Summary
急性脳外傷は現在まで適切な治療を持っていない重傷です。多光子顕微鏡は、縦方向に急性脳外傷開発のプロセスを研究し、げっ歯類における治療的戦略をプロービングできます。脳のin vivo二光子イメージングに師事急性脳外傷の二つのモデルは、このプロトコルで実証されています。
Abstract
急性脳外傷は多くの場合、異なる事故頭部損傷に起因して、人口のかなりの部分に影響を与えますが、そのための有効な治療法がありません。現在使用されている動物モデルの制限は、病理メカニズムの理解を妨げる。多光子顕微鏡は、長手方向の生理学的および病理学的条件の下で、無傷の動物の脳内の細胞や組織を研究できます。ここでは、外傷後の条件下で脳細胞挙動の二光子イメージングによって研究急性脳損傷の2つのモデルを記載している。選択された脳領域は、脳実質内の制御幅と深さの外傷を生成するために鋭利な針でけがをされている。我々の方法は、同時薬物アプリケーションと組み合わせることができ、注射針で刺す定位を使用しています。我々は、この方法は、哺乳動物の脳における急性の外傷の病態生理学的影響の細胞機構を研究するための高度なツールとして使用することができることを提案する
Introduction
急性脳損傷は、自動車のクラッシュにおける損傷の高い発生率と有意な公衆衛生問題である落下又は暴行、およびその後の慢性障害の有病率が高い。脳損傷の治療に対する治療的アプローチは、このように、病院前の手術や救命医療の有効性を制限する、完全に症候性のまま。これは脳損傷の社会的·経済的影響が特に深刻になる。様々な理由のために、臨床試験のほとんどは、新規な治療アプローチを使用して脳損傷後の回復の改善を示すことができなかった。
動物モデルは、薬効が脳損傷を有する患者において予測することができるステージに向けて新たな治療戦略を開発するために重要である。現時点では、頭部外傷のいくつかの十分に確立された動物モデルは、制御された皮質衝撃1は、流体パーカッション傷害2、動的変形皮質3、体重低下を含む、存在する4とフォト損傷5。実験モデルの数は、頭部外傷に関連した病理学の特定の形態学、分子生物学および行動の側面を研究するために使用されてきた。しかし、単一の動物モデルは、新たな治療戦略の検証において完全に成功していない。脳損傷の、信頼性の高い再現性及び制御された動物モデルの開発は、複雑な病理学的プロセスを評価する必要がある。
最新の顕微鏡イメージング技術と遺伝的に符号化された蛍光レポーターの新規な組み合わせは、一次損傷、二次的損傷、および再生の広がり、原発傷害を含む脳損傷のすべてのフェーズを、調査する前例のない機会を提供しています。具体的には、in vivoでの 2光子顕微鏡は、げっ歯類の脳の深部皮質層の細胞でも細胞内構造をリアルタイムに可視化を可能にする独自の非線形光学技術です。細胞やORGAにはいくつかの種類Nelles社は、異なる蛍光マーカーを組み合わせることによって同時に撮像することができる。この強力なツールを使用して、我々は外傷後の条件での脳の生活の動的な形態学的および機能的変化を視覚化することができます。脳損傷の研究にin vivoでの 2光子顕微鏡の利点は、最近キーロフと同僚6によって実証された。軽度の焦点皮質挫傷モデルを使用して、これらの著者は、pericontusional皮質の急性樹状損傷がローカルの血流の減少によりゲート制御されることを示した。さらに、それらは挫傷部位の周囲の代謝的に損なわ皮質をさらに脱分極拡散によって損傷されることを実証した。この二次的な損傷は、外傷性脳損傷の影響がより深刻なこと、シナプス回路に影響を与えます。
ここでは、地元の頭脳のための高度なモデルとして、同時局所薬物のアプリケーションと組み合わせることができる注射針で刺す定位の方法を提案する傷害およびin vivoで哺乳動物の脳内の急性外傷の病態生理学的影響を研究するためのツールとして。
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Protocol
ここで紹介するすべての手順は、動物のケア（動物実験2006分の62にフィンランドACT）のためのローカルのガイダンスに従って行った。動物ライセンス（ESAVI/2857/04.10.03/2012）は、地方自治体（ELÄINKOELAUTAKUNTA-ELLA）から入手した。 1-3ヶ月齢の成体マウス、体重24〜38グラムは、認定大学の動物施設内の個々のケージで飼育し、餌と水を自由に与えた。
1。頭蓋窓を通して脳損傷イメージング
- 動物を麻酔し、演算フィールドを調製する
- フィルター滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、pH7.4中に溶解したケタミン（ケタラール、80ミリグラム/ kg）およびキシラジン（ロンプン、10 mg / kg）の混合物の腹腔内注射によりマウスを麻酔。麻酔の深さを確認するために、マウスの反射神経を定期的に（尾とつま先のピンチプローブ）を確認してください。適切なときに適切な麻酔を維持するために、投与量を増加させるがoverdを避けるOSE。
- 麻酔からの回復後に手術、撮像セッションと最初の1時間加熱パッドを使用して37.0℃で動物を維持する。
- 乾燥からマウスの目を保護するために、目の潤滑剤を塗布。
- 炎症や脳浮腫を軽減するために皮下注射することにより、デキサメタゾン（Rapidexon獣医、2 mg / kgの）を管理。
- 前または直後に手術後30分まで（Ketoprophene腹腔例えば）鎮痛剤を投与する。動物はこのような、移動飲食、または体重減少に難色として痛みの症状を示す場合、流涎、立毛、または異常な呼吸は、手術後、鎮痛剤の注射を繰り返し鳴ります。
- シェービングマシン（材料および装置を参照）、マウスの頭を剃る。ウィスカーの損傷を防ぐ。
- 剃毛領域をきれいにする70％エタノール溶液でマウスの頭部の皮膚を処置する。
- 外科はさみを使用して（材料とを参照してください。機器）と鉗子（材料および装置を参照）、額に耳の間の中間線から皮膚を切った。
- 優しく鈍い顕微刃で頭蓋骨に付着した結合組織を削り取る。
- 横皮膚の境界線をスライドさせて、わずかに頭と皮膚固定用の頭蓋骨の聴覚オリフィスに耳バーを引き出します。
- 次いで、滅菌綿棒、圧縮空気の組み合わせを使用して、頭蓋骨の表面を乾燥、滅菌PBSで頭蓋骨をきれいにし、0.5％グルコン酸クロルヘキシジンでマウスの頭に手術部位を治療。
- 刺す傷害の刑罰
- 位置動物ホルダーと小動物定位装置（材料および装置を参照）。
- 動物の頭蓋骨の表面に集中する次の定位固定装置に双眼顕微鏡の位置を調整します。
- 双眼顕微鏡を用いて、頭蓋骨にブレグマポイントを探します。
- レジオを識別定位座標を使用して、近隣のnである。
注：直接表面的な皮質血管の上に配置された関心のある分野を避けてください。これらの破壊は強く外傷の進行に影響を与えることができる。 - 選択した領域の上の30のGの針を配置し、頭蓋骨の表面を引っ掻いて標的部位をマーク。
- 影響を受けた骨の表面領域の不要な拡大を避けるために、すべての可能な予防措置で頭蓋骨を開けます。顕微鏡下での高速外科ドリルを（材料および装置を参照）を使用します。液体が掘削領域に表示された場合に掘削を停止します。
- 針で掘削井戸の底に触れてください。
- プリック適用部位の座標に応じて0.5〜2.0ミリメートルの深さまで、脳（挿入率5〜10ミリメートル/分）にスムーズに針を浸します。
- 所望の深さに達した後、直ちに針を取り外します（後退速度5〜10ミリメートル/分）と小さなタンポンを刺す後に現れる血を拭く（SEE資機材）。
- マイクロシリンジポンプ（WPI）を使用して病変部位に100μMのローダミン101または関心のある他の化合物のマイクロインジェクションを行い、10μlのハミルトンシリンジをガラスピペットで組み立てる。
NOTE：ホウケイ酸ガラス毛細管からガラスピペットの調製中に、10〜20ミクロンの直径に先端を鋭く。 - 2-5 NL /秒の速度で注射液の250-1,500 NLを吹き込む。
注：その後、ソリューションの流出を防ぐために、ゆっくりと慎重に取り外し、脳実質内に少なくとも5分間の注入の終了後に、ピペットのままにしておきます。
- 慢性頭蓋窓のため開頭
- 損傷部位の周りに円窓を作るためにゆっくりと、慎重に頭蓋骨を開けます。 3〜3.5ミリメートルの窓径を使用してください。
- w iを覆う皮質緩衝液滴（125mMのNaCl、5mMのKCl、10mMのグルコース、10mMのHEPES、蒸留H 2 O中2mMのCaCl 2および2mMのMgSO 4）し適用する表示ウインドウ。
- 頭蓋窓の丸いガラスカバースリップ（＃1.5厚さ）の位置にします。
- カバーガラスの周りの皮質バッファの過剰を取り除く。
- アクリル接着剤でカバースリップの端をシール（材料および装置を参照）。
注：接着剤がカバーガラスの上面に塗布されていないことを確認してください。カバーガラスを接着剤で汚染されている場合は、慎重にマイクロブレードを汚染する接着剤を除去すると、ガラスを安定して頭蓋骨に接着されるまで待機し、ガラス表面に接着剤が乾く。 - 接着剤が枯渇せて5分間待ちます。
- 金属ホルダを配置することができるように、耳のバーの高さのネジを使用して、ヘッド位置を調整する。
- （材料および装置を参照）スチールホルダーのリングにアクリル接着剤の少量を適用します。
- 後方監督の金属ホルダーハンドルカバーガラスにスチールホルダーのリングを接着します。
- 接着剤が枯渇せて5分間待ちます。
- MIX歯科用セメントの粘性条件を達成するために3.5センチメートルペトリ皿（またはアナログ）にポリアクリル接着剤で（材料および機器を参照）。
- セメント+接着剤混合物を用いた頭蓋窓の境界をシールし、皮膚の国境まで同じ混合物で頭蓋骨の露出面をカバーしています。
- セメント+接着剤混合物が枯渇して、耳のバーを削除できるように15分間待ちます。
- それはプロトコル3に記載のように関心領域及び制御領域の二光子励起顕微鏡（テンソル積展開法）撮影を行う。
- イメージングの後、動物は加熱パッド上に麻酔から回復し、完全に回復するまで観察下に個々のケージにそれを維持することができます。ウェットフードは、咀嚼や水和を促進するために与えることができます。
2。間伐頭蓋骨を通して脳損傷イメージング
- 動物Anaesthetizingおよび演算フィールドを調製する
- マウスを麻酔し、外傷誘導のために準備工程1.1に記載のように。
- 頭蓋骨の間伐やプリック損傷の刑罰
- 位置動物ホルダーと小動物定位器（材料および機器を参照）。
- 動物の頭蓋骨の表面に集中する次の定位固定装置に双眼顕微鏡の位置を調整します。
- 双眼顕微鏡を用いて頭蓋骨にブレグマ点の位置を確認し、定位座標に基づいて画像化される脳領域を特定し、引っ掻いてそれをマーク。
注：頭蓋骨の安定性は、それらの領域に侵害されたとしてスカル間伐位置は、頭蓋縫合の上または近くに配置するべきではありません。さらに、頭蓋骨縫合糸の下に位置する大皮質または髄膜血管および髄膜は、撮像アーチファクトを引き起こす可能性がある。 - 動物の頭蓋骨に関心のある領域上に接着剤で被覆された金属ホルダーを配置し、光の圧力を適用し、金属ホルダーがしっかりと頭蓋骨に接着されるまで5分間待ちます。 粘性の条件を達成するために3.5センチメートルペトリ皿（またはアナログ）にポリアクリル接着剤で（材料および機器を参照）歯科用セメントを混ぜる。
- セメント+接着剤混合物と金属ホルダーの境界をシールし、皮膚の国境まで同じ混合物で頭蓋骨の露出面をカバーしています。
- セメントや接着剤混合物が枯渇させるために15分間待ちます。
- 非重合接着剤の残りを洗い流すように、薄くなった頭蓋骨領域およびPBSで金属ホルダーの周囲の部分を数回すすいでください。
注意：ホルダーに頭蓋骨の安定した取り付けを確実にするために非常に重要です。これは、撮影時の準備の安定性を可能にします。 - 双眼顕微鏡の高倍率モードを使用して、直径〜0.5〜1.5ミリメートルの薄くなった頭蓋骨領域を作成するために、高速マイクロドリルで頭蓋骨の上層を除去します。骨の破片を除去するために掘削中に圧縮空気を使用しています。掘削intermittentlを行う摩擦によって誘発される過熱を避けるために、間伐手順中Y。室温溶液を用いてドリルビットを冷却し、定期的に熱を吸収するために薄型化エリアへのバッファを適用します。
注：皮質の損傷を回避するために、薄い層（<50ミクロン）まで大きな領域（> 1.5ミリメートル）上でドリルダウンしません。
注：齧歯類頭蓋骨構造は、海綿骨の厚い層で分離された緻密骨の2の薄層で構成されています。海綿骨の小さな空洞が血管を含有する、同心円および細管を形成する。外部コンパクト骨層とスポンジ状の層のほとんどの両方を削除するために、マイクロドリルを使用しています。海綿骨内の血管の破壊は、出血を引き起こすことがあります。この出血を止めるために止血コラーゲンスポンジを使用してください。 - 海綿骨の大部分が削除されたかどうか検査するために第二高調波発生（SHG）イメージングを使用してください。残りの骨が目であることを確認して、過度の薄肉化を避けるように注意してください準備のこの段階では50μmよりicker。
- 薄くなった領域の上に暖かいバッファー（35〜37℃）の低下を置く。さらに、骨の層を除去し、〜20μmの骨の厚さ、直径〜700ミクロンの円滑なエリアを形成するためにバールを仕上げ顕微ブレードやマイクロを使用してください。このステップの間に、反復的なSHGイメージングを行い、定期的に骨の厚さを測定するために有用である。
- 関心領域とコントロール領域のためのテンソル積展開法の撮影を行う。
- 領域は厳密に水平に配置されて薄くなったように耳のバーの高さのネジを使用してヘッド位置を調整します。薄くなった領域の上に針を置き、標的部位の下に大きな船がないことを確認してください。
- 薄くなった頭蓋骨表面から0.5〜2.0ミリメートルの深さに、脳内に針を浸し、プリック適用部位の座標に応じによって病巣を作る。
- 針を外し、T後に現れる出血を抑える彼は止血タンポン（材料および機器を参照）脳損傷、急性。損傷部位での血の塊の形と血管の脈動が停止するまで待ちます。
- セクション1.2.10で説明したように、100μMのローダミン101または病変部位への関心の別の化合物のマイクロインジェクションを実行します。
- プロトコル3に記載のように損傷の進行および回復をモニターするためにテンソル積展開法撮影を行う。
- イメージングの後、動物は加熱パッド上に麻酔から意識を回復することができます。無人の動物を残し、唯一のフル物理復旧後にそのホームケージに戻すことはありません。
3。イメージング
- カスタム構築されたフレームに金属ホルダーを装着することにより、顕微鏡下で動物を置きます。
- イメージングのために、 例えばマイタイDeepSeeのレーザーとのin vivo二光子用に最適化さXLPLN 25X 1.05 NAの水浸対物レンズを搭載したFV1000MPE 2光子顕微鏡を使用イメージング。
- 広視野蛍光モードを用いて顕微鏡下で病変部位を同定する。脳血管系を視覚化し、血管の観察されたパターンに従って制御領域を選択するためにロングパスフィルタを使用する。
- 画像の第二高調波発生（SHG）信号、同調波長800nmのフェムト秒レーザー380から410 nmのバイパス·フィルタを用いて放出された光を集める。蛍光イメージングのために、放射された光を収集するためにバンドパスフィルタ（515から560 nm）を使用し、以下の波長が蛍光励起するために使用される：GFP-860 nmのYFP-950ナノメートル。
- 画像取得のためのFLUOVIEWソフトウェアを使用してください。
- ストアは、その後の反復的なイメージングのためのすべてのROIの座標。時間をかけて画像と同じ関心領域を、座標の画像の重なりを最大化するたびに調整してください。
- 適切なソフトウェア（ 例えば 。のImageJ）を使用して画像を分析します。ここに提示再構成は、IMARISソフトウェアを用いて行った。
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Representative Results
トランスジェニックマウスにおける外傷後の脳の画像化のために、1）慢性頭蓋窓および2）頭蓋骨間伐：我々は2つの操作方法を最適化しています。実験的製剤の模式図が図1に示されている。の0.3mm OD（G 30）のスチール針による穿刺外傷性は、当穿孔（ 図1A）に印加される。 THY1-YFP-の三次元再構成で示されているように頭蓋骨間伐は、約300ミクロン（ 図1C）の制限を課す傾向にあるのに対し、成功した頭蓋窓の準備は、軟膜表面（ 図1B）、以下の650ミクロンまでの深さでイメージングを可能にするHマウス皮質錐体ニューロン。
大脳皮質の制御された量の樹状突起と毛細血管網の破壊の排除におけるプリック外傷の結果。最初の2日間、病変領域が増加し、外傷誘導性樹状突起のブレブ形成および樹状後退bの形成perilesion領域のulbs、 インビボ多光子顕微鏡で （ 図2）を用いて観察される。
私たちはすぐに損傷（ 図3A）後の画像の活性化とCX3CR1-EGFPマウスにおけるミクログリアの遊走に間伐頭蓋骨を行った。 SHGイメージングは、正確に損傷部位（ 図3B）を線引きする貴重なツールを提供しています。 SHG信号を生成する細胞外マトリックス分子が大きくプリック外傷で脳実質中に濃縮される。まず、細かいミクログリアのプロセスが取得され、その後、ミクログリア細胞が損傷部位（ 図3A）の境界に移動する。
薄いガラスピペット挿入や色素の送達によって誘発される可能性の傷害を推定するために、我々は脳損傷せずに、生体内で THY1-YFP-Hマウスにおけるローダミン101マイクロインジェクションと2光子顕微鏡の実験を行う。 図4に示されている代表的な画像は、MIを実証注入後croinjectionサイト3時間。ピペット挿入のトレースは、SHG（ 図4A）により可視化し、脳の髄膜に見ることができる。星状細胞は、注射（ 図4B）によって導入されたスルホローダミン101で標識される。 THY1プロモーター下でYFPを発現している樹状突起は、小疱形成または後退球根（ 図4のC）のような損傷のいずれかの形態学的兆候を示さない。
図1。頭蓋窓またはin vivoでの 2光子顕微鏡と組み合わせた薄い頭蓋骨標本との組み合わせで、急性脳損傷の方法。 0.3ミリメートルOD（30G）のスチール針による。外傷性プリックはよく掘削に適用。針を簡単にウェルの底部から深部脳0.5〜2ミリメートルに浸漬する。B、Cに （C）Dに示されている。すぐに急性脳損傷後のガラス窓から表在血管の明視野ビュー。E。傷害適用前に頭蓋骨を薄くし。インタレスト（白枠）の選択された地域やプリック適用部位（赤い円）。薄くなった領域の異なるエリア（赤枠）が可能、手術によって誘発される成果物を監視するために画像化されるべきである。
図2。薄くなった頭蓋骨を通して脳損傷の発達の縦多光子イメージングの例。 。へ20分外傷刑罰後の皮質ニューロンのYFPで標識された樹状突起に囲まれた損傷部位のPビュー、薄くなった頭蓋骨の準備を通して画像として。B。パネルAに概説領域の拡大図である。C。 Bのように、脳の同じ領域が、5日間外傷後の再イメージ。赤い矢印が付いた - デンドライト疱形成は白矢印、樹状後退電球で表示されます。
図3。 インビボ多光子イメージング、例えば蛍光タンパク質、色素、および第二高調波発生信号に適した別のマーカーを用いて脳損傷の開発中に監視炎症およびグリア活性化の例を示す。画像は、脳損傷後3時間を取得した。
図4。ガラスマイクロピペットを経由して溶液注入によって行われた組織への影響の検討。トレース（SHO脳の髄膜に注入後3時間を可視化SHGに破線でWN）。B。注入により導入されたローダミンで標識したアストロサイト。C。 THY1プロモーター下でYFPを発現している樹状突起。 開発 。 （SHG -グレー）の合成画像、B（アストロサイト-赤）、C（神経細胞の樹状突起-黄）。
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Discussion
脳外傷は突然の、予期できないイベントです。ここでは、このような神経変性、樹状突起の除去、脳浮腫、グリア性瘢痕、焦点くも膜下出血との透過性の増大と相まって、大脳皮質内の出血などの脳損傷後のヒト患者で観察病理学的変化のスペクトルを再現する動物モデルを記述する血液脳関門。プライマリとセカンダリの病因を研究だけでなく、外傷後の回復には、この損傷モデルは、細かい神経細胞とグリア構造物の生体内可視化の縦と一緒にした。トランスジェニックマウス系統は、（THY1-YFP-H）7、アストロサイト（GFAP-EGFP）8神経細胞で蛍光タンパク質を発現する、またはミクログリア（CX3CR1-EGFP）9が使用された。さらに、当社はSulfarhodamine 101 10と第二高調波発生（SHG）イメージングおよびアストロサイトのロードを使用していました。
ここで説明するモデルは、PENEを再現脳損傷のtratingタイプ。したがって、本モデルの制限は、閉鎖性頭部外傷のメカニズムについての情報を提供しないということです。最近剣と共著者pericontusional皮質6に細胞挙動に対する多光子イメージング結果を報告した。頭部外傷を閉じ考慮に入れては、筆者らが報告された方法論的アプローチは、インパクト脳外傷11の分野で伝統的な研究方法を補完する非常に有望であり、より頻繁に医療ケースです。
我々は慢性頭蓋窓12と脳生体内外傷後条件下で細胞の挙動を研究する13の準備を薄く頭蓋骨の両方を使用していました。どちらの方法も、いくつかの利点と制限があります。このように、慢性頭蓋窓解像度が向上し、脳組織と複数の画像化セッションの利便性をより深く、光の侵入を提供しています。逆に、頭蓋骨の薄型化が目に炎症を誘導しにくいおそらくより重要なことには、電子撮像部位、及び、それは薬剤および染料の繰返しアプリケーションを可能にする。実験のこのタイプで適用する薬理学的物質のいくつかの例を表1に示す。
| エージェントのタイプ | 注入剤 | 生物学/薬学研究の分野 |
| 抗炎症薬 | シクロスポリンA | 外傷性脳損傷、二次的な損傷、神経変性 |
| 毒素 | テトロドトキシン | TBI - 二次的損害、excytotoxicity |
| ビククリン | TBI - 二次的被害、塩化ホメオスタシス | |
| シグナル伝達経路の阻害剤 | PD98059（MAPKK阻害剤） | 炎症、二次的な損傷、外傷後の細胞死、神経変性および再生のシグナル伝達機構 |
| SU6656（Srcファミリーキナーゼ阻害剤） | ||
| 神経栄養因子 | 脳由来神経栄養因子、BDNF | TBI - 損傷後の神経細胞の生存、二次的外傷後脳損傷における神経保護 |
| ウイルス | タンパク質発現のためのレンチウイルスベクター | 外傷後の神経変性および再生の分子機構、 インビボイメージングのために損傷した脳における細胞型の特異的標識 |
| タンパク質発現のためのアデノウイルスベクター | ||
| のCa 2 +蛍光指示薬 | のFluo-2、4 | 外傷後の炎症のシグナル伝達機構、細胞死、細胞移動、軸索/樹状リハビリ |
表1。刺す傷害モデルにおける皮質注射のための薬理学的薬剤、染料。
生理学的および病理学的条件下で非常に重要な生化学的事象、広範囲の化学阻害剤、蛍光指示薬およびウイルス構築物を介して導入された変異体タンパク質でプローブすることができる。頭蓋骨の細線化の準備が提供する特定の時間帯を選択する利点は、これらの研究のために非常に関連するかもしれない。
本研究では、損傷部位を描写するために第二高調波発生信号を使用していました。代わりに、損傷部位の境界線は、インスタンス、高分子量デキストランの蛍光体（200万ダルトン）のために、弱い拡散する蛍光色素によって示すことができた。
最近では、シェーファーや同僚14は 、慢性の準備を使用していたマウスの大脳皮質への蛍光色素の反復的な送達のためのreopenable頭蓋窓付き。これは頭蓋窓の再開に悪影響脳組織の透過性に影響を及ぼし得る可能性がある。また、結合組織の再成長に影響を与える可能性が再び開く誘発性炎症、の経時変化を予測することは困難である。
薄くなった頭蓋骨の調製の1つの主な利点は、（再び開くことなく、 例えば、頭蓋窓）アーチファクトを複雑にすることなく、外傷の進行中に複数回（脳組織への局所注射を必要とする他の材料）治療化合物を送達する可能性である。
損傷部位への直接反復的な化合物送達が所望される場合、一方は頭蓋骨ドライアウトおよび細菌感染を予防するための特別な手段を考慮すべきである。このように、無菌状態と（例えばエンロフロキサシンなど）抗生物質の適用下で動作頭部領域を維持することが推奨されます。 Tを保持するには乾燥から頭蓋骨領域hinned、1.5％アガロースで金属ホルダーを記入し、丸いカバーガラスでそれをカバーしています。ほとんどの場合、これは最大10日の期間にわたって同じ透明または薄くなった頭蓋骨を維持することを可能にする。薄くなった頭蓋骨の準備中の複数の撮像セッションが長期間にわたって計画されている場合は、いくつかの追加を行うこと。すぐに各撮像セッションの前に、そっと顕微ブレードを使用して薄くなった領域から新たに形成された結合組織を除去します。画質と指標骨の厚さを確認するために、SHGのテンソル積展開法イメージングを使用してください。組織の再成長は、侵入深さとバックグラウンド蛍光の増加を伴う原因像ぶれを損なう可能性がある。高い画像品質を取り戻すために顕微ブレードで軽く間伐頭蓋骨を更新します。
損傷部位への直接アクセスを必要としないような場合、我々は非常にガラスcoversliで頭蓋骨の薄くなった領域をカバーするお勧めします研磨し、補強紙で説明したようにpがKleinfeldと同僚15によって頭蓋骨の準備を薄くし。これは、次の任意の手順を使用して行うことができる。 すなわち唯一の損傷部位でそれを残して、すべての不要なアガロースを削除する、がゲル状になるまで待って、薄くなった頭蓋骨領域上にアガロースの小滴（1.5％）を配置します。アガロースは、外部の影響から損傷部位を保護する必要があります。圧縮空気を使用して薄くなった頭蓋骨地域を乾かします。 ＃0カバーガラスの小片にアクリル接着剤の少量をドロップし、薄くなった頭蓋骨領域の上に置きます。アクリル接着剤は、このように保存され、ウィンドウの下に薄くなった頭蓋骨を維持し、骨および結合組織の再成長を防ぐことができます。
これらの手順の組み合わせは、急性および慢性の外傷後のプロセスを研究局所的または全身的に薬物を送達し、直接の治療効果をモニターすることを可能にする。二重または三重トランスジェニックマウス株の使用はまた、パーティション有益であり得るこのようなグリア瘢痕形成と神経細胞の枝の再成長など、複数の外傷後のプロセスの同時イメージングのためcularly。私たちは、急性脳損傷の我々のモデルは、薬剤候補のテストのための実りを証明するために生体2光子顕微鏡を用いて研究を期待しています。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
私たちは、GFAP-EGFPおよびCX3CR1-EGFPマウス系統を提供するための博士フランクキルヒホッフに深く感謝しています。作品は、フィンランドの国際的な流動のセンター、技術庁、神経科学のフィンランド大学院（FGSN）、フィンランドアカデミーからの補助金によって支えられている。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2A-sa dumb Tweezers, 115 mm | XYtronic | XY-2A-SA | |
| 30 G ½ in needle | BD | REF 304000 | |
| Animal trimmer, shaving machine | Aesculap | Isis GT420 | |
| Binocular Microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Biological Temperature Controller with stainless steel heating pad | Supertech | TMP-5b | |
| Blunt microsurgical blade | BD | REF 374769 | |
| Borosilicate tube with filament | Sutter Instruments | BF120-69-10 | For glass pipette production |
| Carprofene | Pfizer | Rimadyl vet | |
| Chlorhexidine digluconate | Sigma | C9394 | |
| Dental cement | DrguDent, Dentsply | REF 640 200 271 | |
| Dexamethasone | FaunaPharma | Rapidexon vet | |
| Disposable drills | Meisinger | HP 310 104 001 001 008 | |
| Dulbeco’s PBS 10x | Sigma | D1408 | |
| Dumont #5 forceps, 110 mm | FST | 91150-20 | |
| Ealing microelectrode puller | Ealing | 50-2013 | Vertical puller for glass pipette production |
| Eye ointment | Novartis | Viscotears | |
| Foredom drill control | Foredom | FM3545 | |
| Foredom micromotor handpiece | Foredom | MH-145 | |
| Gas anesthesia platform for mice | Stoelting | 50264 | Assembled on stereotaxic instrument |
| Hemostasis Collagen Sponge | Avitene, Ultrafoam BARD | Ref 1050050 | |
| Imaris | Bitplane | ||
| Ketamine | Intervet | Ketaminol vet | |
| Mai Tai DeepSee laser | Spectra-Physics | ||
| Metal holder | Neurotar | ||
| Microdressing forceps, 105 mm | Aesculap | BD302R | |
| Microfil | WPI | MF34G-5 | Micro syringe filling capillaries |
| Mineral oil | Sigma | M8410 | |
| Multiphoton Laser Scanning Microscope | Olympus | FV1000MPE | |
| NanoFil Syringe 10 μl | WPI | NANOFIL | Hamilton syringe |
| Nonwoven swabs 5 x 5 | Molnlycke Health Care | Mesoft | Surgical tampons |
| Polyacrylic glue | Henkel | Loctite 401 | |
| Round glass coverslip | Electron Microscopy Sciences | ||
| 1.5 thickness | |||
| Small animal stereotaxic instrument | David Kopf Instruments | 900 | |
| Stoelting mouse and neonatal rat adaptor | Stoelting | 51625 | Assembled on stereotaxic instrument. |
| Student iris scissors, straight 11.5 cm | FST | 91460-11 | |
| Sulforhodamine 101 | Molecular Probes | S-359 | |
| UMP3 microsyringe pump and Micro 4 microsyringe pump controller | WPI | UMP3-1 | Microinjector and controller |
| Xylazine | Bayer Health Care | Rompun vet |
References
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