Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.
Heme dient als prosthetische groep voor een grote verscheidenheid aan eiwitten bekend als heemeiwitten, zoals hemoglobine, myoglobine en cytochromen. Het is betrokken bij verschillende moleculaire en cellulaire processen zoals gentranscriptie, translatie, celdifferentiatie en celproliferatie. De biosynthese van heem niveaus uiteenlopen weefsels en celtypes en wordt gewijzigd ziektetoestanden zoals bloedarmoede, neuropathie en kanker. Deze techniek maakt gebruik van [4- 14 C] 5-aminolevulinezuur ([14 C] 5-ALA), één van de vroege voorlopers in het heem biosyntheseweg het niveau van synthese van heem in zoogdiercellen te meten. Deze bepaling omvat incubatie van cellen met [14 C] 5-ALA, gevolgd door extractie van heem en meting van de radioactiviteit opgenomen in heem. Deze procedure is accuraat en snel. Deze werkwijze meet de relatieve niveaus van heem biosynthese plaats van het totale gehalte heem. Om het gebruik van deze techn tonenique de biosynthese van heem niveaus werden gemeten in verschillende zoogdiercellijnen.
Heem, een complex van ferro-ijzer en protoporfyrine IX een bepaalde molecule voor transport en gebruik van zuurstof in vrijwel alle levende organismen 1-3. De unieke structuur van heem in staat stelt om te functioneren als drager van tweeatomige gassen en elektronen, alsook verschillende andere functies uitvoeren 1-5. Bijvoorbeeld bindt heem zuurstof van hemoglobine en myoglobine voor de overdracht en opslag van zuurstof 6,7. Het werkt ook als een elektron drager in de cytochromen uitgeademde fungeert als elektrondonor voor redox reacties gekatalyseerd door cytochroom P450-enzymen 8,9. Een van de belangrijkste kenmerken van heem is dat het regulerende rol kunnen spelen bij de cellulaire en moleculaire processen zoals gentranscriptie, eiwitsynthese en micro-RNA biogenese 4. Zo beïnvloedt de transcriptie van veel genen door regeling van de activiteit van zoogdier transcriptionele repressor Bach1 en het zoogdier nucleaire receptor Rev-erbα 10-15. Heme regelt de activering van haem activator-eiwit (Hap) 1 die een belangrijke rol bij de activatie van genen die betrokken zijn bij de ademhaling en controle oxidatieve beschadiging speelt, in reactie op heem of zuurstof 16. Heem regelt ook gentranscriptie in neuronale cellen via zenuwgroeifactor (NGF) signalering 3,17-20. Daarnaast regelt eiwitsynthese in zoogdiercellen erythroïde cellen door het moduleren van de activiteit van haem-gereguleerde kinase eIF2α (HRI) 21-24. Voorts heem beïnvloedt de activiteit van belangrijke signalering eiwitten zoals tyrosine kinase Jak2 en Src, die essentieel voor een goede celfunctie en celgroei 4,20,25 zijn. Gevonden werd dat bij HeLa-cellen heem remming veroorzaakt celcyclus en activering van markers geassocieerd met senescentie en apoptose 26. Beide Heem deficiëntie of verhoogde niveaus van heem in verband worden gebracht met ernstige gevolgen voor de gezondheid bij de mens 27. Recente moleculaire eennd epidemiologische studies een positieve associatie hoge heem inname en verhoogde kans op ziekten, zoals type-2 diabetes, coronaire hartziekten en verschillende kankers waaronder longkanker, colorectale kanker en pancreaskanker 27,28. Met behulp van een matched pair van lab normale en kanker longcellen auteurs hebben geconstateerd dat de kankercellen niveaus van zuurstofverbruik, heem synthese en eiwitten die betrokken zijn bij de opname van heem en zuurstofverbruik 28 zijn toegenomen. Interessant remming van synthese van heem verminderde zuurstofconsumptie, proliferatie, migratie en kolonievorming van kankercellen 28. Aldus, de fluctuatie in de niveaus van endogene heem speelt een belangrijke rol bij de regulatie van moleculaire en cellulaire processen 3,4,28,29.
In zoogdieren, de biosynthese van heem plaatsvindt in acht stappen, waarbij enzymen in de mitochondria en cytosol 4 (figuur 1). Heme Biosynthesis begint in de matrix van de mitochondriën met de condensatie van glycine en succinyl-CoA om 5-aminolevulinezuur (5-ALA) te vormen, gekatalyseerd door ALA-synthase (ALAS) 4,31. Dit is de snelheid stap in heem biosynthese in nonerythroid cellen te beperken. 5-ALA wordt vervolgens uitgevoerd naar het cytosol waar de volgende vier stappen uitgevoerd om coproporphyrinogen III (CPgenIII), die vervolgens naar de mitochondriën, waar het wordt omgezet in protoporfyrine IX (PPIX) wordt ingevoerd vormen. Tot slot wordt een molecuul ijzer opgenomen om de protoporfyrine IX (PPIX) naar heem, een reactie gekatalyseerd door ferrochelatase (Fech) 2,4 produceren.
Het niveau van heem biosynthese vooral afhankelijk van de mate van ALAS enzym die strak wordt gecontroleerd door intracellulair heem ijzer en 4. De biosynthese van heem kan worden beïnvloed door genetische afwijkingen, beschikbaarheid van bepaalde mineralen en vitaminen (bijvoorbeeld riboflavine, zink), blootstelling aan toxinen (bijvoorbeeld aluminium, lood), Anoxie, koorts en waarden van bepaalde steroïden (bijvoorbeeld oestrogeen) 32-35. Het niveau van synthese van heem wordt veranderd in diverse ziektetoestanden. Verminderde heem biosynthese kan bloedarmoede evenals neurologische aandoeningen 3,36 veroorzaken. Anderzijds verhoogde biosynthese van heem speelt een belangrijke rol bij de progressie van bepaalde kankers 28,37. Heem is getoond essentieel voor de groei, differentiatie en overleving van zoogdieren vet-, erythroïde en neuronale cellen 4,38-41 zijn. Bijvoorbeeld, heem-deficiëntie leidt tot neurieten schade primaire muis corticale neuronen via de remming van glutamaat NMDA (N-methyl-D-aspartaat) receptor 17. Bovendien remming van synthese van heem veroorzaakt geprogrammeerde celdood in humane epitheliale cervixcarcinoom HeLa-cellen 26,41. Derhalve meet het heem biosynthese niveaus in verschillende cellen onder verschillende condities is van belang voor het bestuderen etiologie en Progressieen van vele ziekten.
Hier beschrijven we een snelle en gevoelige methode om het niveau van intracellulair heem-synthese gemeten door [4- 14 C] 5-aminolevulic acid. Dit is een alternatieve methode om andere methoden waarbij 55 Fe of 59 Fe. We liever met behulp van 14 C, omdat de straling is zeer zwak. Daarentegen is een krachtige bescherming vereist voor het werken met Fe isotopen. Bovendien is deze werkwijze bedoeld voor het meten en vergelijken heemsynthese in verschillende cellen in parallel op een snelle wijze. Om absolute heme te meten, kan men de eerder vastgestelde werkwijze die het gebruik van HPLC 42,43 gebruiken.
Heme speelt een belangrijke rol bij het genereren van cellulaire energie via ademhaling 26. Veranderde haem metabolisme is bekend dat zij samenhangen met verschillende ziekten waaronder kanker 28,41. Remming van de synthese van heem is bekend celcyclus en apoptose in HeLa cellen 26,41 veroorzaken. Er werd aangetoond dat hoge heemsynthese niveau wordt geassocieerd met de progressie van longkankercellen 28. Daarom zou het van groot belang zijn om de niveaus van heem biosyn…
The authors have nothing to disclose.
De HCC4017 en HBEC30KT cellijnen werden vriendelijk verschaft door Dr John Minna's lab. Dit werk werd ondersteund door de Cecil H. en Ida Green fondsen om Dr. Li Zhang.
Acetone | Sigma | 650501 | |
Diethy ether | Sigma | 296082 | |
HCl (Hydrochloric acid) | Fisher | A481-212 | |
Liquid Scintillation cocktail | MP Biomedicals | 882470 | |
Trypan blue | Gibco | 15250 | |
Radiolabeled 4-14C aminolevulinic acid | Perkin-Elmer life sciences | Store @ -80 °C | |
CelLytic M | Sigma | C2978 | Mammalian cell lysis reagent |
Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23227 | |
Specific reagent | |||
Component | Dispense | ||
Heme extraction buffer- Acetone: HCl:Water (25:1.3:5) | Acetone | 25ml | |
Concentrated HCl | 1.3ml | ||
Water | 5ml |