Summary
Akut hjärntrauma är en allvarlig skada som inte har någon adekvat behandling hittills. Multi mikroskopi tillåter studerar längs processen med akut hjärntrauma utveckling och sondering terapeutiska strategier hos gnagare. Två modeller av akut hjärntrauma studerades med in vivo två-photon avbildning av hjärnan demonstreras i detta protokoll.
Abstract
Även akut hjärntrauma resulterar ofta från topp skador i olika olyckor och påverkar en betydande del av befolkningen, det finns ingen effektiv behandling för det ännu. Begränsningar för närvarande används djurmodeller hindra förståelse för patologi mekanismen. Multi mikroskopi tillåter att studera celler och vävnader i intakta djur hjärnor längsled under fysiologiska och patologiska tillstånd. Här beskriver vi två modeller av akut hjärnskada som studerats med hjälp av två-photon avbildning av hjärncell beteende under posttraumatiska förhållanden. En utvald hjärnregion är skadad med en vass nål för att producera ett trauma av en kontrollerad bredd och djup i hjärnparenkymet. Vår metod använder stereotaktisk prick med en injektionsnål, som kan kombineras med samtidig läkemedelsansökan. Vi föreslår att denna metod kan användas som ett avancerat verktyg för att studera cellulära mekanismer av patofysiologiska följderna av akut trauma i däggdjurshjärna
Introduction
Akut hjärnskada är ett betydande folkhälsoproblem med hög förekomst av skador på motorfordon kraschar, faller eller överfall, och hög förekomst av följande kroniska funktionshinder. Terapeutiska metoder för behandling av hjärnskada förblir helt symptomatisk, vilket begränsar effektiviteten av prehospital, kirurgisk och intensivvård. Det gör den sociala och ekonomiska effekterna av hjärnskada särskilt svår. Av olika skäl, de flesta av de kliniska prövningar inte visat förbättrad återhämtning efter hjärnskada med hjälp av nya terapeutiska metoder.
Djurmodeller är avgörande för att utveckla nya behandlingsstrategier mot ett stadium där läkemedlets effektivitet kan förutsägas hos patienter med hjärnskador. För närvarande har flera väletablerade djurmodeller av skallskada finns, inklusive kontrollerad kortikal påverkan 1, flytande slagskada 2, dynamisk kortikal deformation 3, vikt-släpp4, och fotoskador 5. Ett antal experimentella modeller har använts för att studera vissa morfologiska, molekylära och beteendemässiga aspekter av huvudtrauma-associerad patologi. Dock är ingen enskild djurmodell helt framgångsrika i att validera nya terapeutiska strategier. Utveckling av tillförlitliga, reproducerbara och kontrollerade djurmodeller av hjärnskada är nödvändiga för att bedöma komplexa patologiska processer.
Den nya kombinationen av den senaste mikroskopiska avbildningsteknik och genetiskt kodade fluorescerande reportrar ger en oöverträffad möjlighet att undersöka alla faser av hjärnskada, som omfattar primär skada, spridning av den primära skadan, sekundär skada, och förnyelse. Det är i synnerhet in vivo-två-foton-mikroskopi en unik icke-linjär optisk teknik som tillåter realtidsvisualisering av cellulära och även subcellulära strukturer i djupa kortikala skikt av gnagare hjärnan. Flera typer av celler och orgaNelles kan avbildas samtidigt genom att kombinera olika fluorescerande markörer. Med hjälp av detta kraftfulla verktyg kan vi visualisera dynamiska morfologiska och funktionella förändringar i levande hjärnan i posttraumatiska förhållanden. Fördelarna med in vivo två-foton mikroskopi studera hjärnskada har nyligen visats av Kirov och kollegor 6. Med hjälp av en mild fokal kortikal kontusion modell, dessa författare visade att akut dendritiska skada i pericontusional cortex är gated av nedgången i den lokala blodflödet. Dessutom visade de att den metaboliskt äventyras cortex runt kontusion webbplats är ytterligare skadas av spridnings depolarisation. Denna sekundära skador påverkar synaptisk kretsar, vilket gör konsekvenserna av traumatisk hjärnskada svårare.
Här föreslår vi metoden för stereotaktisk prick med en injektionsnål, som kan kombineras med samtidig lokal Drug Application, som en avancerad modell för lokal hjärnaskada och som ett verktyg för att studera patofysiologiska konsekvenser av akut trauma i däggdjurshjärnan in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla förfaranden som presenteras här utfördes enligt lokala riktlinjer för djurvård (Den finska lagen djurförsöks 62/2006). Djur licens (ESAVI/2857/04.10.03/2012) erhölls från kommunen (ELÄINKOELAUTAKUNTA-ELLA). Vuxna möss av 1-3 månaders ålder, vikt 24-38 g, hölls i enskilda burar i certifierade universitetets djuranläggning och försedd med mat och vatten efter behag.
1. Hjärnskada Imaging Genom en Kraniell fönster
- Anesthetizing djur och förbereda operationen fältet
- Bedöva möss genom peritoneal injektion av en blandning av ketamin (Ketalar, 80 mg / kg) och xylazin (Rompun, 10 mg / kg) löst i filtersteriliserad fosfatbuffrad saltlösning (PBS), pH 7,4. Kontrollera musens reflexer regelbundet (svans och tå nypa sond) för att kontrollera anestesidjupet. Öka dosen vid behov, för att upprätthålla god anestesi men undvika Overdose.
- Bibehåll djuret vid 37,0 ° C med hjälp av en värmedyna under operation, avbildning session och första timmen efter återhämtning från anestesi.
- För att skydda musens ögon torkar ut, applicera ögon smörjmedel.
- Administrera dexametason (Rapidexon veterinär, 2 mg / kg) genom subkutan injektion för att minska inflammation och cerebralt ödem.
- Administrera ett analgetikum (exempelvis Ketoprophene intraperitonealt) upp till 30 minuter före eller omedelbart efter operationen. Om djuret uppvisar några smärtsymtom, till exempel ovilja att röra sig, äta eller dricka, eller viktminskning, salivering, upprest päls eller onormala andningsljud efter operationen, upprepa injektion av smärtstillande.
- Raka musen huvud med en rakning maskin (se Material och utrustning). Undvik att skada morrhår.
- Behandla huden på musen huvud med 70% etanollösning för att rengöra det rakade området.
- Användning av kirurgisk sax (se Material ochEquipment) och pincett (se Material och utrustning), skära huden från mittlinjen mellan öronen till pannan.
- Skrapa försiktigt bort bindväv ansluten till skallen med en trubbig mikrokirurgisk blad.
- Skjut hud gränser åt sidan och dra örat barer något i ljudform öppningar i skallen för huvud och hud fixering.
- Rengör skalle med steril PBS och behandla operationsstället i musens huvud med 0,5% klorhexidindiglukonat och torka skallytan med hjälp av en kombination av sterila bomullspinnar och tryckluft.
- Åsamka den prick skada
- Placera ett litet djur stereotaxic instrument med en djurhållare (se Material och utrustning).
- Justera positionen av binokulärt mikroskop bredvid stereotaxic instrument för att fokusera på ytan av djurets skalle.
- Med hjälp av en kikare mikroskop, lokalisera bregma punkt på skallen.
- Identifiera region av intresse med hjälp av stereotaktiska koordinaterna.
OBS: Undvik de intresseområden som är direkt placerade över ytliga kortikala kärl. Förstörelse av dessa kan starkt påverka trauma progression. - Placera 30 G nål ovanför det valda området och markera målplatsen genom att skrapa skallen ytan.
- Borra skallen med alla möjliga försiktighetsåtgärder för att undvika onödig breddning av det drabbade benet yta. Använd en snabb kirurgisk borr (se Material och utrustning) under mikroskop. Sluta borra om vätska visas i det borrade området.
- Tryck ner på borrad brunn med nålen.
- Doppa nålen smidigt in i hjärnan (införingstakten 5-10 mm / min), till ett djup av 0,5 till 2,0 mm i enlighet med koordinaterna för den prickappliceringsstället.
- Ta bort kanylen omedelbart efter att ha nått det önskade djupet (indragningshastighet 5-10 mm / min) och torka av blodet som förekommer efter prick med en liten tampong (see Material och utrustning).
- Utför mikroinjektion av 100 mikroM Sulforhodamine 101 eller en annan förening av intresse i lesionsstället med hjälp av en mikropump (WPI) och 10 pl Hamilton spruta ihop med glas pipett.
OBS: Under utarbetandet av glaspipett från borosilikatglas kapillär, slipa spetsen till en diameter på 10-20 nm. - Infundera 250-1,500 nl av injektionslösningen med en hastighet av 2-5 nl / sek.
OBS: Låt pipetten efter avslutad infusion under minst 5 min i hjärnparenkymet, ta sedan bort det långsamt och försiktigt för att förhindra lösning utflöde.
- Kraniotomi för kronisk kraniell fönster
- Borra skallen sakta och försiktigt för att göra en cirkel runt markeringsramen skadan webbplats. Använd fönsterdiameter av 3-3,5 mm.
- Applicera en droppe cortex buffert (125 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM glukos, 10 mM HEPES, 2 mM CaCl2 och 2 mM MgSO 4 i destillerat H 2 O) för att täcka wiNdow.
- Placera en rund täckglas (# 1.5 tjocklek) på hjärn fönstret.
- Ta bort överskottet av cortex buffert runt täckglas.
- Täta kanterna på täckglas med polyakryl lim (se Material och utrustning).
Anmärkning: Se till att limmet inte appliceras på den övre ytan av täckglas. Om täckglaset är förorenad med lim, vänta tills glaset är stabilt limmad mot skallen och limmet på glasytan blir torr, sedan försiktigt bort kontaminerande lim med en mikroblad. - Vänta 5 min för att låta limmet torka.
- Med hjälp av öron bar höjd skruvar, justera huvudläge så att metallhållaren kan placeras.
- Applicera en liten mängd polyakryl lim på ringen av stålhållaren (se Material och utrustning).
- Lim ringen av stålhållaren på täckglas med metallhållarens handtag riktade bakåt.
- Vänta 5 min för att låta limmet torka.
- Mix dentalcement (se Material och utrustning) med polyakryl lim i en 3,5 cm petriskål (eller analog) för att uppnå viskösa förhållanden.
- Täta gränser kraniala fönstret med cement + limblandningen och täcka den exponerade ytan av skallen med samma blandning upp till gränsen hud.
- Vänta i 15 minuter för att låta cement + lim blandning torka upp och ta sedan bort örat barer.
- Utför tvåfotonexcitering mikroskopisk (TPEM) avbildning för regionen av intresse och ett kontrollområde som det beskrivs i protokoll 3.
- Efter bildbehandling, låta djuret att återhämta sig från anestesi på en värmedyna och förvara den på en enskild bur under observation tills fullständig återhämtning. Våt mat kan ges för att underlätta tuggning och återfuktning.
2. Brain Injury Imaging Genom förtunnad skallen
- Bedövning av djur och förbereda operationen fältet
- Bedöva musen och förbereda den för trauma induktionenligt beskrivningen i steg 1.1.
- Skull gallring och åsamka den prick skada
- Placera ett litet djur stereotaxic instrument med djurhållaren (se Material och utrustning).
- Justera placeringen av ett binokulärt mikroskop bredvid stereotaxic instrument för att fokusera på det djur skallytan.
- Leta reda på bregma punkt på skallen med hjälp av kikare mikroskop, identifiera hjärnan område som ska avbildas utifrån stereotaktiska koordinater och markera det genom att skrapa.
OBS: Skull gallring ställning bör inte placeras över eller i närheten kraniala suturer, eftersom skallen stabiliteten äventyras i dessa områden. Dessutom stora kortikala eller meningeal fartyg och hjärnhinnorna nedanför suturerna kan orsaka imaging artefakter. - Placera metallhållare belagda med lim över det intressanta området på djurets skalle, tillämpa lätt tryck och vänta 5 min tills metallhållaren är ordentligt limmad mot skallen. Blanda dentalcement (se Material och utrustning) med polyakryl lim i en 3,5 cm petriskål (eller analog) för att uppnå viskösa förhållanden.
- Täta gränser metallhållare med cement + limblandningen och täcka den exponerade ytan av skallen med samma blandning upp till gränsen hud.
- Vänta i 15 min för att låta cement och lim blandning torka upp.
- Skölj den uttunnade skallen regionen och omgivande delar av metallhållaren flera gånger med PBS, så att resterna av nonpolymerized lim tvättas bort.
OBS: Det är viktigt att säkerställa en stabil infästning av skallen till innehavaren. Detta möjliggör framställning stabilitet under avbildning. - Använda hög förstoring läget av binokulärt mikroskop, ta bort övre lagren av skallbenet med en hög hastighet mikroborr för att skapa en förtunnad skallen område ~ 0,5-1,5 mm i diameter. Använd tryckluft vid borrning för att ta bort ben skräp. Utför borr intermittently under gallring förfarandet för att undvika friktion-inducerad överhettning. Kyl borret med hjälp av lösning vid rumstemperatur och regelbundet tillämpa buffert till den förtunnade området för att absorbera värme.
OBS: För att undvika skador på hjärnbarken, inte borra över stora områden (> 1,5 mm) ner till ett tunt lager (<50 mikrometer).
OBS! Gnagare benet strukturen består av två tunna skikt av kompakt ben separerade av ett tjockt lager av spongiösa benet. Mycket små håligheterna i den svampiga ben bildar koncentriska cirklar och canaliculi, som innehåller blodkärl. Använd mikroborr att avlägsna både den yttre kompakt ben skiktet och det mesta av det spongiösa lagret. Störning av blodkärlen i den svampiga ben kan orsaka blödningar. Använd hemostas kollagen svamp för att stoppa blödningen. - Använd andra harmonisk generationen (SHG) som avbildar för att undersöka om de flesta av de svampiga ben har tagits bort. Var noga med att undvika överdriven förtunning, se till att det återstående benet är thicker än 50 ^ m i detta skede av beredningen.
- Placera en droppe av varm-buffert (35 till 37 ° C) på ovansidan av förtunnad region. Använd en mikrokirurgisk blad eller Micro Finishing Bur att ytterligare avlägsna ben lager och en slät yta på ~ 700 nm i diameter med ben tjocklek på ~ 20 um. Under detta steg är det bra att utföra repetitiva SHG bildbehandling och mäter regelbundet benet tjocklek.
- Utför TPEM avbildning för regionen av intresse och ett kontrollområde.
- Justera huvudets position med hjälp av öron bar höjdskruvar på ett sådant sätt att förtunnad region placeras strikt vågrätt. Placera nålen ovanför den förtunnade området och se till att det inte finns några stora fartyg nedanför den riktade platsen.
- Gör en lesion genom doppning av nålen in i hjärnan, till djupet av 0,5-2,0 mm från uttunnade skallen ytan och enligt koordinaterna för prickappliceringsstället.
- Ta bort nålen och undertrycka blödning uppträder efter than akut hjärnskada med BLODS tampong (se Material och utrustning). Vänta tills blodproppar formen och fartyg pulsering vid skadeplats avbryts.
- Utför mikroinjektion av 100 pM Sulforhodamine 101 eller en annan förening av intresse in i skadestället, såsom beskrivits ovan i avsnitt 1.2.10.
- Utför TPEM imaging att övervaka skadeutveckling och återhämtning som beskrivs i protokoll 3.
- Efter avbildning, att djuret skall kunna återfå medvetandet från anestesi på en värmedyna. Lämna inte djuret utan uppsikt och returnera den till sitt hem bur först efter fullständig fysisk återhämtning.
3. Imaging
- Placera djuret under mikroskop genom att fästa metallhållaren till den egenbyggda ram.
- För bildbehandling använder t.ex. FV1000MPE två-photon mikroskop utrustat med Mai Tai DeepSee laser och XLPLN 25X 1,05 NA nedsänkning i vatten mål optimerad för in vivo två-fotonavbildning.
- Identifiera lesionsstället i mikroskop med hjälp av brett fält fluorescens-läge. Använd långa passfilter för att visualisera hjärnans kärlsystem och välj kontrollområde enligt det observerade mönstret av blodkärl.
- Till bilden den andra harmoniska generationen (SHG) signal, stämma femtosecondlaser till 800 nm våglängd och samla det emitterade ljuset med hjälp av 380-410 nm bypassfilter. För fluorescensavbildning, använda bandpassfilter (515-560 nm) för att samla in det emitterade ljuset, och följande våglängder används för att excitera fluorescens: GFP-860 nm, YFP-950 nm.
- Använd FluoView programvara för bildtagning.
- Affär koordinaterna för varje ROI för efterföljande repetitiva avbildning. Bild samma ROI över tiden, och justera koordinater varje gång för att maximera bild överlappning.
- Analysera bilder med lämplig programvara (t.ex.. ImageJ). Rekonstruktioner som presenteras här gjordes med hjälp Imaris programvara.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har optimerat två operationsförfaranden: 1) kroniska kraniella fönster och 2) skalle gallring, för posttraumatisk hjärnavbildning i transgena möss. Schematisk bild av de experimentella beredningar presenteras i Figur 1. Traumatisk prick genom stålnål av 0,3 mm OD (30 G) anbringas på borrad brunn (Figur 1A). En framgångsrik kraniell fönster förberedelse möjliggör avbildning på djup upp till 650 ìm under pial ytan (Figur 1B), medan skallen gallring tenderar att införa en gräns på ca 300 nm (Figur 1C), vilket visas i 3D-rekonstruktion av Thy1-YFP- H mus kortikala pyramidala nervceller.
De pricktrauma medför eliminering av dendriter och förstörelse av kapillära nätverk i en kontrollerad volym av hjärnbarken. Under de två första dagarna, ökad lesionen området och trauma inducerat dendrit blåsbildning och bildning av dendritisk indragnings bulbs i perilesion områden, som observeras med användning av in vivo multifotonmikroskop (figur 2).
Vi utförde skallen gallring till bild aktivering och migrering av mikroglia i CX3CR1-EGFP möss omedelbart efter skada (Figur 3A). SHG avbildning erbjuder ett värdefullt verktyg för att beskriva exakt skada plats (Figur 3B). Extracellulära matrixmolekyler som producerar SHG signaler berikat i hjärnparenkymet vid prick trauma. Först är fina microglial processer hämtas, sedan mikrogliaceller migrera till gränsen av webbplatsen skada (Figur 3A).
För att uppskatta de potentiella skador som framkallas av tunt glas pipett insättning och leverans av färg, vi utför in vivo två-photon mikroskopi experiment med Sulforhodamine 101 mikroinjektion i Thy1-YFP-H möss utan hjärntrauma. Bilderna som visas i Figur 4 visar milcroinjection site 3 h efter injektion. De spår av pipett insättning kan ses i hjärnhinnor visualiseras genom SHG (Figur 4A). Astrocyter är märkta med Sulforodamine 101 infördes genom injektion (Figur 4B). Dendriter uttrycker YFP i Thy1 promotor inte påvisa några morfologiska tecken på skador som blåsbildning eller indragnings lökar (Figur 4 C).
Figur 1. Metoden för akut hjärnskada i kombination med kranial fönster eller tunna skallen preparat i kombination med in vivo två-foton mikroskopi. A. Traumatisk prick genom stålnål av 0,3 mm OD (30G) appliceras på borrad brunn. Nålen är i korthet nedsänktes i hjärn 0,5-2 mm djup från botten av brunnen. B, C (C). D. Ljusa fält tanke på de ytliga blodkärlen genom glasfönstret direkt efter akut hjärnskada. E. Förtunnad skallen innan skadan ansökan. Den valda regionen av intresse (vit ram) och applikationsstället prick (röd cirkel). Ett annat område (röd ram) på den uttunnade regionen bör avbildas för att övervaka eventuella kirurgi-artefakter.
Figur 2. Exempel på longitudinell multi avbildning av hjärntrauma utveckling genom den förtunnade skallen. A. För attp bild av skada plats omgiven av YFP-märkta dendriter av kortikala neuroner 20 min efter trauma vållande, som avbildas genom den förtunnade skallen förberedelser. B. Förstorad bild av platsen som visades i panel A. C. Samma område i hjärnan som i B, återavbildas 5 dagar efter trauma. Dendrite blebbing visas med vita pilar, dendritiska indragnings lökar - med röda pilar.
Figur 3. Exempel på övervakning av inflammation och glia aktivering under utvecklingen av hjärntrauma med användning av olika markörer som är lämpliga för in vivo multifotonavbildnings t.ex. fluorescerande proteiner, färgämnen och andra harmoniska generationen signal. Bilderna förvärvades 3 h efter hjärnskada.
Figur 4. Undersökning av vävnadspåverkan som gjorts av lösning injektion via en glasmikropipett. A. En trace (shown med streckad linje) i SHG visualisera hjärnhinnor 3 timmar efter injektionen. B. Astrocyter märkta med sulforodamin införts av injektionen. C. Dendriter uttrycker YFP i Thy1 promotor. D. Kombinerad bild av A (SHG - grå), B (astrocyter - rött), C (neuronala dendriter - gul).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Brain trauma är en plötslig, oförutsägbar händelse. Här beskriver vi den djurmodell som återger ett spektrum av patologiska förändringar som observeras i humana patienter efter hjärnskada såsom neurodegeneration, eliminering av dendriter, hjärnödem, glia-ärr, blödningar i hjärnbarken kopplad med fokal subaraknoidal hemorragi och ökad permeabilitet hos blod-hjärnbarriären. Att studera primär och sekundär patogenes, samt återhämtning efter trauma, var denna skada modell i kombination med längsgående in vivo visualisering av fina neuronala och gliaceller strukturer. Transgen mus linjer användes som uttrycker fluorescerande proteiner i nervceller (Thy1-YFP-H) 7, astrocyter (GFAP-EGFP) 8, eller mikroglia (CX3CR1-EGFP) 9. Dessutom använde vi andra harmoniska generationen (SHG) imaging och astrocyternas lastning med Sulfarhodamine 101 10.
Den modell som beskrivs här recapitulates penebalkar, typ av hjärnskada. Därför är en begränsning av föreliggande modell är att den inte tillhandahåller information om mekanismerna för sluten huvudskada. Nyligen Svärd och medförfattare rapporterade multi imaging resultat på cellens beteende i pericontusional cortex 6. Med beaktande av att sluten skallskada är en tätare medicinska fall är den metod som rapporterats av författarna mycket lovande att komplettera traditionella forskningsmetoder inom området för påverkan hjärntrauma 11.
Vi använde både den kroniska kraniella fönstret 12 och skallen gallring 13 förberedelser för att studera cellens beteende under posttraumatiska förhållanden i levande hjärna. Båda metoderna har vissa fördelar och begränsningar. Således tillhandahåller kronisk kraniell fönster bättre upplösning, djupare optisk penetrering in i hjärnvävnaden och bekvämlighet för flera avbildning sessioner. Omvänt är mindre benägna att framkalla inflammation på th skallen gallringe imaging plats, och, kanske ännu viktigare, gör det upprepade ansökningar av läkemedel och färgämnen. Några exempel på farmakologiska medel som skall tillämpas på denna typ av experiment ges i tabell 1.
| Agent typ | Injicerad agent | Områden i biologi / farmaci forskning |
| Antiinflammatorisk | Cyklosporin A | Traumatisk hjärnskada, följdskador, neurodegeneration |
| Toxiner | Tetrodotoxin | TBI - sekundära skador, excytotoxicity |
| Bikukullin | TBI - sekundära skador, klorid homeostas | |
| Hämmare av signalvägar | PD98059 (MAPKK hämmare) | signalering mekanismer för inflammation, sekundära skador, posttraumatisk celldöd, neurodegeneration och förnyelse |
| SU6656 (Src-familj-kinashämmare) | ||
| Neurotrofiska faktorer | Brain-derived neurotrophic factor, BDNF | TBI - neuronal överlevnad efter skada, neuroprotektion vid sekundär posttraumatisk hjärnskada |
| Virus | lentivirusvektorer för proteinuttryck | molekylära mekanismer av posttraumatisk neurodegeneration och förnyelse, differentiell märkning av celltyper i skadad hjärna för in vivo imaging |
| adenovirala vektorer för proteinuttryck | ||
| Ca2 + fluorescerande indikatorer | Fluo-2, 4 | signaleringsmekanismer av posttraumatisk inflammation, celldöd, cellmigration, axonal / dendritiska regeneration |
Tabell 1. Farmakologiska ämnen och färgämnen för kortikal injektion i prick skademodell.
Ett brett spektrum av biokemiska händelser som är mycket viktigt under fysiologiska och patologiska tillstånd kan sonderas med kemiska inhibitorer, fluorescerande indikatorer och mutantprotein infördes via virala konstrukt. Fördelar att välja särskilt tidsfönster som tillhandahålls av skallen gallring preparatet kan vara mycket relevant för dessa studier.
I den aktuella studien använde vi andra harmoniska generationens signal att avgränsa skadan webbplats. Alternativt skulle skada plats gränser anges med en svagt diffunderande fluorescerande färgämne, exempelvis ett högmolekylärt dextran fluorescerande konjugat (2.000.000 Dalton).
Nyligen, Schaffer och kollegor 14 har använt en kronisk beredningmed reopenable kraniell fönster för upprepad tillförsel av fluorescerande färgämnen att mus cortex. Det är troligt att kraniell fönster återupptagande negativt kan påverka öppenheten hjärnvävnaden. Dessutom är det svårt att förutsäga tidsförloppet för återupptagande-inducerad inflammation, vilket kan påverka bindväv återväxt.
En stor fördel med den uttunnade skallen beredningen är möjligheten att leverera terapeutiska föreningar (och andra material som kräver topisk injektion i hjärnvävnad) flera gånger under progression av trauma, utan att komplicera artefakter (t.ex. utan kraniell fönster återupptagande).
Om repetitiva förening leverans direkt till skada plats önskas, bör man överväga särskilda medel för att förhindra skallen uttorkning och bakterieinfektion. Således, att hålla det opererade huvudregionen under sterila förhållanden och tillämpning av antibiotika (t.ex. enrofloxacin) rekommenderas. För att bevara thinned skallen region från torkning, fyll metallhållaren med 1,5% agaros och täck den med runda glas täckglas. I de flesta fall gör det möjligt att upprätthålla samma transparens eller tunnas skallen under perioden på upp till 10 dagar. Några ytterligare bör tas om flera avbildning sessioner i den uttunnade skallen förberedelser planeras under en längre tid. Omedelbart före varje avbildning session, försiktigt bort den nybildade bindväv från tunnas området med hjälp av en mikrokirurgisk blad. Använd TPEM avbildning av SHG att kontrollera bildkvaliteten och mått ben tjocklek. Vävnads återväxt kan äventyra inträngningsdjup och orsakar oskärpa åtföljs av en ökning i bakgrunden fluorescens. Uppdatera skallen gallring försiktigt med en mikrokirurgisk blad att återfå hög bildkvalitet.
I de fall som inte kräver direkt åtkomst till skada plats, rekommenderar vi täcker tunnas regionen i skallen med ett glas coverslip som beskrivs i tidningen på polerade och förstärkt förtunnad skallen förberedelse av Kleinfeld och kollegor 15. Detta kan göras med hjälp av följande frivilligt förfarande. Placera en liten droppe agaros (1,5%) på den uttunnade skallen regionen, vänta tills det blir en gel, ta bort alla onödiga agaros, dvs lämna den bara på skadeplatsen. Agaros bör skydda skada plats från yttre påverkan. Torka den uttunnade skallen regionen med hjälp av tryckluft. Släpp en liten mängd polyakryl lim på en liten bit av # 0 coverglass och placera den på den uttunnade skallen regionen. Den polyakryl lim förhindrar ben och bindväv återväxt och därmed hålla den uttunnade skallen under fönstret bevaras.
En kombination av dessa förfaranden gör det möjligt att studera akuta och kroniska posttraumatiska processer, leverera droger topiskt eller systemiskt och direkt övervakning av behandlingseffekter. Användning av dubbla eller tredubbla transgen mus linjer kan också vara till nytta, particularly för samtidig avbildning av multipla posttraumatiska processer, såsom glial ärrbildning och neuronal gren återväxt. Vi förväntar oss att våra modeller av akut hjärnskada studerade med intravital två-photon mikroskopi för att visa sig fruktbart för att testa läkemedelskandidaten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Vi är djupt tacksamma till Dr Frank Kirchhoff för att ge GFAP-EGFP och CX3CR1-EGFP musstammar. Arbetet har finansierats med bidrag från Centret för internationellt personutbyte i Finland, Tekes, Finlands Graduate School of Neuroscience (FGSN) och Finlands Akademi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2A-sa dumb Tweezers, 115 mm | XYtronic | XY-2A-SA | |
| 30 G ½ in needle | BD | REF 304000 | |
| Animal trimmer, shaving machine | Aesculap | Isis GT420 | |
| Binocular Microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Biological Temperature Controller with stainless steel heating pad | Supertech | TMP-5b | |
| Blunt microsurgical blade | BD | REF 374769 | |
| Borosilicate tube with filament | Sutter Instruments | BF120-69-10 | For glass pipette production |
| Carprofene | Pfizer | Rimadyl vet | |
| Chlorhexidine digluconate | Sigma | C9394 | |
| Dental cement | DrguDent, Dentsply | REF 640 200 271 | |
| Dexamethasone | FaunaPharma | Rapidexon vet | |
| Disposable drills | Meisinger | HP 310 104 001 001 008 | |
| Dulbeco’s PBS 10x | Sigma | D1408 | |
| Dumont #5 forceps, 110 mm | FST | 91150-20 | |
| Ealing microelectrode puller | Ealing | 50-2013 | Vertical puller for glass pipette production |
| Eye ointment | Novartis | Viscotears | |
| Foredom drill control | Foredom | FM3545 | |
| Foredom micromotor handpiece | Foredom | MH-145 | |
| Gas anesthesia platform for mice | Stoelting | 50264 | Assembled on stereotaxic instrument |
| Hemostasis Collagen Sponge | Avitene, Ultrafoam BARD | Ref 1050050 | |
| Imaris | Bitplane | ||
| Ketamine | Intervet | Ketaminol vet | |
| Mai Tai DeepSee laser | Spectra-Physics | ||
| Metal holder | Neurotar | ||
| Microdressing forceps, 105 mm | Aesculap | BD302R | |
| Microfil | WPI | MF34G-5 | Micro syringe filling capillaries |
| Mineral oil | Sigma | M8410 | |
| Multiphoton Laser Scanning Microscope | Olympus | FV1000MPE | |
| NanoFil Syringe 10 μl | WPI | NANOFIL | Hamilton syringe |
| Nonwoven swabs 5 x 5 | Molnlycke Health Care | Mesoft | Surgical tampons |
| Polyacrylic glue | Henkel | Loctite 401 | |
| Round glass coverslip | Electron Microscopy Sciences | ||
| 1.5 thickness | |||
| Small animal stereotaxic instrument | David Kopf Instruments | 900 | |
| Stoelting mouse and neonatal rat adaptor | Stoelting | 51625 | Assembled on stereotaxic instrument. |
| Student iris scissors, straight 11.5 cm | FST | 91460-11 | |
| Sulforhodamine 101 | Molecular Probes | S-359 | |
| UMP3 microsyringe pump and Micro 4 microsyringe pump controller | WPI | UMP3-1 | Microinjector and controller |
| Xylazine | Bayer Health Care | Rompun vet |
References
- Lighthall, J. W. Controlled cortical impact: A new experimental brain injury model. J. Neurotrauma. 5 (1), 1-15 (1988).
- Lindgren, S., Rinder, L.
- Shreiber, D. I., et al. Experimental investigation of cerebral contusion: histopathological and immunohistochemical evaluation of dynamic cortical deformation. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 58 (2), 153-164 (1999).
- Feeney, D. M., Boyeson, M. G., Linn, R. T., Murray, H. M., Dail, W. G. Responses to cortical injury: I. Methodology and local effects of contusions in the rat. Brain Res. 211 (1), 67-77 (1981).
- Bardehle, S., et al. Live imaging of astrocyte responses to acute injury reveals selective juxtavascular proliferation. Nat. Neurosci. 16 (5), 580-586 (2013).
- Sword, J., Masuda, T., Croom, D., Kirov, S. A. Evolution of neuronal and astroglial disruption in the peri-contusional cortex of mice revealed by in vivo two-photon imaging. Brain. 136 (5), 1446-1461 (2013).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Nolte, C., et al. GFAP promoter-controlled EGFP-expressing transgenic mice: a tool to visualize astrocytes and astrogliosis in living brain tissue. Glia. 33 (1), 72-86 (2001).
- Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol. Cell. Biol. 20 (11), 4106-4114 (2000).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Kerr, J. N. D., Helmchen, F. Sulforhodamine 101 as a specific marker of astroglia in the neocortex in vivo. Nat. Methods. 1 (1), 31-37 (2004).
- Carré, E., et al. Technical aspects of an impact acceleration traumatic brain injury rat model with potential suitability for both microdialysis and PtiO2 monitoring. J. Neurosci. Methods. 140, 23-28 (2004).
- Holtmaat, A., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat. Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. B. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nat. Protoc. 5, 201-208 (2010).
- Cianchetti, F. A., Kim, D. H., Dimiduk, S., Nishimura, N., Schaffer, C. B. Stimulus-evoked calcium transients in somatosensory cortex are temporarily inhibited by a nearby microhemorrhage. PloS one. 8 (5), (2013).
- Shih, A. Y., Mateo, C., Drew, P. J., Tsai, P. S., Kleinfeld, D. A polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain. J. Vis. Exp. 61, (2012).
