Summary
Измерение функции антител является ключом к пониманию иммунитет к Plasmodium тропической малярии. Этот способ описывает очистку жизнеспособных мерозоитов, и измерение опсонизации зависит от фагоцитоза методом проточной цитометрии.
Abstract
Малярийного плазмодия мерозоитам антигены находятся в стадии разработки в качестве потенциальных вакцин против малярии. Одним из аспектов иммунитета против малярии является удаление свободных мерозоитов из крови фагоцитов. Однако оценки функциональной эффективности мерозоитов конкретных opsonizing антител является сложной задачей в связи с коротким периодом полураспада мерозоитов и изменчивости первичных фагоцитов. Описанный здесь подробно представляет собой способ получения жизнеспособных мерозоитов с использованием ингибитора протеазы E64, и по результатам анализа мерозоитов опсонин-зависимый фагоцитоз с помощью про-клеточной линии моноцитов ТНР-1. E64 предотвращает шизонт разрыв, позволяя развитие мерозоитов, которые выделяются путем фильтрации обработанных шизонтов. Этидий бромид меченые мерозоитов опсонизированным с образцами плазмы человека и добавляли к ТНР-1 клеток. Фагоцитоз оценивается стандартизованного протокола высокой пропускной способности. Жизнеспособные мерозоиты являются ценным ресурсом для оценки НумерOUS аспекты P. тропической биологии, в том числе оценки иммунной функции. Уровень антител, измеренные этом анализе связаны с клинической иммунитета к малярии в естественно облученных лиц. Анализ может также быть полезен для оценки антитела вакцины индуцированных.
Introduction
Важность антител для иммунитета к Plasmodium тропической малярии был показан 40 лет назад, когда иммуноглобулина от гипериммунных взрослых пассивно переданы детям, страдающим от тяжелой малярии в результате облегчено болезни 1. Следовательно, значительные усилия стремились определить цели защитного малярийного иммунитета, в основном за счет измерения титров антител к пептидам или бактериально выраженных белков по ELISA. На основе ИФА серологические также доказала сильно варьирует в разных исследованиях, и не затрагивает функциональность антител 2. Многие антигены малярии вызвать cytophilic IgG1 и профиль антител IgG3, в частности мерозоитам поверхностные антигены 3. Это смещение подкласс предполагает, что антитело-Fc-рецептор (FcR) взаимодействие с фагоцитами важны для эффекторных функций антител opsonizing antimerozoite 4. Несколько вакцин мерозоитам антиген в стадии разработки предназначены длявыявить фагоцитов эффекторные функции 5, 6 и несмотря на значительный доказательства важности антитело-FcR взаимодействий в моделях грызунов малярией существует 7-9, и несколько последних исследований подтверждают важность функциональных антител и функций фагоцитов эффекторных для иммунитета к малярии у человека 10, 11, эта область остается слабо изученным. Исследование в мерозоитов конкретных opsonizing антител был ограничен двумя факторами; трудность в выделении хорошего качества мерозоиты; и переменные ответы фагоцитоз из первичных клеток.
До недавнего времени высокоскоростного центрифугирования или плотности Перколла градиенты не были использованы для выделения мерозоитов из культуральных супернатантов разрыва шизонт культур. Эти мерозоиты редко жизнеспособным, и часто дальнейшие манипуляции плотности центрифугирования и несколько мыть шаги 12, или криоконсервации 11 перед использованием в анализах. Это процессные процессы потенциально отсоединить много периферии, связанные белки с поверхности мерозоитам, белки, известные как антигенные мишени малярийного иммунитета 13. Недавно ингибитор протеазы цистеина транс-Epoxysuccinyl-L-leucylamido (4-гуанидино) бутан (E64) был использован для создания жизнеспособных мерозоитов. E64 предотвращает разрыв шизонт, генерируя мембранные закрытый мерозоитов 14, которые могут быть разрушены путем фильтрации, чтобы освободить жизнеспособных мерозоитов 15, 16. Этот метод приводит к пространственным разрешением многочисленных белков во эритроцитов вторжения 15, 17-19 и прояснил этап специфическое воздействие нескольких противомалярийных препаратов 16, 20. Тем не менее, образование жизнеспособных мерозоитов остается технически сложной задачей. Для помощи в распространении этой методики и применения к функциональных анализов иммунитета, подробного протокола для жизнеспособного очистки мерозоитам и их использование встандартизированный функциональный анализ антител: сотовые сотрудничество в опсонизации и фагоцитоза описан здесь.
Этот метод демонстрирует значительный шаг вперед по сравнению с предыдущими анализами в пробирке мерозоитам опсонизации, таких как нейтрофилов дыхательного взрыва, антитело-зависимой клеточной ингибирования (ADCI), а также альтернативные мерозоитам фагоцитоза анализов. Эти анализы плохо воспроизводимым вследствие изменения паразита входов и деятельности первичных фагоцитов 11, 21. Заражение hemozoin также может глубоко затронуть функции 22 фагоцитов. Недавно сообщили надежные и воспроизводимые мерозоитам фагоцитоз анализ 23 использует promonocytic клеточной линии THP-1 24. Это идеальный тип клеток для высокой пропускной проточной цитометрии анализа как он не является сторонником и, в частности выполняет Fc-рецептор опосредованного фагоцитоза 25, 26. Дополнительная сложность в то время исследоваtigating фагоцитоз является то, что степень фагоцитоза зависит от количества мерозоитов по отношению к ТНР-1 клеток и концентрации в плазме. Для обеспечения воспроизводимости между экспериментов, мерозоиты должны быть пронумерованы и используется данная концентрация. Из-за их небольшого размера, проточной цитометрии количественное требуется.
Описанная здесь процедура удаляет hemozoin и генерирует жизнеспособных мерозоиты, и описывает применение этих мерозоитов для проточной цитометрии перечисления мерозоитов с последующим опсонизации и фагоцитоза. Хотя технически сложных, методы, описанные может оказаться полезным для выяснения вклада конкретных ответов антител мерозоитам поверхностных естественно приобрел и вакцинального иммунитета.
Protocol
Примечание: Все операции, кроме центрифугирования и проточной цитометрии, должны быть произведены в ламинарном боксе для поддержания стерильности. Проверьте, чтобы все меры предосторожности по обращению с образцами человека. Анализ очень чувствительна для малых количеств плазмы. Разведения предоставляемые являются оптимальными для решения ответов, начиная с 5 - 78% с плазмой от полу-иммунных детей из Папуа-Новой Гвинеи (ПНГ). Оптимальное разведение может изменяться в зависимости плазменные наборы проходит испытания, и поэтому рекомендуется, что плазма титроваться определить экспериментальные условия для каждого приложения. Обеспечивать включение 2 отрицательных контролей ТНР-1 клеток с мерозоитов в отсутствие плазмы; и клетки ТНР-1 с мерозоитов опсонизированным с бассейном плазмы от малярии наивных лиц. Это позволит контролировать для мерозоитам приверженности клеток ТНР-1 и для того, чтобы строгий проточной цитометрии стробирования фагоцитоза событий.
Использование образцов PNG плазмы былоутвержден по медицинским исследованиям Консультативного комитета, Папуа-Новая Гвинея Министерства здравоохранения, Уолтера и Элизы комитета института Зал человека этике исследований (код проекта 04/04) по. Письменное согласие было получено от родителей / опекунов всех участников.
1. THP-1 Культура
- Поддержание человека клеточной линии моноцитов ТНР-1 в среде RPMI-1640, дополненной 10% фетальной телячьей сыворотки (FCS) и 55 мкМ 2-mercapthoethanol (ТНР-1 средний) и при 37 ° С в 5% CO 2 увлажненном инкубаторе.
- Поддерживать клетки при плотности ниже 5 х 10 5 клеток / мл. ПРИМЕЧАНИЕ: Чрезмерный приведет к дифференцировке в прикрепленных клеток и понижающей регуляции Fc рецепторов. После того, как клетки были пассировать около 10 раз, оттепель нового флакона для поддержания фенотипа клеток.
2. Подготовка антител Образец и разведение
- Нагревать инактивированную плазмы для тестирования и малярии наивно контроль плазмы путем инкубации при температуре 56 °; С в течение 30 мин
- Серийно разбавить образцы плазмы до 1/2, 000 в ТНР-1 среды.
- Магазин разводили в плазме при -20 ° С.
3. Культура высокосинхронной P. тропической
ПРИМЕЧАНИЕ: GFP-экспрессирующих паразит линия D10-PfPHG 27 был использован в связи с его 48 часами жизненного цикла, которая помогает синхронизацию паразитов, а контролируемый сроки E64 дополнение. Кроме того, поскольку эта линия выражает GFP в цитоплазме, эта линия позволяет обнаружить паразитемией и свободного мерозоитов по обнаружению проточной цитометрии из GFP. Тем не менее, интенсивность флуоресценции GFP не является достаточным, чтобы обеспечить визуализацию в ТНР-1 клеток, и, следовательно, мерозоитов контрастному окрашиванию бромидом этидия (EtBr). Другие паразит штаммы могут быть использованы при условии, что плотно синхронность достижимо. Синхронизация паразитов с использованием комбинации сорбита лечения для лизиса зрелых форм 28 и гепарин ингибирует инвазию 15
- Поддерживать P. тропической Паразиты в О + эритроцитов человека (RBC) на 3% гематокрита в RPMI-1640 среде (рН 7,4) с добавлением 25 мг / мл HEPES, 50 мкг / мл гипоксантин, 10% объединенной человеческой сыворотки, 2 мг / мл бикарбоната натрия и 20 мкг / мл гентамицина (паразит среда). Добавить 5 мг / мл бластицидин S-гидрохлорида в культуральную среду для отбора GFP + паразитов.
- Инкубируйте культур в герметичных коробках или альтернативно с двойным уплотнением культуральных колбах при 37 ° С в атмосфере 1% O 2, 4% CO 2 и 95% N 2.
- Подготовка тонкий слой слайды, фиксируют в 100% метаноле в течение 10 сек, и пятно с 10%-ным раствором Гимзе в 6,7 мМ (рН 7,1) фосфатного буфера (раствор Гимза) в течение 10 мин для мониторинга паразитемии. После окрашивания промыть слайд в воду и воздушно-сухой. Оценка паразитемии с использованием масла погружения объектив 100X.
- Поддерживать паразитов культур на паразитемией ниже 5% инфицированных РБК путем разделения культур и добавление неинфицированныхРБК мере необходимости.
- Для синхронизации с гепарином, добавить 20 МЕ / мл медицинского сорта гепарина звонить-сценические культуры.
- Когда большинство паразитов находятся на стадии шизонта, пеллетах клетки при 300 мкг в течение 5 мин, удалить гепарин-содержащие среду и ресуспендируют в паразита среды, чтобы позволить разрыв шизонт и мерозоитов вторжение.
- Через 4 часа добавляют 20 МЕ / мл гепарина обратно в культурах, блокируя дальнейшее мерозоитов вторжение. Примечание: Может потребоваться несколько циклов сорбита и лечение гепарином до паразиты достаточно синхронизированы. Для создания подходящих количество мерозоитов, подготовить 150 мл паразита культуры на 3 - 5% паразитемией.
4. Выделение поздней стадии P. тропической Трофозоиты
- Тридцать шесть часов после возвращения в гепарин культур, культивируемых клеток гранул при 300 х г в течение 5 мин и ресуспендируют осадок в паразита среде при 25% гематокрита.
- Прикрепите большой магнитной колонку (объем матрица 6,3мл) к магниту, и уравновесить колонку с паразитами среды, убедившись, что все пузырьки воздуха удаляются.
- Добавить ресуспендированные P. тропической культуры в колонну, и отрегулируйте расход одной капле в секунду.
- После того, как культура прошла через колонку, колонку промывают паразита среде пока проточный не станет чистой.
- Элюции паразитов из колонны в 30 мл 37 ° C паразита среды.
- Приготовьте тонкий слой паразитов, фиксируют в 100% метаноле в течение 10 сек, и окрашивают с Гимза растворе в течение 3 мин. Изучите слайд под микроскопом, и убедитесь, что паразиты почти заполнить эритроцит, и, кажется, на ранних стадиях шизонтами. Если паразиты не достигли соответствующего этапа созревания, вернуться очищенные паразитов в инкубаторе 37 ° C в атмосфере на 1% O 2, 4% CO 2 и 95% N 2 до подходящим не разработаны. ПРИМЕЧАНИЕ: за чистоту более чем 90% зараженных эритроцитов требуется для обеспечения RБЦ не загрязняют мерозоитам препараты.
- Treat изолированных шизонты с 10 мкМ E64 (Epoxysuccinyl-L-leucylamido (4-гуанидино) бутан (E64) в течение 6 - 10 часов. Примечание: Более длительные времена инкубации с E64 возможны, однако мерозоитов, производимые больше не будет иметь инвазивными.
5. Выделение P. тропической Мерозоиты
- После инкубации с E64, мазок паразитов, исправить клеток в 100% метаноле и пятно с Гимза раствора для оценки образование мембранных корпусе мерозоитов. ПРИМЕЧАНИЕ: Хороший выход мерозоитов будут получены, если более 50% паразитов сформировали мембранные закрытых мерозоиты.
- Пелле E64 обращению шизонты в 1900 мкг в течение 8 мин. Промыть 50 мл RT RPMI-1640 среде (рН 7,4) с добавлением 25 мг / мл HEPES, 50 мкг / мл гипоксантин, 2 мг / мл бикарбоната натрия и 20 мкг / мл гентамицина (мыть среде), чтобы удалить остатки человеческой сыворотки .
- Ресуспендируют гранул в 2 мл промывочной среды. ПРИМЕЧАНИЕ: Использование ФТС содержащих ТНР-1 СМИ будет производить вспенивания в процессе фильтрации.
- Фильтрация 2 мл ресуспендировали E64-шизонтов через 1,2 μm/32 мм шприцевой фильтр. Сбор фильтрата в 10 мл пробирку. ПРИМЕЧАНИЕ: фильтрат содержит мерозоиты и кристаллы hemozoin, с не-разрыв шизонтов и мусора, собранных в фильтре.
- Присоединить небольшое магнитное колонки к магниту, и в равновесие с 500 мкл ТНР-1 среды.
- Pass фильтрата над магнитной колонки. Соберите проточные. ПРИМЕЧАНИЕ: Hemozoin будет связываются с колонкой, в то время как мерозоиты пройдет через.
- Передайте проточные через колонку еще два раза, чтобы удалить hemozoin, собирая поток через каждый раз.
- Промыть колонку 2 мл RT ТНР-1 среды для сбора любых оставшихся мерозоитов.
- Добавить EtBr в концентрации 10 мкг / мл (конечная концентрация) и красителем в течение 30 мин при комнатной температуре. Защита от света, чтобы предотвратить фотообесцвечивания. Примечание: Убедитесь, что все EtBr загрязненная жидкость и рLastic отходы удаляются в манере, подходящей для цитотоксических химических веществ. Мерозоиты не больше не инвазивной После этой инкубации.
- Спином вниз мерозоиты в 4000 мкг в течение 10 мин.
- Удалите супернатант в соответствующий контейнер для отходов.
- Ресуспендируют осадок мерозоитов в 4 мл ТНР-1 среды, и спин вниз в 4000 х г в течение 10 мин.
- Добавить ТНР-1 среды до объема 15 мл и защиты от света.
6. Количественная мерозоитов Концентрация с помощью проточной цитометрии
- Принесите считая бусы до комнатной температуры.
- Подготовка PBS с 0,5% БСА для разбавления мерозоитов.
- Всего мерозоиты на 3 разведения; 1 из 100; 1 в 50 и 1 в 25. Подготовка 3 FACS труб с 940, 930 и 910 мкл PBS 0,5% BSA, соответственно. Добавить 10, 20 и 40 мкл очищенных мерозоитов на пробирку, соответственно.
- Подсчета Vortex шарики для 30 сек, и добавить 50 мкл шариков на FACS пробирку, содержащую разводненной мерозоиты.
- Запустите три DILОбразцы uted мерозоитов на проточном цитометре оснащен 488 нм лазера. Установить строгий ворота для мерозоитов на основе EtBr и флуоресценции GFP двухполосной флуоресценции и подсчета ворота бисером по флуоресценции в отдельном канале. Приобретать события до 2000 бисер не собираются. Примечание: Эти инструкции относятся к подсчету GFP + мерозоиты, которые были против, окрашенных EtBr. Если не использует GFP выражения паразитов затем задать мерозоитам ворота, основанные на боковом рассеивании и флуоресценции EtBr.
- Определить соотношение количества мерозоитов: бусы путем деления количества мерозоитов событий на счетных бортовых событий 2000, вычислить коэффициент для каждого разведения. Использование спецификаций пакетных подсчета шарик, чтобы определить количество гранул в 50 мкл шариков добавили в трубки.
- Умножьте количество шариков в 50 мкл на коэффициент разбавления и мерозоита: шарик соотношение для этого фактор разведения. Это число соответствует концентрации мерозоитов на мл. Выполните тыс.ESE шаги для каждого разведения.
- Среднее значение на основании концентрации мерозоитам измеренные по трем разведения. ПРИМЕЧАНИЕ: стандартные отклонения, превышающие 10% для концентраций, определенных для 1 в 100, 1 в 50, и 1 в 25 разведения указывают технические неточности в подготовке образцов подсчета.
- Ресуспендируют мерозоитов в 8 × 10 6 мерозоитов / мл в ТНР-1 среды, чтобы обеспечить конечное соотношение четырех мерозоитов в ТНР-1 клетки. ПРИМЕЧАНИЕ: Другое мерозоитам в ТНР-1 коэффициентов могут быть использованы, и концентрация должна быть соответствующим образом изменены.
7. Фагоцитоз Анализ
- Добавить 200 мкл тепла неактивных ФТС на лунку 96 хорошо U-листов днища, и оставить при комнатной температуре O / N, чтобы блокировать пластины. После инкубации удалить FCS и мыть скважин в два раза с 200 мкл стерильной PBS. Удаление PBS и хранить пластины при 4 ° С до использования.
- Подсчитать количество клеток ТНР-1, необходимых для тестирования образцов плазмы и элементов управления, что позволяет три лунки на образец на 1 х 10
- Определите ТНР-1 концентрации культуры путем загрузки 10 мкл культуры на гемоцитометра слайда. Подсчитайте количество клеток, присутствующих в 4 наборов 16 угловых квадратов гемоцитометра под микроскопом, то в среднем счетчики. Умножьте среднюю счет на 10000, чтобы вычислить количество клеток на мл.
- Спин вниз требуемое количество клеток ТНР-1 при 500 мкг в течение 5 мин и ресуспендируют в 6,7 х 10 5 клеток / мл в ТНР-1 среды.
- Добавить 150 мкл клеток ТНР-1 в ТНР-1 среды на лунку в FCS-блокированного 96 и U-нижней пластине, в результате чего 10 5 клеток / лунку. Подготовьте 3 скважины на образец, что будут протестированы. Вернуться пластину не в инкубатор до готовности добавить мерозоиты.
- Добавить 150 мкл подготовки мерозоитам в 8 х 10 6 / мл на лунку в отдельную FCS-блокированного 96 хорошо U-нижней пластине. Подготовить одну скважину на испытуемого образца
- Добавить 10 мкл подготовленных разбавленных образцах плазмы на лунку, тон пластину, которая содержит мерозоитов, и хорошо перемешать, чтобы обеспечить гомогенного раствора.
- Извлеките ТНР-1 пластины из инкубатора, а также добавить 50 мкл раствора мерозоитов / плазмы в лунку, содержащую клетки ТНР-1, с трех лунок на образец плазмы.
- Все хорошо перемешать и инкубировать при 37 ° С в 5% СО 2, увлажненном инкубаторе в течение 40 мин. Накрыть фольгой для защиты от света.
- После 40 мин, образцы центрифуг в течение 5 мин при 500 х г в 4 ° С prechilled центрифуги арестовать фагоцитоз.
- Удалить супернатант и промыть клетки дважды в охлажденном льдом PBS +0,5% БСА +2 мМ ЭДТА (FACS буфера). Примечание: ЭДТА будет способствовать поддержанию однородной клеточной суспензии для проточной цитометрии.
- Исправить клеток в 90 мкл 2% параформальдегида (PFA) в PBS +0,5% БСА +2 мМ ЭДТА (FACS фиксатор). Оставьте на льду до приобретения, защищенном от света месте.
8. Проточной цитометрии
- Получить образцы использованием проточного цитометра оборудованной Wiго лазера на 488 нм и высокой пропускной привязанность планшет-ридер. ПРИМЕЧАНИЕ: Это позволит до 400 образцов плазмы для тестирования от одного препарата мерозоитам. Клетки также могут быть переданы в трубах для ручной загрузки образца.
- Gate жизнеспособные клетки ТНР-1 по вперед и SS.
- Установите EtBr положительный ворота на основе «ТНР-1 клеток с мерозоитов и ни плазма" контроля.
- Приобретать минимум 10000 событий в образце.
9. Анализ данных
- Анализ данных с помощью проточной цитометрии программного обеспечения для анализа, и установить строгие ворота для EtBr позитивных событий.
- Рассчитывается процент фагоцитоза для каждого образца:% от EtBr + клеток для образца минус% положительных клеток с неиммунной плазмы.
- Средние результаты по трем образцам. ПРИМЕЧАНИЕ: Стандартные отклонения для трех экземплярах, превышающей 10% указывают экспериментальные неточности. Некоторые фоновые EtBr положительные события могут наблюдаться в результате merozoiТе адгезии к поверхности клеток ТНР-1, но должно быть одинаковым во всех образцах, содержащих мерозоитов. Установка ворот на основе «ТНР-1 клеток с мерозоитов и ни плазма" управления, а затем вычитая любой фон из «ТНР-1 клеток с неиммунной плазмы" контроля приведет% фагоцитоза, который отражает флуоресценции из-за усвоены / фагоцитированы только мерозоиты.
Representative Results
Период созревания паразитов до начала лечения E64 имеет решающее значение для создания мембранных закрытой мерозоиты. Рисунок 1AI показывает соответствующий этап созревания шизонтов для добавления E64. Паразиты должны быть большими и почти заполнить эритроцит. Пятнистый появление Гимза показывает мерогонии началось, и E64 следует добавить, чтобы получить мембранные закрытой мерозоиты (Рисунок 1Aii). Если E64 добавляется ранее трофозоита стадии паразитов, мембранные, заключенные мерозоиты не создаются даже после 12 часов от E64. Вместо паразиты взять на аномальную морфологию, таких как расширения пищеварительной вакуоли (рис. 1Bi и 1Bii) и мерозоитов не образуются. Если E64 позже будет добавлен к шизонтов, мембранные закрытой мерозоиты не создаются как разрыв шизонт является раскованный (рис. 1CI и 1Cii). Высокий уровень паразита синхронности требуется, другоймудрый выбор всех трех результатов, описанных будет видно после лечения E64.
Удаление hemozoin является еще одним важным шагом для очистки мерозоитов. Если мерозоитов не очищен от hemozoin затем мерозоитов-hemozoin кластеры образуют которые не могут быть смещены с помощью пипетки. Эти агрегаты работают на цитометр как единичных событий, хотя и с разными прямого рассеяния и боковые разброс характеристик, чем отдельные мерозоитов, в результате неточной подсчета мерозоитам с помощью проточной цитометрии (рис. 2А). Как клетки ТНР-1 также может фагоцитируют hemozoin эти мерозоитам-hemozoin кластеры могут быть также фагоцитированы (рис. 2б). Эти агрегаты обладают высокой EtBr флуоресцентный как они содержат несколько мерозоитов. Фагоцитоз агрегатов приводит к ТНР-1 Профиль флуоресценции EtBr эквивалентной что наблюдается для фагоцитоза нескольких отдельных мерозоитов. Следовательно, если hemozoin не удаляется, EtBr флуоресценции клеток ТНР-1 будет оverestimate из opsonizing потенциала для плазмы проходит испытания. Hemozoin Также сообщается, существенно изменить функцию фагоцитов. GFP положительные мерозоиты счетчик окрашивали EtBr увеличить визуализацию мерозоитов фагоцитированы клеток ТНР-1. Использование условий, описанных в этом протоколе, все GFP положительные мерозоиты контрастно с EtBr который имеет более яркий интенсивности флуоресценции (рис. 3А). Оценка Фагоцитоз по флуоресценции EtBr обеспечивает исключительную разрешение мерозоитам фагоцитоза, чем GFP флуоресценции (рис. 3В).
Количество мерозоитов, добавленных в анализе будет модулировать количество фагоцитоза наблюдалось. По этой причине точный подсчет с помощью проточной цитометрии имеет решающее значение. Увеличение соотношения мерозоитов: ТНР-1 приведет к увеличению адгезии мерозоитов к ТНР-1 клеток в отсутствие плазмы (фиг.4А). Увеличение мерозоитов: ТНР-1 коэффициенты также приводит к увеличению телответы agocytosis когда мерозоиты опсонизированным (рис. 4В). 4:01 мерозоитам: ТНР-1 отношение рекомендуется для надежных фагоцитарных ответов. Используя этот коэффициент, и разбавление плазмы указанного, этот анализ способен решить низкие, промежуточные и высокие уровни opsonizing антител. Между 0 и 78 процентов ответов фагоцитоз наблюдались с помощью образцов плазмы PNG и другие условия, описанные. Такие ответы были недавно показаны связать с естественным приобретенного клинической иммунитета к малярии 10. Рисунок 5 показывает примеры 4 квартили фагоцитоза ответов PNG лиц.
Рисунок 1. Сроки E64 дополнение имеет решающее значение для создания мембранных закрытой мерозоиты. (А) Подходит maturatio. п этап паразитов я) до начала лечения E64, и б) мембранные закрытой мерозоиты произведенные после 6 часов лечения E64 (B) мембранные заключенные мерозоиты не создаются, если E64 добавляется незрелых паразитов; я) поздней стадии трофозоиты и II) после 12 часов от E64 (С) шизонт разрыв не препятствует, если E64 добавляется поздно сегментирован шизонты.; я) поздней стадии шизонты, и б) после 6 часов от E64. Шкала бар составляет 10 мкм.
Рисунок 2. Удаление Hemozoin имеет решающее значение для создания одноклеточных мерозоитов подвески. Мерозоитов-hemozoin агрегаты форме после фильтрации мембранных закрытых мерозоитов, если hemozoin не магнитно отделена от мерозоитов. (А) прямого рассеяния и боковые разброс участков мерозоитов с hemozoin удаленыи hemozoin сохраняется. (B) Hemozoin-мерозоитов агрегаты могут быть фагоцитированы ТНР-1 клеток. Разница-Быстрый окрашенные цито-спиновые слайды ТНР-1 клеток, инкубированных с PNG опсонизированным плазмой мерозоитам препараты с или без hemozoin. Шкала бар составляет 10 мкм.
Рисунок 3. Окрашивание этидийбромида позволяет для превосходной разрешением мерозоитам фагоцитоза. D10-GFP очищенные мерозоиты контрастно с EtBr улучшить интенсивность флуоресценции. (А) методом проточной цитометрии histrogram очищенных мерозоитов с стробирования на GFP положительных мерозоитов, и дот-блот показывая EtBr флуоресценции в этом закрытом GFP положительного населения. (В) вперед разброс по сравнению с GFP и вперед разброс по сравнению с EtBr из клеток ТНР-1 следующим фагоцитоза GFP и EtBr двойных люминесцентных мерозоитов. Гейтс были г Rawn на основе клеток ТНР-1 с мерозоитов без контроля плазмы.
Рисунок 4 мерозоитов. THP-1 соотношение влияет на степень фагоцитоза наблюдалось. (A) Пять мерозоитов: ТНР-1 изображены показатели; 50:1, 20:1, 10:1, 4:1, 1:1. Клетки только контроль указывает фоновой флуоресценции из-за ТНР-1 клеток. THP-1 EtBr флуоресценции для каждого соотношения показан для мерозоитов опсонированных с пулом PNG плазмы или с неиммунной австралийской плазме (B) средней интенсивности флуоресценции из THP-1 клеток для различных мерозоитов. ТНР-1 коэффициентов, и опсонизация с бассейном из PNG плазме или неиммунной Австралии плазме (в среднем + SEM). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5. Большой диапазон opsonizing антител могут быть измерены. Мерозоитов опсонизированным плазмой из PNG лиц и инкубировали с ТНР-1 клеток. Четыре представительные ответы фагоцитоз показаны. Гейтс были сделаны на основе клеток ТНР-1 с мерозоитов без контроля плазмы, и цифры обозначают% фагоцитоз после вычитания клеток ТНР-1 с неиммунной контроля плазмы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Discussion
Для измерения мерозоитов фагоцитоз, знание двух методов требуется: очистку мерозоитов и ТНР-1 фагоцитоза анализа. Наиболее важные шаги для объединения этих двух методов являются: 1) Высоко синхронизированные паразиты; 2) Добавление E64 в нужное время, получая мембранные закрытых мерозоиты; 3) Удаление hemozoin чтобы избежать агрегатов; 4) Точная подсчета с помощью проточной цитометрии мерозоитам; 5) разбавление плазмы используется; и 6) поддержание низкой плотности клеток и проход количество клеток ТНР-1. Тщательное рассмотрение этих ключевых аспектов обеспечит наблюдаются устойчивые ответы фагоцитоз.
Хотя описанная здесь является получение мерозоитов для оценки фагоцитоз, методика может быть использована для широкого диапазона приложений. Независимо от вниз методологии потока, оптимальные препараты мерозоитам зависит от правильно ремень E64 дополнение в целях получения мерозоиты. Способ E64 описано здесь было показано, что уIELD инвазивных мерозоиты для использования в микроскопия высокого разрешения инвазионных событий и анализов чувствительности наркотиков 15-20. В то время как мерозоитов жизнеспособность не является необходимым для фагоцитоза, целостность мерозоитов поверхности покрытия не требуется. Поэтому метод, описанный здесь E64 позволяет высокое качество мерозоитов быть произведены для оценки реакции антител на поверхности покрытия. Как указано на рисунке 1, если E64 добавляется слишком рано или слишком поздно мембранные заключенные мерозоиты не образуются. По этой причине, очень синхронные культуры паразита требуется. Здесь, использование сорбита и гепарина лечения, чтобы плотно синхронизировать D10-GFP паразитов культур к окну 2 ч описано. Гепарин может способствовать gametocytogenesis в других лаборатория изолирует, и, следовательно, следует использовать осторожно. Альтернативные способы синхронизации, такие как аланин также может быть использован при условии, что плотно синхронизированные паразиты получают 29. Если E64 добавляется в асинхронных паразитов, низшую пропortion мембранных закрытой мерозоитов будут выпускаться и остальные паразит-инфицированных РБК либо разрыв обычно или развивать аномальную морфологию. Наличие паразитов, которые не превратились в мембранных заключены мерозоитов приведет к засорению фильтра и значительно уменьшить выход мерозоитов полученное.
В процессе фильтрации мембранных закрытой мерозоитов, hemozoin освобождается от пищеварительных вакуолей и присутствует в виде свободных кристаллов в растворе. Hemozoin весьма провоспалительные и, как сообщалось, модулировать моноцитов и фагоцитоз макрофагов ответов 30, 31. В дополнение к модуляции фагоцитоз, как показано на рисунке 2, hemozoin могут образовывать агрегаты с мерозоитов в растворе. Как клетки ТНР-1 может фагоцитируют эти агрегаты, это может быть одним из основных confounder для решения опосредованной антителами фагоцитоза. Таким образом, удаление hemozoin необходимо в этом анализе А. В.подъязычная дополнительная сложность hemozoin на фагоцитов биологии. Кроме того, отказ удалить hemozoin может также вредно при использовании этого метода для создания свободной мерозоиты для других приложений, особенно там, где требуется мерозоитам количественное.
Как указано на рисунке 4, количество мерозоитов добавлен в анализе могут влиять на степень фагоцитоза клеток ТНР-1. Хотя проточной цитометрии позволяет перечисления концентрации мерозоитам, тщательного пипетки и повторить подсчет мерозоитов необходимы для повышения точности. Это особенно важно, если несколько строк паразитов должны быть проверены бок-о-бок. Ранее было показано, что плазма от полу-иммунных детей из PNG может быть значительно ослаблены перед ответы снижаться 23. Описанный здесь является оптимальным разбавление плазмы (1/120, 000 Конечное разведение плазмы) для когорты 5 - 12-летними детьми PNG, которая привела к большой диапазон phagocyt. ответы Осис, описанные на рисунке 5 Этот диапазон позволило стратификации ответов на четыре группы (0 - 19%, 20 - 39%, 40 - 59% и 60 - 79% фагоцитоза), и регрессионное моделирование показало, что opsonizing ответы были связаны с защита от клинической картины заболевания и высокой плотности паразитемией 10 Для различных групповых исследований это может быть необходимо отрегулировать разбавление плазмы для обеспечения фагоцитоз клеток ТНР-1 не насыщен или ниже уровня обнаружения.
Проточной цитометрии позволяет быстро и количественно фагоцитоз с повышенной точностью по микроскопии. Этот протокол является высокая пропускная способность, плиты на основе и автоматизированных приобретение 96-луночные планшеты для изучения естественно приобретенный гуморальный иммунитет. Метод требует окрашивания мерозоитов с этидийбромидом, однако альтернативные пятна ДНК, такие как SYBRgreen, DAPI и пропидия йода, мембранных пятен или белковых пятен могут быть использованы. Этот анализ будет поддаются Primarу моноциты или нейтрофилы, и могут быть адаптированы, если фагоцитов или FcR биология представляет интерес. Первичные элементы или ТНР-1 клетки, дифференцированные в пробирке с PMA может быть использован для изучения фагоцитоза в малярии и других патогенов 12, 32-34. Однако с помощью первичных клеток может оказаться непростой задачей, поскольку эти клетки являются приверженцем а также отображать не-антитела опосредованной фагоцитоз 35. Кроме того, различия в чистоте, жизнеспособности и функциональности некоторые ключевые ограничения к применению первичных фагоцитов. Рецепторы Fc, участвующие в мерозоитам фагоцитоза остаются неохарактеризованной, и, следовательно, с помощью блокирующих антител к конкретным Fc рецепторов может выяснить вклад каждого Fc рецептора к мерозоитам фагоцитоз. Как ТНР-1 фагоцитоз FcR зависит, это позволяет простой интерпретации фагоцитоза наблюдается. Этот анализ также поддается решению антигенную специфичность opsonizing антитела, которые могут быть достигнуты с помощью UtilИзинга нокаут-паразитов для мерозоитов поверхностных антигенов, или с использованием аффинно-очищенные человеческие антитела к мерозоитам поверхностные белки. Кроме того, в глубине исследования реакций цитокинов следующие мерозоитов фагоцитоза отсутствуют, и может быть достигнуто с помощью этого теста.
Эти две технологии являются значительные успехи в изучение функциональных antimerozoite антител. Очистку высококачественных мерозоитов выгодно используя криоконсервированных мерозоиты, или флуоресцентные микросферы, покрытые мерозоитов антигенов. Хотя этот анализ был использован в качестве инструмента для оценки естественно приобретенный иммунитет, это может оказаться важным инструментом для решения о приобретении иммунитета в ответ на вакцинацию. В то время как это было недавно показано, что фагоцитоз или opsonised мерозоиты связано с защитой от клинической малярии, это не возможно, чтобы привлечь прямые выводы из в пробирке ТНР-1 фагоцитоза в естественных условиях phagocytoлиз мерозоитов, как фагоцитоз в этом анализе происходит в статических условиях и в отсутствие конкурирующих эритроциты. Потенциальные адаптации этого анализа могут таким образом обеспечивают универсальный инструмент для дальнейшего понимания малярии и мерозоитам фагоцитоза.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы хотели бы выразить признательность детей и взрослых доноров плазмы и персонал в Папуа-Новая Гвинея Института медицинских исследований. Авторы хотели бы поблагодарить Амандин B Carmagnac, Кэтрин Q Nie, Дэнни W Уилсон, Иво Мюллер и Диана S Хансен за их вклад в развитие этой техники, и поблагодарить Австралийский Красный Крест для крови и сыворотки упаковках. Эта работа стала возможной благодаря викторианской правительства штата операционной инфраструктуры поддержки и правительства Австралии NHMRC IRIISS. Эта работа была поддержана Национальным здравоохранения и медицинского исследовательского совета предоставляет # 1031212 и # 637406, и Национальные институты здравоохранения грант # AI089686.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| THP-1 cell line | American Type Culture Collection | TIB-202 | |
| RPMI-1640 | Gibco | 31800-089 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Invitrogen | 10099-141 | |
| 2-mercapthoethanol | Sigma-Aldrich | M6250-100ML | Use in Fume Hood |
| Pen/Strep Solution (100x) | Sigma | P0781 | |
| HEPES | SAFC | 90909C | Cell culture grade |
| Hypoxanthine | Calbiochem | 4010 | |
| Human Serum | Donation from Australian Red Cross | Available commercially (i.e. Invitrogen) | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Merck | 1.06329.0500 | |
| Gentamycin | Pfizer | 61022027 | Injection Quality |
| Heparin Sodium BP (5000 IU/ml) | Pfizer | Porcine origin | |
| Blasticidin S-hydrochloride | Sigma-Aldrich | 15205 | |
| D-Sorbitol | Sigma-Aldrich | 50-70-4 | |
| E64 Protease Inhibitor | Sigma-Aldrich | E3132-10MG | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 98281-100G | Use for phosphate buffer |
| Na2HPO4.2H20 | Merck | 10383.4G | Use for phosphate buffer |
| Giemsa's azur eosin methylene blue solution | Merck | 1.09204.0500 | 1:10 dilution in 6.7 mN Phosphate buffer (make fresh each stain) |
| EDTA disodium salt | Merck | 10093.5V | 0.1 M, pH 7.2 |
| Acrodisc Syringe Filters 1.2-μm/32-mm | Pall Life Sciences | 4656 | |
| QuadroMACS Separator (for small column) | MACS Miltenyi BioTec | 130-091-051 | Interchangeable with MidiMACS |
| VarioMACS Separator (for large columns) | MACS Miltenyi BioTec | 130-090-282 | |
| MACS MultiStand | MACS Miltenyi BioTec | 130-042-303 | |
| LS Column (small magnetic column) | MACS Miltenyi BioTec | 130-042-401 | |
| Large magnetic column | MACS Miltenyi BioTec | 130-041-305 | |
| Ethidium Bromide | Bio-Rad | 1510433 | Cytotoxic |
| CountBright Absolute Counting Beads | Invitogen | C36950 | |
| BD FACSCalibur Flow Cytometer with HTS plate reader | BD Biosciences | ||
| EDTA disodium salt | Merck | 10093.5V | 0.1 M, pH 7.2 |
| FlowJo cytometry analysis software | Tree Star |
References
- Cohen, S., McGregor, I. A., Carrington, S. Gamma-globulin and acquired immunity to human malaria. Nature. 192, 733-737 (1961).
- Fowkes, F. J. I., Richards, J. S., Simpson, J. A., Beeson, J. G. The relationship between anti-merozoite antibodies and incidence of Plasmodium falciparum malaria: A systematic review and meta-analysis. PLoS Medicine. Medicine, P. L. oS. 7, (2010).
- Bouharoun-Tayoun, H., Attanath, P., Sabchareon, A., Chongsuphajaisiddhi, T., Druilhe, P. Antibodies that protect humans against Plasmodium falciparum blood stages do not on their own inhibit parasite growth and invasion in vitro, but act in cooperation with monocytes. The Journal of experimental medicine. 172, 1633-1641 (1990).
- Jafarshad, A., et al. A novel antibody-dependent cellular cytotoxicity mechanism involved in defense against malaria requires costimulation of monocytes FcgammaRII and FcgammaRIII. Journal of immunology. 178, Baltimore, MD. 3099-3106 (1950).
- Genton, B., et al. A recombinant blood-stage malaria vaccine reduces Plasmodium falciparum density and exerts selective pressure on parasite populations in a phase 1-2b trial in Papua New Guinea. The Journal of Infectious Diseases. 185, 820-827 (2002).
- Sirima, S. B., Cousens, S., Druilhe, P. Protection against malaria by MSP3 candidate vaccine. The New England journal of medicine. 365, 1062-1064 (2011).
- Llewellyn, D., et al. Assessment of antibody-dependent respiratory burst activity from mouse neutrophils on Plasmodium yoelii malaria challenge outcome. Journal of leukocyte biology. , (2013).
- McIntosh, R. S., et al. The importance of human FcgammaRI in mediating protection to malaria. PLoS pathogens. 3, 72 (2007).
- Pleass, R. J., et al. Novel antimalarial antibodies highlight the importance of the antibody Fc region in mediating protection. Blood. 102, 4424-4430 (2003).
- Hill, D. L., et al. Opsonizing Antibodies to P. falciparum Merozoites Associated with Immunity to Clinical Malaria. PLoS One. 8, (2013).
- Joos, C., et al. Clinical Protection from Falciparum Malaria Correlates with Neutrophil Respiratory Bursts Induced by Merozoites Opsonized with Human Serum Antibodies. PLoS ONE. 5, (2010).
- Kumaratilake, L. M., Ferrante, A. Opsonization and phagocytosis of Plasmodium falciparum merozoites measured by flow cytometry. Clinical and diagnostic laboratory immunology. 7, 9-13 (2000).
- Richards, J. S., et al. Identification and Prioritization of Merozoite Antigens as Targets of Protective Human Immunity to Plasmodium falciparum Malaria for Vaccine and Biomarker Development. The Journal of Immunology. , (2013).
- Salmon, B. L., Oksman, A., Goldberg, D. E. Malaria parasite exit from the host erythrocyte: a two-step process requiring extraerythrocytic proteolysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 271-276 (2001).
- Boyle, M. J., et al. Isolation of viable Plasmodium falciparum merozoites to define erythrocyte invasion events and advance vaccine and drug development. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, 14378-14383 (2010).
- Wilson, D. W., Langer, C., Goodman, C. D., Mcfadden, G. I., Beeson, J. G. Defining the timing of action of anti-malarial drugs against Plasmodium falciparum. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 1-46 (2013).
- Angrisano, F., et al. Spatial Localisation of Actin Filaments across Developmental Stages of the Malaria Parasite. PLoS ONE. 7, (2012).
- Riglar, D. T., et al. Super-resolution dissection of coordinated events during malaria parasite invasion of the human erythrocyte. Cell Host and Microbe. 9, 9-20 (2011).
- Zuccala, E. S., et al. Subcompartmentalisation of Proteins in the Rhoptries Correlates with Ordered Events of Erythrocyte Invasion by the Blood Stage Malaria Parasite. PLoS ONE. 7, (2012).
- Marapana, D. S., et al. Malaria Parasite Signal Peptide Peptidase is an ER-Resident Protease Required for Growth but not for Invasion. Traffic. 13, 1457-1465 (2012).
- Rzepczyk, C. M., Lopez, J. A., Anderson, K. L., Alpers, M. P. Investigation of the effect of monocytes with Papua New Guinea sera on Plasmodium falciparum in culture. International Journal for Parasitology. 18, 401-406 (1988).
- Schofield, L., Mueller, I. Clinical immunity to malaria. Curr Mol Med. 6, 205-221 (2006).
- Hill, D. L., et al. Efficient measurement of opsonizing antibodies to Plasmodium falciparum merozoites. PLoS ONE. 7, (2012).
- Tsuchiya, S., et al. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1). International journal of cancer Journal international du cancer. 26, 171-176 (1980).
- Ackerman, M. E., et al. A robust, high-throughput assay to determine the phagocytic activity of clinical antibody samples. Journal of Immunological Methods. 366, 8-19 (2011).
- Ataíde, R., et al. Using an Improved Phagocytosis Assay to Evaluate the Effect of HIV on Specific Antibodies to Pregnancy-Associated Malaria. PLoS ONE. 5, (2010).
- Wilson, D. W., Crabb, B. S., Beeson, J. G. Development of fluorescent Plasmodium falciparum for in vitro growth inhibition assays. Malar J. 9, 152 (2010).
- Lambros, C., Vanderberg, J. P. Synchronization of Plasmodium falciparum erythrocytic stages in culture. J Parasitol. 65, 418-420 (1979).
- Braun-Breton, C., Rosenberry, T. L., da Silva, L. P. Induction of the proteolytic activity of a membrane protein in Plasmodium falciparum by phosphatidyl inositol-specific phospholipase. C. Nature. 332, 457-459 (1988).
- Jaramillo, M., Godbout, M., Olivier, M. Hemozoin induces macrophage chemokine expression through oxidative stress-dependent and -independent mechanisms. J Immunol. 174, 475-484 (2005).
- Schofield, L., Tachado, S. D. Regulation of host cell function by glycosylphosphatidylinositols of the parasitic protozoa. Immunology and cell biology. 74, 555-563 (1996).
- Khusmith, S., Druilhe, P., Gentilini, M. Enhanced Plasmodium falciparum merozoite phagocytosis by monocytes from immune individuals. Infection and immunity. 35, 874-879 (1982).
- Lunov, O., et al. Differential uptake of functionalized polystyrene nanoparticles by human macrophages and a monocytic cell line. ACS. 5, 1657-1669 (2011).
- Tebo, A. E., Kremsner, P. G., Luty, A. J. Fcgamma receptor-mediated phagocytosis of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes in vitro. Clinical and experimental immunology. 130, 300-306 (2002).
- McGilvray, I. D., Serghides, L., Kapus, A., Rotstein, O. D., Kain, K. C. Nonopsonic monocyte/macrophage phagocytosis of Plasmodium falciparum-parasitized erythrocytes: a role for CD36 in malarial clearance. Blood. 96, 3231-3240 (2000).
