Summary
Trauma cerebral aguda es una lesión grave que no tiene un tratamiento adecuado hasta la fecha. Multiphoton microscopía permite estudiar longitudinalmente el proceso de desarrollo trauma cerebral agudo y en la exploración de estrategias terapéuticas en los roedores. Dos modelos de trauma cerebral agudo estudiado con imágenes in vivo de dos fotones de cerebro se demuestran en este protocolo.
Abstract
Aunque el trauma cerebral aguda a menudo resulta de daño cabeza en diferentes accidentes y afecta a una fracción sustancial de la población, no existe un tratamiento eficaz para la que todavía. Limitaciones de modelos animales utilizados actualmente impiden la comprensión del mecanismo de patología. Multiphoton microscopía permite estudiar las células y los tejidos dentro de los cerebros animales intactos longitudinalmente en condiciones fisiológicas y patológicas. A continuación, describimos dos modelos de lesión cerebral aguda estudiados por medio de dos fotones de imágenes de la conducta de las células cerebrales en condiciones postraumáticas. Una región del cerebro seleccionado se lesiona con una aguja para producir un trauma de una anchura controlada y la profundidad en el parénquima cerebral. Nuestro método utiliza pinchazo estereotáxica con una aguja de jeringa, que se puede combinar con la aplicación del fármaco simultánea. Proponemos que este método se puede utilizar como una herramienta avanzada para estudiar los mecanismos celulares de consecuencias fisiopatológicas de trauma agudo en cerebro de los mamíferos
Introduction
Lesión cerebral aguda es un problema de salud pública con una alta incidencia de lesiones en accidentes automovilísticos, caídas o agresiones, y la alta prevalencia de la discapacidad crónica posterior. Enfoques terapéuticos para el tratamiento de la lesión cerebral permanecen totalmente sintomático, lo que limita la eficacia de la atención pre-hospitalaria, quirúrgica y crítica. Esto hace que el impacto social y económico de la lesión cerebral particularmente grave. Por una variedad de razones, la mayoría de los ensayos clínicos no han demostrado mejora en la recuperación después de la lesión cerebral utilizando nuevos enfoques terapéuticos.
Los modelos animales son cruciales para el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas hacia una etapa en que la eficacia del medicamento se puede predecir en los pacientes con lesiones cerebrales. En la actualidad, existen varios modelos animales bien establecidos de trauma en la cabeza, incluyendo el impacto controlado cortical 1, lesión de percusión de fluido 2, la deformación cortical dinámico 3, peso-drop4, y la lesión foto 5. Un número de modelos experimentales se han utilizado para estudiar algunos aspectos morfológicos, moleculares y de comportamiento de la patología asociada con el trauma de cabeza. Sin embargo, ningún modelo animal único es un éxito completo en la validación de nuevas estrategias terapéuticas. Desarrollo de modelos confiables, reproducibles y controlados animales de lesión cerebral, es necesario evaluar los procesos patológicos complejos.
La nueva combinación de las últimas tecnologías de la imagen microscópica y reporteros fluorescentes genéticamente codificados ofrece una oportunidad sin precedentes para investigar todas las fases de la lesión cerebral, que incluyen la lesión primaria, extensión de la lesión primaria, lesión secundaria, y la regeneración. En particular, microscopía in vivo de dos fotones es una tecnología óptica no lineal único que permite la visualización en tiempo real de las estructuras celulares y subcelulares incluso en profundas capas corticales del cerebro de roedores. Varios tipos de células y OrgaNelles se pueden obtener imágenes de forma simultánea mediante la combinación de diferentes marcadores fluorescentes. El uso de esta potente herramienta, podemos visualizar cambios morfológicos y funcionales dinámicos en el cerebro que vive en condiciones postraumáticas. Las ventajas de la in vivo microscopía de dos fotones en el estudio de la lesión cerebral se demostraron recientemente por Kirov y colegas 6. Utilizando un modelo de contusión cortical focal leve, estos autores demostraron que la lesión aguda dendríticas en la corteza pericontusional es cerrada por la disminución en el flujo sanguíneo local. Por otra parte, demostraron que la corteza metabólicamente comprometido alrededor del sitio de contusión está dañado aún más por la despolarización de la difusión. Este daño secundario afecta circuitos sinápticos, haciendo que las consecuencias de la lesión cerebral traumática más severa.
Aquí, se propone el método de punción estereotáxica con una aguja de jeringa, que podría combinarse con la aplicación tópica del fármaco simultánea, como un modelo avanzado de cerebro locallesiones y como una herramienta para estudiar las consecuencias fisiopatológicas de trauma agudo en el cerebro de mamíferos in vivo.
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Protocol
Todos los procedimientos que aquí se presentan se realizaron de acuerdo a la guía local para el cuidado de animales (La Ley finlandesa sobre Experimentación Animal 62/2006). Licencia Animal (ESAVI/2857/04.10.03/2012) se obtuvo de las autoridades locales (ELÄINKOELAUTAKUNTA-ELLA). Ratones adultos de 1-3 meses de edad, peso 24-38 g, se mantuvieron en jaulas individuales en las instalaciones de animales certificados de la Universidad y siempre con comida y agua ad libitum.
1. Lesión Cerebral Imaging través de una ventana craneal
- Anestesiar animales y la preparación del campo operatorio
- Anestesie ratones por inyección peritoneal de una mezcla de ketamina (Ketalar, 80 mg / kg) y xilazina (Rompun, 10 mg / kg) disuelto en esterilizada por filtración tampón fosfato salino (PBS), pH 7,4. Compruebe los reflejos del ratón de forma regular (de cola y sonda pizca dedo del pie) para verificar la profundidad de la anestesia. Aumentar la dosis cuando sea apropiado, para mantener la anestesia adecuada, pero evitar Overdose.
- Mantener el animal a 37,0 ° C usando una almohadilla calefactora durante la operación quirúrgica, sesión de imágenes y primera hora después de la recuperación de la anestesia.
- Para proteger los ojos del ratón se seque, aplique lubricante ocular.
- Administrar dexametasona (veterinario Rapidexon, 2 mg / kg) por inyección subcutánea para reducir la inflamación y el edema cerebral.
- Administrar un analgésico (por ejemplo, ketoprofeno por vía intraperitoneal) hasta 30 minutos antes o inmediatamente después de la cirugía. Si el animal muestra algún síntoma de dolor, como la renuencia a moverse, comer o beber, o pérdida de peso, salivación, piloerección o respiratoria anormal sonidos después de la cirugía, repetir la inyección de analgésico.
- Afeitarse la cabeza del ratón 'con una máquina de afeitar (ver Materiales y Equipos). Evite dañar los bigotes.
- Tratar la piel sobre la cabeza del ratón con solución de etanol al 70% para limpiar el área afeitada.
- Con unas tijeras quirúrgicas (ver Materiales yEquipment) y las pinzas (ver Materiales y Equipos), cortaron la piel de la línea media entre las orejas de la frente.
- Raspar suavemente lejos el tejido conectivo unido al cráneo con una cuchilla microquirúrgica contundente.
- Deslice las fronteras de la piel hacia los lados y tire de barras para los oídos ligeramente en los orificios auditivos en el cráneo de la cabeza y la fijación de la piel.
- Limpie el cráneo con PBS estéril y tratar la zona de la cirugía en la cabeza del ratón con el 0,5% de digluconato de clorhexidina, luego seque la superficie del cráneo usando una combinación de hisopos de algodón estériles y aire comprimido.
- Imposición de la lesión pinchazo
- Coloque un pequeño animal instrumento estereotáxico con un titular de los animales (ver Materiales y Equipos).
- Ajustar la posición del microscopio binocular al lado del instrumento estereotáxico para centrarse en la superficie del cráneo del animal.
- Utilizando un microscopio binocular, localice el punto bregma en el cráneo.
- Identificar el region de interés utilizando las coordenadas estereotáxica.
NOTA: Evite las áreas de interés que se encuentran directamente sobre los vasos corticales superficiales. La destrucción de estas puede afectar fuertemente a la progresión trauma. - Coloque la aguja de 30 G por encima de la región elegida y marca el sitio de destino por el rascado la superficie del cráneo.
- Perforar el cráneo con todas las precauciones posibles para evitar la ampliación innecesaria de la superficie del hueso afectado. Use un taladro quirúrgico de alta velocidad (ver Materiales y Equipos) bajo el microscopio. Fresando si el líquido aparece en el área perforada.
- Toque la parte inferior del pozo perforado con la aguja.
- Sumergir la aguja sin problemas en el cerebro (tasa de inserción de 5-10 mm / min), a la profundidad de 0,5-2,0 mm de acuerdo con las coordenadas de la zona de aplicación de pinchazo.
- Retire la aguja inmediatamente después de llegar a la profundidad deseada (velocidad de retracción de 5-10 mm / min) y limpiar la sangre que aparece después del pinchazo con un pequeño tapón (see Los materiales y equipos).
- Realizar la microinyección de 100 M sulforrodamina 101 u otro compuesto de interés en el sitio de la lesión utilizando una bomba de microjeringa (WPI) y 10 l jeringa Hamilton de montar con pipeta de vidrio.
NOTA: Durante la preparación de la pipeta de vidrio de capilar de vidrio de borosilicato, afilar la punta de un diámetro de 10 a 20 micras. - Infundir 250-1.500 nl de la solución de inyección a una velocidad de 2-5 nl / seg.
NOTA: Deje la pipeta después de la final de la infusión durante al menos 5 min en el parénquima cerebral, luego retírela lentamente y con cuidado para evitar la solución de flujo de salida.
- Craneotomía para ventana craneal crónica
- Perforar el cráneo con mucho cuidado para hacer una ventana de círculo alrededor del sitio de la lesión. Utilice la ventana diámetro de 3-3,5 mm.
- Aplicar una gota de tampón de corteza (NaCl 125 mM, KCl 5 mM, glucosa 10 mM, HEPES 10 mM, CaCl2 2 mM y 2 mM de MgSO4 en H2O destilada) para cubrir el wiNDOW.
- Coloque un cubreobjetos ronda (# 1.5 grosor) en la ventana del cráneo.
- Retire el exceso de buffer de la corteza alrededor del cubreobjetos.
- Selle los bordes del cubreobjetos con pegamento acrílico (ver Materiales y Equipos).
NOTA: Asegúrese de que el pegamento no se aplica a la superficie superior del cubreobjetos. Si el cristal de la cubierta está contaminada con cola, esperar hasta que el vidrio sea de forma estable pegado al cráneo y el pegamento en la superficie de vidrio se seca, a continuación, retire con cuidado el pegamento contaminando con un microcuchilla. - Espere 5 minutos a que el pegamento se seque.
- Con los tornillos altura de la barra del oído, ajuste la posición de la cabeza de manera que el soporte de metal puede ser colocado.
- Aplique una pequeña cantidad de pegamento acrílico en el anillo del soporte de acero (ver Materiales y Equipos).
- Pegue el anillo del soporte de acero para el cubreobjetos de vidrio con la maneta metal titular dirigido hacia atrás.
- Espere 5 minutos a que el pegamento se seque.
- Mix cemento dental (ver Materiales y equipos) con pegamento poliacrílico en una placa de 3,5 cm de Petri (o análogo) para lograr condiciones viscosos.
- Selle los bordes de la ventana craneal con la mezcla + cemento cola y cubrir la superficie expuesta del cráneo con la misma mezcla hasta la frontera de la piel.
- Espere 15 minutos para dejar que la mezcla de pegamento + cemento seque y luego retire las barras de oído.
- Realice microscópica de excitación (TPEM) de dos fotones para la región de interés y un área de control, ya que se describe en el Protocolo 3.
- Después de las imágenes, que el animal pueda recuperarse de la anestesia en una almohadilla eléctrica y mantenerla en una jaula individual bajo observación hasta la recuperación completa. Alimento húmedo se puede dar para facilitar la masticación y la hidratación.
2. Lesión Cerebral Imaging través del cráneo Diluido
- Anestesiar animales y la preparación del campo operatorio
- Anestesiar el ratón y prepararlo para la inducción traumacomo se describe en el paso 1.1.
- Cráneo adelgazamiento e imposición de la lesión pinchazo
- Coloque un pequeño animal instrumento estereotáxico con el titular de los animales (ver Materiales y equipos).
- Ajuste la posición de un microscopio binocular junto al instrumento estereotáxico para centrarse en la superficie del cráneo animal.
- Localice el punto bregma en el cráneo usando un microscopio binocular, identificar el área del cerebro en ser fotografiado en base a coordenadas estereotáxica y se marca por el rascado.
NOTA: La posición adelgazamiento cráneo no debe colocarse sobre o cerca suturas craneales, como la estabilidad del cráneo se ve comprometida en esas áreas. Por otra parte, los grandes vasos y las meninges, situados debajo de las suturas del cráneo corticales o meníngeos son susceptibles de causar los artefactos de imagen. - Coloque el soporte de metal recubierto con pegamento sobre el área de interés en el cráneo del animal, aplicar una ligera presión y esperar 5 minutos hasta que el soporte de metal está sólidamente pegadas al cráneo. Mezclar cemento dental (ver Materiales y equipos) con pegamento poliacrílico en una placa de 3,5 cm de Petri (o análogo) para lograr condiciones viscosos.
- Selle los bordes del soporte de metal con la mezcla + cemento cola y cubrir la superficie expuesta del cráneo con la misma mezcla hasta la frontera de la piel.
- Espere 15 minutos para dejar que el cemento y la mezcla de pegamento se secan.
- Enjuague la región adelgazada cráneo y las partes circundantes del soporte metálico varias veces con PBS, de manera que los restos de pegamento no polimerizado son lavados.
NOTA: Es fundamental para garantizar el apego estable del cráneo para el titular. Esto permite que la estabilidad de la preparación durante la exploración. - Usando el modo de alta magnificación del microscopio binocular, eliminar las capas superiores del hueso del cráneo con una micro-perforación de alta velocidad para crear una zona adelgazada cráneo de ~ 0,5 a 1,5 mm de diámetro. Utilice aire comprimido durante la perforación para eliminar los restos de los huesos. Realice la perforación intermittentlY durante el procedimiento de adelgazamiento con el fin de evitar el sobrecalentamiento inducida por la fricción. Se enfría la broca utilizando la solución a temperatura ambiente y aplicar periódicamente tampón a la zona adelgazada para absorber el calor.
NOTA: Para evitar daños en la corteza, no perforar en grandes regiones (> 1,5 mm) hasta una capa fina (<50 micras).
NOTA: La estructura ósea del cráneo del roedor se compone de dos capas delgadas de hueso compacto separadas por una gruesa capa de hueso esponjoso. Cavidades diminutas de la forma del hueso y círculos concéntricos canalículos esponjosos, que contienen vasos sanguíneos. Utilice la microtaladro para eliminar tanto la capa de hueso compacto externo y la mayor parte de la capa esponjosa. La interrupción de los vasos sanguíneos dentro del hueso esponjoso puede causar sangrado. Utilice la hemostasia esponja de colágeno para detener el sangrado. - Utilice la generación de segundo armónico (SHG) de formación de imágenes para examinar si se ha eliminado la mayoría del hueso esponjoso. Tenga cuidado de evitar el adelgazamiento excesivo, asegúrese de que el hueso restante es thel parpadeo de 50 micras, en esta etapa de la preparación.
- Ponga una gota de tampón caliente (35-37 ° C) en la parte superior de la región adelgazada. Utilice una hoja de microcirugía o Micro Acabado Bur para eliminar más capas de hueso y formar un área lisa de ~ 700 m de diámetro con un grosor de hueso de ~ 20 micras. Durante este paso, es útil para realizar las imágenes SHG repetitivo y medir regularmente el espesor de los huesos.
- Realice imagen TPEM para la región de interés y un área de control.
- Ajustar la posición de la cabeza con los tornillos altura de la barra del oído de una manera tal que adelgaza región está posicionado estrictamente horizontal. Coloque la aguja por encima de la región adelgazada y asegúrese de que no hay grandes vasos debajo de la página de destino.
- Hacer una lesión por inmersión de la aguja en el cerebro, a la profundidad de 0,5-2,0 mm de superficie del cráneo adelgazada y de acuerdo con las coordenadas de la zona de aplicación de pinchazo.
- Retire la aguja y reprimir la hemorragia que aparece después de tque la lesión cerebral aguda con el tapón hemostático (ver Materiales y equipos). Espere hasta que se forman coágulos sanguíneos y la pulsación del vaso en el lugar de la lesión se detiene.
- Realizar la microinyección de 100 M sulforrodamina 101 u otro compuesto de interés en el sitio de la lesión, tal como se describe anteriormente en la Sección 1.2.10.
- Realice imagen TPEM para monitorear la progresión de lesiones y la recuperación como se describe en el Protocolo 3.
- Después de las imágenes, que el animal pueda recuperar la conciencia de la anestesia en una almohadilla térmica. No deje que el animal desatendido y devolverlo a su jaula sólo después de la recuperación física completa.
3. Imaging
- Colocar el animal bajo el microscopio por colocación del soporte del metal para el marco a la medida.
- Para imágenes, utilizar por ejemplo el FV1000MPE microscopio de dos fotones equipado con láser de Mai Tai DeepSee y XLPLN 25X 1,05 NA objetivo de inmersión en agua optimizado para in vivo de dos fotonesde formación de imágenes.
- Identificar el lugar de la lesión en el microscopio utilizando el modo de fluorescencia de campo amplio. Utilice filtros de paso largo para visualizar la vasculatura cerebral y seleccione el área de control de acuerdo con el patrón observado de los vasos sanguíneos.
- Para la imagen de la señal de generación de segundo armónico (SHG), ajustar el láser de femtosegundo para la longitud de onda de 800 nm y recogen la luz emitida mediante el filtro de derivación nm 380-410. Para imágenes de fluorescencia, utilice el filtro de paso de banda (515-560 nm) para recoger la luz emitida, y las siguientes longitudes de onda se utilizan para excitar la fluorescencia: GFP-860 nm, YFP-950 nm.
- Utilice software Fluoview para la adquisición de imágenes.
- Tienda Coordenadas cada ROI para imágenes repetitivas posterior. Imagen de la misma ROI con el tiempo, y ajustar las coordenadas cada vez para maximizar el solapamiento de imagen.
- Analizar las imágenes con el software apropiado (por ejemplo. ImageJ). Las reconstrucciones que se presentan aquí se realizaron utilizando el software Imaris.
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Representative Results
Hemos optimizado dos procedimientos de operación: 1) la ventana craneal crónica y 2) adelgazamiento del cráneo, por imagen cerebral postraumático en ratones transgénicos. Vista esquemática de las preparaciones experimentales se presenta en la Figura 1. Pinchazo traumática por aguja de acero de 0,3 mm de diámetro exterior (30 g) se aplica a la pozo perforado (Figura 1A). Una preparación de ventana del cráneo con éxito permite obtener imágenes a profundidades de hasta 650 m por debajo de la superficie pial (Figura 1B), mientras que el adelgazamiento cráneo tiende a imponer un límite de aproximadamente 300 micras (Figura 1C), como se demuestra en la reconstrucción 3D de Thy1-YFP- H ratón neuronas piramidales corticales.
Los resultados de trauma de punción en la eliminación de dendritas y la destrucción de las redes de capilares en un volumen controlado de la corteza cerebral. Durante los dos primeros días, el área de la lesión aumenta y el trauma ocasionado blebbing dendrita y la formación de la retracción dendrítica bULB en las áreas perilesion, como se observa utilizando microscopía multifotónica en vivo (Figura 2).
Se realizó cráneo adelgazamiento a la activación de la imagen y la migración de la microglia en ratones CX3CR1-EGFP inmediatamente después de la lesión (Figura 3A). La formación de imágenes de SHG ofrece una valiosa herramienta para delinear con precisión el sitio de la lesión (Figura 3B). Moléculas de la matriz extracelular que producen señales de los grupos de autoayuda se enriquecen en gran medida en el parénquima cerebral en el traumatismo pinchazo. En primer lugar, se recuperan los procesos microgliales finos, a continuación, las células microgliales migran hacia el borde de la zona de la lesión (Figura 3A).
Para estimar las posibles lesiones inducidas por la inserción de la pipeta de vidrio delgado y entrega de tinte, llevamos a cabo in vivo de dos fotones experimentos de microscopía con Sulforodamina 101 microinyección en ratones Thy1-YFP-H sin trauma cerebral. Imágenes representativas se muestran en la Figura 4 demuestran millassitio croinjection 3 horas después de la inyección. La traza de la inserción de la pipeta se puede ver en las meninges cerebrales visualizados por SHG (Figura 4A). Los astrocitos se etiquetan con Sulphorodamine 101 introducido por la inyección (Figura 4B). Las dendritas que expresan YFP bajo el promotor Thy1 no demuestran signos morfológicos de lesión como bombillas blebbing o retracción (Figura 4 C).
Figura 1. El método de la lesión cerebral aguda en combinación con la ventana craneal o cráneo preparaciones finas combinados con microscopía in vivo de dos fotones. A. Pinchazo traumática por aguja de acero de 0.3mm OD (30G) aplicados a bien el taladrado. La aguja se sumerge brevemente en el cerebro de 0,5-2 mm de profundidad desde la parte inferior del pozo. B, C (C). D. Campo de visión brillante de los vasos sanguíneos superficiales a través de la ventana de vidrio inmediatamente después de la lesión cerebral aguda. E. Diluido cráneo antes de la aplicación de la lesión. La región elegida de interés (marco blanco) y el punto de aplicación de pinchazo (círculo rojo). Un área diferente (cuadro rojo) de la región adelgazada debe tomarse imágenes para monitorear posibles artefactos inducida por la cirugía.
Figura 2. Ejemplo de proyección de imagen multifotónica longitudinal de desarrollo trauma cerebral a través del cráneo adelgazada. Una. Paravista p del sitio de la lesión rodeada de dendritas marcadas con YFP de neuronas corticales 20 min después de infligir un trauma, como reflejado a través de la preparación del cráneo adelgazada. B. La vista ampliada del área mostrada en el panel A. C. La misma área del cerebro como en B, reimaged 5 días después de un trauma. Dendrita blebbing se muestra con flechas blancas, bulbos de retracción dendríticas - con flechas rojas.
Figura 3. Ejemplos de inflamación monitoreo y activación glia durante el desarrollo de un traumatismo cerebral utilizando diferentes marcadores adecuados para la formación de imágenes in vivo de proteínas en multifotón por ejemplo fluorescentes, colorantes y segunda señal de generación de armónicos. Las imágenes se adquirieron 3 horas después de la lesión cerebral.
Figura 4. Examen de impacto tejido hecho por inyección de la solución a través de una micropipeta de vidrio. A. Un trace (shown con línea discontinua) en SHG visualizar meninges cerebrales 3 horas después de la inyección. B. Los astrocitos marcados con sulforodamina introducidas por la inyección. C. Las dendritas que expresan YFP bajo el promotor Thy1. D. Imagen combinada de A (SHG - gris), B (astrocitos - rojo), C (dendritas neuronales - amarillo).
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Discussion
Traumatismo cerebral es un acontecimiento imprevisible abrupto. Aquí, se describe el modelo animal que reproduce un espectro de cambios patológicos observados en pacientes humanos después de la lesión cerebral, tales como la neurodegeneración, la eliminación de las dendritas, edema cerebral, cicatriz glial, hemorragias en la corteza cerebral, junto con una hemorragia subaracnoidea focal y aumento de la permeabilidad de la barrera sangre-cerebro. Para estudiar la patogénesis primaria y secundaria, así como la recuperación después de un traumatismo, este modelo de lesión se combinó con longitudinal en la visualización in vivo de estructuras bien neuronal y glial. Líneas de ratones transgénicos fueron utilizados que expresan proteínas fluorescentes en las neuronas (Thy1-YFP-H) 7, los astrocitos (GFAP-EGFP) 8, o microglia (CX3CR1-EGFP) 9. Además, se utilizó generación de segundo armónico (SHG) de imágenes y de los astrocitos de carga con Sulfarhodamine 101 10.
El modelo descrito aquí recapitula penetrante tipo de lesión cerebral. Por lo tanto, una limitación de este modelo es que no proporciona información sobre los mecanismos de lesión en la cabeza cerrada. Recientemente Espada y coautores reportaron resultados de imagen multifotónica en el comportamiento de las células en la corteza pericontusional 6. Teniendo en cuenta que cerró lesión en la cabeza es un caso médico más frecuentes, el enfoque metodológico reportado por los autores es muy prometedor para complementar los métodos tradicionales de investigación en el campo de trauma cerebral impacto 11.
Se utilizó tanto la ventana craneal crónica 12 y el cráneo adelgazamiento 13 preparaciones para estudiar el comportamiento celular en condiciones post-traumáticas en el cerebro vivo. Ambos métodos tienen ciertas ventajas y limitaciones. Por lo tanto, la ventana craneal crónica proporciona una mejor resolución, penetración óptica más profundamente en el tejido cerebral y la comodidad para múltiples sesiones de formación de imágenes. Por el contrario, adelgazamiento cráneo es menos probable que induzca la inflamación en el thEl sitio de imágenes e, y, quizás más importante, permite que las aplicaciones repetidas de drogas y colorantes. Algunos ejemplos de agentes farmacológicos que deben aplicarse en este tipo de experimentos se dan en la Tabla 1.
| Tipo de agente | Agente inyectado | Las áreas de investigación de biología / pharmacy |
| Anti-inflamatorio | La ciclosporina A | La lesión cerebral traumática, daño secundario, neurodegeneración |
| Toxinas | La tetrodotoxina | TBI - daño secundario, excytotoxicity |
| Bicuculina | TBI - daño secundario, la homeostasis de cloruro | |
| Los inhibidores de las vías de señalización | PD98059 (inhibidor de MAPKK) | mecanismos de la inflamación, daño secundario, la muerte celular postraumático, la neurodegeneración y la regeneración de señalización |
| SU6656 (inhibidor de la quinasa de la familia Src) | ||
| Los factores neurotróficos | Factor neurotrófico derivado del cerebro, BDNF | TBI - la supervivencia neuronal después de una lesión, la neuroprotección en el daño cerebral postraumático secundario |
| Virus | lentiviral vectores para la expresión de proteínas | los mecanismos moleculares de la neurodegeneración y regeneración postraumático, etiquetado diferencial de los tipos de células en el cerebro dañado para obtener imágenes in vivo |
| vectores adenovirales para la expresión de proteínas | ||
| Ca 2 + indicadores fluorescentes | Fluo-2, 4 | mecanismos de la inflamación postraumática de señalización, la muerte celular, la migración celular, axonal / regeneración dendríticas |
Tabla 1. Agentes farmacológicos y colorantes para la inyección cortical en el modelo de lesión pinchazo.
Una amplia gama de eventos bioquímicos que son altamente importante en condiciones fisiológicas y patológicas se puede sondear con inhibidores químicos, indicadores fluorescentes y proteína mutante introducidas a través de construcciones virales. Ventajas para la elección de determinada ventana de tiempo proporcionadas por la preparación adelgazamiento cráneo pueden ser de gran importancia para los estudios.
En el presente estudio, hemos utilizado segunda señal de generación de armónicos para delinear la zona de la lesión. Alternativamente, las fronteras sitio de la lesión podrían ser indicados por un colorante fluorescente débilmente difusión, por ejemplo, un conjugado de alto peso molecular de dextrano fluorescente (de 2 millones de Dalton).
Recientemente, Schaffer y sus colegas 14 han utilizado una preparación crónicacon ventana craneal reopenable para entrega repetitiva de colorantes fluorescentes a la corteza del ratón. Es probable que craneal ventana reapertura puede afectar negativamente a la transparencia del tejido cerebral. Por otra parte, es difícil de predecir el curso temporal de la inflamación inducida por la reapertura, lo que puede afectar la regeneración del tejido conjuntivo.
Una gran ventaja de la preparación cráneo adelgazada es la posibilidad de entregar compuestos terapéuticos (y otros materiales que requieren la inyección tópica en el tejido cerebral) varias veces durante la progresión del trauma, sin complicar artefactos (por ejemplo, sin ventana craneal reapertura).
Si se desea la entrega compuesto repetitivo directamente al sitio de la lesión, se debe considerar medios especiales para evitar cráneo seco de salida y la infección bacteriana. Por lo tanto, se recomienda mantener la región de la cabeza operado bajo condiciones estériles y aplicación de antibióticos (tales como enrofloxacina). Para preservar la thinned región cráneo de secado, llene el soporte de metal con un 1,5% de agarosa y se cubre con un cubreobjetos ronda. En la mayoría de los casos esto permitirá mantener la misma transparencia o el cráneo adelgazado durante el período de hasta 10 días. Algunos adicional se debe tomar si se han previsto varias sesiones de formación de imágenes en la preparación del cráneo adelgazada en un período de tiempo prolongado. Inmediatamente antes de cada sesión de imágenes, retire suavemente el tejido conectivo recién formado de la región adelgazada con una cuchilla microquirúrgica. Utilice la imagen TPEM de SHG para verificar el espesor óseo calidad de imagen y medida. El nuevo crecimiento de tejido puede comprometer la imagen causa profundidad de penetración y desenfoque acompañado por un aumento en la fluorescencia de fondo. Refresque el cráneo adelgazamiento suavemente con una hoja de microcirugía para recuperar la alta calidad de imagen.
En aquellos casos que no requieren acceso directo a la zona de la lesión, es muy recomendable que cubre la región adelgazada del cráneo con un vaso coverslip como se describe en el documento sobre pulido y reforzado adelgazado preparación cráneo por Kleinfeld y sus colegas 15. Esto podría hacerse mediante el uso de la siguiente procedimiento opcional. Coloque una pequeña gota de agarosa (1,5%) en la región cráneo adelgazada, espere hasta que se convierte en un gel, retire todo agarosa innecesaria, es decir, dejarlo sólo en el sitio de la lesión. La agarosa debe proteger el sitio de la lesión de los efectos externos. Seque la región cráneo diluido con aire comprimido. Caída de una pequeña cantidad de pegamento acrílico en un pequeño trozo de # 0 cubreobjetos y colocarlo en la región cráneo adelgazada. El pegamento poliacrílico impide que el hueso y el nuevo crecimiento de tejido conectivo, manteniendo así el cráneo adelgazada debajo de la ventana conservado.
Una combinación de estos procedimientos permite el estudio de los procesos de post-traumáticas agudas y crónicas, la administración de fármacos por vía tópica o sistémica y el seguimiento directamente los efectos del tratamiento. El uso de líneas de ratones transgénicos dobles o triples también puede ser beneficioso, particialmente para formación de imágenes simultánea de múltiples procesos postraumáticos, tales como la formación de cicatriz glial y el nuevo crecimiento neuronal rama. Esperamos que nuestros modelos de lesión cerebral aguda estudiados con intravital microscopía de dos fotones para ser fructífera para las pruebas de drogas candidato.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Estamos profundamente agradecidos con el Dr. Frank Kirchhoff para proporcionar GFAP-EGFP y cepas de ratón CX3CR1-EGFP. El trabajo fue apoyado por becas del Centro de Movilidad Internacional de Finlandia, Tekes, finlandés Graduate School of Neuroscience (FGSN) y la Academia de Finlandia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2A-sa dumb Tweezers, 115 mm | XYtronic | XY-2A-SA | |
| 30 G ½ in needle | BD | REF 304000 | |
| Animal trimmer, shaving machine | Aesculap | Isis GT420 | |
| Binocular Microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Biological Temperature Controller with stainless steel heating pad | Supertech | TMP-5b | |
| Blunt microsurgical blade | BD | REF 374769 | |
| Borosilicate tube with filament | Sutter Instruments | BF120-69-10 | For glass pipette production |
| Carprofene | Pfizer | Rimadyl vet | |
| Chlorhexidine digluconate | Sigma | C9394 | |
| Dental cement | DrguDent, Dentsply | REF 640 200 271 | |
| Dexamethasone | FaunaPharma | Rapidexon vet | |
| Disposable drills | Meisinger | HP 310 104 001 001 008 | |
| Dulbeco’s PBS 10x | Sigma | D1408 | |
| Dumont #5 forceps, 110 mm | FST | 91150-20 | |
| Ealing microelectrode puller | Ealing | 50-2013 | Vertical puller for glass pipette production |
| Eye ointment | Novartis | Viscotears | |
| Foredom drill control | Foredom | FM3545 | |
| Foredom micromotor handpiece | Foredom | MH-145 | |
| Gas anesthesia platform for mice | Stoelting | 50264 | Assembled on stereotaxic instrument |
| Hemostasis Collagen Sponge | Avitene, Ultrafoam BARD | Ref 1050050 | |
| Imaris | Bitplane | ||
| Ketamine | Intervet | Ketaminol vet | |
| Mai Tai DeepSee laser | Spectra-Physics | ||
| Metal holder | Neurotar | ||
| Microdressing forceps, 105 mm | Aesculap | BD302R | |
| Microfil | WPI | MF34G-5 | Micro syringe filling capillaries |
| Mineral oil | Sigma | M8410 | |
| Multiphoton Laser Scanning Microscope | Olympus | FV1000MPE | |
| NanoFil Syringe 10 μl | WPI | NANOFIL | Hamilton syringe |
| Nonwoven swabs 5 x 5 | Molnlycke Health Care | Mesoft | Surgical tampons |
| Polyacrylic glue | Henkel | Loctite 401 | |
| Round glass coverslip | Electron Microscopy Sciences | ||
| 1.5 thickness | |||
| Small animal stereotaxic instrument | David Kopf Instruments | 900 | |
| Stoelting mouse and neonatal rat adaptor | Stoelting | 51625 | Assembled on stereotaxic instrument. |
| Student iris scissors, straight 11.5 cm | FST | 91460-11 | |
| Sulforhodamine 101 | Molecular Probes | S-359 | |
| UMP3 microsyringe pump and Micro 4 microsyringe pump controller | WPI | UMP3-1 | Microinjector and controller |
| Xylazine | Bayer Health Care | Rompun vet |
References
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