Summary
È stata riportata la sintesi e la fabbricazione di fibre lunghe elettrofilate coprono un'area più grande deposito tramite un collettore di nuova concezione da un polimero biodegradabile romanzo chiamato poli (glicerolo-dodecanoato) (PGD). Le fibre sono in grado di sostenere la crescita di cellule derivate da cellule staminali pluripotenti di topo.
Abstract
Per applicazioni di ingegneria tissutale, la preparazione di supporti biodegradabili e biocompatibili è il compito più desiderabile ma impegnativo. Tra i vari metodi di fabbricazione, elettrospinning è il più attraente uno per la sua semplicità e versatilità. Inoltre, nanofibre elettrofilate imitano la dimensione della matrice extracellulare naturale, garantendo un ulteriore sostegno per la sopravvivenza e la crescita delle cellule. Questo studio ha dimostrato la fattibilità della fabbricazione di fibre lunghe che coprono un'area più grande deposito per un romanzo polimero biodegradabile e biocompatibile chiamato poli (glicerolo-dodecanoato) (PGD) 1 utilizzando un collettore di nuova concezione per electrospinning. PGD presenta proprietà uniche elastici con proprietà meccaniche simili a tessuti nervosi, quindi è adatto per applicazioni di ingegneria tissutale neurali. La sintesi e la fabbricazione di set-up per la fabbricazione di materiali ponteggi fibrosi era semplice, altamente riproducibile e poco costoso. In biocompatibilitàtest, cellule derivate da cellule staminali embrionali di topo potrebbero aderire e crescere sulle fibre PGD elettrofilate. In sintesi, questo protocollo ha fornito un metodo di fabbricazione versatile per la fabbricazione di fibre PGD elettrofilate per sostenere la crescita di topo cellule staminali embrionali derivate cellule neurali lignaggio.
Introduction
Electrospinning è uno dei metodi di trattamento efficaci per produrre scaffold fibre dimensioni micro-to-nanometri. Il principio di base di elettrospinning comporta un cono di Taylor soluzione che viene tenuta in corrispondenza dell'orifizio di un ago applicando alta tensione tra la punta dell'ago e un collettore a terra. Quando la repulsione elettrostatica nella soluzione supera la tensione superficiale, un getto di fluido caricato viene espulso dalla punta dell'ago, viaggia attraverso l'aria con evaporazione del solvente, ed è infine depositato sul collettore a terra. La pompa a siringa fornisce un flusso continuo di soluzione che emerge dalla filiera e quindi più copie delle fibre elettrofilate può essere fabbricato in un breve periodo di tempo. Nel corso del lasciando la filiera per arrivare al collettore, il getto carica subirà stretching e frustate secondo un certo numero di parametri che includono la viscosità e la tensione superficiale della soluzione polimerica, i electrostatic forza nella soluzione, e l'interazione del campo elettrico esterno, ecc 2.
Nel processo electrospinning, un collettore funge da substrato conduttore dove si possono depositare le fibre micro-to-nanometri. In questo studio, un nuovo tipo di collettore fibra creata avere stuoie in fibra con la dimensione desiderata (lunghezza x larghezza). Tradizionalmente, un foglio di alluminio è usato come collettore ma è difficile trasferire le fibre dalla superficie piana per un altro substrato. La difficoltà di raccolta un feltro di fibre intatte da un collettore tradizionale è dovuto principalmente al fatto che le fibre elettrofilate attaccano fortemente alla superficie del collettore. Pertanto, abbiamo modificato il collettore piegando un pezzo di foglio di alluminio in una striscia rettangolare e legandolo perpendicolare ad una piastra metallica piana. Le fibre sono tese elettrofilate tutta l'area tra la punta della striscia e la piastra metallica, che può essere facilmente trasferito ad un altro Substrate.
L'interesse per polimeri elastomerici termicamente reticolati è in rapida crescita a causa del lavoro pionieristico del gruppo di Robert Langer, che ha introdotto poli (glicerolo sebacate) (PGS), un poliestere che è analoga alla gomma vulcanizzata, nel 2002 3. Simile a PGS, abbiamo sviluppato con successo poli (glicerolo-dodecanoato) (PGD) per condensazione termica di glicerolo e acidi dodecanodioico e ha dimostrato la sua unica proprietà di memoria di forma 1. A differenza più rigido materiali sintetici poli (butirrato ossidrile) o poli (L-lattide) (moduli di Young di 250 MPa e 660 MPa rispettivamente), PGD esibisce proprietà elastomeriche come gomma, con un modulo di Young di 1,08 MPa quando la temperatura è superiore a 37 ° C, che è una stretta corrispondenza al nervo periferico in-situ (0,45 MPa). Inoltre, PGD è biodegradabile e il tempo di degradazione può essere messo a punto variando il rapporto di glicerolo e acidi dodecanodioico. L'acido dodecanodioico è un sub dodici carbonioposizione con due gruppi carbossilici terminali, HOOC (CH 2) 10 COOH. Acidi bicarbossilici Anche numerati come l'acido sebacico e acido dodecanodioico possono essere metabolizzati ad acetil-CoA e inserire il acidi tricarbossilici (TCA) / (acido citrico) ciclo. Il prodotto metabolico di acidi bicarbossilici, succinil-CoA, è un precursore gluconeogenetic e intermedio del ciclo di TCA 4. Così, alcuni studi hanno suggerito che possano essere utilizzate come substrato combustibile alternativo per la nutrizione enterale e parenterale, specialmente nelle condizioni patologiche. Inoltre, PGD presenta memoria di forma unica perché la sua temperatura di transizione vetrosa è 31 ° C, quindi si vede distinte proprietà meccaniche a temperatura ambiente e alla temperatura corporea. In sintesi, la PGD è biodegradabile, biocompatibile, esibendo uniche proprietà elastiche con proprietà meccaniche simili ai tessuti nervosi; quindi, è un materiale adatto per applicazioni di ingegneria del tessuto nervoso. In questo protocollo, il electrospunfibre lunghe che coprono una vasta area di deposito sono stati realizzati attraverso il collettore di nuova concezione da PGD. I ponteggi in fibra in grado di supportare la crescita delle cellule staminali pluripotenti di topo e la differenziazione.
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Protocol
1. Setup Electrospinning Collector
- Tagliare il foglio di alluminio in un pezzo rettangolare.
- Piegare il pezzo rettangolare in una striscia rettangolare, e allegarlo perpendicolare ad una piastra metallica piana con nastro (Figura 1). Nota: La dimensione del tappeto di fibre dipende dalla lunghezza e la larghezza della striscia. Pertanto, le dimensioni strip possono essere regolate come necessario.
2. Polimerico Solution Preparazione
- Mescolare glicerolo e acido dodecanodioico (DDA) in rapporto 1:1 molare in un becher a 120 ° C per 100 ore per ottenere polimero PGD.
- Sciogliere poli (ossido di etilene) (PEO) e gelatina in 65% di etanolo, con un rapporto in peso di 1.5:3:95.5 in una provetta da 15 ml, serrare il tappo e scaldare la miscela in un forno a 60 ° C per 1 ora sotto agitazione fino ad ottenere una soluzione omogenea (soluzione Basal).
- Per elettrofilatura, mescolare il polimero PGD e la soluzione basale in 04:06 rapporto di peso. Nota: concentrazione PGD ha un big effetto sul diametro delle fibre. 30% -50% per cento PGD è accettabile per la produzione di fibre di lunghezza superiore a 5 cm, con un aumento dei diametri delle fibre.
- Aggiungere 0,1% riboflavina alla soluzione polimerica e mescolare bene.
3. Electrospinning
- Alimentare la soluzione polimerica in una siringa da 5 ml di serie con un 18 G smussati ago in acciaio inossidabile.
- Inserire la siringa nella pompa a siringa.
- Fissare il cavo di messa a terra di una sorgente di alimentazione ad alta tensione per la piastra metallica e il conduttore carica positiva all'ago.
- Regolare la distanza tra l'ago e la striscia di foglio di alluminio a 15 cm.
- Posizionare la pompa a siringa in un angolo di circa 15 ° con l'orizzontale per prevenire l'aggregazione delle fibre nella parte anteriore della striscia.
- Accendere la pompa a siringa e regolare la portata della pompa di 0,6 ml / hr.
- Accendere la fonte di alimentazione ad alta tensione e impostare la tensione di esercizio a 14,6 kV.
4.Fiber Processing
- Dopo la collezione è completa, esporre il tappeto di fibre di luce UV per 60 minuti per la reticolazione.
- Trasferire il tappeto di fibre dalla striscia di foglio di alluminio per una capsula di Petri 100 mm, ed esporlo alla luce UV per altri 20 minuti per la sterilizzazione.
- In un armadio biosicurezza, tagliare il tappeto di fibre in pezzi rotondi della stessa dimensione con una lama chirurgica e disporre i pezzi in una piastra da 24 pozzetti.
- Per cellula di trattamento pre-semina, immergere campioni di fibre in 1 ml di tampone fosfato (PBS) e incubare a 37 ° C per una notte.
- Il giorno seguente, aspirare PBS con attenzione, aggiungere 1 ml di terreno di differenziamento (DMEM/F12, N2, e FGF2) (vedi ricetta in tabella materiali) in ciascun pozzetto ed incubare a 37 ° C per 3 ore.
- Aspirare il terreno di differenziamento accuratamente, aggiungere 0,2 ml di matrigel a ciascun campione fibra e incubare a 37 ° C per 30 min. Nota: laminina può essere utilizzato anche per il rivestimento di fibra. Aggiungere 0,2 ml di 20 mg / ml lamininaalla fibra e incubare a temperatura ambiente per 3 ore.
- Rimuovere l'eccesso di matrigel da ogni pozzetto. Lavare con 2 ml di terreno di differenziazione volta. Nota: I campioni di fibre sono pronti per la coltura cellulare.
5. Semina delle cellule su fibre
- Aggiungere 1 ml di Accutase alla cella piatto cultura MES e incubare per 10 min a 37 ° C.
- Dopo 10 minuti, le cellule MES sono staccate dalla piastra di coltura. Aggiungere 4 ml di terreno di differenziamento alla piastra. Raccogliere le cellule MES galleggianti in una provetta da 15 ml e le cellule pipetta su e giù per rompere colonie (circa 15x).
- Centrifugare a 400 xg per 5 min e risospendere le cellule in 4 ml di terreno di differenziamento.
- Contare le cellule utilizzando un emocitometro. Trasferire 200 microlitri della sospensione cellulare in una provetta da 15 ml e diluire 10x con terreno di differenziamento. Trasferire 15 ml di sospensione cellulare diluita ad una camera sul emocitometro con una copertura antiscivolo in posto. Contarele celle nel centro di piazza 1 mm e le quattro piazze d'angolo del emocitometro sotto il microscopio. Nota: Cell per ml = conteggio medio per quadrato x fattore di diluizione x 10 4
- Porre circa 5 x 10 4 cellule MES su ogni bene. Lentamente cadere la sospensione cellulare in mezzo ai campioni di fibre, invece di scivolare fuori al lato del pozzo, per evitare che la soluzione di drenaggio tappeto di fibre.
- Aggiungere 1 ml di terreno di differenziamento in ciascun pozzetto, e mantenere la piastra in un incubatore a 37 ° C e 5% di CO 2 per consentire cellule attaccamento, crescita e differenziazione.
- Aspirare il vecchio mezzo da ciascun pozzetto e sostituirlo con 1 ml di terreno di differenziamento fresco ogni altro giorno.
6. Vitalità cellulare
- Aspirare il vecchio mezzo da ogni pozzetto.
- Mescolare 1/10 del volume di resazurina reagente fluorescenza con terreno di coltura e aggiungere 1 ml in ogni pozzetto.
- Incubmangiato a 37 ° C e 5% di CO 2 per 4 ore, al riparo dalla luce diretta.
- Dopo 4 ore, trasferire 100 microlitri 3x del reagente da ciascun pozzetto di una piastra da 96 pozzetti, e poi i campioni sono pronti per essere misurata mediante uno spettrofotometro a fluorescenza usando impostazioni di filtro 560EX nm/590EM.
7. Real Time PCR
- Dopo 14 giorni di coltura, aggiungere tampone di lisi per campioni e isolare l'RNA totale da cellule sui campioni di fibre.
- Utilizzare 4 pl di RNA totale per sintetizzare cDNA in 20 microlitri di reazione scale mediante trascrizione inversa.
- Preparare la miscela di reazione PCR in ciascun tubo ottico: 10 microlitri Master Mix (2x), 0,2 ml di colorante, 8 microlitri di acqua priva di nucleasi, 1 ml cDNA, e 1 ml di fondo (primer utilizzati in questo studio sono elencati nella Tabella 1).
- Impostare il programma PCR: a. 95 ° C 2:20 min, 1 ciclo b. 95 ° C 3 sec → 60 ° C 1 min, 40 ciclo c. 95 ° C 15 sec, 1 ciclo d. 60 ° C 1min, 1 ciclo e. 95 ° C 15 sec, 1 ciclo. Scegli il metodo comparativo C T per determinare i livelli di espressione genica relativa.
- Dopo la PCR è finito, analizzare i real-time PCR risultati con il software StepOne ed esportare i risultati in Excel.
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Representative Results
I componenti principali del elettrospinning sono mostrati in Figura 1. Velo di taglia grande era tipicamente ottenuta attraverso la striscia di foglio di alluminio perpendicolarmente divisoria e una piastra metallica piana. Figura 2 mostra la struttura del collettore e il tappeto di fibre elettrospinning. La larghezza e la lunghezza può essere regolata per diverse applicazioni. La lunghezza della fibra a base di polimero PGD e miscela soluzione basale è fino a 10 cm. La morfologia delle fibre elettrofilate è mostrato in Figura 3. I diametri di fibre a base di concentrazione PGD 40% sono nella gamma micrometro. Microscopia confocale di cellule differenziate derivate da cellule MES coltivate per 3 e 6 giorni su fibre sono descritte nella Figura 4. I segnali fluorescenti verdi provenivano dalla espressione eccessiva di proteina fluorescente verde (GFP) nelle cellule. Il risultato di resazurina reagente fluorescenza in Figura 5 ha mostrato che cellule MES cresconon sul rivestimento fibre PGD con matrigel e laminina avuto vitalità cellulare equivalente e aveva proliferazione relativamente più elevata rispetto al gruppo non rivestito. L'espressione genica di pluripotency e cellule neurali marcatori è stato quantificato mediante real time PCR (Figura 6). La maggior parte delle cellule MES coltivate sulle fibre espresso l'OCT4 marcatori di pluripotenza, Nanog e Sox2, mentre la minoranza di cellule espresso cellule staminali neurali segna PAX6 e Nestin. Dopo 2 settimane cultura, MES coltivate su fibre hanno mostrato un aumento dei livelli di espressione di marchi di cellule neurali come MAP2 e DCX, così come marcatore degli oligodendrociti Oligo1 e marcatore astrociti GFAP.
Figura 1. Electrospinning impostato. La soluzione polimerica viene espulso da un ago smussato. Motivi di una fonte di alimentazione ad alta tensione un metallo piatto piatto unnd una striscia di foglio di alluminio tra cui le fibre metro micro-to-nano sono depositati (blu).
Figura 2. Progettazione collettore e fibra electrospun mat. La larghezza e la lunghezza del tappeto di fibre possono essere cambiati facilmente regolando la dimensione della striscia di foglio di alluminio. Non c'è limite per la larghezza tappeto, e le fibre più lunghe può essere lungo fino a 10 cm.
Figura 3. Immagini SEM di electrospun di PGD e soluzione basale 04:06 (w / w). Il diametro medio delle fibre è di circa 2 micron. Quando la concentrazione PGD scende al 30%, il diametro medio delle fibre cade in nanometri. Il biancobarra della scala rappresenta 10 micron.
Figura 4. Immagini di microscopia confocale di cellule differenziate MES su fibre. Le cellule che trasportano la GFP esporre brillante fluorescenza verde quando esposto alla luce blu per gamma ultravioletta. L'aumento del numero di cellule fluorescenti verdi su Giorno 6 indica che i ponteggi in fibra in grado di supportare l'adesione e la proliferazione cellulare. La barra della scala bianco rappresenta 100 micron. (Day 3 e 6 ° giorno).
Figura 5. La vitalità cellulare di cellule MES sulle fibre PGD rivestimento con Matrigel e laminina a 1, 3 e 5 giorni come determinato dal resazurina fluorereagente scence. cellule coltivate sulle fibre rivestite utilizzati come controllo (p <0,05).
Figura 6. QRT-PCR dell'espressione genica in cellule differenziate MES su fibre PGD. I marcatori di cellule neurali evidenti dopo 2 settimane hanno dimostrato che le cellule MES sui ponteggi sono differenziate in cellule neurali.
| mGAPDH-L | AACTTTGGCATTGTGGAAGG |
| mGAPDH-R | ACACATTGGGGGTAGGAACA |
| mOct4-L | CACGAGTGGAAAGCAACTCA |
| mOct4-R | AGATGGTGGTCTGGCTGAAC |
| mNanog-L | AAGTACCTCAGCCTCCAGCA |
| mNanog-R | GTGCTGAGCCCTTCTGAATC |
| mSox2-L | CACAGTTCAGCCCTGAGTGA |
| mSox2-R | AGGCCACAACAACAACAACA |
| mPax6-L | AACAACCTGCCTATGCAACC |
| mPax6-R | ACTTGGACGGGAACTGACAC |
| mNestin-L | CCAGAGCTGGACTGGAACTC |
| mNestin-R | ACCTGCCTCTTTTGGTTCCT |
| mMAP2-L | CTTATGGGAATGTGGGATGG |
| mMAP2-R | AAAAAGTGGGCCTTGGAACT |
| mDCX-L | ATGCAGTTGTCCCTCCATTC |
| mDCX-R | ATGCCACCAAGTTGTCATCA |
| mOligo1-L | CTTGCTCTCTCCAGCCAAAC |
| mOligo1-R | GCGAGCCTGAAAAACAGAAC |
| mGFAP-L | CACGAACGAGTCCCTAGAGC |
| mGFAP-R | ATGGTGATGCGGTTTTCTTC |
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Discussion
Le limitazioni di collettori semplici o la complessità di collettori che sono attualmente utilizzati per elettrospinning aumentare la restrizione di ottenere la lunghezza desiderata e dimensione del tappeto di fibre per alcune applicazioni rotanti. Inoltre, il trasferimento delle fibre dal collettore di terra alla piastra di coltura o altri substrati è una sfida 5. In questo rapporto, un collezionista di nuova concezione, realizzato semplicemente collegando una striscia di foglio di alluminio al collettore a terra, è stato in grado di ottenere stuoie in fibra di dimensioni grandi fino a 10 cm per 20 cm alla volta. Figure 1 e 2 illustrano l'impostazione schematica progettata per la fabbricazione di fino a 10 cm fibre lunghe elettrofilate con larghezza stuoia controllata. Influenzato dal campo elettrostatico tra la punta dell'ago e collettore, le fibre elettrofilate erano tese tutta l'area tra la striscia di foglio di alluminio e il collettore a massa per formare un feltro di fibre liscia, che può essere facilmente trasferito ad un altro substrate. Fibre electrospun forniscono porose strutture fibrose che permettono alle cellule di colmare e si attaccano a più fibre in un ambiente realmente tridimensionale. Le stuoie in fibra ottenuti da questo studio sono abbastanza grandi da renderli candidati ideali per una vasta gamma di applicazioni quali la guarigione delle ferite e la rigenerazione neurale.
Diametri delle fibre possono essere regolati controllando diverse variabili nella procedura electrospinning. Queste variabili includono la concentrazione di polimero, ampiezza della tensione applicata, tasso di consegna del polimero, la distanza dall'ago al collettore, ecc 6-8. In questo studio, le soluzioni di test, che sono stati composti con il 50% PGD e il 50% BS, 40% PGD e il 60% BS, 30% PGD e il 70% BS, e il 20% PGD e l'80% BS, rispettivamente, sono stati preparati per rendendo le fibre elettrofilate. I ponteggi fibrosi sono stati esaminati usando SEM per determinare i diametri e morfologie delle fibre (Figura 3). Come previsto, le concentrazioni più elevate PGD produced diametri di fibre elettrofilate. Inoltre, è fondamentale per regolare la lunghezza delle strisce secondo le diverse concentrazioni PGD. Una concentrazione PGD inferiore richiede una lunghezza striscia più corta per garantire la formazione di fibre.
Numerosi sforzi sono stati fatti per esplorare la biocompatibilità degli scaffold fibrosi elettrofilate attraverso lo studio di coltura cellulare 9-13. Le immagini di microscopia confocale in figura 4 mostrano che le cellule attaccate con i segnali fluorescenti verdi forti indicavano la sopravvivenza delle cellule in fibre PGD. Inoltre, la densità cellulare crescente dal giorno 3 al giorno 6 anche suggerito la proliferazione cellulare sulle fibre PGD. Il test di vitalità cellulare in figura 5 ha confermato questo risultato. L'espressione genica di cellule neurali marchi MAP2 e DCX dimostrato che le cellule MES erano in grado di differenziarsi in cellule neurali sui ponteggi (Figura 6). In conclusione, PGD ponteggi fibrosi potrebbero sostenere adhesio cellularen e la proliferazione, e quindi esporre il potenziale per applicazioni di ingegneria tissutale neurali.
Ecco alcune linee guida generali di risoluzione dei problemi: se la fibra che esce l'ago è discontinuo, riscaldare la soluzione polimerica di nuovo e mescolare bene o se la fibra è attaccare la striscia di foglio di alluminio con nessuna attrazione per la piastra metallica, ridurre la striscia lunghezza o aumentare la concentrazione PGD. A volte grandi gocce di polimero formano sulla punta dell'ago, spegnere la fonte di alimentazione ad alta tensione, pulirla con un tovagliolo di carta, e di ridurre la portata della pompa. Inoltre, a volte fibre aggregato sul bordo superiore della striscia di foglio di alluminio provare a regolare l'angolo della pompa a siringa.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato condotto utilizzando le strutture del Dipartimento di Ingegneria Biomedica presso la Florida International University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G7757 | |
| Dodecanedioic acid | Sigma-Aldrich | D1009 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | D1890 | |
| Poly(ethylene oxide) (PEO) | Sigma-Aldrich | 182028 | |
| Riboflavin | Sigma-Aldrich | 132350250 | 0.10% |
| Mouse embryonic stem cells | GlobalStem | GSC-5002 | |
| Matrigel | Becton Dickinson | 356234 | |
| DMEM/F12 | Thermo Scientific | SH30272.02 | |
| N2 supplement | Invitrogen | 17502048 | 1% |
| FGF2 | Stemgent | 03-0002 | 10 ng/ml |
| Accutase | Invitrogen | A11105-01 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Invitrogen | 10010-031 | |
| Resazurin fluorescence dye | Sigma-Aldrich | 62758-13-8 | |
| SV Total RNA Isolation System | Promega | Z3100 | |
| GoScript Reverse Transcription System | Promega | A5000 | |
| GoTaq qPCR Master Mix | Promega | A6001 | |
| Syringe pump | Fisher scientific | 14-831-200 | |
| High voltage power source | Spellman High Voltage Electronics Corporation | SL30 | |
| UV light | Philips | 308643 | 15W/G15T8 |
| Synergy HT Multi-Mode Microplate Reader | BioTek | ||
| Perkin Elmer GeneAmp PCR System 9600 | Perkin Elmer | 8488 | |
| StepOne Real-time PCR System | Applied Biosystems | 4376357 |
References
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