Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.
Hæm tjener som den prostetiske gruppe for en bred vifte af proteiner kaldet hæmoproteiner såsom hæmoglobin, myoglobin og cytochromer. Det er involveret i forskellige molekylære og cellulære processer, såsom gen-transkription, translation, celledifferentiering og celleproliferation. Biosyntesen niveauer af hæm varierer på tværs af forskellige væv og celletyper og ændres i syge tilstande, såsom anæmi, neuropati og cancer. Denne teknik anvender [4- 14C] 5-aminolevulinsyre ([14C] 5-ALA), en af de tidlige forstadier i hæm-biosyntesevejen at måle indholdet af hæm syntese i pattedyrceller. Dette assay involverer inkubation af celler med [14C] 5-ALA efterfulgt af ekstraktion af hæm og måling af radioaktiviteten inkorporeret i hæm. Denne procedure er nøjagtig og hurtig. Denne metode måler de relative det samlede hæm indholdet niveauer af hæm biosyntesen stedet. For at demonstrere brugen af denne technique niveauerne af hæm-biosyntese blev målt i flere mammale cellelinjer.
Hæm, et kompleks af ferrojern og protoporphyrin IX er et centralt molekyle til transport og udnytte ilt i næsten alle levende organismer 1-3. Den unikke struktur af hæm gør det muligt at fungere som en bærer af diatomiske gasser og elektroner, samt til at udføre forskellige andre funktioner 1-5. For eksempel hæm binder sig til ilt i hæmoglobin og myoglobin til overførsel og opbevaring af ilt 6,7. Det virker også som en elektron luftfartsselskab i cytochromer under respiration og virker som en elektron donor for redoxreaktioner katalyseret af cytochrom P450 enzymer 8,9. En af de mest betydningsfulde træk ved hæm er, at det kan spille regulatoriske roller i cellulære og molekylære processer, såsom gentranskription, proteinsyntese og mikro-RNA biogenese 4. For eksempel den påvirker transkriptionen af mange gener ved at styre aktiviteten af pattedyr transskriptionsrepressor Bach1 og pattedyrs nukleare receptor Rev-erbα 10-15. Hæm regulerer aktiveringen af hæm aktivatorprotein (Hap) 1, som spiller en vigtig rolle i aktiveringen af gener involveret i respiration og styring oxidativ skade, som reaktion på hæm eller oxygen 16. Hæm også regulerer gentranskription i neuronale celler via nervevækstfaktor (NGF) signalering 3,17-20. Det regulerer også proteinsyntese i mammale erythroide celler ved at modulere aktiviteten af hæm-reguleret eIF2α kinase (HRI) 21-24. Desuden hæm påvirker aktiviteten af centrale signalering proteiner såsom tyrosinkinase Jak2 og Src, som er afgørende for korrekt celle funktion og cellevækst 4,20,25. Det konstateredes, at celler hæm inhibering i HeLa forårsager cellecyklusstandsning og aktivering af markører associeret med alderdom og apoptose 26. Både Heme mangel eller øget hæm er forbundet med alvorlige virkninger sundhed hos mennesker 27. Seneste molekylær ennd epidemiologiske undersøgelser har vist en positiv sammenhæng med høj hæm indtag og øget risiko for sygdomme, såsom type-2 diabetes, hjertesygdomme og flere kræftformer, herunder lungekræft, tarmkræft og bugspytkirtelkræft 27,28. Ved hjælp af en matchede par normale og cancer lungeceller forfatternes lab har fundet, at kræftceller har øget indhold af ilt forbrug, hæm syntese og proteiner involveret i hæm optagelse og ilt udnyttelse 28. Interessant inhibering af hæm syntese reduceret oxygenforbrug, proliferation, migration og kolonidannelse af kræftceller 28. Således udsving i niveauet af endogen hæm spiller en vigtig rolle i reguleringen af molekylære og cellulære processer 3,4,28,29.
I pattedyr biosyntesen af hæm forekommer i otte trin, der involverer enzymer placeret i mitokondrierne og cytosolen 4 (figur 1). Hæm Biosynafhandling begynder i matrixen af mitokondrier med kondensationen af glycin og succinyl-CoA til dannelse af 5-aminolevulinsyre (5-ALA), katalyseret af ALA synthase (desværre) 4,31. Dette er det hastighedsbegrænsende trin i hæm biosyntese i nonerythroid celler. 5-ALA derefter eksporteres ud til cytosolen, hvor de næste fire trin forekommer for at danne coproporphyrinogen III (CPgenIII), som derefter importeres tilbage til mitokondrierne, hvor det omdannes til protoporphyrin IX (PPIX). Endelig er et molekyle af jern inkorporeres i protoporphyrin IX (PPIX) til fremstilling af hæm, en reaktion katalyseret af ferrochelatase (FECH) 2,4.
Niveauet af hæm biosyntesen afhænger primært af niveauet af ALAS enzym, der er stramt styret af intracellulær jern og hæm 4. Biosyntesen af hæm kan påvirkes af genetiske defekter, tilgængelighed af visse mineraler og vitaminer (f.eks, riboflavin, zink), udsættelse for toksiner (fx aluminium, bly), Anoksi, feber og koncentrationer af visse steroider (f.eks østrogen) 32-35. Niveauet af hæm syntese ændres i forskellige sygdomstilstande. Nedsat hæm biosyntesen kan forårsage anæmi samt neurologiske sygdomme 3,36. Alternativt øget hæm biosyntesen spiller en vigtig rolle i udviklingen af visse kræftformer 28,37. Hæm har vist sig at være kritisk for vækst, differentiering og overlevelse af pattedyr adipose, erythroide og neuronale celler 4,38-41. For eksempel hæm mangel fører til neurit skader i primære muse corticale neuroner via hæmning af glutamat NMDA (N-methyl-D-aspartat) -receptoren 17. Derudover inhibering af hæm syntese forårsager programmeret celledød i den humane epitel cervix carcinoma HeLa-celler 26,41. Derfor er vigtig for at studere ætiologi og progressi måling af hæm biosyntese niveauer i forskellige celler under forskellige betingelserpå af mange sygdomme.
Her beskriver vi en hurtig og følsom metode til at måle niveauet af intracellulær hæm syntese ved anvendelse af [4- 14C] 5-aminolevulic syre. Dette er en alternativ metode til andre fremgangsmåder, der anvender 55 Fe eller 59 Fe. Vi foretrækker at bruge 14C fordi dens stråling er meget svag. I modsætning hertil er nødvendig for at arbejde med Fe isotoper stærk beskyttelse. Desuden er denne metode bestemt til at måle og sammenligne hæm syntese i forskellige celler i parallel på en hurtig måde. For at måle absolutte hæm niveauer, kan man anvende den tidligere fastsatte fremgangsmåde involverer anvendelsen af HPLC 42,43.
Hæm spiller en central rolle i dannelsen af cellulære energi via respiration 26. Altered hæm stofskifte er kendt for at være forbundet med forskellige sygdomme herunder kræft 28,41. Inhibering af hæm syntese er kendt for at forårsage cellecyklusstop og apoptose i Hela-celler 26,41. Det er blevet vist, at høje hæm syntese niveau er forbundet med progressionen af lungecancerceller 28. Det ville derfor være af stor betydning at måle indholdet af hæm biosyntese i celle…
The authors have nothing to disclose.
De HCC4017 og HBEC30KT cellelinjer blev venligst stillet til rådighed af Dr. John Minna laboratorium. Dette arbejde blev støttet af Cecil H. og Ida Grøn midler til Dr. Li Zhang.
Acetone | Sigma | 650501 | |
Diethy ether | Sigma | 296082 | |
HCl (Hydrochloric acid) | Fisher | A481-212 | |
Liquid Scintillation cocktail | MP Biomedicals | 882470 | |
Trypan blue | Gibco | 15250 | |
Radiolabeled 4-14C aminolevulinic acid | Perkin-Elmer life sciences | Store @ -80 °C | |
CelLytic M | Sigma | C2978 | Mammalian cell lysis reagent |
Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23227 | |
Specific reagent | |||
Component | Dispense | ||
Heme extraction buffer- Acetone: HCl:Water (25:1.3:5) | Acetone | 25ml | |
Concentrated HCl | 1.3ml | ||
Water | 5ml |