Summary
Akutt traume hjernen er en alvorlig skade som ikke har noen adekvat behandling til dags dato. Multiphoton mikroskopi kan studere lengde prosessen med akutt hjernetraume utvikling og sondering terapeutiske strategier hos gnagere. To modeller av akutt hjernetraume studert med in vivo to-foton avbildning av hjernen er demonstrert i denne protokollen.
Abstract
Selv om det akutte hjernetraume resulterer ofte fra hodet skade på forskjellige ulykker og påvirker en betydelig del av befolkningen, er det ingen effektiv behandling for den ennå. Begrensninger av tiden brukes dyremodeller hindre forståelse av patologi mekanismen. Multiphoton mikroskopi kan studere celler og vev i intakte dyr hjernen lengde under fysiologiske og patologiske tilstander. Her beskriver vi to modeller av akutt hjerneskade studert ved hjelp av to-foton avbildning av hjernen celle oppførsel under posttraumatiske tilstander. En valgt hjerneregion blir skadet med en skarp nål for å produsere en traumer av en kontrollert bredde og dybde i hjernen parenchyma. Vår metode anvender stereotaktisk stikk med en kanyle, som kan kombineres med samtidig legemiddel søknad. Vi foreslår at denne fremgangsmåte kan anvendes som en avansert verktøy for å studere cellulære mekanismer av patofysiologiske følgene av akutt trauma i hjernen hos pattedyr
Introduction
Akutt skade hjernen er et betydelig folkehelseproblem med høy forekomst av skader i motorkjøretøyer krasjer, faller eller overgrep, og høy forekomst av påfølgende kronisk funksjonshemming. Terapeutiske tilnærminger til behandling av hjerneskader forbli helt symptomatisk, og dermed begrense effektiviteten av prehospital, kirurgiske og kritisk behandling. Dette gjør de sosiale og økonomiske konsekvensene av hjerneskade spesielt alvorlig. For en rekke grunner, de fleste av de kliniske studiene viste ingen bedring i bedring etter hjerneskade ved hjelp av nye terapeutiske tilnærminger.
Dyremodeller er avgjørende for å utvikle nye terapeutiske strategier mot en scene der legemidlets effekt kan forutsies hos pasienter med hjerneskader. I dag er flere godt etablerte dyremodeller av hodetraume finnes, inkludert kontrollert kortikal virkning en, væskeperkusjonsskade 2, dynamisk kortikal deformasjon 3, vekt-slipp4 og fotoskade 5. En rekke eksperimentelle modeller har blitt brukt til å studere bestemte morfologiske, molekylære og atferdsmessige aspekter ved hodetraume-assosiert patologi. Det er imidlertid ingen enkel dyremodell helt vellykket i å validere nye terapeutiske strategier. Er nødvendig å vurdere de komplekse patologiske prosesser utvikling av pålitelige, reproduserbare og kontrollerte dyremodeller av hjerneskade.
Den nye kombinasjonen av de nyeste mikroskopiske bildeteknologi og genetisk kodet fluorescerende reportere gir en enestående mulighet til å undersøke alle faser av hjerneskade, som inkluderer primær skade, spredning av den primære skaden, sekundær skader, og regenerering. Spesielt er in vivo to-fotonmikros en unik ikke-lineær optisk teknologi som tillater sanntids visualisering av celle-og enda subcellulære strukturer i dype kortikale lag av gnager hjernen. Flere typer celler og organisaNelles kan avbildes samtidig ved å kombinere ulike fluorescerende markører. Ved hjelp av dette kraftige verktøyet, kan vi visualisere dynamiske morfologiske og funksjonelle endringer i levende hjernen etter posttraumatiske tilstander. Fordelene med in vivo to-foton mikroskopi i å studere hjerneskade ble nylig demonstrert av Kirov og kolleger seks. Ved hjelp av en mild fokal kortikal contusion modell, disse forfatterne viste at akutt dendrittiske skade i pericontusional cortex er inngjerdet av nedgangen i den lokale blodstrømmen. Videre har de vist at metabolisk kompromittert cortex rundt bloduttredelse side er ytterligere skadet av spredning depolarisering. Denne sekundære skader påvirker synaptiske krets, slik at konsekvensene av traumatisk hjerneskade mer alvorlig.
Her, foreslår vi å følge prosedyren i stereotaxic stikk med en kanyle, som kan bli kombinert med samtidig topisk medikament applikasjon, som en avansert modell for lokal hjerneskade og som et verktøy for å studere konsekvensene av patofysiologiske akutt trauma i hjernen hos pattedyr in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle de prosedyrer som presenteres her ble utført i henhold til lokale retningslinjer for dyr omsorg (Den finske loven om forsøk med dyr 62/2006). Animal lisens (ESAVI/2857/04.10.03/2012) ble innhentet fra kommunen (ELÄINKOELAUTAKUNTA-ELLA). Voksen mus på 1-3 måneder alder, vekt 24-38 g, ble holdt i enkeltmerder i sertifisert universitetets dyr anlegget og utstyrt med mat og vann ad libitum.
En. Brain Injury Imaging Gjennom en Kranio Window
- Anesthetizing dyr og klargjøring av operasjonsfelt
- Anesthetize mus ved peritoneal injeksjon av en blanding av ketamin (Ketalar, 80 mg / kg) og xylazin (Rompun, 10 mg / kg) oppløst i filter-sterilisert fosfatbuffersaltløsning (PBS), pH 7,4. Sjekk musens reflekser regelmessig (hale og tå klype probe) for å verifisere anestesidybden. Øke dosen når det er hensiktsmessig, for å opprettholde riktig anestesi, men unngå overdose.
- Oppretthold dyret ved 37,0 ° C ved hjelp av en varmepute under kirurgisk operasjon, avbildning økt og første timen etter oppvåkning fra anestesi.
- For å beskytte musens øynene tørker ut, gjelder øye smøremiddel.
- Administrer deksametason (Rapidexon veterinær, 2 mg / kg) ved subkutan injeksjon for å redusere betennelse og hjerneødem.
- Administrere et analgetikum (for eksempel Ketoprophene intraperitonealt) opp til 30 minutter før, eller umiddelbart etter kirurgi. Hvis dyret viser eventuelle smerter symptomer, som for eksempel motvilje mot å bevege seg, spise eller drikke, eller vekttap, spyttsekresjon, bustepels, eller unormale lungelyder etter operasjonen, gjenta injeksjon av smertestillende.
- Barbere musa "hodet med en barbermaskin (se Materialer og utstyr). Unngå å skade værhår.
- Unn huden på mus hode med 70% etanol løsning for å rense det barberte området.
- Ved hjelp av kirurgisk saks (se Materialer ogUtstyr) og tang (se Materialer og utstyr), kutt i huden fra den midterste linjen mellom ørene til pannen.
- Forsiktig skrape bort bindevevet festet til skallen med en stump mikrokirurgisk kniv.
- Skyv hud grenser sidelengs og trekker øret barer litt inn aural åpninger i skallen for hode og hud fiksering.
- Rengjør skallen med sterile PBS og behandle kirurgi området på musen hode med 0,5% klorheksidin digluconate, tørk skallen overflaten ved hjelp av en kombinasjon av sterile bomullspinner og trykkluft.
- Påføre stikk skade
- Plasser et lite dyr stereotaksisk instrument med et dyr holderen (se Materialer og utstyr).
- Justere posisjonen til kikkert mikroskop ved siden av stereotaksisk instrument for å fokusere på overflaten av dyrets skallen.
- Ved hjelp av en kikkert mikroskop, finn bregma punkt på skallen.
- Identifiser region av interesse å bruke de stereotaksiske koordinater.
MERK: Unngå de områder av interesse som er direkte ligger over overfladiske kortikale fartøy. Ødeleggelse av disse kan sterkt påvirke traumer progresjon. - Plasser 30 G nål over den valgte regionen og markere målet området ved å skrape skallen overflaten.
- Bor skallen med alle mulige forholdsregler for å unngå unødvendig utvidelse av berørte bein areal. Bruk en høyhastighets kirurgisk drill (se Materialer og utstyr) under mikroskopet. Stans boringen hvis væsken fremstår i boret området.
- Trykk i bunnen av boret brønn med nålen.
- Dypp nålen jevnt inn i hjernen (innføringshastighet 5-10 mm / min), den dybde på 0,5-2,0 mm i henhold til koordinatene for stikk påføringsstedet.
- Fjern kanylen umiddelbart etter å ha nådd den ønskede dybden (tilbaketrekking rente 5-10 mm / min) og tørk blodet vises etter stikk med en liten tampong (see Materialer og utstyr).
- Utfør mikroinjeksjon av 100 uM Sulforhodamine 101 eller en annen forbindelse av interesse inn i lesjonen side ved hjelp av en mikrosprøyte pumpe (WPI) og 10 pl Hamilton sprøyte sammen med glass-pipette.
MERK: Under utarbeidelsen av glass pipette fra borsilikatglass kapillær, skjerpe tips til en diameter på 10-20 mikrometer. - Sette mot 250-1500 nl av injeksjonsløsningen med en hastighet på 2-5 nl / sek.
MERK: La pipette etter avsluttet infusjon i minst 5 min i hjernen parenchyma, deretter fjerne den sakte og forsiktig for å hindre løsning strøm.
- Kraniotomi for kronisk kranie vindu
- Bor skallen forsiktig og nøye for å lage en sirkel vindu rundt skadestedet. Bruk vinduet diameter på 3-3,5 mm.
- Påfør en dråpe cortex-buffer (125 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM glukose, 10 mM HEPES, 2 mM CaCl 2 og 2 mM MgSO 4 i destillert H2O) for å dekke window.
- Plasser en runde glass dekkglass (# 1.5 tykkelse) på kranie vinduet.
- Fjern overflødig av cortex buffer rundt dekkglass.
- Forsegle kantene av dekkglass med polyakryl lim (se Materialer og utstyr).
MERK: Kontroller at limet ikke er brukt på oversiden av dekkglass. Hvis dekselet glass er forurenset med lim, vente til glasset er stabilt klistret til skallen og limet på glassflaten blir tørr, deretter forsiktig fjerne forurensende lim med en mikro. - Vent i 5 minutter for å la limet tørke opp.
- Bruke øret bar høyde skruer, justere hodeposisjon, slik at metallholderen kan plasseres.
- Påfør en liten mengde polyakryl lim på ringen av stålholderen (se Materialer og utstyr).
- Lim ring av stålholderen til glass dekkglass med metallholderen håndtaket rettet bakover.
- Vent i 5 minutter for å la limet tørke opp.
- Mix dental sement (se Materialer og utstyr) med polyakryl lim i en 3,5 cm petriskål (eller analog) for å oppnå viskøse forhold.
- Forsegle grensen til kranie vinduet med sement + lim blandingen og dekker den eksponerte overflaten av skallen med den samme blandingen opp til huden grensen.
- Vent i 15 minutter for å la sement + lim blandingen tørke opp og deretter fjerne øret barer.
- Utfør to-foton eksitasjon mikroskopisk (TPEM) bildebehandling for regionen av interesse og et kontrollområde som det er beskrevet i protokoll 3.
- Etter bildebehandling, at dyret kan gjenopprette fra anestesi på en varmepute og holde den i en individuell bur under observasjon inntil full restitusjon. Våtfôr kan gis for å lette tygging og hydrering.
2. Brain Injury Imaging Gjennom tynnet Skull
- Bedøvende dyr og klargjøring av operasjonsfelt
- Anesthetize mus og forberede den for traumer induksjonsom beskrevet i trinn 1.1.
- Skull tynning og påføre den stikk skade
- Plasser et lite dyr stereotaksisk instrument med dyret holderen (se Materialer og utstyr).
- Justere posisjonen av et binokulært mikroskop ved siden av stereotaksisk instrument for å fokusere på dyret skalleoverflaten.
- Finn bregma punkt på hodeskallen ved hjelp av kikkert mikroskop, identifisere hjernen området til å bli fotografert basert på stereotaktisk koordinater og markere det ved å skrape.
MERK: Skull tynning stilling bør ikke plasseres over eller i nærheten kraniale suturer, som skallen stabilitet er svekket i disse områdene. Videre store kortikale eller meningeal fartøyene og hjernehinnene som ligger under skallen sting vil sannsynligvis føre til bildebehandling gjenstander. - Plasser metallholderen belagt med lim over det aktuelle området på dyrets skallen, bruke et lett trykk og vent i 5 min til metallholderen sitter klistret til skallen. Bland dental sement (se Materialer og utstyr) med polyakryl lim i en 3,5 cm petriskål (eller analog) for å oppnå viskøse forhold.
- Forsegle grensene av metall holder med sement + lim blandingen og dekker den eksponerte overflaten av skallen med den samme blandingen opp til huden grensen.
- Vent i 15 minutter for å la sement og lim blandingen tørke opp.
- Skyll tynnet skallen regionen og de omkringliggende deler av metall holder flere ganger med PBS, slik at restene av nonpolymerized limet blir vasket bort.
MERK: Det er avgjørende å sikre stabil innfesting av skallen til innehaveren. Dette muliggjør fremstilling stabilitet under avbildning. - Ved å bruke en stor forstørrelse modusen for binokulært mikroskop, fjerner øvre lag av skallebenet med en høyhastighets mikro drill for å lage en tynnet skalle område på ~ 0,5 til 1,5 mm i diameter. Bruk trykkluft under boring for å fjerne bein rusk. Utfør bore intermittently under tynning fremgangsmåte for å unngå friksjon-indusert overoppheting. Avkjøl borkronen ved hjelp av romtemperatur-løsning og med jevne anvende buffer til tynnet området for å absorbere varme.
MERK: For å unngå skade på cortex, ikke bore over store områder (> 1,5 mm) ned til et tynt lag (<50 mikrometer).
MERK: Den gnager skallen bein struktur består av to tynne lag av kompakt bein atskilt med et tykt lag av svampaktig bein. Små hulrom av svampaktig bein danner konsentriske sirkler og canaliculi, som inneholder blodårer. Bruk microdrill for å fjerne både det ytre kompakt ben sjikt og det meste av svampaktig sjikt. Forstyrrelse av blodårene i svampaktig bein kan føre til blødninger. Bruk hemostase kollagen svamp for å stoppe denne blødningen. - Bruk andre-harmoniske generasjon (SHG) bildebehandling for å undersøke om de fleste av svampaktig bein er fjernet. Vær forsiktig for å unngå overdreven tynning, sørg for at de resterende bein er thicker enn 50 mikrometer på dette stadium av fremstillingen.
- Sette en dråpe av varm buffer (35-37 ° C) på toppen av den tynnet regionen. Bruk et mikrokirurgisk kniv eller Micro Finishing Bur for ytterligere å fjerne bein lag og danner en glatt område i ~ 700 mikrometer i diameter med bein tykkelse på ~ 20 pm. I løpet av dette trinnet, er det nyttig å utføre repetitive SHG bildebehandling og måle regelmessig benet tykkelse.
- Utfør TPEM bildebehandling for regionen av interesse og et kontrollområde.
- Juster hodestilling ved hjelp av øret bar høyde skruer på en slik måte at tynnet region er posisjonert strengt vannrett. Plasser nålen over tynnet regionen og sørge for at det ikke er noen store fartøyer under målrettede området.
- Gjør en lesjon ved å dyppe nålen i hjernen, i den dybde på 0,5 til 2,0 mm fra tynnet skallen overflate og i henhold til koordinatene for stikk påføringsstedet.
- Fjern nålen og undertrykke blødning vises etter than akutt hjerneskade med hemostatisk tampong (se Materialer og utstyr). Vent til blodpropp form og fartøy pulse på skadestedet stopper.
- Utfør mikroinjeksjon av 100 uM Sulforhodamine 101 eller en annen forbindelse av interesse inn i lesjonen side, slik det er beskrevet ovenfor i avsnitt 1.2.10.
- Utfør TPEM imaging å overvåke skaden progresjon og utvinning som beskrevet i protokoll 3.
- Etter bildebehandling, at dyret kan gjenvinne bevissthet fra anestesi på en varmepute. Ikke la dyret uten tilsyn og returnere den til sin hjem buret bare etter full fysisk restitusjon.
Tre. Imaging
- Plasser dyret under mikroskopet ved å feste metallholderen til tilpasset bygget rammen.
- For bildebehandling, bruke f.eks FV1000MPE to-foton mikroskop utstyrt med Mai Tai DeepSee laser og XLPLN 25X 1,05 NA vannimmersjonsobjektiv optimalisert for in vivo to-fotonbildebehandling.
- Identifiser lesjonen nettstedet under mikroskopet bruke et vidt felt fluorescens-modus. Bruk lange pass filter for å visualisere hjerne vaskulaturen og velger kontrollområdet i henhold til den observerte mønster av blodkar.
- Skal avbilde andre harmoniske generasjon (SHG) signal, tune den femtosecond laser til 800 nm bølgelengde og samle lyset bruker 380-410 nm bypass filter. For fluorescens bildebehandling, bruker bandet pass filter (515-560 nm) til å samle lyset, og følgende bølgelengder brukes til å opphisse fluorescens: GFP-860 nm, YFP-950 nm.
- Bruk Fluoview programvare for bildeopptak.
- Lagre koordinater for hver ROI for påfølgende repeterende bildebehandling. Bilde samme ROIs over tid, og justere koordinater hver gang for å maksimere bildeoverlapper hverandre.
- Analysere bilder med passende programvare (f.eks. ImageJ). Rekonstruksjoner som presenteres her ble gjort ved hjelp av Imaris programvare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har optimalisert to operasjonsprosedyrer: 1) kronisk kranie vindu og 2) kraniet tynning, for posttraumatisk avbildning av hjernen i transgene mus. Skjematisk oversikt over eksperimentelle preparater er presentert i figur 1. Trauma stikk ved nål med 0,3 mm OD (30 G) tilføres til det borede brønnen (figur 1A). En vellykket kranie vindu forberedelse gjør bildebehandling på dybder opp til 650 mikrometer under pial overflaten (Figur 1B), mens skallen tynning tendens til å innføre en grense på ca 300 mikrometer (figur 1C), som vist i 3D rekonstruksjon av Thy1-YFP- H mus kortikale pyramidale nevroner.
Stikk traumer resulterer i eliminering av dendritter og ødeleggelse av kapillære nettverk i et kontrollert volum av hjernebarken. I løpet av de to første dagene, økte lesjonsområdet og traumer indusert dendrite blebbing og dannelse av dendrittiske tilbaketrekkings bulbs i perilesion områder, som observert ved hjelp av in vivo multiphoton mikroskopi (figur 2).
Vi utførte skallen tynning til bilde aktivering og migrering av mikroglia i CX3CR1-EGFP mus umiddelbart etter skaden (figur 3A). SHG bildebehandling gir et verdifullt verktøy for å avgrense presist skade området (Figur 3B). Ekstracellulære matrise molekyler som produserer SHG signaler er sterkt anriket i hjernen parenchyma ved stikk traumer. Først er fine microglial prosesser hentet, da microglial celler migrere til grensen av skadestedet (figur 3A).
Å anslå potensielle skader indusert av tynne glass pipette innsetting og levering av fargestoff, vi utfører in vivo to-foton mikroskopi eksperimenter med Sulforhodamine 101 mikroinjeksjon i Thy1-YFP-H mus uten hjerne traumer. Representative bildene som er vist i Figur 4 viser microinjection stedet tre timer etter injeksjon. De spor av pipette innsetting kan sees i hjernehinnene visualisert ved SHG (figur 4A). Astrocytter er merket med Sulphorhodamine 101 innføres ved injeksjon (figur 4B). Dendritter uttrykker YFP henhold Thy1 arrangøren ikke påvise noen morfologiske tegn til skader som blebbing eller heve pærer (figur 4 C).
Figur 1. Metoden for akutt hjerneskade i kombinasjon med kranial vindu eller tynne skull preparater i kombinasjon med in vivo to-fotonmikroskopi. A. Traumatisk stikk ved stålnål en 0,3 mm OD (30G) påføres boret brønn. Nålen er kort dyppes i hjernen 0,5-2 mm dyp fra bunnen av brønnen. B, C (C). D. Bright synsfelt av de overfladiske blodkar gjennom glassvinduet umiddelbart etter akutt hjerneskade. E. Tynnet skallen før skaden søknaden. Den valgte region av interesse (hvit ramme) og stikk applikasjonsstedet (rød sirkel). Et annet område (rød ramme) av tynnet regionen bør bli fotografert for å overvåke mulige kirurgi-indusert gjenstander.
Figur 2. Eksempel på lengde multiphoton avbildning av hjernen traumer utvikling gjennom tynnet skallen. A. Åp visning av skade området omgitt av YFP-merket dendritter av kortikale nevroner 20 min etter traumer påføre, som avbildes gjennom tynnet skallen forberedelse. B. Forstørret bilde av området som er uthevet i panel A. C. Det samme området av hjernen som i B, reimaged 5 dager etter trauma. Dendrite blebbing er vist med hvite piler, dendrittiske heve pærer - med røde piler.
Figur 3. Eksempler på overvåking betennelse og gliaceller aktivering under utvikling av hjernetraume ved hjelp av forskjellige markører som egner seg for in vivo avbildning multiphoton f.eks fluorescerende proteiner, fargestoffer og andre harmoniske generering signal. Bildene ble ervervet 3 hr etter hjerneskade.
Figur 4. Undersøkelse av vev virkningen gjort av løsning injeksjon via et glass micropipette. A. Et spor (shown med stiplet linje) i SHG visualisere hjernehinnene tre timer etter injeksjon. B. Astrocytter merket med sulphorhodamine introdusert av injeksjonen. C. Dendritter uttrykker YFP henhold Thy1 promoter. D. Kombinert bilde av A (SHG - grå), B (astrocytter - rød), C (nevronale dendritter - gul).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Brain traumer er en brå, uforutsigbar hendelse. Her beskriver vi en dyremodell som gjengir et spektrum av patologiske forandringer observert i humane pasienter etter hjerneskader slik som neurodegenerering, eliminering av dendritter, hjerneødem, glial arr, blødninger i den cerebrale cortex kombinert med fokal subarachnoid blødning og økt permeabilitet av blod-hjerne-barrieren. For å studere primær og sekundær patogenese, samt utvinning etter traume, ble denne skaden modellen kombinert med langsgående in vivo visualisering av fine neuronal og glial-strukturer. Transgene mus linjer ble brukt som uttrykker fluorescerende proteiner i nerveceller (Thy1-YFP-H) 7, astrocytter (GFAP-EGFP) 8, eller microglia (CX3CR1-EGFP) 9. I tillegg brukte vi andre harmoniske generasjon (SHG) bildebehandling og astrocyte lasting med Sulfarhodamine 101 10.
Modellen er beskrevet her sammenfatter penetrating type hjerneskade. Derfor er en begrensning av den foreliggende modell, er at den ikke gir informasjon om mekanismene for lukket hodeskade. Nylig Sword og medforfattere rapportert multiphoton imaging resultater på celle atferd i pericontusional cortex seks. Tatt i betraktning at lukket hodeskade er en hyppigere medisinsk tilfelle, er den metodiske tilnærmingen rapportert av forfatterne svært lovende til å utfylle tradisjonelle forskningsmetoder innen innvirkning hjernetraume 11.
Vi brukte både kronisk kranie vindu 12 og skallen tynning 13 forberedelsene til å studere celle oppførsel under posttraumatiske tilstander i levende hjerne. Begge fremgangsmåter har visse fordeler og begrensninger. Således gir kronisk cranial vinduet bedre oppløsning, optiske dypere penetrasjon inn i hjernevevet og bekvemmelighet for flere imaging sesjoner. Motsatt er mindre sannsynlig å indusere betennelse på th skallen tynninge bildebehandling stedet, og, kanskje enda viktigere, gjør det gjentatte anvendelser av narkotika og fargestoffer. Noen få eksempler på farmakologiske midler som skal anvendes i denne type forsøk er gitt i tabell 1..
| Agent typen | Injisert agenten | Områder av biologi / apotek forskning |
| Anti-inflammatorisk | Ciklosporin A | Traumatisk hjerneskade, sekundære skader, neurodegenerering |
| Toksiner | Tetrodotoxin | TBI - sekundære skader, excytotoxicity |
| Bicuculline | TBI - sekundære skader, klorid homeostase | |
| Hemmere av signalveier | PD98059 (MAPKK hemmer) | signaliserer mekanismer for betennelse, sekundære skader, posttraumatisk celledød, nevrodegenerasjon og regenerering |
| SU6656 (Src familien kinase inhibitor) | ||
| Neurotrofiske faktorer | Brain-derived neurotrophic factor, BDNF | TBI - nevronale overlevelse etter skade, nevro i videregående posttraumatisk hjerneskade |
| Virus | lentiviral vektorer for protein expression | molekylære mekanismer av posttraumatisk nevrodegenerasjon og regenerering, differensial merking av celletyper i skadet hjernen for in vivo avbildning |
| adenovirus vektorer for protein expression | ||
| Ca 2 + fluorescerende indikatorer | Fluo-2, 4 | signaliserer mekanismer på posttraumatisk betennelse, celledød, cellemigrasjon, axonal / dendrittiske regenerering |
Tabell 1. Farmakologiske midler og fargestoffer for cortical injeksjon i stikk skade modell.
Et bredt spekter av biokjemiske hendelser som er av stor betydning under fysiologiske og patologiske tilstander kan bli probet med kjemiske inhibitorer, fluorescerende indikatorer og mutant protein innført via virale konstruksjoner. Fordeler for å velge bestemt tidsvindu som tilbys av skallen tynning preparatet kan være svært relevant for disse studiene.
I denne studien har vi brukt andre harmoniske generasjon signal å avgrense skaden området. Alternativt kan skade området grenser som angis av en svakt spredende fluorescerende fargestoff, f.eks en høymolekylær dekstran fluorescerende konjugat (2 millioner Dalton).
Nylig, Schaffer og kolleger 14 har brukt en kronisk forberedelsemed reopenable kranie vindu for repeterende levering av fluorescerende fargestoffer til mus cortex. Det er sannsynlig at kranie vindu gjenåpning kan påvirke hjernevevet åpenhet. Videre er det vanskelig å forutsi tidsforløpet for gjenåpning-indusert inflammasjon, som kan påvirke bindevev gjenvekst.
En stor fordel med den tynnet skallen preparatet er muligheten til å levere terapeutiske forbindelser (og andre materialer som krever lokal injeksjon i hjernevev) flere ganger under progresjon av trauma, uten komplise gjenstander (f.eks uten kranial vindu gjenåpning).
Ved repeterende forbindelse levering direkte til skadestedet er ønsket, bør man vurdere spesielle midler for å hindre at hodeskallen tørke ut og bakteriell infeksjon. Således holder drives hoderegionen under sterile betingelser og anvendelse av antibiotika (for eksempel enrofloxacin) anbefales. For å bevare thinned skallen regionen fra tørking, fyll metallholderen med 1,5% agarose og dekke den med runde glass dekkglass. I de fleste tilfeller vil dette tillate å opprettholde de samme transparens eller tynnet skallen over en periode på opptil 10 dager. Noe tilleggs bør tas hvis flere imaging økter i tynnet skallen forberedelse er planlagt over en lengre tidsperiode. Umiddelbart før hver avbildning sesjon, forsiktig fjerne den nylig dannet bindevev fra tynnet regionen ved hjelp av en mikro blad. Bruk TPEM avbildning av SHG å verifisere bildekvalitet og måle beintykkelse. Tissue gjenvekst kan kompromittere penetrasjon dybde og årsaken bildet blir uskarpt ledsaget av en økning i bakgrunnen fluorescens. Oppdater skallen tynning forsiktig med en mikrokirurgisk kniv for å gjenvinne høy bildekvalitet.
I de tilfellene som ikke krever direkte tilgang til skadestedet, anbefaler vi sterkt dekker tynnet regionen i skallen med et glass coverslip som beskrevet i avisen på polert og forsterket tynnet skallen forberedelse ved Kleinfeld og kolleger 15. Dette kan gjøres ved hjelp av følgende valgfrie prosedyre. Plasser en liten dråpe agarose (1,5%) på tynnet skallen regionen, må du vente til det blir en gel, fjerne all unødvendig agarose, dvs. la den bare på skadestedet. Agarose bør beskytte skadestedet fra eksterne effekter. Tørk tynnet skallen regionen ved hjelp av trykkluft. Drop en liten mengde polyakryl lim på en liten del av # 0 coverglass og plassere den på tynnet skallen regionen. Polyakrylsyresaltet limet hindrer bein og bindevev gjenvekst, og dermed holde tynnet skallen under vinduet bevart.
En kombinasjon av disse fremgangsmåter gjør det mulig å studere akutt og kronisk posttraumatiske prosesser, og leverer medikamenter topisk eller systemisk, og direkte overvåking av behandlingseffekter. Bruk av doble eller triple transgene mus linjer kan også være gunstig, særsielt for samtidige avbildning av flere posttraumatiske prosesser, for eksempel glial arrdannelse og nevronale gren gjenvekst. Vi forventer at våre modeller for akutt hjerneskade studert med intra to-foton mikroskopi for å være fruktbart for narkotika kandidat testing.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi er dypt takknemlig til Dr. Frank Kirchhoff for å gi GFAP-EGFP og CX3CR1-EGFP musestammer. Arbeidet ble støttet med tilskudd fra Centre of International Mobility of Finland, Tekes, finsk Graduate School of Neuroscience (FGSN) og Academy of Finland.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2A-sa dumb Tweezers, 115 mm | XYtronic | XY-2A-SA | |
| 30 G ½ in needle | BD | REF 304000 | |
| Animal trimmer, shaving machine | Aesculap | Isis GT420 | |
| Binocular Microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Biological Temperature Controller with stainless steel heating pad | Supertech | TMP-5b | |
| Blunt microsurgical blade | BD | REF 374769 | |
| Borosilicate tube with filament | Sutter Instruments | BF120-69-10 | For glass pipette production |
| Carprofene | Pfizer | Rimadyl vet | |
| Chlorhexidine digluconate | Sigma | C9394 | |
| Dental cement | DrguDent, Dentsply | REF 640 200 271 | |
| Dexamethasone | FaunaPharma | Rapidexon vet | |
| Disposable drills | Meisinger | HP 310 104 001 001 008 | |
| Dulbeco’s PBS 10x | Sigma | D1408 | |
| Dumont #5 forceps, 110 mm | FST | 91150-20 | |
| Ealing microelectrode puller | Ealing | 50-2013 | Vertical puller for glass pipette production |
| Eye ointment | Novartis | Viscotears | |
| Foredom drill control | Foredom | FM3545 | |
| Foredom micromotor handpiece | Foredom | MH-145 | |
| Gas anesthesia platform for mice | Stoelting | 50264 | Assembled on stereotaxic instrument |
| Hemostasis Collagen Sponge | Avitene, Ultrafoam BARD | Ref 1050050 | |
| Imaris | Bitplane | ||
| Ketamine | Intervet | Ketaminol vet | |
| Mai Tai DeepSee laser | Spectra-Physics | ||
| Metal holder | Neurotar | ||
| Microdressing forceps, 105 mm | Aesculap | BD302R | |
| Microfil | WPI | MF34G-5 | Micro syringe filling capillaries |
| Mineral oil | Sigma | M8410 | |
| Multiphoton Laser Scanning Microscope | Olympus | FV1000MPE | |
| NanoFil Syringe 10 μl | WPI | NANOFIL | Hamilton syringe |
| Nonwoven swabs 5 x 5 | Molnlycke Health Care | Mesoft | Surgical tampons |
| Polyacrylic glue | Henkel | Loctite 401 | |
| Round glass coverslip | Electron Microscopy Sciences | ||
| 1.5 thickness | |||
| Small animal stereotaxic instrument | David Kopf Instruments | 900 | |
| Stoelting mouse and neonatal rat adaptor | Stoelting | 51625 | Assembled on stereotaxic instrument. |
| Student iris scissors, straight 11.5 cm | FST | 91460-11 | |
| Sulforhodamine 101 | Molecular Probes | S-359 | |
| UMP3 microsyringe pump and Micro 4 microsyringe pump controller | WPI | UMP3-1 | Microinjector and controller |
| Xylazine | Bayer Health Care | Rompun vet |
References
- Lighthall, J. W. Controlled cortical impact: A new experimental brain injury model. J. Neurotrauma. 5 (1), 1-15 (1988).
- Lindgren, S., Rinder, L.
- Shreiber, D. I., et al. Experimental investigation of cerebral contusion: histopathological and immunohistochemical evaluation of dynamic cortical deformation. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 58 (2), 153-164 (1999).
- Feeney, D. M., Boyeson, M. G., Linn, R. T., Murray, H. M., Dail, W. G. Responses to cortical injury: I. Methodology and local effects of contusions in the rat. Brain Res. 211 (1), 67-77 (1981).
- Bardehle, S., et al. Live imaging of astrocyte responses to acute injury reveals selective juxtavascular proliferation. Nat. Neurosci. 16 (5), 580-586 (2013).
- Sword, J., Masuda, T., Croom, D., Kirov, S. A. Evolution of neuronal and astroglial disruption in the peri-contusional cortex of mice revealed by in vivo two-photon imaging. Brain. 136 (5), 1446-1461 (2013).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Nolte, C., et al. GFAP promoter-controlled EGFP-expressing transgenic mice: a tool to visualize astrocytes and astrogliosis in living brain tissue. Glia. 33 (1), 72-86 (2001).
- Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol. Cell. Biol. 20 (11), 4106-4114 (2000).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Kerr, J. N. D., Helmchen, F. Sulforhodamine 101 as a specific marker of astroglia in the neocortex in vivo. Nat. Methods. 1 (1), 31-37 (2004).
- Carré, E., et al. Technical aspects of an impact acceleration traumatic brain injury rat model with potential suitability for both microdialysis and PtiO2 monitoring. J. Neurosci. Methods. 140, 23-28 (2004).
- Holtmaat, A., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat. Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. B. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nat. Protoc. 5, 201-208 (2010).
- Cianchetti, F. A., Kim, D. H., Dimiduk, S., Nishimura, N., Schaffer, C. B. Stimulus-evoked calcium transients in somatosensory cortex are temporarily inhibited by a nearby microhemorrhage. PloS one. 8 (5), (2013).
- Shih, A. Y., Mateo, C., Drew, P. J., Tsai, P. S., Kleinfeld, D. A polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain. J. Vis. Exp. 61, (2012).
