Demonstration af proteolytiske Aktivering af Epithelial Natrium Channel (ENAC) ved at kombinere strømmålinger med påvisning af spaltningsfragmenter

Summary

Proteolytisk aktivering af epithelial natrium-kanal (ENAC) heterologt udtrykt i Xenopus laevis-oocytter kan påvises ved at kombinere de aktuelle målinger med en biotinylering fremgangsmåde til at undersøge forekomsten af ionkanal spaltningsprodukter på celleoverfladen. Funktionelt vigtige spaltningssteder kan identificeres ved hjælp af steddirigeret mutagenese.

Introduction

Proteaser er enzymer, der er involveret i forskellige fysiologiske reaktioner, der spænder fra den velkendte proteolytisk nedbrydning af proteiner, i forbindelse med fordøjelsen, til yderst sofistikerede protease kaskader involveret i komplekse regulerende signalveje. Proteaser inddeles i syv grupper efter deres katalytiske aktive site: aspartat, asparagin, cystein, glutaminsyre, metallo, serin og threonin proteaser. Forskellige proteaser målrette forskellige spaltningssteder som ikke altid er let at forudsige fra den primære struktur af et protein. Den Merops database ( http://merops.sanger.ac.uk/ ) indeholder detaljerede oplysninger om en bred vifte af proteaser og deres privilegerede spaltningssites. Funktionelt relevante spaltningssteder kan identificeres under anvendelse af stedorienteret mutagenese.

Det er velkendt, at proteolytisk behandling af ENAC er en vigtig mekanisme for aktivering af ther særlig ionkanal ^1,2. Interessant, der er bevis for, at funktionen af den tilhørende syre-sensing ionkanal 1a (ASIC1a) også kan ændres af proteaser ^3-5. På nuværende tidspunkt er det stadig et åbent spørgsmål, om proteolytisk kanal spaltning spiller en relevant fysiologisk rolle i reguleringen af ​​aktiviteten af ​​andre ionkanaler eller transportvirksomheder. Det er imidlertid velkendt, at proteolytisk spaltning aktiverer en gruppe af G-protein-koblede receptorer, protease-aktiverede receptorer (Pars) ^6. Adskillige serinproteaser (f.eks kanal-aktiverende proteaser (CAP1-3), chymotrypsin, trypsin, furin, plasmin, neutrofil elastase og kallikrein) er blevet vist at proteolytisk aktivere ENAC ^2. Ud over serinproteaser, kan andre grupper af proteaser involveret i proteolytisk ENAC aktivering. Faktisk seneste data viser, at den metalloproteinasen meprin-β ⁷ og cystein protease cathepsin-S ⁸ kan også activate ENAC. De (pato-) fysiologisk relevante proteaser til ENAC aktivering imidlertid stadig skal bestemmes, og kan variere fra væv til væv.

Proteaser er kendt for fortrinsvis at spalte på bestemte steder i aminosyresekvensen. For eksempel serinprotease chymotrypsin viser en specifik spaltning mønster spaltning efter den aromatiske aminosyre rester phenylalanin og tyrosin. I modsætning hertil serinprotease trypsin efter præference spalter efter den grundlæggende rester lysin eller arginin. Brug mutant menneskelig γENaC konstruktioner genereret ved site-directed mutagenese, kunne funktionelt relevante spaltningssteder i ENAC heterologt udtryk i oocyt ekspressionssystem identificeres ^8-13.

Ved at indsprøjte cRNA for de tre ENAC underenheder (αβγ) til isolerede oocytter kan ENAC være funktionelt udtrykt i disse celler og aktiviteten af ​​kanaler til stede på plasmamembranen kan måles vedved hjælp af to elektroder spænding-clamp-teknikken. Ved hjælp af den diuretiske amilorid, en specifik ENAC hæmmer, amilorid-følsomme ENAC-medieret helcelle-aktuelle komponent (Ai _ami) kan adskilles fra uspecifikke læk strømme eller strømme, der foretages af andre ionkanaler. Således Ai _AMI værdier afspejler generelle ENAC aktivitet og kan bestemmes ved at subtrahere helcelle-strømme målt i nærvær af amilorid fra de tilsvarende helcelle-strømme er optaget i fravær af amilorid. For at teste om en protease har en stimulerende virkning på ENAC, er Ai _ami målt to gange i den samme oocyt, dvs før og efter inkubation af oocytten i en protease opløsning. En stigning på Ai _ami fra den første til den anden måling indikerer proteolytisk ENAC aktivering. Chymotrypsin eller trypsin vides at maksimalt stimulere ENAC i oocyt-ekspressionssystem ^2,14 og kan bruges til at fortrorm at proteolytiske ENAC aktivering kan påvises i en given batch af oocytter.

Parallelt med helcelle-strømmålinger blev en biotinylering tilgang ⁹ anvendt til at undersøge om stigningen i Ai _ami påvist ved udsættelse af oocytterne for proteaser korrelerer med forekomsten af ENAC spaltningsfragmenter på celleoverfladen. Proteiner på celleoverfladen er mærket med biotin og kan adskilles fra intracellulære proteiner ved binding af de biotinylerede proteiner neutravidin-mærkede agaroseperler. De biotinylerede proteiner kan analyseres ved western blot. γENaC spaltningsfragmenter på celleoverfladen kan detekteres ved anvendelse af et specifikt antistof rettet mod en epitop i C-terminalen af ​​γENaC. At identificere funktionelt relevant kløvningssted (r), forudsagde spaltningssites kan muteres ved hjælp af site-directed mutagenese. Vildtype-og mutant kanaler sammenlignes i parallelle eksperimenter under anvendelse af oocytter fra same batch.

Med denne metodik det blev påvist for første gang, at proteolytisk aktivering af ENAC-medierede helcelle-strømme korrelerer med den tidsafhængige udseende ENAC spaltningsfragmenter på celleoverfladen. Disse resultater tyder på en årsagssammenhæng mellem kanal spaltning og kanal aktivering. Desuden, ved hjælp af steddirigeret mutagenese af formodede spaltningssteder i kombination med to-elektrode spænding-clamp-teknikken, funktionelt relevante spaltningssteder for plasmin, chymotrypsin ¹³ og ^{cathepsin-S-8} blev identificeret.

Protocol

1. Isolering af Xenopus oocyter og mikroinjektion af cRNA

1. Anskaf oocytter fra voksne kvindelige Xenopus laevis. Bedøve dyr i 0,2% MS222 og resect æggestokkene lapper gennem en lille abdominal incision.
2. Isoler oocytter fra æggestokkene lapper ved enzymatisk fordøjelse ved 19 ° C i 3-4 timer med 600-700 U / ml type 2 collagenase fra Clostridium histolyticum opløst i calciumfrit OR2 opløsning (opskrift i tabel 1).
3. For udvælgelse, placere defolliculated oocytter i en petriskål under et binokulært mikroskop i en høj natrium opløsning (ND96: opskrift i tabel 1).
4. Vælg fase V-VI oocytter og placere dem i en anden petriskål med en Pasteur-pipette. BEMÆRK: Blunt Pasteur pipette ved flambering at forhindre oocyt skade.
5. Injicere oocyter med cRNA (fx 0,2 ng pr αβγENaC underenhed). Opløses cRNA'er i RNase-frit vand. BEMÆRK: I altinjiceret i hver oocyt volumen er 46 nl.
6. Opbevares injicerede oocytter ved 19 ° C i en lav natrium løsning for at forhindre natrium belastning af oocytterne (ND9: opskrift i tabel 1). Supplement opløsningen med 100 U / ml natrium-penicillin og 100 ug / ml streptomycin-sulfat til at forhindre bakterievækst. Håndtag forsigtigt oocytter at begrænse mængden af ​​beskadigede eller døde oocytter og vedligeholde dem i individuelle små grupper i en 12-godt-brønde fyldt med bad løsning under de to dage efter cRNA injektion.

2.. Udførelse To elektrodespænding-clamp Eksperimenter

1. Mål oocytter to dage efter injektion.
2. Fyld en sprøjte af en tyngdekraftsforsynet perfusionssystem med ND96-opløsning og en anden sprøjte med ND96 opløsning indeholdende amilorid (2 uM). Mount sprøjter 50 cm over oocyt bad kammer. BEMÆRK: Koncentrationen af ENAC inhibitor amilorid blev valgt til at være 20 gange højere end _IC50
3. Tænd en 150 W halogen kold lyskilde og justere det til 10 cm over oocyt bad kammer giver god visualisering med kikkerten mikroskop. Tænd derefter suge-og justere sugerøret i slutningen af ​​oocyt badkammeret. Find sugerøret modsat superfusionsapparatet rør "adapter ind i oocyt bad. BEMÆRK: Sugestyrke skal være tilstrækkelig til at understøtte kontinuerlig strøm af løsningen superfusing ægget.
4. Juster superfusionsapparatet hastighed af hver opløsning på 3-5 ml / min ved hjælp af iv tyngdekraftsstrømningsystem betjeningsanordning. Slut superfusionsapparatet rør med en adapter til oocyt bad kammer.
5. Træk glaskapillarer med en mikropipette aftrækker til at opnå tip diameter <1 um. Derefter fyldes kapillærer til ~ 1/4 med 3 M KCI. BEMÆRK: Sørg for, at chlorerede del af sølvtråd af elektroden indehaver er nedsænket i KCl-opløsning. Kontroller for luftbobler i spidsen af ​​kapillarrøret. Luftbobler forringe measuat kravet ved at øge modstanden snyltekapacitet.
6. Sæt kapillærerne ind i elektroden indehaverne af den nuværende og den spænding elektroden og placere dem i ND96 indeholdende amilorid (2 uM) løsning ved hjælp af mikro-manipulatorer.

3.. Måling af Amiloride følsomme Whole-celle Currents

1. Zero elektrode potentiale spændingselektrodeenhederne (V _m) og strømelektroden (V _e) ved at tilpasse V _m og V _e offset _{knapper BEMÆRK:.} Modstanden skal være 1-2 MOhm for elektroden at måle V _m og 0,5 -1 MOhm for den aktuelle injektion elektrode.
2. Placer oocyt ind i badkammeret i tæt nærhed til spændingsmåling elektrode. BEMÆRK: Undgå at beskadige oocyt under nogle af disse transfer trin. Anvend en Pasteur-pipette for at overføre oocyt. For at undgå at beskadige oocyt kanterne af pipetten skal stumpe ved flambering.
3. Spidde oocytes forsigtigt med begge mikroelektroderne.
4. Indstil den bedrift potentiale på forstærkeren til -60 mV og tænde diagramskriver. Tænd amilorid (2 uM) opløsning. BEMÆRK: Den nuværende bør være omkring 0 ± 0,5 uA. Større læk strømme indikerer en utæt impalement. Derfor bør disse oocytter afvises. Endvidere bør læk strømme målt i nærværelse af amilorid (2 uM) være ens i αβγ-WT udtrykker oocytter til dem, der måles i αβγ-mutant ENAC udtrykker oocytter. Dette indikerer, at mutationerne ikke påvirker amilorid-følsomhed af kanalen.
5. Start optagelsen. Hvis det er nødvendigt justere forstærkningen.
6. Efter den målte strøm når et stabilt plateau, skifte til amilorid-fri løsning. BEMÆRK: Nedadgående nuværende udbøjninger i de nuværende spor svarer til aktiv strøm, dvs bevægelse af positiv ladning (Na ⁺⁾ fra den ekstracellulære side ind i cellen.
7. After en aktuel plateau er nået (efter ~ 60 sek), skal du skifte superfusionsapparatet tilbage til amilorid opløsning. Efter den nuværende af ægget når den indledende baseline strøm, sluk for spændingen klemme og forsigtigt trække elektroderne.
8. For at tillade genlukning af plasmamembranen på de steder impalement placere ægget i en brønd på en 96-brønds plade indeholdende 100-150 ul af protease fri ND96 løsning.
9. Efter 5 minutter overføre oocyt til en protease indeholdende opløsning eller en kontrolopløsning uden protease for en 30 min inkubation. BEMÆRK: Inkubationstiden afhænger af protease og studerede kanal.
10. Efter inkubationstrinnet gentage den aktuelle måling (se 3.2 ff.) BEMÆRK: Det er muligt at måle> 90% af oocytter efter inkubation i protease løsning.

4.. Biotinylering Assay

1. Vælg og kassere defekte oocytter under kikkerten mikroskop. BEMÆRK: Brug injicereed oocyter fra samme parti for den aktuelle målinger og biotinyleringsbetingelserne eksperimenter.
2. Hold biotin ved stuetemperatur i mindst 20 minutter inden anvendelse i eksperimentet.
3. Forbered løsninger: ND96 og ND96 indeholder den passende protease. Forbered pasteurpipetter ved mærkning dem og ved kortvarigt flammende deres tips til at undgå skade af oocytter. BEMÆRK: Her er protease chymotrypsin 2 ug / ml i ND96 anvendes. Behandl hver gruppe med en separat pipette til at undgå krydskontaminering af løsninger.
4. Fyld hver brønd i en plade med 6 brønde med 2,5 ml kontrol ND96 eller ND96 indeholdende en protease ved stuetemperatur. Derefter deponere 30 oocytter pr brønd og inkuber dem i 30 minutter ved stuetemperatur. BEMÆRK: For de efterfølgende procedurer er det vigtigt at holde prøver på is på alle tidspunkter. Alle centrifugeringstrin er på udført ved 4 ° C.
5. Fyld hver brønd i en ny 6-brønds plade med 2,5 ml ND96 (hver gruppe har brug for 3 brønde til vasketrinene), afvejes biotin. BEMÆRK: 2,5 mg biotin pis godt (1 mg / ml) er påkrævet. Biotin opløses i biotinylering buffer (dvs. 25 mg biotin (10 grupper) i 25 ml biotinylering puffer (opskrift i tabel 1).
6. Overfør hver gruppe af oocytter til en brønd fyldt med 2,5 ml ND96. Transfer oocytter sekventielt i to yderligere brønde med ND96 at vaske resterende protease. Inkuber oocytter i 5 min i ND96.
7. Overfør oocytterne i en brønd indeholdende 2,5 ml biotin-opløsning og inkuberes dem med forsigtig omrøring (»shaker) i 15 min. BEMÆRK: Minimer overførte ND96 med pipetten for at undgå fortynding af biotin løsning.
8. Overfør hver gruppe af oocytter i en brønd indeholdende 2,5 ml quench puffer (opskrift i tabel 1) for at stoppe biotinylering-reaktionen. Overfør derefter hver gruppe af oocytter i en anden brønd, der også indeholder 2,5 ml slukke buffer og inkuberes i 5 minutter med forsigtig rystning.
9. Fjern beskadigede eller døde oocytter. BEMÆRK:Vælg det samme antal oocytter per gruppe til følgende procedure.
10. Overfør hver gruppe af oocytter til et 1,5 ml mikrocentrifugerør af plast. BEMÆRK: Minimer mængden af ​​quench buffer, der er overført.
11. Derefter lysere oocytter ved at lade dem passere gennem en 27 G nål i 1 ml lysisbuffer (opskrift se tabel 1) suppleret med proteaseinhibitorer.
12. Centrifuger lysaterne i 10 min ved 1.500 x g..
13. Aspirer supernatanten og overføre det til et 1,5 ml mikrocentrifugerør indeholdende 0,5% Triton-X-100 og 0,5% NP40. Kassér den resterende pellet. BEMÆRK: Supernatanten indeholder biotinylerede plasmamembranproteiner og ikke-biotinylerede intracellulære proteiner.
14. Inkubér mikrocentrifugerør i 20 minutter på is. Gentagne gange vortex rørene i denne periode for at opløse proteinerne i NP40 og Triton-X-100.
15. Centrifuger 100 pi agaroseperler per oocyt gruppe i 3 minutter ved 1.500 x g. Eftercentrifugering fjernes supernatanten fra perlerne opløsning og vaskes tre gange med lyseringsbuffer ækvilibrere perlerne med puffer.
16. Afpipetteres 100 pi af de vaskede perler i hvert mikrocentrifugerør indeholdende protein-detergent-opløsning fremstillet i 4,13 for at tillade binding af de biotinylerede proteiner til perlerne.
17. Inkuber mikrocentrifugerør med overhead rotation O / N ved 4 ° C.
18. Centrifugere mikrocentrifugerør i 3 min ved 1.500 x g.. Derefter overføres supernatanten til et nyt rør. BEMÆRK: intracellulære proteiner er ikke mærket med biotin. Supernatanten kan opbevares ved -20 ° C. Aspirér ikke perlerne.

5.. Påvisning af ENAC spaltningsfragmenter på celleoverfladen ved Western blot-analyse

1. Vask perlerne tre gange med lyseringsbuffer og 100 pi 2x SDS-PAGE-prøvebuffer. BEMÆRK: Prøver kan opbevares ved -20 ° C eller umiddelbart forberedt til Western blot-analyse.
2. Kog ssempler i 5 minutter ved 95 ° C og derefter placere rørene på is.
3. Centrifugér prøver i 3 min ved 20.000 xg og pipetteres supernatanten til et nyt mikrocentrifugerør. BEMÆRK: Denne supernatant indeholder de biotinylerede plasmamembranproteiner fra celleoverfladen af ​​oocyt.
4. Analyser 30 pi af denne supernatant ved Western blot for at undersøge spaltningsfragmenter på celleoverfladen.
5. Adskil de biotinylerede proteiner ved SDS-PAGE (natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgel-elektroforese) under anvendelse af en passende gel (8%, 10%, 12%, afhængigt af molekylvægten af ​​spaltningsfragmenter undersøgte).
6. Overfør proteinerne til polyvinylidendifluorid (PVDF) membraner ved halvtør blotting.
7. Probe af membranen med et specifikt antistof mod human γENaC rettet mod en epitop i C-terminalen (se figur 3 og ^13).
8. Brug peberrodsperoxidase-mærket gede-anti-kanin-antistof som sekundært antikrop.
9. Detect kemiluminescerende signaler.

Representative Results

For at undersøge om den serinprotease plasmin kan aktivere ENAC medierede blev Ai _ami individuelle ENAC-udtrykkende oocyter bestemmes før og efter 30 minutters inkubation af oocytterne i protease-fri (kontrol) (figur 2A) eller plasmin opløsning (figur 2B) ved hjælp af to elektroder spænding-clamp-teknikken (se figur 1). Udsættelse for plasmin øget Ai _ami i hver oocyt målt. I modsætning hertil i kontrolforsøg, 30 min inkubation af ENAC-udtrykkende oocytter i protease-fri løsning havde en ubetydelig effekt (Figur 2 C, D). Således, ved anvendelse af denne fremgangsmåde en stimulering af ENAC-medieret strøm med plasmin kan påvises.

For at undersøge effekten af ​​at mutere putative spaltningssteder upon aktivering af ENAC-medierede strømme, såvel som på kanal spaltning, blev virkningen af ​​chymotrypsin på WT-ENAC, i sammenligning meden mutant ENAC med muteret prostasin og Plasminspaltning sites (γ _{RKRK178AAAA, K189A).} Tidsforløbet for kanal-aktivering ved chymotrypsin samt udseendet af ENAC spaltningsprodukter på celleoverfladen blev undersøgt ved hjælp af forskellige protease inkubationstider (fig. 4A). Det blev påvist, at de muterede kanal forsinkelser og reducerer aktivering af ENAC-medieret strøm af chymotrypsin. Dette er parallelt med en forsinket udseende af en lavere molekylvægt γENaC spaltningsfragment af 67 kDa svarende til den fuldt spaltede underenhed. Cleavage fragmenter blev detekteret ved γENaC antistof rettet mod en epitop i den C-terminale (figur 3). Denne metodiske fremgangsmåde viser, at tidsforløbet af proteolytisk aktivering af ENAC medierede korrelerer med forekomsten af en 67 kDa γENaC spaltningsprodukt på celleoverfladen (figur 4 B, C). Dette støtter ideen om etårsagssammenhæng mellem proteolytisk kanal spaltning og kanalaktivering ^13. Endvidere, ved at kombinere de aktuelle målinger og påvisning af γENaC fragmenter på celleoverfladen blev det påvist, at de muterede spaltningssteder er funktionelt relevant for proteolytisk kanalaktivering.

Fig. 1. Fremgangsmåde til bestemmelse af den stimulerende virkning af en protease på ENAC heterologt udtrykt i Xenopus laevis-oocytter. ENAC aktivitet vurderes ved at måle amilorid-følsomme helcelle-aktuelle komponent Ai _ami.

Figur 2.. Plasmin stimulerer ENAC medierede currents i oocytter, der udtrykker ENAC. (AD) Oocytter udtrykker human ENAC blev inkuberet i 30 minutter i protease-fri opløsning (kontrol) eller i opløsning indeholdende plasmin (10 ug / ml). For at bestemme Ai _ami før (-) og efter (+) inkubation blev oocytter fastspændt på et holdepotentiale på -60 mV (A, B) Fire repræsentative helcelle-løbende spor fra en batch af oocytter.. Amilorid (AMI) var til stede i badopløsningen specifikt at inhibere ENAC som angivet ved sorte bjælker. (C) opnåede datapunkter fra en enkelt oocyt er forbundet med en linje. (D) Sammenfatning af lignende forsøg som vist i C. kolonner repræsenterer relative stimulerende virkning på Ai _ami beregnet som forholdet mellem Ai _ami målt efter en 30 minutters inkubation (Ai _ami 30 min) til den oprindelige Ai _ami (Ai _ami indledende) målt før inkubation. På indersiden af ​​kolonner angiverantallet af individuelle oocytter måles. N angiver antallet af forskellige batches af oocytter. (Dette tal er blevet ændret fra [Haerteis m.fl. 2012 J Gen Physiol 140, 375-389, doi:. 10.1085/jgp.201110763])

Fig. 3. Model af γENaC subunit viser spaltningssteder for proteolytisk aktivering og bindingsstedet for antistoffet anvendes. Proteolytisk spaltning med Golgi-associerede convertase furin er vigtigt for ENAC modning i biosyntesevejen inden kanalen når plasmamembranen. Efter spaltning med furin en 76 kDa-fragment kan detekteres på celleoverfladen under anvendelse af en biotinylering tilgang og et antistof mod en epitop i C-terminalen af ​​γ-underenhed. Det pivotale sidste trin i proteolytisk DAaC aktivering sandsynligvis finder sted ved plasmamembranen, hvor γENaC spaltes af ekstracellulære proteaser (fx plasmin eller chymotrypsin) i et område distalt i forhold til furinsite resulterer i en 67 kDa spaltningsfragment. (Dette tal er blevet ændret fra [Haerteis m.fl. 2012 J Gen Physiol 140, 375-389, doi:. 10.1085/jgp.201110763])

Figur 4:. Mutere både plasmin (K189) og prostasin spaltningssted (RKRK178) forsinker aktiveringen af ENAC medierede og fremkomsten af en 67 kDa spaltningsprodukt af kanalens γ-underenhed Oocytter udtrykker WT (åbne symboler), og γ _{RKRK178AAAA; K189A} ENAC mutant kanal (lukkede symboler) blev inkuberet i 30 minutter i protease-fri opløsning (kontrol) eller 5, 30 eller 60 minutter i en opløsning indeholdende chymotrypsin (2 ug / ml). (A) at bestemme Ai _ami før og efter inkubation blev oocytter fastspændt på et holdepotentiale på -60 mV. Cirkler repræsenterer forholdet mellem Ai _ami målt efter 5, 30 eller 60 minutters inkubation (Ai _ami min) til den oprindelige Ai _ami (Ai _ami indledende) målt før inkubation. Hvert datapunkt repræsenterer middelværdien Ai _ami målt i 22-24 individuelle oocytter fire forskellige batches. (BD) Parallelt med påvisning af Ai _ami ekspression af biotinyleret γENaC på celleoverfladen blev analyseret ved SDS-PAGE. γENaC blev påvist med et antistof mod en epitop på C-terminalen af ​​human γENaC. Repræsentative western blots fra en batch af oocytter er vist. (CE) Densitometrisk analyse af tre western blots svarende til dem, der er vist i B eller D. hver bane, signals opdaget i regionerne 76 kD (åbne søjler) og 67 kD (grå søjler) blev bestemt og normaliseret til summen af det samlede signal opdaget. N angiver antallet af forskellige partier af oocytter. Klik her for at se større billede.

Discussion

I dette manuskript en metodisk tilgang som med succes blev anvendt til at studere de mekanismer, der ligger til grund aktivering af ENAC af proteaser er beskrevet ^8,13. Den veletablerede Xenopus laevis oocyt udtryk system blev brugt til funktionelt express ENAC. ENAC funktion blev vurderet med det konventionelle to-voltage-clamp-teknikken. Site-directed mutagenese blev anvendt til at identificere funktionelt relevante proteasespaltningssteder. Biotinylering eksperimenter udført parallelt med de elektrofysiologiske målinger gjort det muligt at korrelere forekomsten af ​​ENAC spaltningsprodukter på celleoverfladen med proteolytisk aktuelle aktivering. En sammenhæng mellem tidsforløbet for nuværende aktiveringskode og fremkomsten af ​​proteolytiske spaltningsfragmenter på celleoverfladen støtter ideen proteolytisk kanalaktivering.

To-elektrode spænding-clamp optagelser kræver impalement af en oocyte med to mikroelektroder. Denne procedure udføres sædvanligvis kun én gang i en enkelt oocyt. Det var imidlertid muligt at fjerne mikroelektroder efter en indledende helcelle aktuelle optagelse uden synlig skade på oocyt. Faktisk synes plasmamembranen på de steder, impalements at forsegle inden for et par minutter. Således, efter afslutning af en første to-voltage-clamp-måling, er det muligt at overføre ægget fra den eksperimentelle strømningskammeret af de to elektroder spænding-clamp setup til et mikrocentrifugerør eller en brønd i en 96-brønds plade fyldt med en lille mængde af test eller kontrol løsning. Bagefter kan den samme oocyt overføres tilbage til strømningskammeret og kan spiddet igen for at udføre en anden to-voltage-clamp-måling. Bemærkelsesværdigt havde ENAC medierede ikke varierer meget mellem den første og anden måling, når oocytten blev opretholdt i kontrolopløsning. I modsætning hertil, inkubering af oocytten i en protease indeholdende solution efter den første måling resulterede i øget ENAC-medieret strøm i den anden måling (figur 2). Dette fund tyder på proteolytisk kanalaktivering.

Udførelse af to separate strømmålinger i en enkelt oocyt giver den fordel, at ægget kan blive eksponeret for proteaser eller andre farmakologiske midler mellem de to målinger for en variabel længde af tid i et lille volumen af ​​testopløsning. Dette er vigtigt, når du bruger midler, som er dyre og / eller utilgængelige i store mængder, fx oprensede protease præparater. Den begrænsede tilgængelighed af midler kan gøre det umuligt (eller uoverkommelige) for at bruge dem i kontinuerlige to-elektrode spænding-clamp optagelser på grund af de store mængder af testopløsning kræves for løbende at superfusing oocytter med flowhastigheder på adskillige milliliter per minut. Desuden er kontinuerlige to elektroder spænding-clamp målinger begrænset af den velkendte fænomenEnon for spontan kanal nedtrapning også beskrevet for ENAC ^15. Derimod er at udsætte oocytter at teste løsninger mellem to separate målinger i op til en time eller mere generelt ikke et problem (se figur 4A). Endelig to sekventielle målinger udført i samme ægcelle tillade parret observationer af narkotika effekter. Dette har en fordel i forhold uparrede målinger fra to separate grupper af oocytter (protease-behandlede og vehikel-behandlede), fordi det reducerer problemet med høj variabilitet mellem oocyter, sædvanligvis observeret i ionkanal ekspression. Med parrede observationer og muligheden for at normalisere dataene til den første måling er der behov for færre oocytter pr forsøgsgruppe at påvise en signifikant virkning af et farmakologisk middel. Normalisering af data gør det også nemt at opsummere data fra forskellige batches af oocytter med forskellige ionkanal ekspressionsniveauer og dermed forskellige baseline strømme (figur 2D). Naturligvis er det nødvendigt kontrolforsøg for denne fremgangsmåde til at påvise, ionkanalaktiviteten af interesse forbliver stabil i vehikelbehandlede kontrolgruppe oocytter fra den første til den anden måling (se figur 2).

For at påvise at proteolytisk nuværende aktivering korrelerer med forekomsten af ENAC spaltningsprodukter på celleoverfladen, biotinylering fremgangsmåde oprindeligt beskrevet af Harris et al. ⁹ kan anvendes. Denne procedure (som beskrevet i protokollen afsnit og vist i figur 4) blev tilpasset til at påvise, at eksponeringen af kanaler proteaser og efterfølgende aktivering af ENAC-medierede strømme går hånd i hånd med den tidsafhængige udseende spaltningsfragmenter. Biotinyleringen metode giver også analyse af en samlet stigning eller fald af membranproteiner på celleoverfladen. Således er denne metode egnet til at undersøge effekten af ​​proteaser og andre farmaceutiskehar farmakologisk agenter efter kanal indsætning i plasmamembranen eller efter kanal hentning. Desuden, western blot-analyse af de biotinylerede plasmamembranproteiner muliggør påvisning af proteinfragmenter (f.eks proteolytiske ENAC fragmenter) eller ændringer i glycosyleringsmønster, som kan være funktionelt relevant.

Det konkluderes, at kombinationen af ​​metoder, der anvendes til at undersøge den stimulerende virkning af proteaser på ENAC-medierede helcelle-strømme og til at demonstrere en korrelation med forekomsten af ​​ENAC spaltningsprodukter ved celleoverfladen kan være nyttige for en bred vifte af anvendelser. Især kan disse metoder være egnet til at løse lignende spørgsmål vedrørende regulering af andre ionkanaler, transportører eller transmembrane receptorer (f.eks protease-aktiverede receptorer Pars).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Bath clamp headstage for OC-725C-V	Warner Instrument Corporation
Cold light source - Schott KL 1500 LCD	Schott	#SCOC150200EU	brightness 4; mechanical aperture: D; color temperature: 3,000 K
E Series electrode holder (Str, Vent, Ag Wire, 1.2 mm)	ADinstruments	#ESW-F10v
Left micromanipulator; MM-33L	Warner Instrument Corporation	#64-0055
LIH 1600 - computer interface	HEKA
Magnetic valve system (ALA BPS-8) in combination with a TIB14 interface (HEKA)	ALA Scientific Instruments, HEKA
OC-725C amplifier for two-electrode voltage-clamp recordings	Warner Instrument Corporation
P-97 FLAMING/BROWN Micropipette Puller	Sutter Instruments		heat = 550; velocity = 22; time = 200
Right micromanipulator; MM-33R	Warner Instrument Corporation	#64-0056
Series electrode holder (45°, Vent, Handle, Ag Wire, 1.2 mm)	ADinstruments	#E45w-f10vh
STAT 2 IV gravity flow controller	Conmed	#P-S2V-60
Vacuum generator ejector SEG - for suction to remove bath solution	Schmalz
INFUJECT 60 ml pump syringes for solutions	Braun	#22050
Injekt-F for lysing the oocytes	Braun	#9166033V
Standard wall borosilicate tubing with filament	Sutter Instruments	#BF150-86-10	outside diameter: 1.5 mm; inside diameter: 0.86 mm; length: 10 cm
Complete, Mini, EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets	Roche Applied Science	#11836170001
EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin	Thermo Scientific	#21217
Horseradish peroxidase-labeled secondary goat anti-rabbit antibody	Santa Cruz Biotechnology	#sc-2004
NeutrAvidin Agarose	Thermo Scientific	#29200	Neutravidin-labeled agarose beads
NP40 (Nonidet P-40)	Sigma-Aldrich	#I8896
Roti-Load 1 (2x SDS-PAGE sample buffer)	Carl Roth	#K929.2
SuperSignal West Femto Chemiluminescent Substrate for detection of chemiluminescent signals	Thermo Scientific	#34095
Triton-X-100	Sigma-Aldrich	#T8787