Memeli Hücrelerde Heme Sentezi Düzeylerinin Ölçümü
Summary
Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.
Abstract
Heme örneğin hemoglobin, miyoglobin ve sitokromlar olarak Hemoproteinler olarak bilinen bir protein çok çeşitli protez grup olarak hizmet etmektedir. Bu gibi gen transkripsiyon, translasyon, hücre farklılaşması, hücre çoğalması gibi farklı moleküler ve hücresel süreçlerde rol oynamaktadır. Heme biyosentez düzeyleri, farklı dokular ve hücre türleri arasında değişiklik gösterir ve anemi, nöropati ve kanser gibi, hastalıklı koşullarda değiştirilir. Bu tekniği kullanan [4- 14C] 5-aminolevulinik asit ([14C] 5-ala), memeli hücrelerinde hema sentez seviyesini ölçmek için hema biyosentez yolunun erken öncüler biri. Bu deney, heme dahil radyoaktivite heme ve ölçüm ekstre [14C] 5-ALA ile hücrelerin inkübasyonu içerir. Bu prosedür doğru ve hızlı. Bu yöntem, heme biyosentezi göreli seviyeleri ziyade toplam heme içeriğini ölçer. Bu techn kullanımını göstermek içinhema biyosentez düzeyleri IQue birçok memeli hücre çizgileri ölçüldü.
Introduction
Heme, ferros demir ve protoporfirin IX kompleks taşınması ve hemen hemen bütün canlı organizmalarda 1-3 oksijen kullanan için merkezi bir moleküldür. heme eşsiz yapısı atomlu gaz ve bir elektron taşıyıcı madde olarak işlev gibi çeşitli fonksiyonları yerine 1-5 sağlar. Örneğin, heme oksijen 6,7 transferi ve depolama için hemoglobin ve miyoglobin oksijen bağlanır. Ayrıca, solunum sırasında sitokromlar halinde bir elektron taşıyıcı madde olarak işler ve sitokrom P450 enzimleri ile katalize edilmiş 8,9-kimyasal redoks reaksiyonları için, elektron verici olarak hareket eder. Heme en önemli özelliklerinden biri de, gen transkripsiyonu, protein sentezi ve mikro-RNA biyogenez 4 gibi hücresel ve moleküler olayların düzenlenmesinde rol oynayabilir olmasıdır. Örneğin, bir memeli transkripsiyonel represör Bach1 aktivitesini ve memeli nükleer rec kontrol edilmesiyle çok sayıda genin transkripsiyonunu etkiliyorsaeptor Rev-erbα 10-15. Heme heme ya da oksijen 16. yanıt olarak, solunum ve oksidatif hasarını kontrol katılan genlerin aktivasyonunda önemli bir rol oynar heme aktivatör protein (Hap) 1 aktivasyonunu düzenler. Heme da 3,17-20 sinyal, sinir büyüme faktörü (NGF) ile nöronal hücrelerde gen transkripsiyonunu düzenler. Ayrıca, hema-regüle eIF2α kinaz (HRI) 21-24 aktivitesini modüle edilmesiyle, memeli eritroid hücrelerde protein sentezini düzenler. Bundan başka, heme uygun hücre fonksiyonu ve hücre büyümesi 4,20,25 için gerekli olan gibi tirosin kinaz Jak2 ve Src gibi anahtar sinyal proteinlerinin aktivitesini etkiler. Bu HeLa hücreleri hema inhibisyonu yaşlanma ve apoptoz 26 ile ilişkili markörler hücre siklüs hapsine ve aktivasyonunu neden olduğu tespit edilmiştir. Heme eksikliği ya da heme artmış düzeyleri her iki insanlarda 27 ciddi sağlık etkileri ile ilişkilidir. Son moleküler and epidemiyolojik çalışmalar yüksek heme alımının pozitif bir ilişki ve bu tip-2 diyabet, koroner kalp hastalığı ve akciğer kanseri, kolorektal kanser ve pankreas kanseri gibi birçok kanser 27,28 olarak hastalıkların riski göstermiştir. Normal ve kanser, akciğer hücreleri yazarların laboratuar eşleşen bir çift kullanarak kanser hücreleri, oksijen tüketimi, hema sentezi ve hem alımı ve oksijen kullanımı 28 yer alan protein düzeylerinde artış olduğunu bulmuşlardır. İlginç bir şekilde, heme sentezinin engellenmesi, oksijen tüketimi, proliferasyonu, kanser hücrelerinin 28 göç ve koloni oluşumu azalmıştır. Böylece endojen Heme seviyelerinde dalgalanmaları, moleküler ve hücresel süreçlerin 3,4,28,29 düzenlenmesinde önemli bir rol oynar.
Memelilerde, hema grubuna ait biyosentezi mitokondri ve sitosol 4 (Şekil 1) yer alan enzimler içeren, sekiz adımda meydana gelir. Heme biosyntezi ALA sentaz (yazık) 4,31 ile katalize edilmiş 5-aminolevulinik asit (5-ALA) oluşturmak için glisin ve süksinil-CoA kondensasyonu ile mitokondri matris içinde başlar. Bu nonerythroid hücrelerde hem biyosentezi, oranın sınırlandığı aşama olan. 5-ALA ardından sonraki dört adım geri o protoporfirin IX (PPIX) dönüştürülür mitokondri, ithal edilir coproporphyrinogen III (CPgenIII) oluşturmak üzere meydana sitoplazmada dışarı ihraç edilmektedir. Son olarak, demir bir molekülü heme, ferrokelataz (FECH) 2,4 ile katalize edilen bir reaksiyonun üretilmesi için protoporfirin IX (PPIX) için dahil edilmiştir.
hema biyosentezinin seviyesi esas olarak sıkı bir şekilde hücre içi demir ve heme 4 tarafından kontrol ne yazık ki enzim seviyesine bağlıdır. Heme biyosentez genetik bozukluklar, belirli bir mineral ve vitamin (örneğin, riboflavin, çinko), toksinler (örneğin, alüminyum, kurşun maruz kalma durumu etkilenebilir), Bazı steroidler (bir anoksi, ateş, ve düzeyler, örneğin östrojen) 32-35. hema sentezi düzeyi çeşitli hastalıklı koşullarda değiştirilir. Azalmış heme biyosentezi aneminin yanı sıra nörolojik hastalıklar 3,36 neden olabilir. Seçenek olarak ise, artan hem biyosentezi bazı kanser 28,37 ilerlemesinde önemli bir rol oynar. Heme memeli yağ, eritroid ve nöronal hücrelerin 4,38-41 büyümesi, farklılaşması ve hayatta kalması için kritik olduğu gösterilmiştir. Örneğin, hema eksikliği glutamat NMDA (N-metil-D-aspartat) reseptörü 17 inhibisyonu yoluyla birincil fare kortikal nöronlarda nörit hasarına yol açar. Buna ek olarak, heme sentezinin engellenmesi, insan epitel serviks karsinomu, HeLa hücreleri, 26,41 programlanmış hücre ölümüne neden olur. Bu nedenle, farklı koşullar altında çeşitli hücrelerde hem biyosentezi seviyelerini ölçmek etyoloji ve progressi çalışmaları için önemlidirbirçok hastalığın üzerinde.
Burada [4- 14 C] 5-aminolevulic asit kullanılarak hücre içi heme sentez düzeyini ölçmek için hızlı ve hassas bir yöntem açıklanmaktadır. Bu 55 Fe veya 59 Fe kullanan diğer yöntemlere alternatif bir yöntemdir. Onun radyasyon çok zayıf olduğu için biz 14 C kullanmayı tercih. Buna karşılık, güçlü bir koruma Fe izotopları ile çalışmak için gereklidir. Bundan başka, bu yöntem, ölçülmesi ve hızlı bir şekilde paralel olarak, farklı hücrelerde hema sentezi Karşılaştırma amaçlanmıştır. Mutlak heme düzeylerini ölçmek amacıyla, bir HPLC 42,43 kullanımını içeren daha önce kurulmuş yöntemi kullanabilirsiniz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Heme solunum yoluyla 26 hücresel enerji üretiminde önemli bir rol oynar. Altered heme metabolizması kanseri 28,41 dahil olmak üzere çeşitli hastalıklarla ilişkili olduğu bilinmektedir. Hema sentezinin önlenmesi Hela hücreleri 26,41 hücre döngüsü tutuklama ve apoptoza yol açtığı bilinmektedir. Yüksek heme sentez düzeyi akciğer kanseri hücrelerinin 28 ilerlemesi ile ilişkili olduğu gösterilmiştir. Bu nedenle, farklı koşullar altında hücrelerde hem…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
HCC4017 ve HBEC30KT hücre hatları nazik Dr John Minna laboratuvarında tarafından sağlandı. Bu çalışma Dr Li Zhang Cecil H. ve Ida Yeşil fonları tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Acetone | Sigma | 650501 | |
| Diethy ether | Sigma | 296082 | |
| HCl (Hydrochloric acid) | Fisher | A481-212 | |
| Liquid Scintillation cocktail | MP Biomedicals | 882470 | |
| Trypan blue | Gibco | 15250 | |
| Radiolabeled 4-14C aminolevulinic acid | Perkin-Elmer life sciences | Store @ -80 °C | |
| CelLytic M | Sigma | C2978 | Mammalian cell lysis reagent |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23227 | |
| Specific reagent | |||
| Component | Dispense | ||
| Heme extraction buffer- Acetone: HCl:Water (25:1.3:5) | Acetone | 25ml | |
| Concentrated HCl | 1.3ml | ||
| Water | 5ml |
References
- Furuyama, K., Kaneko, K., Vargas, P. D. Heme as a magnificent molecule with multiple missions: heme determines its own fate and governs cellular homeostasis. Tohoku J Exp Med. 213, 1-16 (2007).
- Hamza, I., Dailey, H. A. One ring to rule them all: trafficking of heme and heme synthesis intermediates in the metazoans. Biochim Biophys Acta. 1823, 1617-1632 (2012).
- Zhu, Y., Hon, T., Ye, W., Zhang, L. Heme deficiency interferes with the Ras-mitogen-activated protein kinase signaling pathway and expression of a subset of neuronal genes. Cell Growth Differ. 13, 431-439 (2002).
- Zhang, L. HEME BIOLOGY: The Secret Life of Heme in Regulating Diverse Biological Processes. Singapore: World Scientific Publishing Company. , (2011).
- Mense, S. M., Zhang, L. Heme: a versatile signaling molecule controlling the activities of diverse regulators ranging from transcription factors to MAP kinases. Cell Res. 16, 681-692 (2006).
- Ingram, D. J., Kendrew, J. C. Orientation of the haem group in myoglobin and its relation to the polypeptide chain direction. Nature. 178, 905-906 (1956).
- Perutz, M. F. X-ray analysis of hemoglobin. Science. 140, 863-869 (1963).
- Chance, B. The nature of electron transfer and energy coupling reactions. FEBS Lett. 23, 3-20 (1972).
- Guengerich, F. P., MacDonald, T. L. Mechanisms of cytochrome P-450 catalysis. Faseb J. 4, 2453-2459 (1990).
- Igarashi, K., et al. Multivalent DNA binding complex generated by small Maf and Bach1 as a possible biochemical basis for beta-globin locus control region complex. J Biol Chem. 273, 11783-11790 (1998).
- Ogawa, K., et al. Heme mediates derepression of Maf recognition element through direct binding to transcription repressor Bach1. Embo J. 20, 2835-2843 (2001).
- Oyake, T., et al. Bach proteins belong to a novel family of BTB-basic leucine zipper transcription factors that interact with MafK and regulate transcription through the NF-E2 site. Mol Cell Biol. 16, 6083-6095 (1996).
- Snyder, S. H., Jaffrey, S. R., Zakhary, R. Nitric oxide and carbon monoxide: parallel roles as neural messengers. Brain Res Brain Res Rev. 26, 167-175 (1998).
- Sun, J., et al. Hemoprotein Bach1 regulates enhancer availability of heme oxygenase-1 gene. Embo J. 21, 5216-5224 (2002).
- Zhang, L., Guarente, L. Heme binds to a short sequence that serves a regulatory function in diverse proteins. Embo J. 14, 313-320 (1995).
- Hon, T., Lee, H. C., Hu, Z., Iyer, V. R., Zhang, L. The heme activator protein Hap1 represses transcription by a heme-independent mechanism in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 169, 1343-1352 (2005).
- Chernova, T., et al. Neurite degeneration induced by heme deficiency mediated via inhibition of NMDA receptor-dependent extracellular signal-regulated kinase 1/2 activation. J Neurosci. 27, 8475-8485 (2007).
- Chernova, T., et al. Early failure of N-methyl-D-aspartate receptors and deficient spine formation induced by reduction of regulatory heme in neurons. Mol Pharmacol. 79, 844-854 (2011).
- Sengupta, A., Hon, T., Zhang, L. Heme deficiency suppresses the expression of key neuronal genes and causes neuronal cell death. Brain Res Mol Brain Res. 137, 23-30 (2005).
- Smith, A. G., Raven, E. L., Chernova, T. The regulatory role of heme in neurons. Metallomics. 3, 955-962 (2011).
- Raghuram, S., et al. Identification of heme as the ligand for the orphan nuclear receptors REV-ERBalpha and REV-ERBbeta. Nat Struct Mol Biol. 14, 1207-1213 (2007).
- Wu, N., Yin, L., Hanniman, E. A., Joshi, S., Lazar, M. A. Negative feedback maintenance of heme homeostasis by its receptor Rev-erbalpha. Genes Dev. 23, 2201-2209 (2009).
- Yin, L., et al. Rev-erbalpha, a heme sensor that coordinates metabolic and circadian pathways. Science. 318, 1786-1789 (2007).
- Zhu, Y., Hon, T., Zhang, L. Heme initiates changes in the expression of a wide array of genes during the early erythroid differentiation stage. Biochemical and biophysical research communications. 258, 87-93 (1999).
- Yao, X., Balamurugan, P., Arvey, A., Leslie, C., Zhang, L. Heme controls the regulation of protein tyrosine kinases Jak2 and Src. Biochemical and biophysical research communications. 402, 30-35 (2010).
- Ye, W., Zhang, L. Heme controls the expression of cell cycle regulators and cell growth in HeLa cells. Biochem and biophys res comm. 315, 546-554 (2004).
- Hooda, J., Shah, A., Zhang, L. Heme, an essential nutrient from dietary proteins, critically impacts diverse physiological and pathological processes. Nutrients. 6, 1080-1102 (2014).
- Hooda, J., et al. Enhanced heme function and mitochondrial respiration promote the progression of lung cancer cells. PloS one. 8, e63402 (2013).
- Atamna, H., Walter, P. B., Ames, B. N. The role of heme and iron-sulfur clusters in mitochondrial biogenesis, maintenance, and decay with age. Arch Biochem Biophys. 397, 345-353 (2002).
- Atamna, H., Killilea, D. W., Killilea, A. N., Ames, B. N. Heme deficiency may be a factor in the mitochondrial and neuronal decay of aging. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14807-14812 (2002).
- Ponka, P. Cell biology of heme. Am J Med Sci. 318, 241-256 (1999).
- Brawer, J. R., Naftolin, F., Martin, J., Sonnenschein, C. Effects of a single injection of estradiol valerate on the hypothalamic arcuate nucleus and on reproductive function in the female rat. Endocrinol. 103, 501-512 (1978).
- Daniell, W. E., et al. Environmental chemical exposures and disturbances of heme synthesis. Environ Health Perspect. 105, 37-53 (1997).
- Kihara, T., et al. Hepatic heme metabolism in rats with fever induced by interleukin 1beta. Res Commun Mol Pathol Pharmacol. 104, 115-126 (1999).
- Vijayasarathy, C., Damle, S., Prabu, S. K., Otto, C. M., Avadhani, N. G. Adaptive changes in the expression of nuclear and mitochondrial encoded subunits of cytochrome c oxidase and the catalytic activity during hypoxia. Eur J Biochem. 270, 871-879 (2003).
- Anderson, K. E. S. S., Bishop, D. F., Desnick, R. J. Disorders of heme biosynthesis: X-linked sideroblastic anemia and the porphyrias. The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease. , 1-53 (2009).
- Salvo, M. L., Contestabile, R., Paiardini, A., Maras, B. Glycine consumption and mitochondrial serine hydroxymethyltransferase in cancer cells: the heme connection. Med Hypotheses. 80, 633-636 (2013).
- Ishii, D. N., Maniatis, G. M. Haemin promotes rapid neurite outgrowth in cultured mouse neuroblastoma cells. Nature. 274, 372-374 (1978).
- Padmanaban, G., Venkateswar, V., Rangarajan, P. N. Haem as a multifunctional regulator. Trends Biochem Sci. 14, 492-496 (1989).
- Rutherford, T. R., Clegg, J. B., Weatherall, D. J. K562 human leukaemic cells synthesise embryonic haemoglobin in response to haemin. Nature. 280, 164-165 (1979).
- Ye, W., Zhang, L. Heme deficiency causes apoptosis but does not increase ROS generation in HeLa cells. Biochemical and biophysical research communications. 319, 1065-1071 (2004).
- Bonkovsky, H. L., et al. High-performance liquid chromatographic separation and quantitation of tetrapyrroles from biological materials. Anal Biochem. 155, 56-64 (1986).
- Sinclair, P. R., Gorman, N., Jacobs, J. M. Measurement of heme concentration. Curr Protoc Toxicol. 8, Unit 8.3 (2001).
- Barros, M. H., Carlson, C. G., Glerum, D. M., Tzagoloff, A. Involvement of mitochondrial ferredoxin and Cox15p in hydroxylation of heme O. FEBS Lett. 492, 133-138 (2001).
- Shinjyo, N., Kita, K. Up-regulation of heme biosynthesis during differentiation of Neuro2a cells. J Biochem. 139, 373-381 (2006).
- Israels, L. G., Yoda, B., Schacter, B. A. Heme binding and its possible significance in heme movement and availability in the cell. Ann N Y Acad Sci. 244, 651-661 (1975).
- Yannoni, C. Z., Robinson, S. H. Early-labelled haem in erythroid and hepatic cells. Nature. 258, 330-331 (1975).
- Robinson, S. H. Formation of bilirubin from erythroid and nonerythroid sources. Semin Hematol. 9, 43-53 (1972).
- Granick, S., Granick, D. Nucleolar necklaces in chick embryo myoblasts formed by lack of arginine. J Cell Biol. 51, 636-642 (1971).
- Morell, D. B., Barrett, J., Clezy, P. S. The prosthetic group of cytochrome oxidase. 1. Purification as porphyrin alpha and conversion into haemin alpha. Biochem J. 78, 793-797 (1961).
- Sinclair, P., Gibbs, A. H., Sinclair, J. F., de Matteis, F. Formation of cobalt protoporphyrin in the liver of rats. A mechanism for the inhibition of liver haem biosynthesis by inorganic cobalt. Biochem J. 178, 529-538 (1979).
- Chung, J., Haile, D. J., Wessling-Resnick, M. Copper-induced ferroportin-1 expression in J774 macrophages is associated with increased iron efflux. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 2700-2705 (2004).
