Summary
ポリ（グリセロール - ドデカン）という小説の生分解性ポリマーから新たに設計されたコレクタを経由して、より大きな沈着領域にまたがるエレクトロ長繊維（PGD）の合成及び製造が報告された。繊維は、マウス多能性幹細胞に由来する細胞の増殖を支持することができた。
Abstract
組織工学用途のために、生分解性および生体適合性の足場の調製は、最も望ましいが困難なタスクである。様々な製造方法の中で、エレクトロスピニングは、そのシンプルさと汎用性に最も魅力の一つです。さらに、電界紡糸ナノ繊維は、細胞の生存および増殖のための追加の支持を確保する天然の細胞外マトリックスのサイズを模倣する。本研究では、エレクトロスピニングのために新たに設計されたコレクタを使用してポリ（グリセロール-ドデカン）（PGD）1という名前の新 たな生分解性と生体適合性ポリマーのためのより大きな沈着領域にまたがる長繊維の製造の実現可能性を示した。 PGDは、従って、それが神経組織工学用途に適している、神経組織と同様の機械的特性を有する独特の弾性特性を呈する。繊維性足場材料を製造するための合成および製作のセットアップは、簡単で再現性の高い、安価であった。生体適合性に試験、マウスの胚性幹細胞由来の細胞はに付着し、エレクトロスピニングPGD繊維上で成長できた。要するに、このプロトコルは、マウス胚性幹細胞由来の神経系細胞の増殖を支持するためにPGDの電界紡糸繊維を製造するための多用途の製造方法を提供した。
Introduction
エレクトロスピニングは、マイクロ·ツー·ナノサイズの繊維足場を作製するための効果的な処理方法の一つである。エレクトロスピニングの基本原理は、針の先端と接地されたコレクタとの間に高電圧を印加して、針の開口部に保持される溶液のテーラーコーンを含む。溶液中の静電反発力が表面張力を克服したときに、荷電流体ジェットは、針先端から排出され、溶媒の蒸発と空気を通って移動し、最終的に接地された集電体上に堆積される。シリンジポンプは、紡糸口金から出てくる溶液の連続流を提供し、電界紡糸繊維のこのように複数のコピーが短時間で製造することができる。コレクタに到達するために紡糸口金を出るの過程の間に、帯電したジェットは、ポリマー溶液の粘度及び表面張力を含むパラメータの数、electrostatiに記載の伸縮及び泡立て受けるC溶液の力、及び外部電場との相互作用など2。
電界紡糸プロセスにおいては、集電体は、マイクロ·ツー·ナノファイバーが堆積することができる導電性基板として機能する。本研究では、繊維集新しいタイプの所望のサイズ（長さ×幅）で繊維マットを得るように設計した。伝統的に、アルミニウム箔を集電体として使用されるが、他の基板に平坦な表面から繊維を転送することは困難である。伝統的なコレクタから無傷の繊維マットを収穫することの難しさは、電界紡糸繊維がコレクターの表面に強固に付着するということが主な原因だった。そこで、短冊にアルミニウム箔片を折り畳み、金属平板に垂直に取り付けることによってコレクタを修飾。電界紡糸繊維は、ストリップの先端と簡単に別substratに転送することができる金属板との間の領域にわたって延伸されるE。
熱架橋エラストマーポリマーへの関心が急速にため、ポリ（グリセロールセバケート）（PGS）、2002年3において、加硫ゴムに似ています。PGSと同様にポリエステルを導入しましたロバート·ランガーのグループの先駆的な仕事の成長、私たちが開発に成功しているされているグリセロールおよびドデカン二酸の熱縮合によりポリ（グリセロール-ドデカン）（PGD）とその独特な形状記憶特性1を示した。より硬い合成材料であるポリ（ヒドロキシブチレート）又はポリ（L-ラクチド）（それぞれが250MPaおよび660メガパスカルのヤング率）とは異なり、PGDは、温度が37℃以上である1.08メガパスカルのヤング率を有するゴムのようなエラストマー性を示すその場末梢神経（0.45メガパスカル）に近い試合で、C、。加えて、PGDは、生分解性であり、分解時間は、グリセロールおよびドデカン二酸の比率を変えることによって微調整することができる。ドデカン二酸は12炭素のサブです2端子カルボキシル基、HOOC（CH 2）10 COOHとスタンス。セバシン酸及びドデカン二酸等が偶数番号のジカルボン酸は、アセチル-CoAおよびトリカルボン酸（TCA）/（クエン酸）サイクルを入力するように代謝され得る。ジカルボン酸の代謝産物、スクシニル-CoAは、糖新生前駆体およびTCA回路4の中間体である。したがって、いくつかの研究は、それらが、特に病的状態では、経腸および非経口栄養のための代替燃料の基質として利用できることが示唆された。そのガラス転移温度が31°Cであるため、また、PGD、従ってそれは室温及び体温で異なる機械的性質を示す、ユニークな形状記憶を呈する。要するに、PGDは、神経組織に類似した機械的特性を持つユニークな弾性特性を示す、生分解性、生体適合性である;従って、それは神経組織工学用途に適した材料である。このプロトコルでは、エレクトロ大沈着領域にまたがる長い繊維が、PGDから新設計のコレクタを経由して作製した。ファイバー足場は、マウス多能性幹細胞の増殖および分化を支持することができる。
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Protocol
1。エレクトロコレクターのセットアップ
- 矩形片にアルミホイルを切った。
- 短冊に矩形片を折るし、テープで平らな金属板（ 図1）に垂直に取り付けます。注：繊維マットの寸法は、ストリップの長さおよび幅に依存する。必要に応じて、このようにして、ストリップの寸法を調整することができる。
2。高分子溶液の調製
- PGDポリマーを得100時間、120℃でビーカーに1:1のモル比でグリセロールおよびドデカン二酸（DDA）を混ぜる。
- 15mlチューブ中の1.5:3:95.5の重量比65％エタノール中でのポリ（エチレンオキシド）（PEO）およびゼラチンを溶解させ、キャップを締めて、撹拌しながら1時間60℃のオーブン中で混合物を加熱それは均一な溶液（基礎溶液）になるまで。
- エレクトロスピニングの場合は、PGDポリマーと4時06分重量比で、基礎溶液を混合する。注意：PGD濃度は双方向がありグラム繊維径に与える影響。 30％-50％パーセントのPGDはもはや増加しなくなる繊維直径を有する5 cm未満の繊維を製造するのに許容可能である。
- ポリマー溶液に0.1％のリボフラビンを加え、よく混ぜる。
3。エレクトロスピニング
- 18 gの5ミリリットル標準シリンジにポリマー溶液を供給するには、ステンレス製の針を平滑化。
- シリンジポンプへシリンジを挿入します。
- 金属板への高電圧電源および針に正に荷電リードの接地されたリードを取り付ける。
- 15センチメートルに針とアルミ箔帯の間の距離を調整します。
- ストリップの前面に、繊維の凝集を防止するために、水平方向に約15°の角度でシリンジポンプを配置します。
- シリンジポンプの電源を入れ、0.6ミリリットル/時にポンプの流量を調整します。
- 高電圧電源をオンにして、14.6 kVの動作電圧を設定する。
4。繊維加工
- 収集が完了すると、架橋のために60分間UV光に繊維マットを露出させる。
- 100ミリメートルのペトリ皿にアルミ箔ストリップから繊維マットを転送し、殺菌のためさらに20分間UV光にさらす。
- バイオセーフティキャビネットでは、外科用ブレードを用いて同じ大きさの円形の部分に繊維マットをカットし、24ウェルプレートに作品を配置します。
- 電池プレシーディング処理のために、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）1ml中に繊維サンプルを浸漬し、37℃で一晩インキュベートする。
- 翌日、PBSを吸引除去し、慎重に、各ウェルに（材料表内のレシピを参照）を分化培地（DMEM/F12、N2、およびFGF2）の1ミリリットルを加え、3時間37℃でインキュベートする。
- 吸引し分化培地を慎重に、各繊維サンプルに0.2mlのマトリゲルを添加し、30分間37℃でインキュベートする。注：ラミニンはまた、ファイバ被覆のために使用することができる。 20μg/ mlのラミニンの0.2ミリリットルを追加します。ファイバへと3時間室温でインキュベートする。
- 慎重に各ウェルから過剰マトリゲルを削除します。一度分化培地2mlですすいでください。注：繊維試料は、細胞培養の準備ができている。
繊維上5。細胞播種
- のmES細胞培養皿にして、Accutase 1 mLを加え、37℃で10分間インキュベートする
- 10分後、mES細胞を、培養皿から剥離される。プレートに分化培地4mlを加える。コロニーを破壊するには、上下15ミリリットルチューブとピペット細胞内に浮遊mES細胞を回収（約15倍）。
- 分化培地4ml中の5分間再懸濁細胞を400×gで遠心する。
- 血球計数器を用いて細胞を数える。 15ミリリットルチューブに細胞懸濁液200μlを移すと分化培地で10倍に希釈してください。所定の位置にカバースリップで血球計算板上のチャンバーに希釈した細胞懸濁液15μLを転送します。カウント1ミリメートルの中央広場や顕微鏡下で血球計算板の四隅の正方形のセル。注：ミリリットル当たりの細胞=×10 4希釈倍率X平方あたりの平均回数
- 各ウェルに約5×10 4 mES細胞を配置します。ゆっくりと繊維マットを水抜きからソリューションを防ぐために、代わりにほかの側にオフにスライドする、繊維試料の途中に細胞懸濁液をドロップします。
- 各ウェルに分化培地1 mLを加え、37℃のインキュベーターにプレートを保持し、5％CO 2細胞の付着、増殖および分化を可能にする。
- 各ウェルから古い培地を吸引し、一日おきに新鮮な分化培地1mlと交換してください。
6。細胞生存率
- 各ウェルから古い培地を吸引除去する。
- 培養培地でレサズリン蛍光試薬の1/10の容積を混合し、各ウェルに1ミリリットルを加える。
- Incub37℃、直接光から保護し、4時間、5％CO 2で食べ。
- 4時間後、96ウェルプレートに各ウェルから試薬100μlの3倍を転送し、次にサンプルは560EX nm/590EMフィルタ設定を用いた蛍光分光光度計で測定される準備ができている。
7。リアルタイムPCR
- 培養14日後に、サンプルに溶解緩衝液を追加し、繊維試料上の細胞からトータルRNAを単離する。
- 逆転写により20μlの反応スケールでcDNAを合成した全RNAの4μlを使用する。
- 10μlのマスターミックス（2×）、0.2μlの染料、8μlのヌクレアーゼフリー水、1μlのcDNA、および1μlのプライマー（本研究で用いたプライマーを表1に示します）：各鏡筒内のPCR反応液を調製する。
- PCRプログラムをセットアップします。 95℃で2時20分、1サイクルB。 95℃で3秒間→60℃で1分、40サイクルC。 95℃15秒、1サイクルd。 60℃で1分、1サイクルE。 95℃15秒、1サイクル。相対的な遺伝子発現レベルを決定するために、比較C T法を選択する。
- PCRが終了した後、StepOneソフトウェアでのリアルタイムPCRの結果を分析し、Excelに結果をエクスポート。
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Representative Results
エレクトロスピニングの主要なコンポーネントが図1に示されている。大型繊維マットは、典型的には、垂直に取り付けられたアルミニウム箔ストリップと金属平板を介して得た。 図2は、集電体の設計および電気紡糸繊維マットを示す。幅及び長さは、異なる用途のために調整することができる。 PGDポリマーおよび基底溶液混合物で作られた繊維の長さは10cmまでである。電界紡糸繊維の形態は、図3に示されている。40％PGD濃度から作られた繊維の直径はマイクロメートルの範囲である。繊維上の3および6日間培養mES細胞に由来する分化した細胞の共焦点顕微鏡画像は、 図4に示されている。緑色蛍光信号が細胞における緑色蛍光タンパク質（GFP）の過剰発現から来た。 図5のレサズリン蛍光試薬の結果がmES細胞が成長することを示したNマトリゲルおよびラミニンとPGD繊維コーティング上に同等の細胞の生存率を持っていたし、コーティングされていない群と比較して相対的に高い増殖を示した。多能性神経細胞マーカーの遺伝子発現は、リアルタイムPCR（ 図6）により定量した。少数の細胞は、神経幹細胞がPAX6とネスチンをマーク表明した繊維上で培養mES細胞の大多数は、多能性マーカーOCT4、NanogおよびSox2のを表明した。 2週間の培養後、繊維上に成長したMESが増加し、このようなMAP2およびDCXのような神経細胞マークの発現レベルだけでなく、オリゴデンドロサイトマーカーオリゴ1およびアストロサイトマーカーGFAPを示した。
図1は。セットアップエレクトロスピニング。高分子溶液が鈍い針から排出される。高圧電源グラウンド金属平板aをマイクロ·ツー·ナノメートルの繊維が堆積される間に番目のアルミニウム箔ストリップ（青）。
図2コレクタ設計および電界紡糸繊維マットは、繊維マットの幅及び長さを容易にアルミニウム箔ストリップのサイズを調整することによって変更することができる。そこにマットの幅に制限はなく、最長の繊維は最大10 cmの長さであることができる。
PGD のエレクトロスピニングおよび基底溶液4:6図3 SEM像は、（w / w）である。繊維の平均直径は、約2μmである。 PGD濃度が30％まで低下すると、繊維の平均直径がナノメートルの範囲内に入る。白スケールバーは10μmで表しています。
紫外線領域に青色の光にさらされたときにGFPを担持図4繊維上の分化したmES細胞の共焦点顕微鏡画像。細胞は、明るい緑色蛍光を示す。 6日目の緑色蛍光細胞の数の増加は、繊維足場は、細胞接着および増殖を支持することができることを示している。白いスケールバーは100μmである。（3日目と6日目）を表している。
図5レザズリンfluoreによって決定されるようにPGDの1でマトリゲルおよびラミニンでコーティングした繊維1,3、および5日にmES細胞の細胞生存率scence試薬。制御た（p <0.05）として用いるコーティングされていない繊維上で細胞を培養した。
図6 PGD繊維上の分化したmES細胞における遺伝子発現の定量RT-PCR分析。2週間後に明らかな神経細胞マーカーは、骨格上mES細胞が神経細胞に分化したことを実証した。
| mGAPDH-L | AACTTTGGCATTGTGGAAGG |
| mGAPDH-R | ACACATTGGGGGTAGGAACA |
| mOct4-L | CACGAGTGGAAAGCAACTCA |
| mOct4-R | AGATGGTGGTCTGGCTGAAC |
| mNanog-L | AAGTACCTCAGCCTCCAGCA |
| mNanog-R | GTGCTGAGCCCTTCTGAATC |
| mSox2-L | CACAGTTCAGCCCTGAGTGA |
| mSox2-R | AGGCCACAACAACAACAACA |
| mPax6-L | AACAACCTGCCTATGCAACC |
| mPax6-R | ACTTGGACGGGAACTGACAC |
| mNestin-L | CCAGAGCTGGACTGGAACTC |
| mNestin-R | ACCTGCCTCTTTTGGTTCCT |
| mMAP2-L | CTTATGGGAATGTGGGATGG |
| mMAP2-R | AAAAAGTGGGCCTTGGAACT |
| MDCX-L | ATGCAGTTGTCCCTCCATTC |
| MDCX-R | ATGCCACCAAGTTGTCATCA |
| mOligo1-L | CTTGCTCTCTCCAGCCAAAC |
| mOligo1-R | GCGAGCCTGAAAAACAGAAC |
| mGFAP-L | CACGAACGAGTCCCTAGAGC |
| mGFAP-R | ATGGTGATGCGGTTTTCTTC |
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Discussion
単純コレクタまたは現在いくつかの用途のための所望の長さおよび繊維マットのサイズを取得する制限を増加させるエレクトロスピニングするために使用されるコレクタを回転させる複雑さの限界。さらに、培養皿または他の基板に接地コレクタから繊維を転送することは挑戦5である。本報告では、接地された集電体にアルミニウム箔ストリップを取り付けることにより簡単に行われ、新たに設計されたコレクタは、一度に20センチメートル10 cmの大型繊維マットを得ることができた。1および2は、設計された模式的なセットアップを示して 10センチメートルように制御マット幅の長い電界紡糸繊維を製造する。ニードルチップとコレクタとの間の静電界の影響を受けて、電界紡糸繊維は、容易に別のsに転送することができる滑らかな繊維マットを形成し、アルミニウム箔ストリップと接地された集電体との間の領域を横切って延伸したubstrate。電界紡糸繊維は、細胞が真の3次元環境で埋め、複数の繊維に付着させた多孔質繊維構造を提供する。この研究で生成された繊維マットは、それらは、創傷治癒および神経再生のような広範囲の用途のために理想的な候補にするのに十分な大きさである。
繊維直径は、エレクトロスピニング手順におけるいくつかの変数を制御することによって調整することができる。これらの変数は、ポリマー濃度、印加電圧の大きさは、ポリマー供給速度、コレクタへの針の距離、等が挙げられる6-8。本研究では、50％のPGDと50％のBS、40％PGDおよび60％BS、30％PGDおよび70％のBS、及び20％のPGDそれぞれ80％BS、で構成された試験溶液は、、のために調製した電界紡糸繊維を作る。繊維状足場は、繊維の直径および形態（ 図3）を決定するためにSEMを用いて調べた。予想されるように、より高い濃度のPGD pの電界紡糸繊維の大きな直径をroduced。また、別のPGD濃度に応じて、ストリップ長さを調整することが重要である。低級PGD濃度は、繊維の形成を確実にするために、より短いストリップ長を必要とする。
多くの努力は、細胞培養物9-13で学ぶエレクトロ繊維状足場の生体適合性を探索するためになされている。強い緑色蛍光信号に付着した細胞はPGD繊維上の細胞生存率を示したことが図4は共焦点顕微鏡画像。さらに、6日目に3日目から増加した細胞密度はまた、PGD繊維上の細胞増殖を示唆した。図5における細胞生存率試験はまた、この結果を確認した。神経細胞の遺伝子発現は、MAP2をマークし、DCXはmES細胞は、足場上の神経細胞（ 図6）に分化することができたことを明らかにした。結論として、PGD繊維状足場は、細胞の索状帯をサポートすることができましたnおよび増殖のため、神経組織工学用途のための潜在性を示す。
ここではいくつかの一般的なトラブルシューティングのガイドラインは次のとおりです。針から出てくる繊維が不連続である場合には、再度、ポリマー溶液を温めるとよく混ぜたり繊維が金属板に無い魅力とアルミ箔片に付着している場合、ストリップを減らす長さまたはPGD濃度を増加させる。時々、大きなポリマー塊は、針の先端に形成し、高電圧電源をオフにし、ペーパータオルで拭いて、ポンプの吐出流量を減らす。また、アルミニウム箔ストリップの上縁に時々の繊維集合体は、シリンジポンプの角度を調整してください。
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Disclosures
利害の対立が宣言されていません。
Acknowledgments
この作品は、フロリダ国際大学の医工学部門の設備を用いて行った。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G7757 | |
| Dodecanedioic acid | Sigma-Aldrich | D1009 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | D1890 | |
| Poly(ethylene oxide) (PEO) | Sigma-Aldrich | 182028 | |
| Riboflavin | Sigma-Aldrich | 132350250 | 0.10% |
| Mouse embryonic stem cells | GlobalStem | GSC-5002 | |
| Matrigel | Becton Dickinson | 356234 | |
| DMEM/F12 | Thermo Scientific | SH30272.02 | |
| N2 supplement | Invitrogen | 17502048 | 1% |
| FGF2 | Stemgent | 03-0002 | 10 ng/ml |
| Accutase | Invitrogen | A11105-01 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Invitrogen | 10010-031 | |
| Resazurin fluorescence dye | Sigma-Aldrich | 62758-13-8 | |
| SV Total RNA Isolation System | Promega | Z3100 | |
| GoScript Reverse Transcription System | Promega | A5000 | |
| GoTaq qPCR Master Mix | Promega | A6001 | |
| Syringe pump | Fisher scientific | 14-831-200 | |
| High voltage power source | Spellman High Voltage Electronics Corporation | SL30 | |
| UV light | Philips | 308643 | 15W/G15T8 |
| Synergy HT Multi-Mode Microplate Reader | BioTek | ||
| Perkin Elmer GeneAmp PCR System 9600 | Perkin Elmer | 8488 | |
| StepOne Real-time PCR System | Applied Biosystems | 4376357 |
References
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