एंटीबॉडी समारोह मापने प्लाज्मोडियम फाल्सीपेरम मलेरिया के लिए प्रतिरक्षा को समझने की कुंजी है. इस विधि व्यवहार्य खंडजाणु की शुद्धि, और फ्लो द्वारा opsonization निर्भर phagocytosis की माप का वर्णन करता है.
प्लाज्मोडियम फाल्सीपेरम merozoite एंटीजन संभावित मलेरिया के टीके के रूप में विकास के तहत कर रहे हैं. मलेरिया के खिलाफ प्रतिरोधक क्षमता का एक पहलू phagocytic कोशिकाओं द्वारा रक्त से मुक्त खंडजाणु को हटाने की है. हालांकि merozoite विशिष्ट opsonizing एंटीबॉडी के कार्यात्मक प्रभावकारिता का आकलन करने के कारण खंडजाणु की कम आधा जीवन और प्राथमिक phagocytic कोशिकाओं की परिवर्तनशीलता को चुनौती दे रहा है. विस्तार से वर्णित इस के साथ साथ E64 protease अवरोध का उपयोग व्यवहार्य खंडजाणु पैदा करने के लिए एक विधि है, और समर्थक monocytic सेल लाइन THP-1 का उपयोग merozoite की एक परख opsonin निर्भर phagocytosis है. इलाज schizonts का निस्पंदन द्वारा जारी किया जाता है जो खंडजाणु के विकास की अनुमति है जबकि E64 schizont टूटना रोकता है. Ethidium ब्रोमाइड लेबल खंडजाणु मानव प्लाज्मा नमूनों के साथ opsonized और THP-1 कोशिकाओं को जोड़ा जाता है. Phagocytosis एक मानकीकृत उच्च throughput प्रोटोकॉल द्वारा मूल्यांकन किया है. व्यवहार्य खंडजाणु numer का आकलन करने के लिए एक मूल्यवान संसाधन हैंपी. के ous पहलुओं प्रतिरक्षा समारोह के मूल्यांकन सहित फाल्सीपेरम जीव विज्ञान,. इस परख द्वारा मापा एंटीबॉडी का स्तर स्वाभाविक रूप से उजागर व्यक्तियों में मलेरिया के लिए नैदानिक उन्मुक्ति के साथ जुड़े रहे हैं. परख भी वैक्सीन प्रेरित एंटीबॉडी का आकलन करने के लिए इस्तेमाल की जा सकती है.
प्लाज्मोडियम फाल्सीपेरम मलेरिया के लिए प्रतिरक्षा के लिए एंटीबॉडी का महत्व 40 साल पहले, hyperimmune वयस्कों से इम्यूनोग्लोबिन जब निष्क्रिय क्रमशः समाप्त रोग 1 में जिसके परिणामस्वरूप गंभीर मलेरिया से पीड़ित बच्चों के लिए हस्तांतरित किया गया था दिखाया गया था. नतीजतन, काफी प्रयास ज्यादातर एलिसा द्वारा पेप्टाइड्स या bacterially व्यक्त प्रोटीन के लिए एंटीबॉडी titers मापने के माध्यम से, सुरक्षा मलेरिया उन्मुक्ति के लक्ष्यों की पहचान करने की मांग की है. एलिसा आधारित सीरम विज्ञान भी पढ़ाई के बीच अत्यधिक चर साबित हो गया है, और एंटीबॉडी कार्यक्षमता 2 का पता नहीं है. कई मलेरिया एंटीजन एक कोशिकाओ के प्रति आकर्षित होना वाला IgG1 और IgG3 एंटीबॉडी प्रोफाइल, विशेष रूप से merozoite सतह एंटीजन 3 प्रेरित. इस उपवर्ग पूर्वाग्रह फ़ैगोसाइट साथ एंटीबॉडी एफसी रिसेप्टर (FCR) बातचीत antimerozoite एंटीबॉडी 4 opsonizing की प्रेरक कार्यों के लिए महत्वपूर्ण होते हैं. विकास के अंतर्गत कई merozoite प्रतिजन टीके के लिए तैयार कर रहे हैंभक्षककोशिकीय प्रेरक कार्यों 5, 6 और बटोर कृंतक मलेरिया के मॉडल में एंटीबॉडी FCR बातचीत के महत्व के लिए महत्वपूर्ण सबूत 7-9 से मौजूद है, और कुछ हाल ही के अध्ययन के लिए मानव में मलेरिया के लिए प्रतिरक्षा के लिए कार्यात्मक एंटीबॉडी और भक्षककोशिकीय प्रेरक कार्यों के महत्व का समर्थन करते हैं 10, 11, इस क्षेत्र खराब अध्ययन बनी हुई है. Merozoite विशिष्ट opsonizing एंटीबॉडी में अध्ययन में दो कारकों द्वारा सीमित किया गया है; अच्छी गुणवत्ता खंडजाणु अलग करने में कठिनाई; प्राथमिक कोशिकाओं से और चर phagocytosis के हिमायती हैं.
अभी हाल तक, उच्च गति centrifugation या Percoll gradients घनत्व schizont संस्कृतियों rupturing की संस्कृति supernatants से खंडजाणु अलग करने के लिए उपयोग किया गया. ये खंडजाणु शायद ही कभी व्यवहार्य थे, और अक्सर आगे घनत्व centrifugation द्वारा छेड़छाड़ और कई धोने assays में उपयोग करने से पहले 12 या cryopreservation के 11 पदों. ये processes संभावित merozoite सतह से कई सतही तौर पर जुड़े प्रोटीन, मलेरिया उन्मुक्ति 13 की प्रतिजनी लक्ष्य होने के लिए जाना जाता प्रोटीन को अलग. हाल ही में सिस्टीन protease अवरोध पार Epoxysuccinyl एल leucylamido (4 guanidino) ब्यूटेन (E64) व्यवहार्य खंडजाणु उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. E64 व्यवहार्य खंडजाणु 15, 16 को आजाद कराने के लिए निस्पंदन द्वारा बाधित किया जा सकता है जो झिल्ली संलग्न खंडजाणु 14, सृजन, schizont टूटना रोकता है. इस तकनीक एरिथ्रोसाइट आक्रमण 15, 17-19 के दौरान कई प्रोटीन की स्थानिक संकल्प को जन्म दिया है और कई मलेरिया रोधी दवाओं 16, 20 की अवस्था विशिष्ट प्रभाव स्पष्ट किया है. हालांकि, व्यवहार्य खंडजाणु की पीढ़ी तकनीकी रूप से चुनौती बनी हुई है. उन्मुक्ति के कार्यात्मक assays, एक में व्यवहार्य merozoite शुद्धि और उनके उपयोग के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल के लिए इस तकनीक का और आवेदन के प्रसार में सहायताएंटीबॉडी के मानकीकृत कार्यात्मक परख: opsonization और phagocytosis में सेलुलर सहयोग यहाँ वर्णित है.
यह तकनीक ऐसी न्युट्रोफिल सांस फट, एंटीबॉडी पर निर्भर सेलुलर निषेध (ADCI), और वैकल्पिक merozoite phagocytosis assays के रूप merozoite opsonization के पिछले इन विट्रो assays, पर एक महत्वपूर्ण अग्रिम दर्शाता है. ये assays कारण परजीवी आदानों में भिन्नता और प्राथमिक phagocytic कोशिकाओं 11, 21 की गतिविधि को खराब प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य हैं. Contaminating hemozoin भी गहराई से भक्षककोशिकीय समारोह 22 को प्रभावित कर सकता है. एक हाल ही में सूचना दी मजबूत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य merozoite phagocytosis परख 23 promonocytic सेल लाइन THP-1 24 का इस्तेमाल करता. यह गैर पक्षपाती है और विशेष रूप से एफसी रिसेप्टर मध्यस्थता phagocytosis 25, 26 से करता है क्योंकि यह उच्च throughput फ्लो assays के लिए एक आदर्श सेल प्रकार है. एक अतिरिक्त जटिलता जांच करते हुएphagocytosis tigating phagocytosis की डिग्री THP-1 कोशिकाओं और प्लाज्मा एकाग्रता के सापेक्ष खंडजाणु की संख्या पर निर्भर है. प्रयोगों के बीच reproducibility सुनिश्चित करने के लिए, खंडजाणु प्रगणित किया जाना चाहिए और एक परिभाषित एकाग्रता का इस्तेमाल किया. कारण अपने छोटे आकार, cytometric मात्रा का ठहराव आवश्यक है प्रवाह.
यहाँ वर्णित प्रक्रिया hemozoin हटा और व्यवहार्य खंडजाणु उत्पन्न करता है, और opsonization और phagocytosis द्वारा पीछा खंडजाणु के प्रवाह cytometric गणन के लिए इन खंडजाणु का एक आवेदन का वर्णन करता है. तकनीकी रूप से मांग हालांकि, वर्णित तकनीकों स्वाभाविक रूप से प्राप्त कर लिया और टीका उन्मुक्ति प्रेरित करने merozoite सतह विशिष्ट एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं का योगदान elucidating में उपयोगी साबित हो सकता है.
Merozoite phagocytosis मापने के लिए, दो तकनीक में दक्षता की जरूरत है: खंडजाणु और THP-1 phagocytosis परख की शुद्धि. इन दो तकनीकों के संयोजन के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम हैं: 1) अति सिंक्रनाइज़ परजीवी; 2) झिल्ली संलग्न खंडजाणु उपज के लिए सही समय पर E64 जोड़ना; 3) समुच्चय से बचने के लिए hemozoin निकाला जा रहा है; फ्लो ने 4) सटीक merozoite गिनती; 5) का इस्तेमाल किया प्लाज्मा के कमजोर पड़ने; और 6) कम सेल घनत्व और THP-1 कोशिकाओं के पारित होने संख्या को बनाए रखने. इन महत्वपूर्ण पहलुओं पर सावधानी से विचार मजबूत phagocytosis प्रतिक्रियाओं मनाया जाता है यह सुनिश्चित करेंगे.
यहाँ वर्णित है, हालांकि phagocytosis का आकलन करने के लिए खंडजाणु की तैयारी है, तकनीक आवेदनों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए उपयोग किया जा सकता है. चाहे डाउन स्ट्रीम कार्यप्रणाली के इष्टतम merozoite तैयारी सही ढंग से खंडजाणु उत्पन्न करने के क्रम में E64 इसके अलावा समय पर निर्भर करते हैं. यहाँ वर्णित E64 विधि Y दिखाया गया हैआक्रमण की घटनाओं और दवा संवेदनशीलता assays 15-20 के उच्च संकल्प माइक्रोस्कोपी में उपयोग के लिए आक्रामक खंडजाणु ield. Merozoite व्यवहार्यता phagocytosis के लिए आवश्यक नहीं है, merozoite सतह कोट की अखंडता के लिए आवश्यक है. इसलिए यहाँ वर्णित E64 विधि उच्च गुणवत्ता खंडजाणु सतह कोट करने के लिए एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं का आकलन करने के लिए उत्पादन किया जा सकता है. E64 बहुत जल्दी गयी है या बहुत देर हो चुकी झिल्ली संलग्न खंडजाणु का गठन नहीं कर रहे हैं, चित्रा 1 में उल्लिखित. इस कारण से, अत्यधिक तुल्यकालिक परजीवी संस्कृतियों के लिए आवश्यक हैं. इधर, कसकर को sorbitol और हेपरिन उपचार के उपयोग 2 घंटा की एक खिड़की को D10-GFP परजीवी संस्कृतियों सिंक्रनाइज़ वर्णन किया गया है. हेपरिन अन्य प्रयोगशाला आइसोलेट्स में gametocytogenesis प्रोत्साहित कर सकते हैं, और इसलिए सावधानी से इस्तेमाल किया जाना चाहिए. ऐसे alanine के रूप में वैकल्पिक तुल्यकालन तरीकों में भी कसकर सिंक्रनाइज़ परजीवी 29 उत्पादन किया जाता है, बशर्ते कि इस्तेमाल किया जा सकता है. E64 अतुल्यकालिक परजीवी को जोड़ा जाता है, तो एक कम सहाराझिल्ली संलग्न खंडजाणु की ortion उत्पादन किया है और शेष आरबीसी सामान्य रूप से टूटना या असामान्य आकृति विज्ञान का विकास होगा या तो परजीवी से संक्रमित हो जाएगा. झिल्ली संलग्न खंडजाणु के रूप में विकसित नहीं किया है कि परजीवी की उपस्थिति फिल्टर के clogging में परिणाम और काफी प्राप्त merozoite उपज कम हो जाएगा.
झिल्ली संलग्न खंडजाणु की छानने के दौरान, hemozoin पाचन रिक्तिकाएं से मुक्त है और समाधान में मुफ्त क्रिस्टल के रूप में मौजूद है. Hemozoin अत्यधिक proinflammatory है और एककेंद्रकश्वेतकोशिका और बृहतभक्षककोशिका phagocytosis प्रतिक्रियाओं 30, 31 मिलाना करने के लिए सूचित किया गया है. चित्रा 2 में दिखाया गया है phagocytosis नियमन करने के अलावा,, hemozoin समाधान में खंडजाणु साथ समुच्चय के रूप में कर सकते हैं. THP-1 कोशिकाओं इन समुच्चय phagocytose सकते हैं, यह एंटीबॉडी मध्यस्थता phagocytosis के समाधान के लिए एक प्रमुख confounder हो सकता है. इसलिए, hemozoin को हटाने ए वी इस परख में आवश्यक हैभक्षककोशिकीय जीव विज्ञान पर hemozoin की OID अतिरिक्त जटिलता. Merozoite मात्रा का ठहराव आवश्यक है, खासकर जहां अन्य अनुप्रयोगों के लिए नि: शुल्क खंडजाणु उत्पन्न करने के लिए इस तकनीक का उपयोग करते समय इसके अलावा, hemozoin दूर करने के लिए विफलता भी हानिकारक हो सकता है.
चित्रा 4 में उल्लिखित, खंडजाणु की संख्या THP-1 कोशिकाओं द्वारा phagocytosis की डिग्री को प्रभावित कर सकते परख करने के लिए जोड़ा. फ्लो merozoite एकाग्रता, सावधान pipetting और खंडजाणु की गणना को दोहराने की गणना के लिए अनुमति देता है हालांकि सटीकता में सुधार के लिए आवश्यक हैं. कई परजीवी लाइनों पक्ष द्वारा साइड का परीक्षण किया जाना है अगर यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है. यह पहले से प्रतिक्रियाओं 23 में गिरावट से पहले पीएनजी से अर्द्ध प्रतिरक्षा बच्चों से प्लाज्मा काफी पतला किया जा सकता है कि प्रदर्शन किया गया है. Phagocyt की बड़ी रेंज का उत्पादन किया है कि 12 वर्षीय पीएनजी बच्चों – 5 की एक पलटन के लिए प्लाज्मा के इष्टतम कमजोर पड़ने (1/120, प्लाज्मा के 000 अंतिम कमजोर पड़ने) यहाँ है वर्णित. (- 19%, 20-39%, 40-59% और 60 – 0 79% phagocytosis) चित्रा 5 में वर्णित Osis प्रतिक्रियाएं इस श्रृंखला को चार समूहों में प्रतिक्रियाओं के स्तरीकरण के लिए अनुमति दी, और प्रतिगमन मॉडलिंग opsonizing प्रतिक्रियाओं के साथ जुड़े थे कि पता चला विभिन्न पलटन के लिए नैदानिक रोग और उच्च घनत्व parasitaemia 10 से सुरक्षा या पता लगाने के स्तर से नीचे संतृप्त नहीं है यह THP-1 कोशिकाओं द्वारा phagocytosis सुनिश्चित करने के लिए प्लाज्मा कमजोर पड़ने समायोजित करने के लिए आवश्यक हो सकता है अध्ययन करता है.
फ्लो माइक्रोस्कोपी पर सुधार सटीकता के साथ तेजी से और quantifiable phagocytosis की अनुमति देता है. इस प्रोटोकॉल एक उच्च throughput, थाली आधारित है और स्वाभाविक रूप से प्राप्त कर लिया humoral रोगक्षमता अध्ययन करने के लिए 96 अच्छी तरह से प्लेटों के अधिग्रहण से स्वचालित है. विधि ऐसे SYBRgreen, DAPI और propidium आयोडीन, झिल्ली दाग या प्रोटीन दाग के रूप में हालांकि वैकल्पिक डीएनए दाग उपयोग किया जा सकता है, ethidium ब्रोमाइड के साथ खंडजाणु की धुंधला की आवश्यकता है. यह परख primar करने के लिए उत्तरदायी होगाभक्षककोशिकीय या FCR जीव विज्ञान ब्याज की थी, तो Y monocytes या neutrophils, और अनुकूलित किया जा सकता है. पीएमए के साथ इन विट्रो में भेदभाव प्राथमिक कोशिकाओं या THP-1 कोशिकाओं मलेरिया और अन्य रोगजनकों 12, 32-34 में phagocytosis अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इन कोशिकाओं को पक्षपाती हैं और भी गैर एंटीबॉडी मध्यस्थता phagocytosis 35 प्रदर्शित हालांकि प्राथमिक कोशिकाओं का उपयोग चुनौतीपूर्ण हो सकता है. इसके अलावा, शुद्धता, व्यवहार्यता और कार्यक्षमता में परिवर्तनशीलता प्राथमिक phagocytic कोशिकाओं का उपयोग करने के लिए कुछ महत्वपूर्ण सीमाएं हैं. Merozoite phagocytosis में शामिल एफसी रिसेप्टर्स uncharacterized बने हुए हैं, और इसलिए विशिष्ट एफसी रिसेप्टर्स के लिए एंटीबॉडी अवरुद्ध phagocytosis merozoite करने के लिए प्रत्येक एफसी रिसेप्टर के योगदान को स्पष्ट कर सकता का उपयोग कर. THP-1 phagocytosis FCR निर्भर करता है, इस मनाया phagocytosis की सीधी व्याख्या में सक्षम बनाता है. यह परख भी स्रोतों के उपयोग के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है जो एंटीबॉडी opsonizing के प्रतिजन विशिष्टता को संबोधित करने के लिए उधार देता हैmerozoite सतह प्रतिजनों के लिए नाक आउट परजीवी izing, या सतह प्रोटीन merozoite को समानता विशुद्ध मानव एंटीबॉडी का उपयोग. इसके अलावा, गहराई में merozoite phagocytosis निम्नलिखित साइटोकाइन प्रतिक्रियाओं की पढ़ाई कमी कर रहे हैं, और इस परख का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है.
इन दोनों तकनीकों कार्यात्मक antimerozoite एंटीबॉडी का अध्ययन करने के लिए काफी अग्रिमों का गठन. उच्च गुणवत्ता खंडजाणु की शुद्धि cryopreserved खंडजाणु, या merozoite एंटीजन के साथ लेपित फ्लोरोसेंट microspheres का उपयोग करने के लिए लाभप्रद है. इस परख स्वाभाविक रूप से प्राप्त कर लिया उन्मुक्ति के मूल्यांकन के लिए एक उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया गया है, यह टीकाकरण के जवाब में प्रतिरोधक क्षमता के अधिग्रहण के समाधान के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण साबित हो सकता है. यह हाल ही में phagocytosis या opsonised खंडजाणु नैदानिक मलेरिया से बचाव के साथ जुड़ा हुआ है कि दिखाया गया है, उस में विवो phagocyto के लिए इन विट्रो THP-1 phagocytosis से सीधा निष्कर्ष निकालना संभव नहीं हैइस परख में phagocytosis रूप खंडजाणु की बहन स्थिर परिस्थितियों में और लाल रक्त कोशिकाओं प्रतिस्पर्धा के अभाव में होता है. इस परख की संभावित रूपांतरों इस प्रकार मलेरिया और merozoite phagocytosis के आगे समझने के लिए एक बहुमुखी उपकरण प्रदान कर सकता है.
The authors have nothing to disclose.
लेखकों बच्चों और वयस्क प्लाज्मा दाताओं, और चिकित्सा अनुसंधान के पापुआ न्यू गिनी संस्थान में स्टाफ स्वीकार करना चाहते हैं. लेखकों के लिए इस तकनीक के विकास के लिए उनके योगदान के लिए एमेंडीन बी Carmagnac, कैथरीन क्यू एनआईई, डैनी डब्ल्यू विल्सन, इवो म्यूएलर और डायना एस हैनसेन का शुक्रिया अदा करना, और रक्त और सीरम पैक के लिए ऑस्ट्रेलियाई रेड क्रॉस शुक्रिया अदा करना होगा. इस काम विक्टोरियन राज्य सरकार आपरेशनल बुनियादी सुविधाओं का समर्थन और ऑस्ट्रेलियाई सरकार NHMRC IRIISS के माध्यम से संभव बनाया गया था. यह काम राष्ट्रीय स्वास्थ्य और चिकित्सा अनुसंधान परिषद द्वारा समर्थित किया गया # 1031212 और # 637,406 अनुदान, और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान का अनुदान # AI089686.
THP-1 cell line | American Type Culture Collection | TIB-202 | |
RPMI-1640 | Gibco | 31800-089 | |
Fetal Calf Serum (FCS) | Invitrogen | 10099-141 | |
2-mercapthoethanol | Sigma-Aldrich | M6250-100ML | Use in Fume Hood |
Pen/Strep Solution (100x) | Sigma | P0781 | |
HEPES | SAFC | 90909C | Cell culture grade |
hypoxanthine | Calbiochem | 4010 | |
Human Serum | Donation from Autralian Red Cross | Available commercially (i.e. Invitrogen) | |
sodium bicarbonate (NaHCO3) | Merck | 1.06329.0500 | |
gentamycin | Pfizer | 61022027 | Injection Quality |
heparin Sodium BP (5000IU/mL) | Pfizer | procine origin | |
Blasticidin S-hydrochloride | Sigma-Aldrich | 15205 | |
D-sorbitol | Sigma-Aldrich | 50-70-4 | |
E64 Protease Inhibitor | Sigma-Aldrich | E3132-10MG | |
KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 98281-100G | Use for phosphate buffer |
Na2HPO4.2H20 | Merck | 10383.4G | Use for phosphate buffer |
Giemsa's azur eosin methylene blue solution | Merck | 1.09204.0500 | 1:10 dilution in 6.7mN Phosphate buffer (make fresh each stain) |
EDTA disodium salt | Merck | 10093.5V | 0.1M, pH 7.2 |
Acrodisc Syringe Filters 1.2-μm/32-mm | Pall Life Sciences | 4656 | |
QuadroMACS Separator (for small column) | MACS Miltenyi BioTec | 130-091-051 | Interchangeable with MidiMACS |
VarioMACS Separator (for large columns) | MACS Miltenyi BioTec | 130-090-282 | |
MACS MultiStand | MACS Miltenyi BioTec | 130-042-303 | |
LS Column (small magnetic column) | MACS Miltenyi BioTec | 130-042-401 | |
large magnetic column | MACS Miltenyi BioTec | 130-041-305 | |
Ethidium Bromide | Bio-Rad | 1510433 | Cytotoxic |
CountBright Absolute Counting Beads | Invitogen | C36950 | |
BD FACSCalibur Flow Cytometer with HTS plate reader | BD Biopsciences | ||
EDTA disodium salt | Merck | 10093.5V | 0.1M, pH 7.2 |
FlowJo cytometry analysis software | Tree Star |