Summary
סינתזה וייצור של סיבי electrospun ארוכים המשתרעים על שטח גדול יותר הפקדה באמצעות אספן חדש תוכנן מפולימר מתכלה רומן בשם פולי (גליצרול-dodecanoate) (PGD) דווחה. הסיבים היו מסוגלים לתמוך בצמיחה של תאים שמקורם בתאי גזע pluripotent עכבר.
Abstract
עבור יישומי הנדסת רקמות, הכנת פיגומים מתכלים ביולוגית היא המשימה הרצויה אך המאתגרת ביותר. בין שיטות ייצור השונות, electrospinning הוא אחד האטרקטיבי ביותר, בשל הפשטות והרבגוניות שלו. בנוסף, nanofibers electrospun לחקות את הגודל של מטריצה תאית הטבעית הבטחת תמיכה נוספת להישרדות תא וצמיחה. מחקר זה הראה את הכדאיות של הייצור של סיבים ארוכים המשתרעים על הפקדת שטח גדול יותר לפולימר מתכלה ביולוגית חדשני בשם פולי (גליצרול-dodecanoate) (PGD) 1 באמצעות אספן חדש תוכנן עבור electrospinning. PGD מפגין תכונות אלסטיות ייחודיות עם תכונות מכאניות דומות לרקמות עצבים, ולכן הוא מתאים ליישומי הנדסת רקמות עצביים. הסינתזה והגדרת ייצור להכנת חומרי פיגומים סיביים הייתה פשוט, לשעתקו מאוד, ולא יקרים. בbiocompatibilityבדיקות, תאים שמקורם בתאי גזע עובריים של עכברים יכולים לדבוק ולגדול על סיבי PGD electrospun. לסיכום, פרוטוקול זה סיפק שיטת ייצור תכליתית להכנת סיבי electrospun PGD כדי לתמוך בצמיחה של תאי שושלת תאי גזע העובריים של עכברים נגזרו עצביים.
Introduction
Electrospinning הוא אחת מהשיטות העיבוד היעילות לייצר פיגומי גודל סיבי מיקרו לננומטר. העיקרון הבסיסי של electrospinning כרוך קונוס טיילור של פתרון שמתקיים בפתח של מחט על ידי הפעלת מתח גבוה בין קצה המחט ואספן מקורקע. כאשר הדחייה אלקטרוסטטית בפתרון מתגברת מתח הפנים, סילון נוזל טעון הוא נפלט אל מחוץ לקצה המחט, עובר דרך האוויר עם אידוי ממס, ולבסוף הופקד על האספן מקורקע. משאבת המזרק מספקת זרימה רציפה של פתרון המתעוררים מspinneret ועותקים ובכך מרובים של סיבי electrospun יכולים להיות מפוברק בתוך תקופה קצרה של זמן. במהלך עוזב spinneret להגיע לאספן, הסילון הטעון יעבור מתיחה ומצליף על פי מספר הפרמטרים הכוללים את מתח הצמיגות ופני שטח של הפתרון פולימריים, electrostatiכוח ג בפתרון, ואת האינטראקציה של השדה החשמלי החיצוני, וכו '2.
בתהליך electrospinning, אספן משמש כמצע מוליך שבו יכולים להיות מופקדים סיבי מיקרו לננומטר. במחקר זה, סוג חדש של אספן סיבים נועד להשיג מחצלות סיבים עם הגודל הרצוי (רוחב x אורך). באופן מסורתי, רדיד אלומיניום משמש כאספן אבל קשה להעביר את הסיבים מהמשטח השטוח למצע אחר. הקושי של קצירת מחצלת סיבים ללא פגע מאספן מסורתי היה בעיקר בשל העובדה שסיבי electrospun לצרף מאוד על פני השטח של האספן. לכן, אנחנו שונה האספן על ידי קיפול פיסת נייר אלומיניום לרצועה מלבנית והצמדתו בניצב ללוחית מתכת שטוחה. סיבי electrospun נמתחים על פני השטח שבין הקצה של הרצועה ולוחית המתכת, שניתן להעביר בקלות לsubstrat אחרתדואר.
ריבית בפולימרי אלסטומרי תרמית crosslinked הוא גדל במהירות בגלל עבודתם החלוצית של קבוצתו של רוברט לנגר, שהציג את פולי (sebacate גליצרול) (PGS), פוליאסטר שהוא מקביל לגומי מגופר, ב2002 3. דומה לPGS, יש לנו פיתחנו בהצלחה פולי (גליצרול-dodecanoate) (PGD) על ידי עיבוי תרמית של גליצרול וחומצת dodecanedioic והפגינו קניין זיכרון צורה הייחודי שלה 1. שלא כמו פולי נוקשה חומרים סינטטיים (בוטיראט הידרוקסיל) או פולי (L-lactide) (moduli של יאנג של 250 מגפ"ס ו660 מגפ"ס, בהתאמה), PGD מפגין רכוש אלסטומרי כמו גומי, עם מודול יאנג של 1.08 מגפ"ס כאשר הטמפרטורה היא מעל 37 ° C, שהוא משחק קרוב לעצבים באתר ההיקפיים (0.45 MPA). בנוסף, PGD הוא מתכלה וזמן הפירוק ניתן מכויל על ידי שינוי היחס של גליצרול וחומצת dodecanedioic. חומצת Dodecanedioic היא תת עשר פחמןעמדה עם שתי קבוצות קרבוקסיליות מסוף, HOOC (CH 2) 10 COOH. חומצות dicarboxylic אפילו ממוספרות כמו חומצת sebacic וחומצת dodecanedioic יכולות להיות מפורקות לאצטיל-CoA והזן את חומצת tricarboxylic (TCA) מחזור / (חומצת לימון). מוצר חילוף החומרים של חומצות dicarboxylic, succinyl-CoA, הוא מבשר וביניים של מחזור 4 TCA gluconeogenetic. לפיכך, חלק מהמחקרים הראו כי הם יכולים להיות מנוצלים כמצע אלטרנטיבי דלק לתזונת Enteral וparenteral, במיוחד במצבים פתולוגיים. בנוסף, PGD מפגין זיכרון צורה ייחודית משום שטמפרטורת מעבר זכוכית שלה היא 31 במעלות צלזיוס, ובכך הוא מציג תכונות מכאניות שונות בטמפרטורת חדר ובטמפרטורת גוף. לסיכום, PGD הוא מתכלה, ביולוגית, המציג תכונות אלסטיות ייחודיות עם תכונות מכאניות דומות לרקמות עצבים; ולכן, זה חומר מתאים ליישומי הנדסת רקמת עצב. בפרוטוקול זה, electrospunסיבים ארוכים המשתרעים על שטח מרבץ גדול היו מפוברק באמצעות האספן החדש תוכנן מPGD. פיגומי הסיבים יכולים לתמוך בצמיחה בתאי גזע pluripotent עכבר ובידול.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. התקנת Electrospinning אספן
- חותכים את רדיד האלומיניום לתוך חתיכה מלבנית.
- מקפלים את החתיכה מלבנית לרצועה מלבנית, ולצרף אותו בניצב ללוחית מתכת שטוחה עם קלטת (איור 1). הערה: גודלו של שטיח הסיבים תלוי באורך וברוחב הרצועה. כך, ניתן להתאים את ממדי הרצועה לפי צורך.
2. פולימרית פתרון הכנה
- מערבבים גליצרול וחומצת dodecanedioic (DDA) ב1:1 טוחנת בכוס ב-C ° 120 ל100 שעה להשיג פולימר PGD.
- ממיסים פולי (אתילן אוקסיד) (PEO) וג'לטין באתנול 65% עם יחס משקל של 1.5:3:95.5 בצינור 15 מיליליטר, להדק את הכובע ולחמם את התערובת בתנור ב 60 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 עם ערבוב עד שזה הופך פתרון הומוגני (פתרון בסל).
- לelectrospinning, לערבב פולימר PGD והפתרון הבסיסי ב04:06 יחס משקל. שים לב: יש ריכוז PGD דוהשפעה גרם בקוטר סיבים. 30% -50% PGD אחוזים מקובל לייצר סיבים ארוכים יותר מ -5 ס"מ עם קוטר סיבים מוגבר.
- הוספת ריבופלאבין 0.1% לפתרון פולימריים ומערבבים היטב.
3. Electrospinning
- להאכיל את פתרון פולימרים לתוך מזרק סטנדרטי 5 מיליליטר עם 18 G הקהה מחט פלדה אל חלד.
- הכנס את המזרק לתוך משאבת מזרק.
- צרף את ההובלה מקורקעת של מקור כוח במתח גבוה ללוחית המתכת ולהוביל מטען החשמלי החיובי למחט.
- התאם את המרחק בין המחט ורצועת רדיד האלומיניום ל15 סנטימטר.
- מקם את משאבת המזרק בזווית של כ -15 ° ביחס לאופק כדי למנוע הצטברות של הסיבים בחלק הקדמי של הרצועה.
- הפעל את משאבת המזרק ולהתאים את קצב הזרימה של המשאבה ל0.6 מיליליטר / שעה.
- הפעל את מקור החשמל במתח הגבוה ולהגדיר את מתח ההפעלה ל14.6 KV.
4.עיבוד סיבים
- לאחר האיסוף יושלם, לחשוף את מחצלת סיבים לאור UV במשך 60 דקות לקישור צולב.
- העבר את מחצלת הסיבים מרצועת רדיד האלומיניום לצלחת פטרי 100 מ"מ, ותחשוף אותה לאור UV לעוד 20 דקות לעיקור.
- בארון בטיחות ביולוגי, לחתוך את מחצלת סיבים לחתיכות עגולות באותו הגודל עם להב כירורגים ומניחים את החתיכות לתוך צלחת 24 גם.
- לטיפול מראש זריעת תאים, לטבול את דגימות סיבים ב 1 מיליליטר של בופר פוספט (PBS) ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך לילה.
- ביום שלאחר מכן, לשאוב PBS בזהירות, להוסיף 1 מיליליטר של מדיום התמיינות (DMEM/F12, N2, וFGF2) (ראה מתכון בטבלת חומרים) זה טוב ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות.
- בינוני בידול לשאוב בזהירות, להוסיף 0.2 מיליליטר של matrigel לכל דגימת סיבים ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. שים לב: גם Laminin יכול לשמש לציפוי סיבים. הוספת 0.2 מיליליטר של 20 laminin מיקרוגרם / מיליליטרלסיבים ו דגירה בטמפרטורת חדר למשך 3 שעות.
- מוציא בזהירות matrigel העודף מכל טוב. לשטוף עם 2 מיליליטר של מדיום בידול פעם אחת. שים לב: דגימות הסיבים מוכנות לתרבית תאים.
5. נייד זריעה בסיבים
- הוסף 1 מיליליטר של Accutase לצלחת תרבית תאי MES ודגירה של 10 דקות ב 37 ° C.
- לאחר 10 דקות, תאי MES מנותקים ממנת התרבות. הוסף 4 מיליליטר של מדיום בידול לצלחת. לאסוף את תאי MES צף לתוך צינור 15 מיליליטר ותאי פיפטה מעלה ומטה כדי לשבור מושבות (כ 15x).
- צנטריפוגה ב XG 400 למשך 5 דקות ותאים מחדש להשעות ב4 מיליליטר של מדיום בידול.
- ספירת התאים באמצעות hemocytometer. העבר 200 μl של ההשעיה התא לתוך צינור 15 מ"ל ולדלל אותו 10x עם מדיום בידול. העבר 15 μl של ההשעיה התא המדולל לתא על hemocytometer עם כיסוי להחליק במקום. רוזןהתאים בכיכר מרכז 1 מ"מ וארבעת ריבועי פינת hemocytometer מתחת למיקרוסקופ. הערה: נייד לכל מיליליטר = הספירה לכל מ"ר בממוצע x גורם לדילול x 10 4
- מקום כ 5 x 10 4 תאי MES על כל טוב. לאט לאט שחרר את ההשעיה התא על אמצע דגימות סיבים, במקום מחליק לצד השני של הבאר, כדי למנוע מפתרון הניקוז מחוץ למזרן הסיבים.
- הוסף 1 מיליליטר של מדיום בידול היטב כל אחד, ולשמור את הצלחת באינקובטור ב 37 ° C ו 5% CO 2 כדי לאפשר מצורף תאים, גדילה והתמיינות.
- לשאוב את המדיום הישן מכל טוב ולהחליף עם 1 מיליליטר של מדיום בידול טרי בכל יום אחר.
6. כדאיויות תא
- לשאוב את המדיום הישן מכל טוב.
- מערבבים 1/10 ה נפח של מגיב הקרינה Resazurin עם מדיום התרבות ולהוסיף 1 מיליליטר היטב כל אחד.
- Incubאכלתי ב37 ° C ו 5% CO 2 למשך 4 שעות, מוגן מפני אור ישיר.
- לאחר 4 שעות, להעביר 100 μl 3x של המגיב מכל טוב לצלחת 96 היטב, ולאחר מכן הדגימות מוכנות להימדד על ספקטרופוטומטר הקרינה באמצעות הגדרות מסננים 560EX nm/590EM.
7. Real Time PCR
- לאחר 14 ימים של תרבות, להוסיף למאגר תמוגה לדגימות ולבודד RNA המוחלט מהתאים בדגימות הסיבים.
- השתמש 4 μl של רנ"א הכל לסנתז cDNA ב20 קשקשי תגובת μl ידי שעתוק לאחור.
- מכין את תערובת PCR תגובה בכל צינור אופטי: 10 μl מיקס מאסטר (2x), 0.2 צבע μl, 8 המים Nuclease ללא μl, cDNA μl 1, ופריימר μl 1 (צבעי יסוד המשמשים במחקר זה מופיעים בטבלה 1).
- להגדיר את תכנית ה-PCR: א. דקות 95 C ° 2:20, מחזור ב 1. דקות 95 ° C 3 שניות → 60 ° C 1, 40 מחזור ג. 95 ° C שניות 15, ד המחזור 1. 60 C ° 1דקות, דואר מחזור 1. 95 ° C שניות 15, מחזור 1. בחר את שיטת C T השוואתית כדי לקבוע את רמות ביטוי הגנים יחסית.
- לאחר PCR הוא סיים, לנתח את התוצאות בזמן אמת PCR עם תוכנת StepOne ולייצא את התוצאות ל-Excel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
המרכיבים העיקריים של electrospinning מוצגים באיור 1. מחצלת גודל סיבים גדולה הייתה בדרך כלל שהושגה באמצעות הרצועה המצורפת בניצב רדיד האלומיניום ולוחית מתכת שטוחה. איור 2 מציג את עיצוב האספן ומחצלת electrospinning סיבים. הרוחב והאורך יכולים להיות מותאם ליישומים שונים. אורכו של הסיב עשוי פולימר עם PGD ותערובת פתרון בסיסי הוא עד 10 סנטימטר. המורפולוגיה של סיבי electrospun מוצגת באיור 3. בקטרים של סיבים עשויים מ40% ריכוז PGD הם בטווח מיקרומטר. תמונות מיקרוסקופיה confocal של תאים מובחנים שמקורם בתאים בתרבית למשך 3 ו 6 ימים בסיבים MES מתוארות באיור 4. אותות הניאון הירוקים באו מביטוי יתר של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) בתאים. התוצאה של מגיב הקרינה Resazurin באיור 5 הראתה כי תאי MES לגדולn על ציפוי סיבי PGD עם matrigel וlaminin היו כדאיות תא מקבילות והיה לי התפשטות גבוהה יחסית בהשוואה לקבוצה ללא ציפוי. ביטוי גנים של סמני pluripotency ותאים עצביים היה לכמת ידי PCR בזמן אמת (איור 6). רוב התאים בתרבית MES על סיבים הביעו Oct4 סמני pluripotency, Nanog וSox2 בעוד המיעוט של תאים ביטא בתאי הגזע העצביים מסמן Pax6 וNestin. אחרי תרבות 2 שבועות, MES גדל על סיבים הראה רמות מוגברות ביטוי של סימני תא עצביים כגון MAP2 וDCX, כמו גם Oligo1 סמן oligodendrocyte וGFAP סמן astrocyte.
איור 1. Electrospinning להגדיר. הפתרון פולימריים הוא נפלט ממחט קהה. טענת מקור חשמל במתח גבוה צלחת שטוחה מתכתnd רצועת רדיד אלומיניום שביניהן סיבי מטר מיקרו ל-Nano מופקד (כחולה).
איור 2. עיצוב אספן ומחצלת electrospun סיבים. הרוחב והאורך של מחצלת הסיבים ניתן לשנות בקלות על ידי התאמת הגודל של רצועת רדיד האלומיניום. אין גבול לרוחב מזרן, והסיבים הארוכים יכולים להיות ארוכים עד 10 סנטימטר.
איור 3. SEM תמונות של electrospun של PGD ופתרון בסיסי 04:06 (w / w). הקוטר הממוצע של הסיבים הוא סביב 2 מיקרומטר. כאשר ריכוז PGD מקטין ל30%, הקוטר הממוצע של הסיבים נופל לתוך טווח ננומטר. הלבןסרגל קנה מידה מייצג 10 מיקרומטר.
איור 4. תמונות מיקרוסקופיה confocal של תאי MES הבדיל על סיבים. התאים נושאים את ה-GFP תערוכת הקרינה ירוקה בהירה כאשר נחשף לאור בכחול לטווח אולטרה סגול. מספר הגדל של תאי ניאון ירוקים ביום 6 מציין כי פיגומי הסיבים יכולים לתמוך הידבקות התא ושגשוגם. סרגל קנה המידה הלבנה מייצג 100 מיקרומטר. (יום 3 ויום 6).
איור 5. כדאיות התא של תאי MES על סיבי PGD ציפוי עם Matrigel וlaminin בבית 1, 3, ו -5 ימים, כפי שנקבע על ידי fluore Resazurinמגיב scence. תאים בתרבית על הסיבים ללא ציפוי המשמשים כביקורת (p <0.05).
איור 6. ניתוח qRT-PCR של ביטוי גנים בתאי MES הבדיל על סיבי PGD. תא הסמנים העצביים ניכרו לאחר 2 שבועות, הוכיחו כי תאי MES על הפיגומים יש הבדיל לתאים עצביים.
| mGAPDH-L | AACTTTGGCATTGTGGAAGG |
| mGAPDH-R | ACACATTGGGGGTAGGAACA |
| mOct4-L | CACGAGTGGAAAGCAACTCA |
| mOct4-R | AGATGGTGGTCTGGCTGAAC |
| mNanog-L | AAGTACCTCAGCCTCCAGCA |
| mNanog-R | GTGCTGAGCCCTTCTGAATC |
| mSox2-L | CACAGTTCAGCCCTGAGTGA |
| mSox2-R | AGGCCACAACAACAACAACA |
| mPax6-L | AACAACCTGCCTATGCAACC |
| mPax6-R | ACTTGGACGGGAACTGACAC |
| mNestin-L | CCAGAGCTGGACTGGAACTC |
| mNestin-R | ACCTGCCTCTTTTGGTTCCT |
| mMAP2-L | CTTATGGGAATGTGGGATGG |
| mMAP2-R | AAAAAGTGGGCCTTGGAACT |
| mDCX-L | ATGCAGTTGTCCCTCCATTC |
| mDCX-R | ATGCCACCAAGTTGTCATCA |
| mOligo1-L | CTTGCTCTCTCCAGCCAAAC |
| mOligo1-R | GCGAGCCTGAAAAACAGAAC |
| mGFAP-L | CACGAACGAGTCCCTAGAGC |
| mGFAP-R | ATGGTGATGCGGTTTTCTTC |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
המגבלות של אספנים פשוטים או המורכבות של מסתובב אספנים שכיום משמשים לelectrospinning להגדיל את המגבלה של קבלת האורך הרצוי וגודל של שטיח סיבים עבור יישומים מסוימים. בנוסף, העברת סיבים מאספן הקרקע למנת התרבות או מצעים אחרים היא אתגר 5. בדו"ח זה, אספן חדש תוכנן, עשוי בפשטות על ידי הצמדת רצועת רדיד אלומיניום לאספן מקורקע, היה יכול לקבל את מחצלות בגודל סיבים גדולות ל10 סנטימטר על 20 סנטימטר בכל פעם. איורים 1 ו -2 ממחישים את ההגדרה סכמטית נועדה בודה עד 10 ס"מ סיבי electrospun ארוכים עם רוחב מזרן מבוקר. בהשפעת השדה אלקטרוסטטי בין קצה המחט והאספן, סיבי electrospun נמתחו על פני השטח שבין רצועת רדיד האלומיניום והאספן המעוגן בצורת מחצלת סיבים חלקה, שניתן להעביר בקלות למשנהו שלubstrate. סיבי electrospun לספק מבנים סיביים נקבוביים המאפשרים לתאים כדי לגשר ולצרף לסיבים מרובים בסביבה באמת תלת ממדים. מחצלות הסיבים שנוצרו במחקר זה הן גדולים מספיק כדי להפוך אותם למועמדים אידיאליים עבור מגוון רחב של יישומים, כגון ריפוי פצעים והתחדשות עצבית.
יכולים להיות מותאמים בקטרים סיבים על ידי שליטה במספר משתנה בהליך electrospinning. משתנה אלו כוללים ריכוז הפולימר, סדר גודל של מתח מיושם, שיעור לידת הפולימר, מרחק בין המחט לאספן, וכו '6-8. במחקר זה, פתרונות הבדיקה, שחוברו עם PGD 50% וBS 50%, PGD 40% וBS 60%, PGD 30% וBS 70%, וPGD 20% וBS 80%, בהתאמה, היו מוכנים ל מה שהופך את סיבי electrospun. הפיגומים סיביים נבחנו באמצעות SEM כדי לקבוע את הקטרים ומורפולוגיות של הסיבים (איור 3). כצפוי, עמ 'ריכוזים גבוהים PGDroduced קטרים גדולים יותר של סיבי electrospun. כמו כן, זה הוא קריטי כדי להתאים את אורך הרצועה בהתאם לריכוזי PGD השונים. ריכוז PGD נמוך יותר דורש אורך רצועה קצר יותר כדי להבטיח היווצרות סיבים.
מאמצים רבים נעשו כדי לחקור את ההתאמה הביולוגית של הפיגומים סיביים electrospun באמצעות הלימוד של תא התרבות 9-13. תמונות confocal מיקרוסקופ באיור 4 מראה כי התאים המצורפים עם אותות ניאון הירוקים חזקים הצביעו על הישרדות התא בסיבי PGD. בנוסף, הגדלת צפיפות התאים מיום 3 ליום 6 גם הציעה התפשטות התאים בסיבי PGD. בדיקת כדאיות תא באיור 5 אישרה גם את התוצאה הזאת. ביטוי גנים של MAP2 סימני תא העצבי וDCX הוכיח כי תאי MES היו מסוגלים להתמיין לתאים עצביים על הפיגומים (איור 6). לסיכום, פיגומים סיביים PGD יכולים לתמוך adhesio תאn והפצה, ובכך להציג את הפוטנציאל עבור יישומי הנדסת רקמה עצביים.
הנה כמה קווים מנחים לפתרון בעיות כלליים: אם הסיבים שיוצאים מהמחט הוא רציפים, לחמם את הפתרון פולימריים שוב ולערבב אותו היטב או אם הסיבים הוא דבק רצועת רדיד האלומיניום ללא משיכה ללוחית המתכת, לצמצם את הרצועה אורך או להגדיל את ריכוז PGD. לפעמים גושי פולימר גדולים יוצרים בקצה המחט, כבה את מקור החשמל במתח הגבוה, לנגב אותו עם מגבת נייר, ולהפחית את שיעור המסירה של המשאבה. בנוסף, לפעמים מצטברים סיבים בקצה העליון של רצועת רדיד האלומיניום נסה לכוון את הזווית של משאבת המזרק.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Acknowledgments
עבודה זו נערכה באמצעות המתקנים של ביו רפואית הפקולטה להנדסה באוניברסיטה הבינלאומית בפלורידה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G7757 | |
| Dodecanedioic acid | Sigma-Aldrich | D1009 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | D1890 | |
| Poly(ethylene oxide) (PEO) | Sigma-Aldrich | 182028 | |
| Riboflavin | Sigma-Aldrich | 132350250 | 0.10% |
| Mouse embryonic stem cells | GlobalStem | GSC-5002 | |
| Matrigel | Becton Dickinson | 356234 | |
| DMEM/F12 | Thermo Scientific | SH30272.02 | |
| N2 supplement | Invitrogen | 17502048 | 1% |
| FGF2 | Stemgent | 03-0002 | 10 ng/ml |
| Accutase | Invitrogen | A11105-01 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Invitrogen | 10010-031 | |
| Resazurin fluorescence dye | Sigma-Aldrich | 62758-13-8 | |
| SV Total RNA Isolation System | Promega | Z3100 | |
| GoScript Reverse Transcription System | Promega | A5000 | |
| GoTaq qPCR Master Mix | Promega | A6001 | |
| Syringe pump | Fisher scientific | 14-831-200 | |
| High voltage power source | Spellman High Voltage Electronics Corporation | SL30 | |
| UV light | Philips | 308643 | 15W/G15T8 |
| Synergy HT Multi-Mode Microplate Reader | BioTek | ||
| Perkin Elmer GeneAmp PCR System 9600 | Perkin Elmer | 8488 | |
| StepOne Real-time PCR System | Applied Biosystems | 4376357 |
References
- Migneco, F., Huang, Y. -C., Birla, R. K., Hollister, S. J. Poly (glycerol-dodecanoate), a biodegradable polyester for medical devices and tissue engineering scaffolds. Biomaterials. 30, 6479-6484 (2009).
- Reneker, D. H., Yarin, A. L. Electrospinning jets and polymer nanofibers. Polymer. 49, 2387-2425 (2008).
- Wang, Y., Ameer, G. A., Sheppard, B. J., Langer, R.
- Panunzi, S., De Gaetano, A., Mingrone, G. Approximate linear confidence and curvature of a kinetic model of dodecanedioic acid in humans. American Journal of Physiology-Endocrinology And Metabolism. 289, (2005).
- Park, S., et al. Apparatus for preparing electrospun nanofibers: designing an electrospinning process for nanofiber fabrication. Polymer Internationa l. 56, 1361-1366 (2007).
- Barnes, C. P., Sell, S. A., Boland, E. D., Simpson, D. G., Bowlin, G. L. Nanofiber technology: designing the next generation of tissue engineering scaffolds. Advanced drug delivery reviews. 59, 1413-1433 (2007).
- Li, W. -J., Mauck, R. L., Tuan, R. S. Electrospun nanofibrous scaffolds: production, characterization, and applications for tissue engineering and drug delivery. Journal of Biomedical Nanotechnology. 1, 259-275 (2005).
- Pham, Q. P., Sharma, U., Mikos, A. G. Electrospinning of polymeric nanofibers for tissue engineering applications: a review. Tissue engineering. 12, 1197-1211 (2006).
- Lim, S. H., Mao, H. -Q. Electrospun scaffolds for stem cell engineering. Advanced drug delivery reviews. 61, 1084-1096 (2009).
- Lowery, J. L., Datta, N., Rutledge, G. C. Effect of fiber diameter, pore size and seeding method on growth of human dermal fibroblasts in electrospun poly (epsilon-caprolactone) fibrous mats. Biomaterials. 31, 491-504 (2010).
- Tillman, B. W., et al. The in vivo stability of electrospun polycaprolactone-collagen scaffolds in vascular reconstruction. Biomaterials. 30, 583-588 (2009).
- Ju, Y. M., Choi, J. S., Atala, A., Yoo, J. J., Lee, S. J. Bilayered scaffold for engineering cellularized blood vessels. Biomaterials. 31, 4313-4321 (2010).
- McCullen, S. D., et al. In situ collagen polymerization of layered cell-seeded electrospun scaffolds for bone tissue engineering applications. Tissue Engineering Part C: Methods. 16, 1095-1105 (2010).
