable للتسليم المتكررة من الأصباغ الفلورية إلى الماوس القشرة. فمن المرجح أن إعادة فتح الجمجمة نافذة قد تؤثر سلبا على الشفافية أنسجة المخ. علاوة على ذلك، فإنه من الصعب التنبؤ بمسار وقت الالتهاب الناجم عن اعادة فتح، والتي قد تؤثر على إعادة نمو النسيج الضام.
واحد الميزة الرئيسية لإعداد الجمجمة ضعيفة هو احتمال لتسليم المركبات العلاجية (وغيرها من المواد التي تتطلب الحقن الموضعية في أنسجة المخ) عدة مرات خلال التقدم من الصدمات النفسية، ودون تعقيد التحف (على سبيل المثال دون نافذة الجمجمة إعادة فتح).
إذا كان المطلوب تسليم مجمع المتكررة مباشرة إلى موقع الإصابة، ينبغي للمرء النظر في وسائل خاصة لمنع الجمجمة الجافة التدريجي والعدوى البكتيرية. وبالتالي، والحفاظ على منطقة الرأس تعمل تحت ظروف معقمة وتطبيق المضادات الحيوية (مثل انروفلوكساسين) ويوصى. للحفاظ على رhinned المنطقة الجمجمة من التجفيف، وملء حامل معدني مع 1.5٪ الاغاروز وتغطية ذلك مع الزجاج الجولة ساترة. في معظم الحالات هذا سوف يسمح الحفاظ على نفس الشفافية أو الجمجمة ضعفت على مدى فترة تصل إلى 10 يوما. بعض إضافية ينبغي أن تؤخذ إذا تم التخطيط جلسات التصوير متعددة في إعداد الجمجمة ضعيفة على مدى فترة طويلة من الزمن. مباشرة قبل كل دورة التصوير، وإزالة بلطف النسيج الضام التي شكلت حديثا من المنطقة ضعفت باستخدام شفرة المجهرية. استخدام التصوير TPEM من مجموعات المساعدة الذاتية للتحقق من جودة الصورة وقياس سماكة العظام. إعادة نمو الأنسجة قد تعرض للخطر عمق الاختراق والسبب عدم وضوح الصورة يرافقه زيادة في مضان الخلفية. تحديث الجمجمة رقيق بلطف مع شفرة المجهرية لاستعادة جودة التصوير عالية.
في تلك الحالات التي لا تتطلب الوصول المباشر إلى موقع الإصابة، ونحن نوصي بشدة تغطي المنطقة ضعفت من الجمجمة مع coversli الزجاجع كما هو موضح في ورقة على مصقول وعززت ضعيفة إعداد الجمجمة بواسطة كلاينفيلد وزملاؤه 15. ويمكن القيام بذلك عن طريق استخدام الإجراء الاختياري التالية. وضع قطرة صغيرة من الاغاروز (1.5٪) على المنطقة الجمجمة ضعيفة، وانتظر حتى يصبح هلام، وإزالة جميع الاغاروز لا لزوم لها، أي ترك الأمر فقط على موقع الإصابة. الاغاروز يجب حماية الموقع من الإصابة المؤثرات الخارجية. تجفيف منطقة الجمجمة ضعيفة باستخدام الهواء المضغوط. انخفاض كمية صغيرة من الغراء polyacrylic على قطعة صغيرة من # 0 ساترة ووضعه على منطقة الجمجمة ضعيفة. الغراء polyacrylic يمنع إعادة نمو العظام والأنسجة الضامة، وبالتالي الحفاظ على الجمجمة ضعيفة تحت النافذة الحفاظ عليها.
مزيج من هذه الإجراءات يتيح دراسة عمليات ما بعد الصدمة الحادة والمزمنة، وتقديم الأدوية موضعيا أو جهازيا ومراقبة مباشرة من آثار العلاج. استخدام خطوط الماوس المعدلة وراثيا المزدوج أو الثلاثي يمكن أن تكون مفيدة أيضا، الجسيماتcularly للتصوير في وقت واحد من عمليات ما بعد الصدمة متعددة، مثل تشكيل ندبة الدبقية والخلايا العصبية فرع إعادة النمو. نتوقع نماذجنا من إصابات الدماغ الحادة درس مع حيوي داخلي اثنين من الفوتون المجهري لإثبات مثمرة للاختبار المرشح المخدرات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
والكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
نحن ممتنون للغاية للدكتور فرانك كيرشوف لتوفير GFAP-EGFP وسلالات الفئران CX3CR1-EGFP. وأيد العمل من المنح المقدمة من مركز الحراك الدولي من فنلندا، تيكيس، كلية الدراسات العليا الفنلندية العلوم العصبية (FGSN) وأكاديمية فنلندا.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2A-sa dumb Tweezers, 115 mm | XYtronic | XY-2A-SA | |
| 30 G ½ in needle | BD | REF 304000 | |
| Animal trimmer, shaving machine | Aesculap | Isis GT420 | |
| Binocular Microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Biological Temperature Controller with stainless steel heating pad | Supertech | TMP-5b | |
| Blunt microsurgical blade | BD | REF 374769 | |
| Borosilicate tube with filament | Sutter Instruments | BF120-69-10 | For glass pipette production |
| Carprofene | Pfizer | Rimadyl vet | |
| Chlorhexidine digluconate | Sigma | C9394 | |
| Dental cement | DrguDent, Dentsply | REF 640 200 271 | |
| Dexamethasone | FaunaPharma | Rapidexon vet | |
| Disposable drills | Meisinger | HP 310 104 001 001 008 | |
| Dulbeco’s PBS 10x | Sigma | D1408 | |
| Dumont #5 forceps, 110 mm | FST | 91150-20 | |
| Ealing microelectrode puller | Ealing | 50-2013 | Vertical puller for glass pipette production |
| Eye ointment | Novartis | Viscotears | |
| Foredom drill control | Foredom | FM3545 | |
| Foredom micromotor handpiece | Foredom | MH-145 | |
| Gas anesthesia platform for mice | Stoelting | 50264 | Assembled on stereotaxic instrument |
| Hemostasis Collagen Sponge | Avitene, Ultrafoam BARD | Ref 1050050 | |
| Imaris | Bitplane | ||
| Ketamine | Intervet | Ketaminol vet | |
| Mai Tai DeepSee laser | Spectra-Physics | ||
| Metal holder | Neurotar | ||
| Microdressing forceps, 105 mm | Aesculap | BD302R | |
| Microfil | WPI | MF34G-5 | Micro syringe filling capillaries |
| Mineral oil | Sigma | M8410 | |
| Multiphoton Laser Scanning Microscope | Olympus | FV1000MPE | |
| NanoFil Syringe 10 μl | WPI | NANOFIL | Hamilton syringe |
| Nonwoven swabs 5 x 5 | Molnlycke Health Care | Mesoft | Surgical tampons |
| Polyacrylic glue | Henkel | Loctite 401 | |
| Round glass coverslip | Electron Microscopy Sciences | ||
| 1.5 thickness | |||
| Small animal stereotaxic instrument | David Kopf Instruments | 900 | |
| Stoelting mouse and neonatal rat adaptor | Stoelting | 51625 | Assembled on stereotaxic instrument. |
| Student iris scissors, straight 11.5 cm | FST | 91460-11 | |
| Sulforhodamine 101 | Molecular Probes | S-359 | |
| UMP3 microsyringe pump and Micro 4 microsyringe pump controller | WPI | UMP3-1 | Microinjector and controller |
| Xylazine | Bayer Health Care | Rompun vet |
References
- Lighthall, J. W. Controlled cortical impact: A new experimental brain injury model. J. Neurotrauma. 5 (1), 1-15 (1988).
- Lindgren, S., Rinder, L.
- Shreiber, D. I., et al. Experimental investigation of cerebral contusion: histopathological and immunohistochemical evaluation of dynamic cortical deformation. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 58 (2), 153-164 (1999).
- Feeney, D. M., Boyeson, M. G., Linn, R. T., Murray, H. M., Dail, W. G. Responses to cortical injury: I. Methodology and local effects of contusions in the rat. Brain Res. 211 (1), 67-77 (1981).
- Bardehle, S., et al. Live imaging of astrocyte responses to acute injury reveals selective juxtavascular proliferation. Nat. Neurosci. 16 (5), 580-586 (2013).
- Sword, J., Masuda, T., Croom, D., Kirov, S. A. Evolution of neuronal and astroglial disruption in the peri-contusional cortex of mice revealed by in vivo two-photon imaging. Brain. 136 (5), 1446-1461 (2013).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Nolte, C., et al. GFAP promoter-controlled EGFP-expressing transgenic mice: a tool to visualize astrocytes and astrogliosis in living brain tissue. Glia. 33 (1), 72-86 (2001).
- Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol. Cell. Biol. 20 (11), 4106-4114 (2000).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Kerr, J. N. D., Helmchen, F. Sulforhodamine 101 as a specific marker of astroglia in the neocortex in vivo. Nat. Methods. 1 (1), 31-37 (2004).
- Carré, E., et al. Technical aspects of an impact acceleration traumatic brain injury rat model with potential suitability for both microdialysis and PtiO2 monitoring. J. Neurosci. Methods. 140, 23-28 (2004).
- Holtmaat, A., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat. Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. B. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nat. Protoc. 5, 201-208 (2010).
- Cianchetti, F. A., Kim, D. H., Dimiduk, S., Nishimura, N., Schaffer, C. B. Stimulus-evoked calcium transients in somatosensory cortex are temporarily inhibited by a nearby microhemorrhage. PloS one. 8 (5), (2013).
- Shih, A. Y., Mateo, C., Drew, P. J., Tsai, P. S., Kleinfeld, D. A polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain. J. Vis. Exp. 61, (2012).
