Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.
Heme sert de groupe prosthétique pour une grande variété de protéines connues comme les hémoprotéines telles que l'hémoglobine, la myoglobine et cytochromes. Elle est impliquée dans divers processus cellulaires et moléculaires, tels que la transcription génique, la traduction, la différenciation cellulaire et la prolifération cellulaire. Les niveaux de la biosynthèse de l'hème varient selon les différents tissus et types de cellules et est altérée dans des conditions pathologiques telles que l'anémie, la neuropathie et le cancer. Cette technique utilise [4- 14 C] de l'acide 5-aminolévulinique ([14 C] 5-ALA), l'un des premiers précurseurs de la voie de biosynthèse de l'hème pour mesurer les niveaux de synthèse de l'hème dans les cellules de mammifères. Ce test implique l'incubation des cellules avec [14 C] 5-ALA suivie d'une extraction de l'hème et de la mesure de la radioactivité incorporée dans l'hème. Cette procédure est précise et rapide. Cette méthode permet de mesurer les niveaux relatifs de biosynthèse de l'hème, plutôt que la teneur totale de l'hème. Pour démontrer l'utilisation de ce technIQUE les niveaux de biosynthèse de l'hème ont été mesurés dans plusieurs lignées de cellules de mammifères.
L'hème, un complexe de fer ferreux et la protoporphyrine IX est une molécule central pour le transport et l'utilisation de l'oxygène dans pratiquement tous les organismes vivants 1-3. La structure unique de l'hème lui permet de fonctionner en tant que transporteur de gaz et des électrons diatomiques, ainsi que pour effectuer diverses autres fonctions 1-5. Par exemple, l'hème se lie à l'oxygène de l'hémoglobine et de la myoglobine pour le transfert et le stockage de 6,7 à oxygène. Il fonctionne aussi comme un porteur d'électrons dans les cytochromes pendant la respiration et agit comme un donneur d'électrons pour des réactions catalysées par des enzymes d'oxydo-réduction du cytochrome P450 8,9. L'une des caractéristiques les plus importantes de l'hème est que, il peut jouer un rôle de régulation dans les processus cellulaires et moléculaires, tels que la transcription des gènes, la synthèse des protéines et de micro-ARN biogenèse 4. Par exemple, elle affecte la transcription de nombreux gènes en contrôlant l'activité de répresseur de la transcription de mammifère et la rec Bach1 nucléaire mammifèreeptor Rev-erbα 10-15. L'hème régule l'activation de la protéine activatrice de l'hème (Hap) 1 qui joue un rôle important dans l'activation de gènes impliqués dans la respiration et de contrôle des dommages oxydatifs, en réponse à l'hème ou de l'oxygène 16. Heme réglemente également la transcription des gènes dans les cellules neuronales par le facteur de croissance des nerfs (NGF) de signalisation 3,17-20. Elle régule également la synthèse des protéines dans les cellules érythroïdes de mammifère en modulant l'activité de l'hème-kinase régulée eIF2α (HRI) 21-24. En outre, l'hème affecte l'activité de protéines de signalisation clés tels que la tyrosine kinase Src et Jak2, qui sont essentiels pour le fonctionnement des cellules et 4,20,25 de la croissance cellulaire. On a constaté que dans les cellules HeLa inhibition de l'hème provoque l'arrêt du cycle cellulaire et l'activation des marqueurs associés à la sénescence et l'apoptose 26. Les deux Heme carence ou des niveaux accrus de l'hème sont associés à des effets graves sur la santé chez les humains 27. Une moléculaire récentend études épidémiologiques ont montré une association positive de l'apport élevé en hème et un risque accru de maladies, comme le diabète de type 2, les maladies coronariennes et plusieurs cancers dont le cancer du poumon, le cancer colorectal et le cancer du pancréas 27,28. Utilisation d'une paire appariée de laboratoire cellules pulmonaires normales et cancéreuses auteurs ont constaté que les cellules cancéreuses ont augmenté les niveaux de consommation d'oxygène, la synthèse de l'hème et des protéines impliquées dans l'absorption de l'hème et de l'oxygène 28 utilisation. Chose intéressante, l'inhibition de la synthèse de l'hème diminution de la consommation d'oxygène, la prolifération, la migration et la formation des colonies de cellules 28 cancéreuses. Ainsi, la fluctuation des niveaux d'hème endogène joue un rôle important dans la régulation des processus moléculaires et cellulaires 3,4,28,29.
Chez les mammifères, la biosynthèse de l'hème se produit en huit étapes, faisant intervenir des enzymes situées dans les mitochondries et le cytosol 4 (figure 1). Heme biosynthèse commence dans la matrice de la mitochondrie avec la condensation de glycine et de succinyl-CoA pour former l'acide 5-aminolévulinique (5-ALA), catalysée par ALA synthase (ALAS) 4,31. Ceci est le taux étape de biosynthèse de l'hème dans les cellules nonerythroid limitant. 5-ALA est ensuite exporté vers le cytosol où les quatre étapes suivantes se produisent pour former coproporphyrinogène III (CPgenIII), qui est ensuite importé retour à la mitochondrie, où il est transformé en protoporphyrine IX (PpIX). Enfin, une molécule de fer est incorporé à la protoporphyrine IX (PpIX) pour produire de l'hème, une réaction catalysée par ferrochélatase (FECH) 2,4.
Le niveau de biosynthèse de l'hème dépend principalement sur le niveau de ALAS enzyme qui est étroitement contrôlée par le fer intracellulaire et 4 de l'hème. La biosynthèse de l'hème peut être affectée par des défauts génétiques, la disponibilité de certains minéraux et des vitamines (par exemple, la riboflavine, zinc), l'exposition à des toxines (par exemple, l'aluminium, le plomb), Anoxie, de la fièvre, et des niveaux de certains stéroïdes (par exemple, l'œstrogène) 32-35. Le niveau de synthèse de l'hème est modifié dans diverses conditions pathologiques. Diminution de la biosynthèse de l'hème peut causer l'anémie ainsi que les maladies neurologiques 3,36. En variante, l'augmentation de la biosynthèse de l'hème joue un rôle important dans la progression de certains cancers 28,37. L'hème a été montré pour être critique pour la croissance, la différenciation et la survie du tissu adipeux chez les mammifères, érythroïde et des cellules neuronales 4,38-41. Par exemple, une déficience de l'hème conduit à des lésions des neurites dans des neurones corticaux primaires de souris via l'inhibition de glutamate NMDA (N-méthyl-D-aspartate) 17 récepteur. En outre, l'inhibition de la synthèse de l'hème entraîne la mort cellulaire programmée dans le col épithéliale carcinome des cellules humaines HeLa 26,41. Par conséquent, en mesurant les niveaux de la biosynthèse de l'hème dans diverses cellules dans des conditions différentes est important pour l'étude de l'étiologie et progressisur de nombreuses maladies.
Nous décrivons ici une méthode rapide et sensible pour mesurer le niveau de synthèse de l'hème intracellulaire en utilisant [4- 14 C] acide 5-aminolevulic. Ceci est une méthode alternative à d'autres méthodes utilisant 55 Fe ou 59 Fe. Nous préférons utiliser 14 C parce que son rayonnement est très faible. En revanche, une forte protection est nécessaire pour travailler avec des isotopes Fe. En outre, cette méthode vise à mesurer et comparer la synthèse de l'hème dans des cellules différentes en parallèle d'une manière rapide. Afin de mesurer les niveaux de l'hème absolus, on peut utiliser la méthode précédemment établi impliquant l'utilisation de HPLC 42,43.
Heme joue un rôle clé dans la génération d'énergie par la respiration cellulaire 26. Altered métabolisme de l'hème est connue pour être associée à diverses maladies y compris le cancer 28,41. L'inhibition de la synthèse de l'hème est connu pour provoquer un arrêt du cycle cellulaire et l'apoptose dans des cellules Hela 26,41. Il a été démontré que le niveau de synthèse de l'hème élevée est associée à la progression de cellules de cancer du p…
The authors have nothing to disclose.
Les lignées cellulaires HCC4017 et HBEC30KT ont été gracieusement fournis par le laboratoire du Dr John Minna. Ce travail a été soutenu par les fonds Cecil H. et Ida Verts au Dr Li Zhang.
Acetone | Sigma | 650501 | |
Diethy ether | Sigma | 296082 | |
HCl (Hydrochloric acid) | Fisher | A481-212 | |
Liquid Scintillation cocktail | MP Biomedicals | 882470 | |
Trypan blue | Gibco | 15250 | |
Radiolabeled 4-14C aminolevulinic acid | Perkin-Elmer life sciences | Store @ -80 °C | |
CelLytic M | Sigma | C2978 | Mammalian cell lysis reagent |
Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23227 | |
Specific reagent | |||
Component | Dispense | ||
Heme extraction buffer- Acetone: HCl:Water (25:1.3:5) | Acetone | 25ml | |
Concentrated HCl | 1.3ml | ||
Water | 5ml |