Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.
Heme משמש כקבוצה התותבת למגוון רחב של חלבונים המכונים hemoproteins, כגון המוגלובין, מיוגלובין וcytochromes. הוא מעורב בתהליכים מולקולריים ותאיים שונים כגון שעתוק הגנים, תרגום, התמיינות תאים וחלוקה של תאים. רמות ביוסינתזה של heme להשתנות על פני רקמות שונות וסוגי תאים ומשתנות בתנאים חולים כגון אנמיה, נוירופתיה וסרטן. טכניקה זו משתמשת [4 14 C] חומצת 5-aminolevulinic ([14 C] 5-ALA), אחד מהמבשרים המוקדמים במסלול ביוסינתזה heme כדי למדוד את הרמות של סינתזת heme בתאי יונקים. assay זה כרוך דגירה של תאים עם [14 C] 5-עלא ואחרי חילוץ של heme ומדידה של הרדיואקטיביות שולבה heme. הליך זה הוא מדויק ומהיר. שיטה זו מודדת את הרמות היחסית של ביוסינתזה heme ולא מוחלט תוכן heme. כדי להדגים את השימוש בtechn זהique הרמות של ביוסינתזה heme נמדדו בכמה שורות תאי יונקים.
Heme, קומפלקס של ברזל ברזלי ותשיעי protoporphyrin הוא מולקולה מרכזית להובלה וניצול חמצן באורגניזמים כמעט כל חיים 1-3. המבנה הייחודי של heme מאפשר לו לתפקד כנשא של גזים ואלקטרונים דו אטומיים, כמו גם לבצע פעולות שונות אחרות 1-5. לדוגמא, heme נקשר לחמצן בהמוגלובין ומיוגלובין להעברה והאחסון של 6,7 חמצן. זה עובד גם כמוביל אלקטרון בcytochromes במהלך נשימה ומשמש כתורם אלקטרונים לתגובות חמצון-חיזור מזורזות על ידי אנזימי ציטוכרום P450 8,9. אחת התכונות החשובות ביותר של heme הוא ש, הוא יכול לשחק תפקידי פיקוח בתהליכים תאיים ומולקולריים כגון שעתוק הגנים, סינתזת חלבון ומייקרו-רנ"א biogenesis 4. לדוגמא, זה משפיע על השעתוק של גנים רבים על ידי שליטה על הפעילות של מדכאי תעתיק יונקים Bach1 וrec הגרעיני היונקיםeptor Rev-erbα 10-15. Heme מסדיר את הפעלת חלבון activator heme (האפ) 1 אשר ממלא תפקיד חשוב בהפעלה של גני המעורבים בנשימה ושליטה נזק חמצוני, בתגובה לheme או חמצן 16. Heme גם מסדיר שעתוק הגנים בתאים עצביים באמצעות גורם גדילה עצבית (NGF) איתות 3,17-20. זה גם מסדיר את סינתזת חלבון בתאי יונקים erythroid על ידי ויסות הפעילות של קינאז מוסדר heme eIF2α (HRI) 21-24. יתר על כן, heme משפיע על פעילותם של חלבוני איתות מפתח כגון טירוזין קינאז Jak2 וSrc, שהם חיוניים לתפקוד תאים תקין ו4,20,25 צמיחת תאים. נמצא כי בהלה עיכוב heme תאים גורם לעצירת מחזור התא והפעלה של סמנים הקשורים להזדקנות ומות תאים מתוכן 26. שני חסר הרן או הרמות הגבוהות של heme המשויכות השפעות בריאותיות חמורות בבני אדם 27. מולקולרי האחרוןND מחקרים אפידמיולוגיים הראו קשר חיובי של צריכת heme גבוהה וסיכון מוגבר למחלות, כגון סוכרת מסוג 2, מחלת לב כלילית וכמה סוגי סרטן, כולל סרטן הריאות, סרטן מעי גס וסרטן לבלב 27,28. בעזרת זוג תואם של המעבדה של המחברים תאי ריאה נורמלים והסרטן מצאו כי תאים סרטניים רמות גבוהות של צריכת חמצן, סינתזת heme וחלבונים המעורבים בספיגת heme וחמצן ניצול 28. מעניין לציין, עיכוב של סינתזת heme ירידה בצריכת חמצן, התפשטות, היווצרות הגירה ומושבה של תאים סרטניים 28. לפיכך, התנודות ברמות של heme אנדוגני ממלא תפקיד חשוב בויסות תהליכים מולקולריים ותאיים 3,4,28,29.
ביונקים, ביוסינתזה של heme מתרחשת בשמונה שלבים, הכולל אנזימים הממוקמים במיטוכונדריה וcytosol 4 (איור 1). biosyn hemeתזה מתחילה במטריצה של המיטוכונדריה עם העיבוי של גליצין וsuccinyl-CoA ליצירת חומצת 5-aminolevulinic (5-ALA), מזורז על ידי synthase ALA (אבוי) 4,31. זהו שיעור הגבלת צעד בביוסינתזה heme בתאי nonerythroid. 5-ALA לאחר מכן ייצא לcytosol בי ארבעה הצעדים הבאים להתרחש כדי ליצור coproporphyrinogen III (CPgenIII), אשר לאחר מכן מיובא חזרה למיטוכונדריה, שבו הוא הופך לIX protoporphyrin (PPIX). לבסוף, מולקולה אחת של ברזל משולב לIX protoporphyrin (PPIX) לייצר heme, תגובה מזורזת על ידי ferrochelatase (FECH) 2,4.
רמת ביוסינתזה heme תלויה בעיקר ברמה של אנזים אבוי שנתונה לפיקוח הדוקה על ידי ברזל וheme 4 תאיים. ביוסינתזה של heme יכולה להיות מושפעת מפגמים גנטיים, זמינות של מינרלים מסוימים וויטמינים (למשל, ריבופלאבין, אבץ), חשיפה לרעלים (למשל, אלומיניום, עופרת), אנוקסיה, חום, ורמות של סטרואידים מסוימים (לדוגמא, אסטרוגן) 32-35. רמת סינתזת heme משתנה בתנאים חולים שונים. ביוסינתזה heme ירד יכולה לגרום לאנמיה, כמו גם מחלות נוירולוגיות 3,36. לחלופין, ביוסינתזה heme המוגברת ממלאת תפקיד חשוב בהתקדמות של סרטן מסוים 28,37. Heme הוכח להיות קריטי לצמיחה, הבידול וההישרדות של שומן יונקים, erythroid ותאים עצביים 4,38-41. לדוגמא, מחסור heme מוביל לנזק neurite בנוירונים בקליפת המוח עכבר העיקרי באמצעות העיכוב של גלוטמט NMDA (N -methyl-D-aspartate) קולטן 17. בנוסף, עיכוב של סינתזת heme גורם למות תאים מתוכנת בקרצינומה של צוואר רחם אפיתל אדם תאי הלה 26,41. לכן, מדידת רמות ביוסינתזה heme בתאים שונים בתנאים שונים חשובה ללימוד אטיולוגיה וprogressiבמחלות רבות.
כאן אנו מתארים שיטה מהירה ורגישה למדידת הרמה של סינתזת heme תאית באמצעות חומצת 5-aminolevulic [4 14 C]. זוהי שיטה חלופית לשיטות אחרות באמצעות 55 או 59 Fe Fe. אנחנו מעדיפים להשתמש 14 C כי הקרינה שלה היא חלשה מאוד. לעומת זאת, הגנה חזקה נדרשת לעבודה עם איזוטופים פה. יתר על כן, בשיטה זו נועדה למדוד ולהשוות סינתזת heme בתאים שונים במקביל באופן מהיר. על מנת למדוד את רמות heme מוחלטות, ניתן להשתמש בשיטה שהוקמה בעבר בתחום השימוש בHPLC 42,43.
Heme ממלא תפקיד מרכזי בדור של אנרגיה תאית באמצעות נשימה 26. חילוף החומרים heme שינה ידוע להיות קשורים למחלות שונות, כוללים סרטן 28,41. עיכוב של סינתזת heme ידוע כגורם לעצירת מחזור התא ואפופטוזיס בתאי הלה 26,41. הוכח שרמת סינתזה הגבוהה heme קשור ההתקדמות של תאי סרט?…
The authors have nothing to disclose.
שורות תאי HCC4017 וHBEC30KT נמסרו באדיבות על ידי המעבדה של ד"ר ג'ון מינה. עבודה זו נתמכה על ידי קרנות ססיל ה 'ואידה הירוקה לד"ר לי ג'אנג.
Acetone | Sigma | 650501 | |
Diethy ether | Sigma | 296082 | |
HCl (Hydrochloric acid) | Fisher | A481-212 | |
Liquid Scintillation cocktail | MP Biomedicals | 882470 | |
Trypan blue | Gibco | 15250 | |
Radiolabeled 4-14C aminolevulinic acid | Perkin-Elmer life sciences | Store @ -80 °C | |
CelLytic M | Sigma | C2978 | Mammalian cell lysis reagent |
Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23227 | |
Specific reagent | |||
Component | Dispense | ||
Heme extraction buffer- Acetone: HCl:Water (25:1.3:5) | Acetone | 25ml | |
Concentrated HCl | 1.3ml | ||
Water | 5ml |