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Bioengineering

माउस भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं से इंजीनियरिंग तंत्रिका ऊतकों के लिए पाली के Electrospun रेशेदार Scaffolds (ग्लिसरॉल dodecanedioate)

Published: June 18, 2014 doi: 10.3791/51587
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biomedical Engineering, Florida International University

Summary

पाली (ग्लिसरॉल dodecanoate) नामक एक उपन्यास biodegradable बहुलक से एक नए डिजाइन कलेक्टर के माध्यम से एक बड़े जमा क्षेत्र में फैले electrospun लंबे फाइबर (पीजीडी) के संश्लेषण और निर्माण की सूचना मिली थी. फाइबर माउस pluripotent स्टेम सेल से ली गई कोशिकाओं के विकास का समर्थन करने में सक्षम थे.

Abstract

ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों के लिए, biodegradable और biocompatible scaffolds की तैयारी सबसे वांछनीय लेकिन चुनौतीपूर्ण कार्य है. विभिन्न निर्माण विधियों के अलावा, electrospinning अपनी सादगी और बहुमुखी प्रतिभा की वजह से सबसे आकर्षक एक है. इसके अतिरिक्त, electrospun nanofibers सेल अस्तित्व और विकास के लिए अतिरिक्त सहायता सुनिश्चित करने प्राकृतिक बाह्य मैट्रिक्स के आकार की नकल. इस अध्ययन electrospinning के लिए एक नए डिजाइन कलेक्टर का उपयोग करके पाली (ग्लिसरॉल dodecanoate) नामक एक उपन्यास biodegradable और biocompatible बहुलक के लिए एक बड़ा जमा क्षेत्र (पीजीडी) 1 फैले लंबे रेशों के निर्माण की व्यवहार्यता दिखाया. पीजीडी इस प्रकार यह तंत्रिका ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त है, तंत्रिका ऊतकों के समान यांत्रिक गुणों के साथ अद्वितीय लोचदार संपत्तियों दर्शाती है. रेशेदार मचान सामग्री बनाने के लिए संश्लेषण और निर्माण सेट अप, सरल अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, और सस्ती थी. Biocompatibility मेंपरीक्षण, माउस भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं से ली गई कोशिकाओं का पालन करना और electrospun पीजीडी फाइबर पर बढ़ सकता है. संक्षेप में, इस प्रोटोकॉल माउस भ्रूणीय स्टेम सेल व्युत्पन्न तंत्रिका वंश कोशिकाओं के विकास का समर्थन करने के लिए पीजीडी electrospun फाइबर बनाने के लिए एक बहुमुखी निर्माण विधि प्रदान की.

Introduction

Electrospinning सूक्ष्म को नैनोमीटर आकार फाइबर scaffolds के निर्माण करने के लिए प्रभावी प्रसंस्करण विधियों में से एक है. electrospinning के बुनियादी सिद्धांत सुई की नोक और एक उड़ान कलेक्टर के बीच उच्च वोल्टेज लगाने से एक सुई के छिद्र में आयोजित किया जाता है कि समाधान का एक टेलर शंकु शामिल है. समाधान में electrostatic प्रतिकर्षण सतह तनाव पर काबू करते हैं, एक चार्ज तरल पदार्थ जेट सुई की नोक से बाहर निकली है, विलायक वाष्पीकरण के साथ हवा के माध्यम से यात्रा, और अंत में जमीन के कलेक्टर पर जमा किया जाता है. सिरिंज पंप spinneret से उभरते समाधान की एक सतत प्रवाह प्रदान करता है और electrospun फाइबर के इस प्रकार कई प्रतियां समय की एक छोटी अवधि के भीतर निर्मित किया जा सकता है. कलेक्टर पर पहुंचने के लिए spinneret छोड़ने के दौरान आरोप लगाया जेट polymeric समाधान की चिपचिपाहट और सतह तनाव भी शामिल है कि मानकों, electrostati की संख्या के हिसाब से खींच और सजा से गुजरना होगासी समाधान में बल, और बाहरी बिजली क्षेत्र की बातचीत, आदि 2.

Electrospinning प्रक्रिया में, एक कलेक्टर सूक्ष्म को नैनोमीटर फाइबर जमा किया जा सकता है, जहां एक प्रवाहकीय सब्सट्रेट के रूप में कार्य करता है. इस अध्ययन में, फाइबर कलेक्टर के एक नए प्रकार वांछित आकार (लम्बाई x चौड़ाई) के साथ फाइबर मैट प्राप्त करने के लिए डिजाइन किया गया था. परंपरागत रूप से, एल्यूमीनियम पन्नी एक कलेक्टर के रूप में इस्तेमाल किया, लेकिन यह एक और सब्सट्रेट करने के लिए फ्लैट सतह से फाइबर स्थानांतरित करने के लिए मुश्किल है. एक पारंपरिक कलेक्टर से एक अक्षुण्ण फाइबर चटाई कटाई की कठिनाई के कारण electrospun फाइबर कलेक्टर के सतह को जोरदार देते हैं तथ्य यह है कि मुख्य रूप से किया गया था. इसलिए, हम एक आयताकार पट्टी में एल्यूमीनियम पन्नी की एक टुकड़ा तह और एक फ्लैट धातु की थाली के लिए सीधा संलग्न करके कलेक्टर संशोधित. electrospun फाइबर पट्टी की नोक और आसानी से एक और substrat को हस्तांतरित किया जा सकता है जो धातु की थाली, बीच के क्षेत्र भर में फैला रहे हैंई.

Thermally Crosslinked elastomeric पॉलिमर में ब्याज तेजी क्योंकि पाली (ग्लिसरॉल sebacate) (पीजीएस), 2002 3 में vulcanized रबर के अनुरूप है जो. पीजीएस के समान पॉलिएस्टर शुरू की जो रॉबर्ट लैंगर के समूह की अग्रणी काम के बढ़ते, हम सफलतापूर्वक विकसित किया है है पाली (ग्लिसरॉल dodecanoate) (पीजीडी) ग्लिसरॉल और dodecanedioic एसिड की थर्मल संक्षेपण द्वारा और अपनी अद्वितीय आकार स्मृति संपत्ति 1 का प्रदर्शन किया. Stiffer सिंथेटिक सामग्री पाली (हाइड्रॉक्सिल butyrate) या पाली (एल Lactide) (क्रमशः 250 MPa और 660 एमपीए, की यंग moduli) के विपरीत, पीजीडी तापमान 37 डिग्री से ऊपर है जब 1.08 MPa के एक यंग मापांक के साथ, रबर की तरह elastomeric संपत्ति दर्शाती सीटू परिधीय तंत्रिका (0.45 एमपीए) के लिए एक करीबी मैच है जो सी,. इसके अलावा, पीजीडी biodegradable है और गिरावट समय ग्लिसरॉल और dodecanedioic एसिड का अनुपात अलग से ठीक tuned किया जा सकता है. Dodecanedioic एसिड एक बारह कार्बन उप हैदो टर्मिनल कार्बोक्जिलिक समूहों, HOOC (सीएच 2) 10 COOH साथ रुख. Sebacic एसिड और dodecanedioic एसिड की तरह भी गिने dicarboxylic एसिड-acetyl सीओए और tricarboxylic एसिड (टीसीए) / (साइट्रिक एसिड) चक्र में प्रवेश करने के लिए metabolized किया जा सकता है. dicarboxylic एसिड के चयापचय उत्पाद, succinyl सीओए, एक gluconeogenetic अग्रदूत और टीसीए चक्र 4 के मध्यवर्ती है. इस प्रकार, कुछ अध्ययनों से वे विशेष रूप से रोग की स्थिति में Enteral और Parenteral पोषण के लिए एक वैकल्पिक ईंधन सब्सट्रेट के रूप में उपयोग किया जा सकता है कि सुझाव दिया. अपने गिलास संक्रमण तापमान 31 डिग्री सेल्सियस है, क्योंकि इसके अलावा, पीजीडी इस प्रकार यह कमरे के तापमान पर और शरीर के तापमान पर अलग यांत्रिक गुणों से पता चलता है, अद्वितीय आकार स्मृति दर्शाती है. संक्षेप में, पीजीडी तंत्रिका ऊतकों के समान यांत्रिक गुणों के साथ अद्वितीय लोचदार संपत्तियों का प्रदर्शन, biodegradable biocompatible है; इसलिए, यह तंत्रिका ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों के लिए एक उपयुक्त सामग्री है. इस प्रोटोकॉल में, electrospunएक बड़े जमा क्षेत्र में फैले लंबे फाइबर पीजीडी से नए डिजाइन कलेक्टर के माध्यम से गढ़े गए थे. फाइबर scaffolds माउस pluripotent स्टेम सेल विकास और भिन्नता का समर्थन कर सकते हैं.

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Protocol

1. Electrospinning कलेक्टर सेटअप

  1. एक आयताकार टुकड़ा में एल्यूमीनियम पन्नी काटें.
  2. एक आयताकार पट्टी में आयताकार टुकड़ा गुना, और टेप के साथ एक फ्लैट धातु प्लेट (चित्रा 1) के लिए सीधा देते हैं. नोट: फाइबर चटाई का आकार पट्टी की लंबाई और चौड़ाई पर निर्भर करता है. जरूरत के रूप में इस प्रकार, पट्टी आयाम समायोजित किया जा सकता है.

2. Polymeric समाधान तैयार

  1. पीजीडी बहुलक प्राप्त करने के लिए 100 घंटे के लिए 120 डिग्री सेल्सियस पर एक बीकर में 01:01 दाढ़ अनुपात में ग्लिसरॉल और dodecanedioic एसिड (डीडीए) मिलाएं.
  2. एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में 1.5:3:95.5 के एक वजन के अनुपात के साथ 65% इथेनॉल में पाली (ethylene ऑक्साइड) (पीईओ) और जिलेटिन भंग, टोपी कसने और सरगर्मी के साथ 1 घंटे के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर एक ओवन में मिश्रण गर्मी यह एक सजातीय समाधान (बेसल समाधान) हो जाता है जब तक.
  3. Electrospinning के लिए, पीजीडी बहुलक और 4:6 के अनुपात वजन में बेसल समाधान मिश्रण. नोट: पीजीडी एकाग्रता एक द्वि हैग्राम फाइबर व्यास पर प्रभाव. 30% -50% प्रतिशत पीजीडी अब वृद्धि हुई फाइबर व्यास के साथ 5 सेमी से फाइबर का उत्पादन करने के लिए स्वीकार्य है.
  4. Polymeric समाधान करने के लिए 0.1% राइबोफ्लेविन जोड़ें और मिश्रण अच्छी तरह से.

3. Electrospinning

  1. एक 18 जी के साथ एक 5 मिलीलीटर मानक सिरिंज में polymeric समाधान फ़ीड स्टेनलेस स्टील सुई पा लिया.
  2. एक सिरिंज पंप में सिरिंज डालें.
  3. धातु प्लेट और सुई को सकारात्मक आरोप लगाया नेतृत्व करने के लिए एक उच्च वोल्टेज बिजली के स्रोत की जमीन का नेतृत्व संलग्न करें.
  4. 15 सेमी करने के लिए सुई और एल्यूमीनियम पन्नी पट्टी के बीच की दूरी को समायोजित करें.
  5. पट्टी के मोर्चे पर फाइबर के एकत्रीकरण को रोकने के लिए क्षैतिज के साथ लगभग 15 डिग्री के कोण में सिरिंज पंप रखें.
  6. सिरिंज पंप पर बारी और 0.6 मिलीग्राम / घंटा के लिए पंप के प्रवाह दर को समायोजित.
  7. उच्च वोल्टेज बिजली स्रोत पर बारी और 14.6 केवी ऑपरेटिंग वोल्टेज निर्धारित किया है.

4.फाइबर प्रसंस्करण

  1. संग्रह पूर्ण होने के बाद, पार से जोड़ने के लिए 60 मिनट के लिए पराबैंगनी प्रकाश में फाइबर चटाई बेनकाब.
  2. एक 100 मिमी पेट्री डिश के लिए एल्यूमीनियम पन्नी पट्टी से फाइबर चटाई स्थानांतरण, और नसबंदी के लिए एक और 20 मिनट के लिए यूवी प्रकाश को बेनकाब.
  3. एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में, एक सर्जिकल ब्लेड के साथ एक ही आकार के गोल टुकड़ों में फाइबर चटाई कटौती और एक 24 अच्छी तरह से थाली में टुकड़े जगह है.
  4. सेल पूर्व बोने उपचार के लिए, फॉस्फेट buffered खारा (पीबीएस) के 1 मिलीलीटर में फाइबर नमूने विसर्जित और रात में 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
  5. अगले दिन, महाप्राण पीबीएस ध्यान से, अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए (सामग्री तालिका में नुस्खा देखें) भेदभाव माध्यम से 1 मिलीलीटर (DMEM/F12, एन 2, और FGF2) जोड़ने के लिए और 3 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
  6. महाप्राण भेदभाव मध्यम ध्यान से, प्रत्येक फाइबर नमूने के Matrigel की 0.2 मिलीलीटर जोड़ें और 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं. नोट: laminin भी फाइबर कोटिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. 20 माइक्रोग्राम / एमएल laminin की 0.2 मिलीलीटर जोड़ेंफाइबर के लिए और 3 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं.
  7. ध्यान से प्रत्येक अच्छी तरह से अतिरिक्त Matrigel हटा दें. एक बार भेदभाव मध्यम 2 मिलीलीटर से कुल्ला. नोट: फाइबर नमूने सेल संस्कृति के लिए तैयार हैं.

फाइबर पर 5. सेल बोने

  1. एमईएस सेल संस्कृति डिश के लिए Accutase के 1 मिलीलीटर जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए सेते
  2. 10 मिनट के बाद, एमईएस कोशिकाओं संस्कृति पकवान से अलग कर रहे हैं. थाली को भेदभाव मध्यम के 4 मिलीलीटर जोड़ें. कालोनियों के बारे में (15x) को तोड़ने के लिए ऊपर और नीचे एक 15 मिलीलीटर ट्यूब और पिपेट कोशिकाओं में चल एमईएस कोशिकाओं को इकट्ठा.
  3. भेदभाव मध्यम के 4 एमएल में 5 मिनट और फिर से निलंबित कोशिकाओं के लिए 400 XG पर अपकेंद्रित्र.
  4. एक hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं की गणना. एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में सेल निलंबन के 200 μl स्थानांतरण और भेदभाव माध्यम के साथ यह 10x पतला. जगह में एक कवर पर्ची के साथ hemocytometer पर एक कक्ष को पतला सेल निलंबन के 15 μl स्थानांतरण. गणना1 मिमी केंद्र वर्ग और खुर्दबीन के नीचे hemocytometer के चार कोने वर्गों में कोशिकाओं. नोट: मिलीलीटर कमजोर पड़ने कारक x 10 x 4 वर्ग प्रति औसत संख्या = सेल प्रति
  5. प्रत्येक कुएं पर लगभग 5 x 10 4 एमईएस कोशिकाओं रखें. धीरे धीरे फाइबर चटाई बंद draining से समाधान को रोकने के लिए, बजाय अच्छी तरह से की तरफ से फिसलने की, फाइबर नमूनों के बीच पर सेल निलंबन ड्रॉप.
  6. प्रत्येक अच्छी तरह से भेदभाव माध्यम से 1 मिलीलीटर जोड़ें, और 37 डिग्री सेल्सियस पर एक मशीन में थाली रखने के लिए और 5% सीओ 2 कोशिकाओं लगाव, विकास और भेदभाव की अनुमति है.
  7. अच्छी तरह से प्रत्येक से पुराने मध्यम Aspirate और हर दूसरे दिन ताजा भेदभाव माध्यम से 1 मिलीलीटर के साथ बदलें.

6. सेल व्यवहार्यता

  1. प्रत्येक अच्छी तरह से पुराने मध्यम Aspirate.
  2. संस्कृति के माध्यम से Resazurin प्रतिदीप्ति अभिकर्मक के 1/10 वें मात्रा मिलाई और अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए 1 मिलीलीटर जोड़ें.
  3. Incub37 डिग्री सेल्सियस और प्रत्यक्ष प्रकाश से रक्षा 4 घंटा, 5% सीओ 2 में खा लिया.
  4. 4 घंटे के बाद, एक 96 अच्छी तरह से थाली करने के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से अभिकर्मक के 100 μl 3x हस्तांतरण, और फिर नमूने 560EX nm/590EM फिल्टर सेटिंग्स का उपयोग कर एक प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोफोटोमीटर पर मापा जा करने के लिए तैयार हैं.

7. रीयल टाइम पीसीआर

  1. संस्कृति के 14 दिनों के बाद, नमूने लिए lysis बफर जोड़ने और फाइबर नमूने पर कोशिकाओं से कुल शाही सेना को अलग.
  2. रिवर्स प्रतिलेखन द्वारा 20 μl प्रतिक्रिया तराजू में सीडीएनए synthesize करने के लिए कुल शाही सेना के 4 μl का प्रयोग करें.
  3. 10 μl मास्टर मिक्स (2x), 0.2 μl डाई, 8 μl nuclease मुफ्त पानी, 1 μl सीडीएनए, और 1 μl प्राइमर (इस अध्ययन में इस्तेमाल प्राइमर्स 1 टेबल में सूचीबद्ध हैं): प्रत्येक ऑप्टिकल ट्यूब में पीसीआर प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार करें.
  4. एक: पीसीआर कार्यक्रम निर्धारित करें. 95 डिग्री सेल्सियस 2:20 मिनट, 1 चक्र बी. 95 डिग्री सेल्सियस 3 सेकंड → 60 डिग्री सेल्सियस 1 मिनट, 40 चक्र सी. 95 डिग्री सेल्सियस 15 सेकंड, 1 चक्र डी. 60 डिग्री सेल्सियस 1मिनट, 1 चक्र ए. 95 डिग्री सेल्सियस 15 सेकंड, 1 चक्र. रिश्तेदार जीन अभिव्यक्ति के स्तर को निर्धारित करने के लिए तुलनात्मक सी टी विधि चुनें.
  5. पीसीआर के समाप्त होने पर, StepOne सॉफ्टवेयर के साथ वास्तविक समय पीसीआर परिणामों का विश्लेषण और एक्सेल में परिणाम निर्यात.

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Representative Results

electrospinning के प्रमुख घटक चित्र 1 में दिखाया गया है. एक बड़े आकार फाइबर चटाई आम तौर पर लंब के रूप में संलग्न एल्यूमीनियम पन्नी पट्टी और एक फ्लैट धातु की थाली के माध्यम से प्राप्त हुई थी. चित्रा 2 कलेक्टर डिजाइन और electrospinning फाइबर चटाई से पता चलता है. चौड़ाई और लंबाई विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए समायोजित किया जा सकता है. पीजीडी बहुलक और बेसल समाधान मिश्रण के साथ बनाया फाइबर की लंबाई 10 सेमी ऊपर है. electrospun फाइबर की आकारिकी 3 चित्र में दिखाया गया है. 40% पीजीडी एकाग्रता से निर्मित फाइबर का व्यास सुक्ष्ममापी रेंज में हैं. फाइबर पर 3 और 6 दिनों के लिए सुसंस्कृत एमईएस कोशिकाओं से व्युत्पन्न विभेदित कोशिकाओं की Confocal माइक्रोस्कोपी छवियों चित्रा 4 में चित्रित कर रहे हैं. हरी फ्लोरोसेंट संकेत कोशिकाओं में हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) की अभिव्यक्ति से अधिक से आया है. चित्रा 5 में Resazurin प्रतिदीप्ति अभिकर्मक के परिणाम एमईएस कोशिकाओं के विकास से पता चला किn Matrigel और laminin साथ पीजीडी फाइबर कोटिंग पर बराबर सेल व्यवहार्यता था और uncoated समूह की तुलना में अपेक्षाकृत अधिक प्रसार किया था. pluripotency और तंत्रिका कोशिकाओं मार्कर के जीन की अभिव्यक्ति (चित्रा 6) वास्तविक समय पीसीआर द्वारा मात्रा निर्धारित किया गया था. कोशिकाओं के अल्पसंख्यक तंत्रिका स्टेम सेल Pax6 और nestin निशान व्यक्त करते हुए तंतुओं पर सुसंस्कृत एमईएस कोशिकाओं के बहुमत pluripotency मार्करों Oct4, Nanog और Sox2 व्यक्त किया. 2 सप्ताह संस्कृति के बाद, फाइबर पर हो एमईएस वृद्धि हुई ऐसी MAP2 और DCX के रूप में तंत्रिका कोशिका के निशान की अभिव्यक्ति के स्तर है, साथ ही oligodendrocyte मार्कर Oligo1 और astrocyte मार्कर GFAP दिखाया.

चित्रा 1
चित्रा 1. की स्थापना electrospinning. Polymeric समाधान एक पा सुई से अलग हो जाता है. एक उच्च वोल्टेज बिजली के स्रोत के मैदान में एक फ्लैट धातु की थाली एकएन डी एक एल्यूमीनियम पन्नी पट्टी जो बीच सूक्ष्म से नैनो मीटर फाइबर (नीला) जमा कर रहे हैं.

चित्रा 2
चित्रा 2. कलेक्टर डिजाइन और electrospun फाइबर चटाई. फाइबर चटाई की चौड़ाई और लंबाई आसानी से एल्यूमीनियम पन्नी पट्टी के आकार का समायोजन करके बदला जा सकता है. वहाँ चटाई चौड़ाई के लिए कोई सीमा नहीं है, और सबसे लंबे समय तक फाइबर के लिए 10 सेमी लंबी हो सकती है.

चित्रा 3
पीजीडी की electrospun और बेसल समाधान 04:06 चित्रा 3. SEM छवियों (डब्ल्यू / डब्ल्यू). फाइबर का औसत व्यास लगभग 2 मीटर है. पीजीडी एकाग्रता 30% तक कम हो जाती है, जब फाइबर का औसत व्यास नैनोमीटर रेंज में आता है. सफ़ेदपैमाने बार 10 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है.

चित्रा 4
चित्रा 4. फाइबर पर विभेदित एमईएस कोशिकाओं के Confocal माइक्रोस्कोपी छवियों. पराबैंगनी श्रृंखला के लिए नीले रंग में प्रकाश के संपर्क में जब GFP चमकीले हरे प्रतिदीप्ति प्रदर्शन कोशिकाओं को ले जाने. दिन 6 पर हरे रंग का फ्लोरोसेंट कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि फाइबर scaffolds सेल आसंजन और प्रसार का समर्थन कर सकते हैं जो इंगित करता है. सफेद पैमाने बार 100 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है. (3 दिन और दिन 6).

चित्रा 5
चित्रा 5. पीजीडी 1 पर Matrigel और laminin साथ कोटिंग फाइबर, 3, और 5 दिन पर एमईएस कोशिकाओं के सेल व्यवहार्यता Resazurin fluore द्वारा निर्धारितScence अभिकर्मक. कोशिकाओं नियंत्रण (पी <0.05) के रूप में इस्तेमाल uncoated फाइबर पर सुसंस्कृत.

चित्रा 6
चित्रा 6. पीजीडी फाइबर पर विभेदित एमईएस कोशिकाओं में जीन की अभिव्यक्ति की QRT-पीसीआर विश्लेषण. 2 हफ्तों के बाद स्पष्ट तंत्रिका कोशिका मार्कर scaffolds पर एमईएस कोशिकाओं तंत्रिका कोशिकाओं में भेदभाव किया है कि प्रदर्शन किया.

mGAPDH-L AACTTTGGCATTGTGGAAGG
mGAPDH आर ACACATTGGGGGTAGGAACA
mOct4-L CACGAGTGGAAAGCAACTCA
mOct4 आर AGATGGTGGTCTGGCTGAAC
mNanog-L AAGTACCTCAGCCTCCAGCA
mNanog आर GTGCTGAGCCCTTCTGAATC
mSox2-L CACAGTTCAGCCCTGAGTGA
mSox2 आर AGGCCACAACAACAACAACA
mPax6-L AACAACCTGCCTATGCAACC
mPax6 आर ACTTGGACGGGAACTGACAC
mNestin-L CCAGAGCTGGACTGGAACTC
mNestin आर ACCTGCCTCTTTTGGTTCCT
mMAP2-L CTTATGGGAATGTGGGATGG
mMAP2 आर AAAAAGTGGGCCTTGGAACT
mDCX-L ATGCAGTTGTCCCTCCATTC
mDCX आर ATGCCACCAAGTTGTCATCA
mOligo1-L CTTGCTCTCTCCAGCCAAAC
mOligo1 आर GCGAGCCTGAAAAACAGAAC
mGFAP-L CACGAACGAGTCCCTAGAGC
mGFAP आर ATGGTGATGCGGTTTTCTTC
ontent "> तालिका 1. पीसीआर प्राइमरों की सूची.

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Discussion

साधारण लेने या वर्तमान में कुछ अनुप्रयोगों के लिए इच्छित लंबाई और फाइबर चटाई का आकार प्राप्त करने का प्रतिबंध बढ़ाने electrospinning के लिए उपयोग किया जाता है कि संग्रहकर्ता घूर्णन की जटिलताओं की सीमाओं. इसके अतिरिक्त, संस्कृति पकवान या अन्य substrates के लिए जमीन कलेक्टर से फाइबर स्थानांतरित एक चुनौती है 5. इस रिपोर्ट में, जमीन कलेक्टर को एक एल्यूमीनियम पन्नी पट्टी संलग्न द्वारा बस बना एक नए डिजाइन कलेक्टर, एक समय में 20 सेमी से 10 सेमी करने के लिए बड़े आकार फाइबर मैट प्राप्त करने में सक्षम था. 1 और 2 से डिजाइन योजनाबद्ध सेटअप उदाहरण देकर स्पष्ट आंकड़े 10 सेमी नियंत्रित चटाई चौड़ाई के साथ लंबे समय electrospun फाइबर के ऊपर fabricating के लिए. सुई टिप और कलेक्टर के बीच electrostatic क्षेत्र से प्रभावित electrospun फाइबर आसानी से किसी अन्य के लिए हस्तांतरित किया जा सकता है, जो एक चिकनी फाइबर चटाई, फार्म करने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी पट्टी और जमीन कलेक्टर के बीच क्षेत्र भर में फैला रहे थेubstrate. Electrospun फाइबर कोशिकाओं को पाटने और वास्तव में एक तीन आयामी वातावरण में कई तंतुओं को संलग्न करने की अनुमति है कि झरझरा रेशेदार संरचनाओं प्रदान करते हैं. इस अध्ययन में उत्पन्न फाइबर मैट उन्हें इस तरह के घाव भरने और तंत्रिका उत्थान के रूप में आवेदन की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए आदर्श उम्मीदवार बनाने के लिए काफी बड़े हैं.

फाइबर व्यास electrospinning प्रक्रिया में कई चर को नियंत्रित करने से समायोजित किया जा सकता है. इन चर बहुलक एकाग्रता, एप्लाइड वोल्टेज की भयावहता, बहुलक वितरण दर, कलेक्टर को सुई से दूरी, आदि 6-8 शामिल हैं. इस अध्ययन में, 50% पीजीडी और 50% बी, 40% पीजीडी और 60% बी, 30% पीजीडी और 70% बी, और 20% पीजीडी और क्रमशः 80% बी, के साथ बना रहे थे, जो परीक्षण समाधान,, के लिए तैयार किए गए electrospun फाइबर बनाने. रेशेदार scaffolds फाइबर के व्यास और morphologies (चित्रा 3) निर्धारित करने के लिए SEM का उपयोग जांच की गई. जैसी कि उम्मीद थी, उच्च पीजीडी सांद्रता पीelectrospun फाइबर के बड़े व्यास roduced. इसके अलावा, यह अलग पीजीडी सांद्रता के अनुसार पट्टी की लंबाई को समायोजित करने के लिए महत्वपूर्ण है. एक कम पीजीडी एकाग्रता फाइबर गठन सुनिश्चित करने के लिए एक छोटी पट्टी की लंबाई की आवश्यकता है.

कई प्रयासों सेल संस्कृति 9-13 के अध्ययन के माध्यम से electrospun रेशेदार scaffolds के biocompatibility पता लगाने के लिए बनाया गया है. मजबूत हरी फ्लोरोसेंट संकेतों के साथ जुड़ी कोशिकाओं पीजीडी फाइबर पर सेल अस्तित्व संकेत दिया कि चित्रा 4 शो में confocal माइक्रोस्कोपी छवियों. इसके अलावा, सुबह 6 से सुबह 3 से बढ़ती सेल घनत्व भी पीजीडी फाइबर पर सेल प्रसार का सुझाव दिया. चित्रा 5 में सेल व्यवहार्यता परीक्षण भी इस परिणाम की पुष्टि की. तंत्रिका कोशिका के निशान MAP2 और DCX के जीन अभिव्यक्ति एमईएस कोशिकाओं (चित्रा 6) scaffolds पर तंत्रिका कोशिकाओं में अंतर करने में सक्षम थे कि प्रदर्शन किया. अंत में, पीजीडी रेशेदार scaffolds सेल चिपकाव का समर्थन कर सकताn और प्रसार, और इस प्रकार तंत्रिका ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों के लिए संभावित दिखा रहे हैं.

यहाँ कुछ सामान्य समस्या निवारण दिशानिर्देश हैं: सुई से बाहर आने फाइबर टूटनेवाला है, तो फिर polymeric समाधान को गर्म और यह अच्छी तरह से मिश्रण या फाइबर धातु की थाली के लिए कोई आकर्षण के साथ एल्यूमीनियम पन्नी पट्टी से चिपके हुए है, तो पट्टी को कम लंबाई या पीजीडी एकाग्रता में वृद्धि. कभी कभी बड़े बहुलक ग्लोब सुई नोक पर फार्म, उच्च वोल्टेज बिजली के स्रोत को बंद कर एक कागज तौलिए से पोंछ, और पंप का वितरण दर को कम. इसके अलावा, एल्यूमीनियम पन्नी पट्टी के ऊपरी छोर पर कभी कभी फाइबर कुल सिरिंज पंप के कोण समायोजित करने की कोशिश.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

इस काम के फ्लोरिडा अंतर्राष्ट्रीय विश्वविद्यालय में बायोमेडिकल इंजीनियरिंग विभाग की सुविधाओं का उपयोग कर आयोजित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glycerol Sigma-Aldrich G7757
Dodecanedioic acid Sigma-Aldrich D1009
Gelatin Sigma-Aldrich D1890
Poly(ethylene oxide) (PEO) Sigma-Aldrich 182028
Riboflavin Sigma-Aldrich 132350250 0.10%
Mouse embryonic stem cells GlobalStem GSC-5002
Matrigel Becton Dickinson 356234
DMEM/F12 Thermo Scientific SH30272.02
N2 supplement Invitrogen 17502048 1%
FGF2 Stemgent 03-0002 10 ng/ml
Accutase Invitrogen A11105-01
Phosphate buffered saline (PBS) Invitrogen 10010-031
Resazurin fluorescence dye Sigma-Aldrich 62758-13-8
SV Total RNA Isolation System Promega Z3100
GoScript Reverse Transcription System Promega A5000
GoTaq qPCR Master Mix Promega A6001
Syringe pump  Fisher scientific 14-831-200
High voltage power source  Spellman High Voltage Electronics Corporation SL30
UV light Philips 308643 15W/G15T8
Synergy HT Multi-Mode Microplate Reader BioTek
Perkin Elmer GeneAmp PCR System 9600 Perkin Elmer 8488
StepOne Real-time PCR System Applied Biosystems 4376357

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Migneco, F., Huang, Y. -C., Birla, R. K., Hollister, S. J. Poly (glycerol-dodecanoate), a biodegradable polyester for medical devices and tissue engineering scaffolds. Biomaterials. 30, 6479-6484 (2009).
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जैव अभियांत्रिकी अंक 88 ऊतक इंजीनियरिंग electrospinning फाइबर scaffolds पाली (ग्लिसरॉल dodecanedioate) (पीजीडी) जिलेटिन माउस भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं
माउस भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं से इंजीनियरिंग तंत्रिका ऊतकों के लिए पाली के Electrospun रेशेदार Scaffolds (ग्लिसरॉल dodecanedioate)
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Dai, X., Huang, Y. C. Electrospun… More

Dai, X., Huang, Y. C. Electrospun Fibrous Scaffolds of Poly(glycerol-dodecanedioate) for Engineering Neural Tissues From Mouse Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp. (88), e51587, doi:10.3791/51587 (2014).

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