Summary
Se informó de síntesis y fabricación de fibras electrohiladas largos que abarcan un área de depósito más grande a través de un colector de nuevo diseño de un nuevo polímero biodegradable llamado poli (glicerol-dodecanoato) (PGD). Las fibras fueron capaces de apoyar el crecimiento de células derivadas de células madre pluripotentes de ratón.
Abstract
Para aplicaciones de ingeniería de tejidos, la preparación de estructuras biodegradables y biocompatibles es la tarea más deseable pero desafiante. Entre los diversos métodos de fabricación, de electrospinning es la más atractiva debido a su simplicidad y versatilidad. Además, las nanofibras electrohiladas imitan el tamaño de la matriz extracelular natural, garantizando un apoyo adicional para la supervivencia y el crecimiento celular. Este estudio demostró la viabilidad de la fabricación de fibras largas que abarcan un área de depósito más grande para un nuevo polímero biodegradable y biocompatible llamado poli (glicerol-dodecanoato) (DGP) 1 mediante el uso de un colector de nuevo diseño para electrospinning. PGD exhibe propiedades elásticas únicas con propiedades mecánicas similares a los tejidos nerviosos, por lo que es adecuado para aplicaciones de ingeniería de tejidos neuronales. La síntesis y fabricación de puesta a punto para la fabricación de materiales de andamios fibrosos era simple, altamente reproducible y de bajo costo. En biocompatibilidadlas pruebas, las células derivadas de células madre embrionarias de ratón podrían adherirse y crecer en las fibras de PGD electrospun. En resumen, este protocolo proporciona un método de fabricación versátil para la fabricación de fibras electrohiladas PGD para apoyar el crecimiento de las células madre embrionarias de ratón derivados de células de linaje neural.
Introduction
Electrospinning es uno de los métodos de procesamiento eficaces para producir andamios de fibra de tamaño micro-a nanómetros. El principio básico de electrospinning implica un cono de Taylor de la solución que se mantiene en el orificio de una aguja, mediante la aplicación de alto voltaje entre la punta de la aguja y un colector a tierra. Cuando la repulsión electrostática en la solución supera la tensión superficial, un chorro de fluido cargado se expulsa fuera de la punta de la aguja, viaja por el aire con la evaporación del disolvente, y finalmente se deposita en el colector conectado a tierra. La bomba de jeringa proporciona un flujo continuo de la solución que emerge de la hilera y por lo tanto múltiples copias de las fibras electrohiladas se puede fabricar dentro de un corto período de tiempo. Durante el curso de salir de la hilera para llegar al colector, el chorro cargada someterse a estiramiento y batir según un número de parámetros que incluyen la viscosidad y la tensión superficial de la solución polimérica, los electrostáticamentefuerza de C en la solución, y la interacción del campo eléctrico externo, etc 2.
En el proceso de electrospinning, un colector sirve como un sustrato conductor, donde las fibras micro-a nanómetros podrían ser depositados. En este estudio, un nuevo tipo de colector de fibras fue diseñado para obtener esteras de fibra con el tamaño deseado (longitud x anchura). Tradicionalmente, el papel de aluminio se utiliza como un colector pero es difícil de transferir las fibras de la superficie plana a otro sustrato. La dificultad de la recolección de una manta de fibra intacta de un coleccionista tradicional se debió principalmente al hecho de que las fibras se adhieren fuertemente electrohiladas a la superficie del colector. Por lo tanto, hemos modificado el colector doblando un pedazo de papel de aluminio en una tira rectangular y lo conecta perpendicularmente a una placa metálica plana. Las fibras electrohiladas se estiran a través del área entre la punta de la tira y la placa de metal, que se puede transferir fácilmente a otro sustrato dee.
El interés en los polímeros elastoméricos reticulados térmicamente está creciendo rápidamente debido a la labor pionera del grupo de Robert Langer, quien presentó poli (sebacato de glicerol) (PGS), un poliéster que es análogo al caucho vulcanizado en 2002 3. Similar a PGS, hemos desarrollado con éxito poli (glicerol-dodecanoato) (PGD) por condensación térmica de glicerol y ácido dodecanodioico y demostraron su única propiedad con memoria de forma 1. A diferencia de más rígido materiales sintéticos de poli (butirato de hidroxilo) o poli (L-lactida) (módulos de Young de 250 MPa y 660 MPa, respectivamente), PGD exhibe la propiedad de elastómero como el caucho, con un módulo de Young de 1,08 MPa cuando la temperatura está por encima de 37 ° C, que es una coincidencia cercana a la de los nervios periféricos in situ (0,45 MPa). Además, PGD es biodegradable y el tiempo de degradación puede ser ajustado por la variación de la proporción de glicerol y ácido dodecanodioico. Ácido dodecanodioico es un sub doce de carbonopostura con dos grupos carboxílicos terminales, HOOC (CH2) 10 COOH. Ácidos dicarboxílicos con número par, como el ácido sebácico y ácido dodecanodioico pueden ser metabolizados a acetil-CoA y entrar en el de los ácidos tricarboxílicos (TCA) / ciclo (ácido cítrico). El producto metabólico de los ácidos dicarboxílicos, succinil-CoA reductasa, es un precursor gluconeogenética y el intermedio de ciclo TCA 4. Por lo tanto, algunos estudios sugieren que podrían ser utilizados como un sustrato de combustible alternativo para la nutrición enteral y parenteral, especialmente en las condiciones patológicas. Además, el DGP presenta memoria de forma única, ya que su temperatura de transición vítrea es de 31 ° C, por lo tanto, muestra propiedades mecánicas distintas a temperatura ambiente y a la temperatura corporal. En suma, PGD es biodegradable, biocompatible, que presenta propiedades elásticas únicas con propiedades mecánicas similares a los tejidos nerviosos; Por lo tanto, es un material adecuado para aplicaciones de ingeniería de tejido nervioso. En este protocolo, el electrospunfibras largas que cubren un área de gran depósito fueron fabricados por el captador de nuevo diseño de PGD. Los andamios de fibra pueden apoyar el crecimiento de células madre pluripotentes de ratón y la diferenciación.
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Protocol
1. Configuración Electrohilado Collector
- Cortar el papel de aluminio en una pieza rectangular.
- Doble la pieza rectangular en una tira rectangular, y adjuntarlo perpendicular a una placa metálica plana con cinta (Figura 1). Nota: El tamaño de la estera de fibras depende de la longitud y la anchura de la tira. Por lo tanto, las dimensiones de la tira se pueden ajustar según sea necesario.
2. Polimérico Preparación de la Solución
- Mezclar glicerol y ácido dodecanodioico (DDA) en una relación molar 1:1 en un vaso de precipitados a 120 ° C durante 100 h para obtener polímero de PGD.
- Disolver poli (óxido de etileno) (PEO) y gelatina en etanol 65% con una relación en peso de 1.5:3:95.5 en un tubo de 15 ml, apretar la tapa y calentar la mezcla en un horno a 60 ° C durante 1 hora con agitación hasta que se convierte en una solución homogénea (solución basal).
- Para electrospinning, mezclar el polímero PGD y la solución basal en 04:06 relación de pesos. Nota: La concentración PGD tiene un big efecto sobre diámetro de la fibra. 30% -50% por ciento PGD es aceptable para producir fibras de más de 5 cm con mayores diámetros de las fibras.
- Añadir 0,1% de riboflavina a la solución polimérica y mezclar bien.
3. Electrohilado
- Alimentar a la solución polimérica en una jeringa estándar de 5 ml con una aguja de 18 G romos de acero inoxidable.
- Inserte la jeringa en una bomba de jeringa.
- Una el plomo a tierra de una fuente de alimentación de alta tensión a la placa metálica y el cable de carga positiva a la aguja.
- Ajustar la distancia entre la aguja y la tira de papel de aluminio a 15 cm.
- Coloque la bomba de jeringa en un ángulo de aproximadamente 15 ° con la horizontal para evitar la agregación de las fibras en la parte delantera de la tira.
- Encienda la bomba de jeringa y ajustar la velocidad de flujo de la bomba a 0,6 ml / h.
- Encienda la fuente de alimentación de alta tensión y ajustar la tensión de funcionamiento a 14,6 kV.
4.Procesamiento de Fibra
- Después de la colección es completa, exponer la esterilla de fibra a luz UV durante 60 min para la reticulación.
- Transfiera la estera de fibra de la tira de papel de aluminio para un 100 mm placa de Petri, y exponerlo a la luz UV durante otros 20 minutos para la esterilización.
- En un gabinete de bioseguridad, corte la estera de fibra en pedazos redondos del mismo tamaño, con una hoja de bisturí y colocar las piezas en una placa de 24 pocillos.
- Para celda de tratamiento de pre-siembra, sumerja las muestras de fibra en 1 ml de tampón fosfato salino (PBS) y se incuba a 37 ° C durante la noche.
- Al día siguiente, aspirado PBS con cuidado, añadir 1 ml de medio de diferenciación (DMEM/F12, N2, y FGF2) (vea la receta en la tabla de materiales) a cada pocillo y se incuba a 37 ° C durante 3 horas.
- Medio de diferenciación Aspirar cuidadosamente, añadir 0,2 ml de Matrigel a cada muestra de fibra y se incuba a 37 ° C durante 30 min. Nota: La laminina también puede ser utilizado para el recubrimiento de fibra. Añadir 0,2 ml de 20 mg / ml de lamininaa la fibra y se incuba a temperatura ambiente durante 3 h.
- Eliminar cuidadosamente el exceso matrigel de cada pocillo. Enjuague con 2 ml de medio de diferenciación una vez. Nota: Las muestras de fibra están listos para el cultivo celular.
5. Siembra de células en fibras
- Añadir 1 ml de Accutase a la placa de cultivo celular MES y se incuba durante 10 min a 37 ° C.
- Después de 10 min, las células TEr se separan de la placa de cultivo. Añadir 4 ml de medio de diferenciación a la placa. Recoger las células TEr flotantes en un tubo de 15 ml y las células de la pipeta hacia arriba y abajo para romper colonias (aproximadamente 15x).
- Centrifugar a 400 xg durante 5 min y volver a suspender las células en 4 ml de medio de diferenciación.
- Contar las células utilizando un hemocitómetro. Transferir 200 l de la suspensión celular en un tubo de 15 ml y diluir 10 veces con medio de diferenciación. Transferir 15 l de la suspensión celular diluida a una cámara en el hemocitómetro con un cubre en su lugar. Contarlas células en la plaza del centro de 1 mm y las cuatro esquinas del hemocitómetro bajo el microscopio. Nota: la célula por ml = el recuento promedio por metro cuadrado x el factor de dilución x 10 4
- Coloque aproximadamente 5 x 10 4 células TEr en cada pocillo. Lentamente gota la suspensión celular en el medio de las muestras de fibra, en vez de deslizarse a un lado del pozo, para evitar que la solución se drene fuera de la estera de fibra.
- Añadir 1 ml de medio de diferenciación a cada pocillo, y mantener la placa en una incubadora a 37 ° C y 5% de CO 2 para permitir la unión de células, el crecimiento y la diferenciación.
- Aspirar el viejo medio de cada pocillo y sustituir con 1 ml de medio de diferenciación fresca cada dos días.
6. Viabilidad de las células
- Aspirar el viejo medio de cada pocillo.
- Mezclar 1/10 volumen de resazurina reactivo de fluorescencia con medio de cultivo y añadir 1 ml a cada pocillo.
- IncubComimos en 37 ° C y 5% de CO 2 durante 4 horas, protegido de la luz directa.
- Después de 4 horas, la transferencia de 100 l 3x del reactivo de cada pocillo a una placa de 96 pocillos, y luego las muestras están listas para ser medido en un espectrofotómetro de fluorescencia utilizando los ajustes de filtro 560EX nm/590EM.
7. En tiempo real PCR
- Después de 14 días de cultivo, añadir tampón de lisis a las muestras y aislar ARN total de las células en las muestras de fibra.
- Utilice 4 l de ARN total para sintetizar cDNA en 20 escalas de reacción mu l mediante transcripción inversa.
- Preparar la mezcla de PCR reacción en cada tubo óptico: 10 l de mezcla maestra (2x), 0,2 l de colorante, 8 l agua libre de nucleasa, 1 l de ADNc, y 1 l de cebadores (primers utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla 1).
- Configure el programa de PCR: a. 95 ° C 2:20 min, 1 ciclo b. 95 ° C 3 seg → 60 ° C 1 min, 40 ciclos c. 95 ° C 15 seg, 1 ciclo d. 60 ° C 1min, 1 ciclo e. 95 ° C 15 seg, 1 ciclo. Elija comparativo C T método para determinar los niveles de expresión génica relativa.
- Después de la PCR está terminado, analizar los resultados en tiempo real de PCR con el software StepOne y exportar los resultados a Excel.
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Representative Results
Los componentes principales de la electrospinning se muestran en la Figura 1. Una gran estera de fibras de tamaño se obtuvo típicamente a través de la tira de papel de aluminio perpendicularmente adjunto y una placa de metal plana. Figura 2 muestra el diseño de colector y la estera de fibra de electrospinning. La anchura y la longitud se pueden ajustar para diferentes aplicaciones. La longitud de la fibra hecho con polímero de PGD y mezcla de solución basal es de hasta 10 cm. La morfología de las fibras electrohiladas se muestra en la Figura 3. Los diámetros de las fibras hechas de concentración PGD 40% están en el intervalo de micrómetros. Imágenes de microscopía confocal de células diferenciadas derivadas de TEr células cultivadas durante 3 y 6 días en fibras se representan en la Figura 4. Las señales fluorescentes verdes vinieron de la expresión sobre-de la proteína fluorescente verde (GFP) en las células. El resultado de resazurina reactivo de fluorescencia en la Figura 5 mostró que las células crecen TErn sobre el revestimiento de fibras de PGD con Matrigel y laminina tenía la viabilidad celular equivalente y tenía relativamente más alta proliferación en comparación con el grupo sin revestir. La expresión de genes de marcadores de pluripotencia y células neuronales se cuantificó mediante PCR en tiempo real (Figura 6). La mayoría de las células cultivadas en TEr fibras expresó la Oct4 marcadores de pluripotencia, Nanog y Sox2 mientras que la minoría de las células expresó la célula madre neural marca PAX6 y nestina. Después de 2 semanas de cultivo, MES cultivadas en fibras mostraron aumento de los niveles de expresión de marcas de células neuronales tales como MAP2 y DCX, así como oligo1 marcador de oligodendrocitos y astrocitos GFAP marcador.
Figura 1. Electrohilado configurado. La solución polimérica se expulsa de una aguja roma. Motivos una fuente de alimentación de alta tensión de una placa metálica plana unand una tira de papel de aluminio entre las que las fibras metros-micro-nano a se depositan (azul).
Figura 2. Diseño de colector y la estera de fibra electrospun. La anchura y la longitud de la estera de fibra se pueden cambiar fácilmente ajustando el tamaño de la tira de papel de aluminio. No hay límite para la anchura de la estera, y las fibras más largas puede ser de hasta 10 cm de largo.
Figura 3. Imágenes de SEM de electrospun de PGD y solución basal 4:06 (w / w). El diámetro medio de las fibras es de alrededor de 2 micras. Cuando la concentración de PGD disminuye a 30%, el diámetro medio de las fibras cae en rango nanométrico. El blancobarra de escala representa 10 micras.
Figura 4. Imágenes de microscopía confocal de células diferenciadas TEr en fibras. Las células que llevan la GFP exhiben una fluorescencia verde brillante cuando se expone a la luz en azul al rango ultravioleta. El aumento del número de células fluorescentes verdes en el Día 6 indica que los andamios de fibra pueden apoyar la adhesión celular y la proliferación. La barra de escala blanca representa 100 m. (Día 3 y el día 6).
Figura 5. La viabilidad celular de las células TEr en fibras PGD recubrimiento con Matrigel y laminina a 1, 3, y 5 días tal como se determina por resazurina Fluorereactivo scence. células cultivadas sobre las fibras sin recubrimiento utilizados como control (p <0,05).
Figura 6. QRT-PCR análisis de la expresión génica en células diferenciadas TEr sobre fibras de PGD. Los marcadores de células neuronales evidente después de 2 semanas demostraron que las células TEr en los andamios han diferenciado en células neurales.
| mGAPDH-L | AACTTTGGCATTGTGGAAGG |
| mGAPDH-R | ACACATTGGGGGTAGGAACA |
| mOct4-L | CACGAGTGGAAAGCAACTCA |
| mOct4-R | AGATGGTGGTCTGGCTGAAC |
| mNanog-L | AAGTACCTCAGCCTCCAGCA |
| mNanog-R | GTGCTGAGCCCTTCTGAATC |
| mSox2-L | CACAGTTCAGCCCTGAGTGA |
| mSox2-R | AGGCCACAACAACAACAACA |
| mPax6-L | AACAACCTGCCTATGCAACC |
| mPax6-R | ACTTGGACGGGAACTGACAC |
| mNestin-L | CCAGAGCTGGACTGGAACTC |
| mNestin-R | ACCTGCCTCTTTTGGTTCCT |
| mMAP2-L | CTTATGGGAATGTGGGATGG |
| mMAP2-R | AAAAAGTGGGCCTTGGAACT |
| mDCX-L | ATGCAGTTGTCCCTCCATTC |
| mDCX-R | ATGCCACCAAGTTGTCATCA |
| mOligo1-L | CTTGCTCTCTCCAGCCAAAC |
| mOligo1-R | GCGAGCCTGAAAAACAGAAC |
| mGFAP-L | CACGAACGAGTCCCTAGAGC |
| mGFAP-R | ATGGTGATGCGGTTTTCTTC |
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Discussion
Las limitaciones de los colectores simples o las complejidades de los colectores que se utilizan actualmente para electrospinning aumentar la restricción de obtener la longitud deseada y el tamaño de la estera de fibra para algunas aplicaciones de rotación. Además, la transferencia de fibras desde el colector de tierra a la placa de cultivo o de otros sustratos es un desafío 5. En este informe, un coleccionista de nuevo diseño, hecho simplemente uniendo una tira de papel de aluminio para el colector a tierra, fue capaz de obtener grandes esteras de fibras de tamaño de hasta 10 cm por 20 cm a la vez. Las figuras 1 y 2 ilustran la configuración del esquema diseñado para la fabricación de hasta 10 cm de largo con fibras electrohiladas ancho estera controlada. Bajo la influencia por el campo electrostático entre la punta de la aguja y el colector, las fibras electrohiladas se estiraron a través del área entre la tira de papel de aluminio y el colector conectado a tierra para formar una estera de fibra lisa, que se puede transferir fácilmente a otro substrate. Fibras electrospun proporcionan estructuras fibrosas porosas que permiten a las células para salvar y se unen a múltiples fibras en un ambiente verdaderamente tridimensional. Las esteras de fibra generados en este estudio son lo suficientemente grandes para que sean candidatos ideales para una amplia gama de aplicaciones tales como la curación de heridas y la regeneración neural.
Diámetros de las fibras se pueden ajustar mediante el control de varias variables en el procedimiento de electrohilado. Estas variables incluyen la concentración de polímero, la magnitud de la tensión aplicada, velocidad de suministro de polímero, la distancia desde la aguja al colector, etc 6-8. En este estudio, las soluciones de prueba, que fueron compuestas con 50% de PGD y 50% BS, 40% y 60% PGD BS, 30% y 70% PGD BS, y 20% de PGD y 80% BS, respectivamente, se prepararon para la fabricación de fibras electrohiladas. Los andamios fibrosos se examinaron mediante SEM para determinar los diámetros y las morfologías de las fibras (Figura 3). Como era de esperar, las concentraciones más altas de PGD produced mayores diámetros de fibras electrohiladas. Además, es crítico para ajustar la longitud de la tira de acuerdo con las diferentes concentraciones de PGD. Una concentración PGD baja requiere una longitud de la tira más corta para asegurar la formación de fibras.
Se han hecho numerosos esfuerzos para explorar la biocompatibilidad de los andamios fibrosos electrospun a través del estudio de cultivo celular 9-13. Las imágenes de microscopía confocal en la Figura 4 muestran que las células unidas con las fuertes señales fluorescentes verdes indican la supervivencia de las células de las fibras de DGP. Además, el aumento de la densidad celular a partir del día 3 al día 6 también sugirió la proliferación de las células en fibras de PGD. La prueba de la viabilidad celular en la figura 5 también confirmó este resultado. La expresión de genes de marcas neuronal de células MAP2 y DCX demostró que las células TEr eran capaces de diferenciarse en células neurales en los andamios (Figura 6). En conclusión, PGD andamios fibrosos podrían apoyar adhesio celularn y la proliferación, y por lo tanto exhibir el potencial para aplicaciones de ingeniería de tejidos neuronales.
Aquí hay algunas pautas generales de solución de problemas: si la fibra que sale de la aguja es discontinua, calentar la solución polimérica de nuevo y se mezcla bien o si la fibra está pegando a la tira de papel de aluminio con ninguna atracción a la placa de metal, reducir la tira longitud o aumentar la concentración de PGD. A veces grandes pegotes de polímeros forman en la punta de la aguja, apague la fuente de alimentación de alta tensión, límpielo con una toalla de papel, y reducir el caudal de la bomba. Además, a veces las fibras de agregado en el borde superior de la tira de papel de aluminio intente ajustar el ángulo de la bomba de jeringa.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Este trabajo se llevó a cabo utilizando las instalaciones del Departamento de Ingeniería Biomédica de la Universidad Internacional de la Florida.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G7757 | |
| Dodecanedioic acid | Sigma-Aldrich | D1009 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | D1890 | |
| Poly(ethylene oxide) (PEO) | Sigma-Aldrich | 182028 | |
| Riboflavin | Sigma-Aldrich | 132350250 | 0.10% |
| Mouse embryonic stem cells | GlobalStem | GSC-5002 | |
| Matrigel | Becton Dickinson | 356234 | |
| DMEM/F12 | Thermo Scientific | SH30272.02 | |
| N2 supplement | Invitrogen | 17502048 | 1% |
| FGF2 | Stemgent | 03-0002 | 10 ng/ml |
| Accutase | Invitrogen | A11105-01 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Invitrogen | 10010-031 | |
| Resazurin fluorescence dye | Sigma-Aldrich | 62758-13-8 | |
| SV Total RNA Isolation System | Promega | Z3100 | |
| GoScript Reverse Transcription System | Promega | A5000 | |
| GoTaq qPCR Master Mix | Promega | A6001 | |
| Syringe pump | Fisher scientific | 14-831-200 | |
| High voltage power source | Spellman High Voltage Electronics Corporation | SL30 | |
| UV light | Philips | 308643 | 15W/G15T8 |
| Synergy HT Multi-Mode Microplate Reader | BioTek | ||
| Perkin Elmer GeneAmp PCR System 9600 | Perkin Elmer | 8488 | |
| StepOne Real-time PCR System | Applied Biosystems | 4376357 |
References
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