Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

טיהור תשואה גבוהה של Published: July 17, 2014 doi: 10.3791/51590
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2
1Division of Infection and Immunity, Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research, 2Department of Medical Biology, University of Melbourne

Summary

מדידת פונקצית נוגדן היא מפתח להבנה חסינות למלרית falciparum Plasmodium. שיטה זו מתארת ​​את הטיהור של merozoites קיימא, ומדידה של phagocytosis opsonization תלוי על ידי cytometry זרימה.

Abstract

אנטיגנים merozoite falciparum Plasmodium נמצאים בפיתוח כחיסון למלריה פוטנציאלית. היבט אחד של חסינות מפני מלריה הוא הסר של merozoites החופשי מהדם על ידי תאי phagocytic. עם זאת הערכת היעילות התפקודית של נוגדנים ספציפיים opsonizing merozoite היא מאתגרת בשל זמן מחצית החיים קצרים של merozoites וההשתנות של תאי phagocytic עיקריים. תאר בפירוט במסמך זה שיטה ליצירה merozoites קיימא באמצעות מעכבי פרוטאז E64, וassay של merozoite phagocytosis opsonin תלוי באמצעות שורת התאים פרו monocytic THP-1. E64 מונע קרע schizont תוך מתן אפשרות לפיתוח של merozoites אשר שוחרר על ידי סינון של schizonts טופל. merozoites רומיד Ethidium שכותרתו opsonized עם דגימות פלזמה אנושיות, והוסיף לTHP-1 תאים. Phagocytosis נבחנים על ידי פרוטוקול תפוקה גבוהה סטנדרטי. merozoites קיימא הוא משאב יקר ערך להערכת numerהיבטים מפוקפקים של פ הביולוגיה falciparum, כולל הערכה של תפקוד מערכת החיסון. רמת נוגדנים שנמדדה על ידי assay זה קשור עם חסינות קלינית למלריה באנשים שנחשפו באופן טבעי. Assay יכול להיות גם שימוש להערכת נוגדני חיסון מושרה.

Introduction

החשיבות של נוגדנים לחסינות למלרית falciparum Plasmodium הוצגה לפני 40 שנה, כאשר אימונוגלובולינים ממבוגרי ההיפר הועברו באופן פסיבי לילדים הסובלים ממלריה חמורה וכתוצאה מכך המחלה להקל 1. כתוצאה מכך, מאמץ ניכר בקש לזהות מטרות של חסינות מלריה מגן, בעיקר באמצעות מדידת טיטר נוגדנים לפפטידים או חלבונים הביעו bacterially ידי ELISA. סרולוגיה מבוססת ELISA הוכיחה גם משתנה מאוד בין לימודים, ואינה מתייחסת לנוגדנים פונקציונלי 2. אנטיגנים מלריה רבים לגרום IgG1 cytophilic ופרופיל נוגדן IgG3, במיוחד פני השטח אנטיגנים merozoite 3. הטיה תת הדבר מצביעה על כך אינטראקציות נוגדן-FC-קולטן (FCR) עם phagocytes חשובות לפונקציות מפעיל של opsonizing נוגדני antimerozoite 4. חיסוני אנטיגן merozoite כמה בפיתוח נועדולעורר פונקציות תא בלען מפעיל 5, 6 ולמרות שראיות משמעותיות לחשיבות של אינטראקציות הנוגדן-FCR במודלים של מלריה מכרסם קיימים 7-9, וכמה מחקרים שנעשה לאחרונה תומכים בחשיבות של נוגדנים פונקציונליים ופונקציות מפעיל תא בלען לחסינות למלריה בבני אדם 10, 11, תחום זה עדיין נחקר גרוע. מחקר לנוגדנים ספציפיים opsonizing merozoite היה מוגבל על ידי שני גורמים; הקושי בבידוד merozoites באיכות טובה; ותגובות phagocytosis משתנים מהתאים ראשוניים.

עד לאחרונה, מילויים צנטריפוגה במהירות גבוהה או צפיפות Percoll נוצלו כדי לבודד merozoites מsupernatants התרבות של פקיעת תרבויות schizont. merozoites אלה היו מעשי רק לעתים נדירות, ולעתים קרובות מניפולציות נוספות על ידי צנטריפוגה צפיפות ולשטוף מרובים שלבים 12, או הקפאה 11 לפני השימוש במבחנים. proc אלהesses פוטנציאל לנתק חלבונים רבים הקשורים שולי ממשטח merozoite, חלבונים ידועים להיות מטרות אנטיגני של חסינות מלריה 13. לאחרונה מעכבי פרוטאז ציסטאין טרנס Epoxysuccinyl-L-leucylamido בוטאן (4 guanidino-) (E64) נעשה שימוש כדי ליצור merozoites קיימא. E64 מונע קרע schizont, שהניבו merozoites קרום סגור 14, שיכול להיות מופר על ידי סינון לשחרר merozoites קיימא 15, 16. טכניקה זו תוביל לרזולוציה מרחבית של חלבונים רבים במהלך הפלישה כדורית אדומה 15, 17-19 והבהירה את ההשפעה הספציפית השלב של כמה תרופות נגד מלריה 16, 20. עם זאת, הדור של merozoites קיימא נותר מאתגר מבחינה טכנית. כדי לסייע בהפצה של טכניקה זו ויישום למבחנים תפקודיים של חסינות, פרוטוקול מפורט לטיהור קיימא merozoite והשימוש בם בassay הסטנדרטי הפונקציונלי של נוגדן: שיתוף פעולה סלולארי בopsonization וphagocytosis מתואר כאן.

טכניקה זו מדגימה התקדמות משמעותית לעומת מבחני קודמים במבחנה של opsonization merozoite, כגון פרץ נויטרופילים נשימה, תלוי נייד עיכוב הנוגדן (ADCI), ומבחני phagocytosis merozoite חלופיים. מבחני אלה הם גרועים לשחזור עקב וריאציה בתשומות טפיל ואת פעילותם של תאים ראשוניים phagocytic 11, 21. hemozoin לזהם גם עשוי מאוד להשפיע על תפקוד התא בלען 22. Assay phagocytosis merozoite חזק לשעתק דיווח לאחרונה 23 מנצל את שורת תאי promonocytic THP-1 24. זה סוג תא אידיאלי עבור מבחני זרימת cytometry תפוקה גבוהה כפי שהוא לא חסיד ובמיוחד מבצע phagocytosis FC-קולטן בתיווך 25, 26. מורכבות נוספות בזמן investigating phagocytosis הוא שהתואר של phagocytosis תלוי במספר merozoites ביחס לTHP-1 תאים וריכוז בפלזמה. כדי להבטיח שחזור בין ניסויים, צריך להיות מנת merozoites וריכוז מוגדר בשימוש. בשל גודלם הזעיר, לזרום כימות cytometric נדרש.

ההליך המתואר כאן מסיר hemozoin ומייצר merozoites קיימא, ומתאר את היישום של merozoites אלה לספירת התזרים cytometric של merozoites אחרי opsonization וphagocytosis. למרות תובעני מבחינה טכנית, הטכניקות המתוארות עשויות להיות שימושיות בהבהרת התרומה של תגובות נוגדנים ספציפיות למשטח merozoite נרכש באופן טבעי וחיסון מושרה חסינות.

Protocol

הערה: כל השלבים, מלבד צנטריפוגה וcytometry זרימה, צריכים להתבצע בתוך הזרימה למינרית כדי לשמור על סטריליות. להבטיח אמצעי זהירות ראויה נלקחות לגבי הטיפול בדגימות אנושיות. Assay הוא רגיש מאוד לכמויות קטנות של פלזמה. דילולים הניתנים הם אופטימליים לפתרון תגובות הנעות 5-78% עם פלזמה מילדים למחצה חסינים מפפואה גינאה החדשה (PNG). הדילול האופטימלי עשוי להשתנות עם ערכות פלזמה נבדקות, ולכן מומלץ שהפלזמה להיות טיטרציה לקבוע תנאי ניסוי עבור כל יישום. להבטיח את הכללתם של 2 פקדים שליליים THP-1 תאים עם merozoites בהעדר הפלזמה; ותאי THP-1 עם merozoites opsonized עם בריכה של פלזמה מאנשים נאיביים מלריה. זה יאפשר בקרה על עמידת merozoite לTHP-1 תאים ולאפשר gating זרימת cytometry הקפדני של אירועי phagocytosis.

השימוש בדגימות הפלזמה PNG היהאושר על ידי הוועדה המייעצת למחקר הרפואית, פפואה גינאה החדשה של משרד בריאות, וולטר ואלייזה הול ועדת מכון אדם מחקר אתיקה (מספר פרויקט 04/04). הסכמה בכתב שהתקבלה מהורים / אפוטרופוסים של כל המשתתפים.

1. תרבות THP-1

  1. לשמור על קו תא monocytic אדם THP-1 במדיום RPMI-1640 תוספת 10% עוברי עגל בסרום (FCS) ו55 מיקרומטר 2-mercapthoethanol (THP-1 בינוני) ועל 37 מעלות צלזיוס ב5% CO 2 באינקובטור humidified.
  2. לשמור על תאים בצפיפות מתחת ל -5 x 10 5 תאים / מיליליטר. הערה: צמיחת היתר תגרום להתמיינות לתאים חסיד ולמטה רגולציה של קולטני Fc. ברגע שתאים כבר passaged כ 10 פעמים, להפשיר בקבוקון חדש כדי לשמור על הפנוטיפ של תאים.

2. לדוגמא הכנת נוגדן ודילול

  1. פלזמה להשבית חום להיבדק ופלזמה שליטת מלריה נאיבית ידי דוגרים על 56 °; צלזיוס למשך 30 דקות
  2. סדרתי לדלל דגימות פלזמה עד 1/2, 000 במדיום THP-1.
  3. פלזמה בחנות בדילול מלא ב -20 ° C.

3. תרבות של פ המסונכרן היטב falciparum

הערה: שורת הטפיל-GFP-לבטא D10-PfPHG 27 נוצלו בשל מחזור החיים 48 שעות שלה, אשר מסייע לסנכרון של טפילים והתזמון המבוקר של בנוסף E64. יתר על כן, מכיוון ששורה זו מבטאת את ה-GFP בcytosol, קו זה מאפשר זיהוי של parasitaemia וmerozoites בחינם על ידי זיהוי התזרים cytometric של ה-GFP. עם זאת, עוצמת הקרינה ה-GFP אינה מספיק כדי לספק להדמיה תוך THP-1 תאים, ולכן, הם merozoites counterstained עם Ethidium רומיד (EtBr). זני טפיל אחרים עשויים להיות מנוצלים, ובלבד שהתיאום הדוק הוא בר השגה. לסנכרן את הטפילים באמצעות שילוב של טיפול סורביטול לlyse צורות בוגרות 28 והפרין לעכב פלישה 15

  1. לשמור על פ falciparum הטפיל בO + אריתרוציטים אנושיים (RBC) בהמטוקריט של 3% במדיום RPMI-1640 (pH 7.4) בתוספת 25 מ"ג / מיליליטר HEPES, 50 מיקרוגרם / hypoxanthine מיליליטר, סרום 10% אדם ונקווה, 2 מ"ג / סודיום ביקרבונט מיליליטר, ו 20 מיקרוגרם / מיליליטר gentamycin (בינוני טפיל). הוסף 5 מ"ג / מיליליטר Blasticidin S-hydrochloride עד בינוני התרבות כדי לבחור עבור ה-GFP + טפילים.
  2. דגירה תרבויות בתיבות אוויר חזק או צלוחיות תרבות לחלופין כפול אטומות על 37 מעלות צלזיוס באווירה של 1% O 2, 4% CO 2 ו95% N 2.
  3. הכן את השקופיות למרוח דקות, לתקן במתנול 100% עבור 10 שניות, ואת כתם עם 10% פתרון Giemsa ב6.7 מ"מ (pH 7.1) חיץ פוספט (פתרון Giemsa) עבור 10 דקות כדי לפקח parasitemia. לאחר צביעה, יש לשטוף את השקופיות במים ואוויר יבש. להעריך parasitemia באמצעות עדשת טבילת שמן 100X.
  4. לשמור על תרבויות טפיל בparasitemia מתחת RBC הנגוע 5% על ידי פיצול תרבויות והוספה נגועRBC כנדרש.
  5. כדי לסנכרן עם הפרין, להוסיף 20 IU / מיליליטר של הפרין בדרגה רפואית לצלצל בשלב תרבויות.
  6. כאשר רוב הטפילים נמצאים בשלב schizont, תאים גלולה XG 300 5 דקות, להסיר בינוני המכיל הפרין ו resuspend במדיום הטפיל כדי לאפשר קרע schizont ופלישת merozoite.
  7. לאחר 4 שעות, להוסיף 20 IU הפרין מיליליטר / חזרה לתרבויות, חוסם כל פלישת merozoite נוספת. הערה: מספר מחזורים של סורביטול וטיפול הפרין עשויים להידרש לפני הטפילים מסונכרנים במידה מספקת. כדי לייצר מספרים מתאימים של merozoites, להכין 150 מיליליטר של תרבות הטפיל ב3 - 5 parasitaemia%.

4. בידוד של השלב מאוחר P. falciparum trophozoites

  1. שלושים ושש שעות לאחר שחזר הפרין לתרבויות, גלולה תאים בתרבית XG 300 5 דקות, וגלול resuspend במדיום טפיל בהמטוקריט 25%.
  2. צרף עמודה מגנטית גדולה (מטריצת נפח 6.3מיליליטר) לאבן שואבת, ולאזן את העמודה עם מדיום הטפיל, כדי לוודא שכל בועות האוויר יוסרו.
  3. הוסף את פ resuspended תרבות falciparum לעמודה, ולהתאים את קצב זרימה לטיפה אחת לשנייה.
  4. ברגע שהתרבות עברה דרך העמודה, לשטוף את העמודה עם מדיום הטפיל עד לזרימה דרך רץ ברור.
  5. Elute טפילים מהעמודה ב30 מיליליטר של מדיום טפיל 37 מעלות צלזיוס.
  6. הכן את המשטח דק של טפילים, לתקן במתנול 100% עבור 10 שניות, ולהכתים עם פתרון Giemsa במשך 3 דקות. בדוק את השקופית מתחת למיקרוסקופ, ולהבטיח כי טפילים כמעט למלא את תא הדם האדום, ונראה כי בשלבי schizont המוקדמים. אם הטפילים לא הגיעו לשלב ההבשלה המתאים, לחזור טפילים מטוהרים לאינקובטור 37 מעלות צלזיוס באווירה של 1% O 2, 4% CO 2 ו95% N 2 עד פותח כראוי. הערה: טוהר של תאי דם גדולים יותר מאשר 90% נגועים אדומים נדרש כדי להבטיח RBCS לא לזהם הכנות merozoite.
  7. פנק schizonts המבודד עם 10 מיקרומטר E64 בוטאן (Epoxysuccinyl-L-leucylamido (4 guanidino-) (E64) ל6-10 שעה הערה:. פעמים דגירה ארוכות יותר עם E64 הן אפשריות, עם זאת merozoites מיוצר כבר לא יהיה פולשני.

5. בידוד של פ falciparum merozoites

  1. לאחר דגירה עם E64, למרוח טפילים, לתקן את התאים במתנול 100%, ואת כתם עם פתרון Giemsa להעריך את היווצרות merozoites המוקף בממברנה. הערה: תשואה טובה של merozoites תושג אם יותר מ 50% מטפילים יצרו merozoites המוקף בממברנה.
  2. טופלו E64 גלולה schizonts ב1,900 XG במשך 8 דקות. לשטוף עם 50 מיליליטר של מדיום RPMI-1640 RT (pH 7.4) בתוספת 25 מ"ג / מיליליטר HEPES, 50 מיקרוגרם / hypoxanthine מיליליטר, 2 מ"ג / מיליליטר סודיום ביקרבונט, ו20 מיקרוגרם / מיליליטר gentamycin (לשטוף בינוני) כדי להסיר סרום אנושי שנותר .
  3. Resuspend את הכדור ב 2 מיליליטר של מדיום לשטוף. הערה: שימוש FCS המכיל THP-1 מדיה תפיק קצף במהלך סינון.
  4. סנן את 2 מיליליטר של E64-schizonts המושעה דרך מסנן מזרק 1.2 μm/32 מ"מ. אסוף את התסנין בצינור 10 מיליליטר. הערה: התסנין מכיל merozoites וגבישי hemozoin, עם schizonts-קרע בלתי ופסולת שנאסף במסנן.
  5. צרף עמודה מגנטית קטנה לאבן שואבת, ולאזן עם 500 בינוני THP-1 μl.
  6. לעבור את התסנין על העמודה המגנטית. לאסוף את זרימת הדרך. הערה: Hemozoin יהיה לאגד את העמודה, ואילו merozoites יעבור.
  7. לעבור את הזרימה דרך על הטור עוד פעמים כדי להסיר hemozoin, איסוף הזרימה דרך כל זמן.
  8. יש לשטוף את העמודה עם 2 מיליליטר של מדיום THP-1 RT לאסוף כל merozoites הנותר.
  9. הוספת EtBr ב10 מיקרוגרם / מיליליטר (ריכוז סופי) וכתם ל30 דקות ב RT. להגן מפני אור כדי למנוע photobleaching. הערה: ודא שכל הנוזל וp EtBr המזוהמיםפסולת lastic ממומשת באופן מתאים לכימיקלים ציטוטוקסיות. Merozoites כבר לא פולשנית הבא דגירה זה.
  10. ספין למטה merozoites ב4,000 XG 10 דקות.
  11. בטל supernatant לתוך מיכל פסולת מתאים.
  12. Resuspend גלולה merozoite ב4 מיליליטר בינוני THP-1, וספין למטה ב4,000 XG 10 דקות.
  13. הוסף בינוני THP-1 עד נפח 15 מיליליטר, ולהגן מפני אור.

6. כימות Merozoite ריכוז על ידי זרימת cytometry

  1. להביא ספירת חרוזים RT.
  2. הכן PBS עם BSA 0.5% לדילול merozoites.
  3. רוזן merozoites ב3 דילולים; 1 ב100; 1 ב50 ו1 ב25. הכן צינורות 3 FACS עם 940, 930 ו910 μl של BSA +0.5% PBS, בהתאמה. הוסף 10, 20 ו40 μl של merozoites מטוהר לכל צינור, בהתאמה.
  4. חרוזים ספירת ורטקס למשך 30 שניות, ולהוסיף 50 μl של חרוזים לכל צינור FACS המכיל merozoites בדילול מלא.
  5. הפעל את דיל שלושדגימות merozoite uted על זרימה מצוידת cytometer עם לייזר 488 ננומטר. קבע שער מחמיר לmerozoites מבוסס על EtBr וקרינה כפולה הקרינה ה-GFP, וחרוזים ספירת שער על ידי הקרינה בערוץ נפרד. לרכוש אירועים עד 2,000 חרוזים נאספים. הערה: הוראות אלו מתייחסות לספירת ה-GFP merozoites + כי כבר מוכתם בדלפק עם EtBr. אם לא ניצול ה-GFP להביע טפילים לאחר מכן להגדיר שערי merozoite מבוססים על פיזור צד וקרינת EtBr.
  6. לקבוע את היחס של merozoites: חרוזים על ידי חלוקת מספר אירועי merozoite ידי אירועי חרוז ספירת 2,000, לחשב יחס עבור כל דילול. השתמש במפרטים אצווה חרוז ספירה כדי לקבוע את מספר חרוזים ב50 μl של חרוזים הוסיף לכל צינור.
  7. הכפל את מספר חרוזים ב50 μl על ידי הגורם לדילול ועל ידי merozoite: יחס חרוז שלגורמים לדילול. מספר זה משווה את הריכוז של merozoites לכל מיליליטר. בצע הESE צעדים עבור כל דילול.
  8. ממוצע ריכוזי merozoite נמדדים על פני שלושה דילולים. הערה: סטיות תקן מעל 10% לריכוזים שנקבעו ל1 ב100, 1 ב50, ו1 ב25 דילולים מצביעים על אי דיוקים טכניים בהכנת דגימות ספירה.
  9. Resuspend merozoites ב8 x 10 6 / מיליליטר merozoites במדיום THP-1 על מנת להבטיח יחס סופי של ארבעה merozoites לכל תא THP-1. הערה: merozoite אחר לTHP-1 יחסים עשוי לשמש, וריכוזים צריכים להיות שונה בהתאם.

7. Assay Phagocytosis

  1. הוסף 200 μl של FCS פעיל חום לכל טוב של 96 צלחות תחתונה U היטב, ולהשאיר על RT O / N לחסום צלחות. לאחר דגירה, להסיר FCS ולשטוף בארות פעמיים עם 200 PBS μl סטרילי. הסר PBS וצלחות חנות ב 4 ° C עד צורך.
  2. לחשב את מספר THP-1 התאים נדרשים לבדוק דגימות פלזמה ובקרה, המאפשר לבארות בשלושה עותקים לדגימה ב1 x 10
  3. לקבוע את ריכוז התרבות THP-1 על ידי טעינת 10 μl של תרבות לשקופית haemocytometer. לספור את מספר התאים הנמצא ב4 סטים של 16 ריבועי פינת haemocytometer תחת מיקרוסקופ, ולאחר מכן בממוצע הספירה. הכפל את הספירה הממוצעת של 10,000 כדי לחשב את מספר תאים לכל מיליליטר.
  4. ספין למטה את המספר הדרוש של THP-1 תאים ב XG 500 למשך 5 דקות, וresuspend ב6.7 x 10 5 תאים / מיליליטר במדיום THP-1.
  5. הוסף 150 μl של THP-1 תאים בינוניים THP-1 לכל גם ל96 צלחת U-תחתונה גם חסם-FCS, וכתוצאה מכך 10 5 תאים / היטב. הכן 3 בארות לדגימה שתיבדקנה. להחזיר את צלחת לחממה עד מוכן להוסיף merozoites.
  6. הוסף 150 μl של הכנת merozoite ב8 x 10 6 / מיליליטר לכל טוב ל96 צלחת תחתונה U היטב חסומה FCS נפרד. להתכונן היטב אחד לדגימה שנבדקה
  7. הוסף 10 μl של דגימות פלזמה בדילול מוכנות לכל טוב, כדי לאהוא הצלחת המכיל את merozoites, ומערבבים היטב כדי להבטיח פתרון הומוגני.
  8. הסר את צלחת THP-1 מהחממה, ולהוסיף 50 μl של פתרון merozoite / פלזמה בכל טוב המכיל THP-1 תאים, עם בארות בשלושה עותקים לדגימה פלזמה.
  9. מערבבים היטב, ולדגור על 37 ° C ב 5% CO 2, חממת humidified ל40 דקות. מכסה בנייר כסף כדי להגן מפני אור.
  10. אחרי 40 דקות, דגימות צנטריפוגות במשך 5 דקות ב XG 500 במעלות צלזיוס 4 prechilled צנטריפוגות כדי לעצור phagocytosis.
  11. הסר supernatant ולשטוף תאים פעמיים בBSA +0.5% קרים כקרח PBS +2 mM EDTA (חיץ FACS). הערה: EDTA יקל בשמירה על השעיה תא בודדת לניתוח cytometry זרימה.
  12. תקן את התאים ב90 μl של paraformaldehyde 2% (PFA) ב-BSA +0.5% PBS +2 mM EDTA (מקבע FACS). השאר על קרח עד רכישה, מוגן מפני אור.

8. Cytometry הזרימה

  1. לרכוש דגימות באמצעות cytometer זרימה wi המצוידה לייזר 488 ננומטר וקובץ מצורף צלחת קורא תפוקה גבוהה. הערה: זה יאפשר עד 400 דגימות פלזמה להיבדק מהכנת merozoite אחד. יכולים גם להיות מועברים תאים לצינורות לטעינת מדגם ידני.
  2. תאי שער קיימא THP-1 על ידי קדימה ופיזור בצד.
  3. הגדר את השער החיובי EtBr המבוסס על התאים THP-1 עם merozoites ולא פלזמה "שליטה.
  4. לרכוש מינימום של 10,000 אירועים לדגימה.

9. ניתוח נתונים

  1. לנתח את הנתונים באמצעות cytometry זרימת תוכנה לניתוח, ולהגדיר שערים מחמירים לאירועים חיוביים EtBr.
  2. לחשב את phagocytosis אחוז עבור כל דגימה:% מEtBr תאים + למדגם מינוס התאים החיוביים% בפלזמה שאינה מחוסנת.
  3. תוצאות ממוצעת על פני triplicates. הערה: סטיות התקן לשלושה עותקים עודף של 10% מצביעות על אי דיוקים ניסיוניים. אירועים חיוביים EtBr רקע מסוים עשויים להיות שנצפו כתוצאה מmerozoiהידבקות te אל פני השטח של THP-1 תאים, אבל צריכה להיות עקבית בכל הדגימות המכילות merozoites. הגדרת השער המבוסס על התאים THP-1 עם merozoites ולא פלזמה 'בקרה, ולאחר מכן חיסור כל רקע של' התאים THP-1 עם הלא חיסונית פלזמה "שליטה תגרום phagocytosis% שמשקף את הקרינה בשל הפנים / Phagocytosed merozoites בלבד.

Representative Results

שלב ההבשלה של טפילים לפני טיפול E64 הוא קריטי ליצירה merozoites מוקף קרום. איור 1Ai מציג את שלב ההבשלה המתאים של schizonts להוספת E64. הטפילים צריכים להיות גדולים וכמעט למלא את תא הדם האדום. מראה מנומר של כתם Giemsa מציין merogony החל, ויש להוסיף E64 להניב merozoites מוקף קרום (איור 1Aii). אם E64 הוא הוסיף קודם לכן לtrophozoite טפילי במה, merozoites המוקף הקרום לא נוצרים גם לאחר 12 שעות של E64. במקום טפילים לקחת על מורפולוגיה חריגה כגון הגדלה של vacuole העיכול (איור 1Bi ו1Bii), וmerozoites לא נוצרים. אם E64 הוא הוסיף מאוחר יותר לschizonts, merozoites מוקף קרום לא נוצרים כקרע schizont חסר עכבות (איור 1Ci ו1Cii). רמה גבוהה של תיאום טפיל נדרש, אחרחכם טווח של כל שלוש התוצאות שתוארו יהיה לראות לאחר טיפול E64.

הסרת hemozoin היא עוד צעד קריטי עבור merozoites לטיהור. אם merozoites אינו מטוהרים מhemozoin אז אשכולות merozoite-hemozoin צורה שלא ניתן וחילצה ידי pipetting. אגרגטים אלה לרוץ על cytometer כאירועים בודדים, אם כי עם מאפיינים צופה פני פיזור ותופעות פיזור שונים מmerozoites אחת, וכתוצאה מספירת merozoite לא מדויקת על ידי cytometry זרימה (איור 2 א). כTHP-1 תאים יכולים גם phagocytose hemozoin, יכולים גם להיות phagocytosed אשכולות merozoite-hemozoin אלה (איור 2). אגרגטים אלה ניאון EtBr מאוד כפי שהם מכילים merozoites מרובה. Phagocytosis של תוצאות אגרגטים במקבילים פרופיל הקרינה EtBr THP-1 לזה שנצפה עבור phagocytosis של merozoites הבודד מרובה. לפיכך, אם hemozoin לא הוסר, הקרינה EtBr של THP-1 תאים תהיה overestimate של פוטנציאל opsonizing לפלזמה הנבדקת. Hemozoin הוא דיווח גם לשנות את תפקוד תא בלען באופן משמעותי. merozoites GFP החיובי הם מוכתמים דלפק עם EtBr להגדיל את ההדמיה של merozoites phagocytosed ידי THP-1 תאים. שימוש בתנאים שתוארו בפרוטוקול זה, כל merozoites GFP החיובי הם counterstained עם EtBr שבו יש עוצמת הקרינה בהירה (איור 3 א). הערכת Phagocytosis ידי הקרינה EtBr מאפשרת רזולוציה מעולה של phagocytosis merozoite מאשר הקרינה ה-GFP (איור 3 ב).

מספר merozoites הוסיף לassay יהיה לווסת את כמות phagocytosis נצפתה. מסיבה זו, ספירה מדויקת על ידי cytometry זרימה היא קריטית. הגדלת יחס של merozoites: THP-1 תגרום לדבקות המוגברת של merozoites לTHP-1 תאים בהעדר הפלזמה (איור 4 א). הגדלת merozoite: THP-1 יחסים גם תוצאות ph המוגברתגובות agocytosis כאשר merozoites הם opsonized (איור 4). Merozoite 4:1: יחס THP-1 מומלץ לתגובות phagocytic חזקות. באמצעות יחס זה, והדילול של פלזמה מצויינים, assay זה הוא מסוגל לפתור רמות נמוכות, בינוניות וגבוהות של נוגדני opsonizing. בין 0 ל 78 תגובות phagocytosis אחוזים נצפו באמצעות דגימות פלזמה PNG ומצבים האחרים שתוארו. תגובות כאלה מוצגות לאחרונה מקשרים עם חסינות קלינית שנרכשה באופן טבעי למלריה 10. איור 5 מראה דוגמאות של 4 הרבעונים של תגובות phagocytosis מאנשים PNG.

איור 1
איור 1. עיתוי בנוסף E64 הוא קריטי ליצירה merozoites המוקף בממברנה. () Maturatio המתאים. שלב n של טפילי i) לפני טיפול E64, וii) merozoites מוקף קרום הופק לאחר 6 שעות של טיפול E64 (merozoites הסגור ב ') קרום לא נוצרים אם E64 מתווסף לטפילים לא בשלה; i) trophozoites בשלב מאוחר, וii) לאחר 12 שעות של E64 (C) schizont קרע לא עכבות אם E64 מתווסף מפולחים מאוחר schizonts.; i) schizonts שלב המאוחר, וii) לאחר 6 שעות של E64. בר סולם מייצג 10 מיקרומטר.

איור 2
איור 2. הסרת Hemozoin היא קריטית כדי ליצור השעיה merozoite תא בודד. אגרגטים Merozoite-hemozoin הטופס הבא סינון של merozoites המוקף הקרום, אלא אם כן hemozoin מופרד מגנטי מmerozoites. () חלקות צופה פני פיזור וצד פיזור של merozoites עם hemozoin הוסרוhemozoin עודפים. ניתן phagocytosed אגרגטים (ב ') Hemozoin-merozoite ידי THP-1 תאים. שקופיות ציטומגלווירוס ספין מוכתמות הבדל-מהיר של תאי THP-1 הודגרו עם הפלזמה PNG opsonized הכנות merozoite עם או בלי hemozoin. בר סולם מייצג 10 מיקרומטר.

איור 3
איור 3. מכתים Ethidium רומיד מאפשר לרזולוציה מעולה של phagocytosis merozoite. Merozoites מטוהר D10-GFP הם counterstained עם EtBr כדי לשפר את עוצמת הקרינה. () Cytometry זרימת histrogram של merozoites מטוהר עם gating על merozoites GFP החיובי, וכתם נקודה מראה EtBr הקרינה בתוך אוכלוסיית ה-GFP מגודרת זה חיובי. (ב) פיזור קדימה לעומת GFP ופיזור קדימה לעומת EtBr של THP-1 תאים הבאים phagocytosis של merozoites ניאון הכפול GFP וEtBr. שערים היו ד rawn המבוסס על תאי THP-1 עם merozoites ואין שליטת פלזמה.

איור 4
איור 4 merozoite:. יחס THP-1 משפיע על מידת phagocytosis נצפתה. (א) חמש merozoite: THP-1 יחסים מתוארים; 50:1, 20:01, 10:01, 4:1, 1:1. שליטה רק תאים מצביעה על הקרינה רקע עקב THP-1 תאים. הקרינה EtBr THP-1 עבור כל יחס מצויינים לmerozoites opsonized עם בריכה של הפלזמה PNG או עם פלזמה אוסטרלית nonimmune ממוצע הקרינה בעוצמה של THP-1 תאים לmerozoite שונה (ב '):. THP-1 יחסים, וopsonization עם בריכה של הפלזמה PNG או פלזמה האוסטרלית nonimmune (ממוצע + SEM). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

ove_content "עבור: together.within-לשמור על עמודים =" תמיד "> איור 5
איור 5. מגוון גדול של נוגדני opsonizing ניתן למדוד. Merozoites היה opsonized עם פלזמה מאנשים PNG וטופחו עם THP-1 תאים. ארבע תגובות phagocytosis נציג מוצגות. גייטס היו סגור המבוססת על תאי THP-1 עם merozoites ואין שליטת פלזמה, ומספרים מצביעים phagocytosis% לאחר הפחתה של תאי THP-1 עם שליטת פלזמה שאינה מחוסנת. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

כדי למדוד phagocytosis merozoite, בקיאות בשתי טכניקות נדרש: טיהור של merozoites וassay phagocytosis THP-1. השלבים הקריטיים ביותר לשילוב של שתי טכניקות אלה הם: 1) טפילים מסונכרנים היטב; 2) הוספת E64 בזמן הנכון כדי להניב merozoites המוקף קרום; 3) הסרת hemozoin להימנע מצרפים; 4) ספירת merozoite מדויקת על ידי cytometry זרימה; 5) הדילול של פלזמה משמשת; ו6) שמירה על צפיפות תא נמוכה ומספר מעבר של THP-1 תאים. בחינה קפדנית של היבטים המרכזיים אלה תבטיח תגובות phagocytosis חזקות הם נצפו.

אמנם, מתואר כאן היא הכנת merozoites להערכת phagocytosis, הטכניקה יכולה להיות מנוצל עבור מגוון רחב של יישומים. ללא קשר למתודולוגיה הזרם למטה, הכנות merozoite אופטימליות תלויות בעיתוי נכון בנוסף E64 על מנת ליצור merozoites. שיטת E64 המתוארת כאן הוכח yIELD merozoites פולשנית לשימוש במיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה של אירועי פלישה ומבחני רגישות הסמים 15-20. בעוד כדאיות merozoite אינה חיונית לphagocytosis, נדרשת יושרה של מעיל משטח merozoite. לכן שיטת E64 המתוארת כאן מאפשרת merozoites באיכות גבוהה כדי להיות מיוצר להערכת תגובת נוגדנים למעייל פני השטח. כפי שמתואר באיור 1, אם E64 מתווסף מוקדם מדי או מאוחר מדי merozoites הקרום סגור לא נוצרים. מסיבה זו, תרבויות טפיל סינכרוני מאוד נדרשות. כאן, השימוש בטיפולי סורביטול והפרין לחוזקה לסנכרן תרבויות טפיל D10-GFP לחלון של שעה 2 הוא תאר. הפרין יכול לקדם gametocytogenesis במעבדה אחרת מבודדת, ולכן יש להשתמש בזהירות. עשויות לשמש גם שיטות סנכרון אלטרנטיביים כגון אלנין, ובלבד שטפילים מסונכרנים היטב מיוצרים 29. אם E64 מתווסף לטפילי אסינכרוני, אבזר נמוךortion של merozoites מוקף קרום יופק ונותר טפיל שנדבק ב-RBC יהיה גם קרע בדרך כלל או לפתח מורפולוגיה נורמלית. נוכחותם של טפילים שלא התפתחה לmerozoites קרום סגור תגרום לסתימה של המסנן ולהפחית באופן משמעותי את תשואת merozoite מתקבלת.

במהלך הסינון של merozoites המוקף בממברנה, hemozoin הוא משוחרר מוקואולות העיכול וקיים כגבישים חופשיים בתמיסה. Hemozoin הוא מעודדי דלקת מאוד וכבר דווח לווסת תגובות מונוציטים וphagocytosis מקרופאג 30, ביום 31. בנוסף לויסות phagocytosis, כפי שמוצג באיור 2, hemozoin יכול ליצור אגרגטים עם merozoites בתמיסה. כTHP-1 תאים יכולים phagocytose אגרגטים אלה, זה יכול להיות confounder עיקרי להחלטה של ​​phagocytosis בתיווך הנוגדנים. לכן, הסרת hemozoin יש צורך בassay זה לאבמורכבות נוספות של OID hemozoin על ביולוגיה תא בלען. בנוסף, אי ספיקת כדי להסיר hemozoin יכולה להיות גם הרסנית בעת השימוש בטכניקה זו כדי ליצור merozoites ללא תשלום עבור יישומים אחרים, במיוחד שבו נדרש כימות merozoite.

כפי שמתואר באיור 4, מספר merozoites הוסיף לassay יכול להשפיע על מידת phagocytosis ידי THP-1 תאים. למרות cytometry הזרימה מאפשר ספירה של ריכוז merozoite, pipetting זהיר ולשכפל את הסעיפים של merozoites נחוץ כדי לשפר את הדיוק. זה קריטי במיוחד אם קווי טפיל מרובים הם להיבדק Side-by-צד. זה בעבר כבר הראה כי פלזמה מילדים למחצה חסינים מפני PNG יכולה להיות מדולל באופן משמעותי לפני תגובות ירידת 23. שתואר כאן הוא הדילול האופטימלי של פלזמה (1/120, 000 הדילול סופי של פלזמה) לקבוצה של 5 - ילדי PNG בת 12 שהפיקה את מגוון הגדול של phagocyt. תגובות אוזיסים המתוארות באיור 5 טווח זה אפשר לריבוד של תגובות לארבע קבוצות (0 - 19%, 20-39%, 40-59% ו60 - phagocytosis 79%), ומודלים רגרסיה חשפו כי תגובות opsonizing היו קשורות עם ההגנה מפני מחלה קלינית וצפיפות גבוהה parasitaemia 10 לעוקבה שונה לומדת ייתכן שיהיה צורך להתאים את דילול פלזמה כדי להבטיח phagocytosis ידי THP-1 תאים לא רווי או מתחת לרמה של זיהוי.

Cytometry זרימה מאפשרת phagocytosis המהיר וכימות עם דיוק משופר על מיקרוסקופ. פרוטוקול זה הוא תפוקה גבוהה, צלחת מבוססת ואוטומטי רכישת 96 צלחות גם ללמוד חסינות הלחות שנרכשה באופן טבעי. השיטה דורשת צביעת merozoites ברומיד ethidium, יכולים להיות מנוצלים כתמי DNA אלטרנטיביים לעומת זאת, כגון SYBRgreen, DAPI ויוד propidium, כתמי קרום או כתמי חלבון. assay זה יהיה מקובל Primarמונוציטים y או נויטרופילים, ויכולים להיות מותאמים אם תא בלען או הביולוגיה FCR היה של עניין. תאים ראשוניים או THP-1 תאים מובחנים במבחנה עם PMA יכולים לשמש כדי לחקור phagocytosis במלריה ופתוגנים אחרים 12, 32-34. עם זאת שימוש בתאים ראשוניים עשויה להיות מאתגר כפי שהתאים אלה הם חסיד וגם להציג phagocytosis שאינו הנוגדן בתיווך 35. בנוסף, השתנות בטהרה, כדאיות ופונקציונליות כמה מגבלות מפתח לשימוש בתאי phagocytic העיקריים. קולטני Fc המעורב בphagocytosis merozoite יישאר uncharacterized, ולכן באמצעות חסימת נוגדנים לקולטניים Fc ספציפי יכולה להבהיר את תרומתו של כל מועדון כדורגל קולטן לmerozoite phagocytosis. כphagocytosis THP-1 הוא FCR תלוי, זה מאפשר פירוש פשוט של phagocytosis נצפה. assay זה גם משאיל את עצמו לטיפול ספציפי אנטיגן של opsonizing נוגדנים אשר יכולים להיות מושגת על ידי utilizing טפילים עקום החוצה לפני שטח אנטיגנים merozoite, או באמצעות נוגדנים אנושיים מטוהרים זיקה לmerozoite חלבוני פני השטח. יתר על כן, בעומק מחקרים של תגובות ציטוקינים הבאים phagocytosis merozoite חסרים, ויכולים להיות מושגת באמצעות assay זה.

שתי טכניקות אלו מהוות התקדמות ניכרת בחקר נוגדני antimerozoite הפונקציונליים. טיהור merozoites באיכות גבוהה יש יתרון לשימוש בmerozoites cryopreserved, או זעירים מניאון מצופה באנטיגנים merozoite. למרות assay זה כבר נעשה שימוש ככלי להערכת חסינות שנרכשה באופן טבעי, זה עשוי להוכיח כלי חשוב להתמודדות עם הרכישה של חסינות בתגובה לחיסון. למרות שזה הוכח לאחרונה כי phagocytosis או merozoites opsonised קשור להגנה מפני מלריה קלינית, לא ניתן להסיק מסקנות ישירות מphagocytosis THP-1 במבחנה לin vivo phagocytoאחות של merozoites כphagocytosis בassay זה מתרחשת תחת תנאים סטטיים ובהעדר מתחרה בתאי דם אדומים. ההתאמות הפוטנציאליות של assay זה עשויות כך לספק כלי תכליתי להבנה נוספת של מלריה וphagocytosis merozoite.

Disclosures

יש המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

המחברים מבקשים להודות לילדים ולתורמי פלזמה למבוגרים, וצוות בפפואה גינאה החדשה המכון למחקר רפואי. המחברים מבקשים להודות לAmandine B Carmagnac, קתרין ש Nie, דני W וילסון, איבו מולר ודיאנה S הנסן על תרומתם לפיתוח של טכניקה זו, ותודה לצלב האדום האוסטרלי לחבילות דם וסרום. עבודה זו התאפשרה בזכות תמיכה ויקטוריאני ממשלת המדינה תפעולית תשתיות ואוסטרלית הממשלה NHMRC IRIISS. עבודה זו נתמכה על ידי הבריאות הלאומית מועצה למחקר רפואית מעניק # 1031212 ו# 637,406, ומכונים הלאומיים לבריאות מענק # AI089686.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
THP-1 cell line American Type Culture Collection TIB-202
RPMI-1640 Gibco 31800-089
Fetal Calf Serum (FCS) Invitrogen 10099-141
2-mercapthoethanol  Sigma-Aldrich M6250-100ML Use in Fume Hood
Pen/Strep Solution (100x) Sigma P0781
HEPES SAFC 90909C Cell culture grade
Hypoxanthine Calbiochem 4010
Human Serum  Donation from Australian Red Cross Available commercially (i.e. Invitrogen)
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Merck 1.06329.0500
Gentamycin Pfizer 61022027 Injection Quality
Heparin Sodium BP (5000 IU/ml) Pfizer Porcine origin
Blasticidin S-hydrochloride Sigma-Aldrich 15205
D-Sorbitol Sigma-Aldrich 50-70-4
E64 Protease Inhibitor Sigma-Aldrich E3132-10MG
KH2PO4 Sigma-Aldrich 98281-100G Use for phosphate buffer
Na2HPO4.2H20 Merck 10383.4G Use for phosphate buffer
Giemsa's azur eosin methylene blue solution Merck 1.09204.0500 1:10 dilution in 6.7 mN Phosphate buffer (make fresh each stain)
EDTA disodium salt Merck 10093.5V 0.1 M, pH 7.2
Acrodisc Syringe Filters 1.2-μm/32-mm Pall Life Sciences 4656
QuadroMACS Separator (for small column) MACS Miltenyi BioTec 130-091-051 Interchangeable with MidiMACS 
VarioMACS Separator (for large columns) MACS Miltenyi BioTec 130-090-282
MACS MultiStand MACS Miltenyi BioTec 130-042-303
LS Column (small magnetic column) MACS Miltenyi BioTec 130-042-401
Large magnetic column MACS Miltenyi BioTec 130-041-305
Ethidium Bromide Bio-Rad 1510433 Cytotoxic
CountBright Absolute Counting Beads Invitogen C36950
BD FACSCalibur Flow Cytometer with HTS plate reader BD Biosciences
EDTA disodium salt Merck 10093.5V 0.1 M, pH 7.2
FlowJo cytometry analysis software Tree Star

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cohen, S., McGregor, I. A., Carrington, S. Gamma-globulin and acquired immunity to human malaria. Nature. 192, 733-737 (1961).
  2. Fowkes, F. J. I., Richards, J. S., Simpson, J. A., Beeson, J. G. The relationship between anti-merozoite antibodies and incidence of Plasmodium falciparum malaria: A systematic review and meta-analysis. PLoS Medicine. Medicine, P. L. oS. 7, (2010).
  3. Bouharoun-Tayoun, H., Attanath, P., Sabchareon, A., Chongsuphajaisiddhi, T., Druilhe, P. Antibodies that protect humans against Plasmodium falciparum blood stages do not on their own inhibit parasite growth and invasion in vitro, but act in cooperation with monocytes. The Journal of experimental medicine. 172, 1633-1641 (1990).
  4. Jafarshad, A., et al. A novel antibody-dependent cellular cytotoxicity mechanism involved in defense against malaria requires costimulation of monocytes FcgammaRII and FcgammaRIII. Journal of immunology. 178, Baltimore, MD. 3099-3106 (1950).
  5. Genton, B., et al. A recombinant blood-stage malaria vaccine reduces Plasmodium falciparum density and exerts selective pressure on parasite populations in a phase 1-2b trial in Papua New Guinea. The Journal of Infectious Diseases. 185, 820-827 (2002).
  6. Sirima, S. B., Cousens, S., Druilhe, P. Protection against malaria by MSP3 candidate vaccine. The New England journal of medicine. 365, 1062-1064 (2011).
  7. Llewellyn, D., et al. Assessment of antibody-dependent respiratory burst activity from mouse neutrophils on Plasmodium yoelii malaria challenge outcome. Journal of leukocyte biology. , (2013).
  8. McIntosh, R. S., et al. The importance of human FcgammaRI in mediating protection to malaria. PLoS pathogens. 3, 72 (2007).
  9. Pleass, R. J., et al. Novel antimalarial antibodies highlight the importance of the antibody Fc region in mediating protection. Blood. 102, 4424-4430 (2003).
  10. Hill, D. L., et al. Opsonizing Antibodies to P. falciparum Merozoites Associated with Immunity to Clinical Malaria. PLoS One. 8, (2013).
  11. Joos, C., et al. Clinical Protection from Falciparum Malaria Correlates with Neutrophil Respiratory Bursts Induced by Merozoites Opsonized with Human Serum Antibodies. PLoS ONE. 5, (2010).
  12. Kumaratilake, L. M., Ferrante, A. Opsonization and phagocytosis of Plasmodium falciparum merozoites measured by flow cytometry. Clinical and diagnostic laboratory immunology. 7, 9-13 (2000).
  13. Richards, J. S., et al. Identification and Prioritization of Merozoite Antigens as Targets of Protective Human Immunity to Plasmodium falciparum Malaria for Vaccine and Biomarker Development. The Journal of Immunology. , (2013).
  14. Salmon, B. L., Oksman, A., Goldberg, D. E. Malaria parasite exit from the host erythrocyte: a two-step process requiring extraerythrocytic proteolysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 271-276 (2001).
  15. Boyle, M. J., et al. Isolation of viable Plasmodium falciparum merozoites to define erythrocyte invasion events and advance vaccine and drug development. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, 14378-14383 (2010).
  16. Wilson, D. W., Langer, C., Goodman, C. D., Mcfadden, G. I., Beeson, J. G. Defining the timing of action of anti-malarial drugs against Plasmodium falciparum. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 1-46 (2013).
  17. Angrisano, F., et al. Spatial Localisation of Actin Filaments across Developmental Stages of the Malaria Parasite. PLoS ONE. 7, (2012).
  18. Riglar, D. T., et al. Super-resolution dissection of coordinated events during malaria parasite invasion of the human erythrocyte. Cell Host and Microbe. 9, 9-20 (2011).
  19. Zuccala, E. S., et al. Subcompartmentalisation of Proteins in the Rhoptries Correlates with Ordered Events of Erythrocyte Invasion by the Blood Stage Malaria Parasite. PLoS ONE. 7, (2012).
  20. Marapana, D. S., et al. Malaria Parasite Signal Peptide Peptidase is an ER-Resident Protease Required for Growth but not for Invasion. Traffic. 13, 1457-1465 (2012).
  21. Rzepczyk, C. M., Lopez, J. A., Anderson, K. L., Alpers, M. P. Investigation of the effect of monocytes with Papua New Guinea sera on Plasmodium falciparum in culture. International Journal for Parasitology. 18, 401-406 (1988).
  22. Schofield, L., Mueller, I. Clinical immunity to malaria. Curr Mol Med. 6, 205-221 (2006).
  23. Hill, D. L., et al. Efficient measurement of opsonizing antibodies to Plasmodium falciparum merozoites. PLoS ONE. 7, (2012).
  24. Tsuchiya, S., et al. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1). International journal of cancer Journal international du cancer. 26, 171-176 (1980).
  25. Ackerman, M. E., et al. A robust, high-throughput assay to determine the phagocytic activity of clinical antibody samples. Journal of Immunological Methods. 366, 8-19 (2011).
  26. Ataíde, R., et al. Using an Improved Phagocytosis Assay to Evaluate the Effect of HIV on Specific Antibodies to Pregnancy-Associated Malaria. PLoS ONE. 5, (2010).
  27. Wilson, D. W., Crabb, B. S., Beeson, J. G. Development of fluorescent Plasmodium falciparum for in vitro growth inhibition assays. Malar J. 9, 152 (2010).
  28. Lambros, C., Vanderberg, J. P. Synchronization of Plasmodium falciparum erythrocytic stages in culture. J Parasitol. 65, 418-420 (1979).
  29. Braun-Breton, C., Rosenberry, T. L., da Silva, L. P. Induction of the proteolytic activity of a membrane protein in Plasmodium falciparum by phosphatidyl inositol-specific phospholipase. C. Nature. 332, 457-459 (1988).
  30. Jaramillo, M., Godbout, M., Olivier, M. Hemozoin induces macrophage chemokine expression through oxidative stress-dependent and -independent mechanisms. J Immunol. 174, 475-484 (2005).
  31. Schofield, L., Tachado, S. D. Regulation of host cell function by glycosylphosphatidylinositols of the parasitic protozoa. Immunology and cell biology. 74, 555-563 (1996).
  32. Khusmith, S., Druilhe, P., Gentilini, M. Enhanced Plasmodium falciparum merozoite phagocytosis by monocytes from immune individuals. Infection and immunity. 35, 874-879 (1982).
  33. Lunov, O., et al. Differential uptake of functionalized polystyrene nanoparticles by human macrophages and a monocytic cell line. ACS. 5, 1657-1669 (2011).
  34. Tebo, A. E., Kremsner, P. G., Luty, A. J. Fcgamma receptor-mediated phagocytosis of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes in vitro. Clinical and experimental immunology. 130, 300-306 (2002).
  35. McGilvray, I. D., Serghides, L., Kapus, A., Rotstein, O. D., Kain, K. C. Nonopsonic monocyte/macrophage phagocytosis of Plasmodium falciparum-parasitized erythrocytes: a role for CD36 in malarial clearance. Blood. 96, 3231-3240 (2000).

Tags

אימונולוגיה גיליון 89 מחלות טפיליות מלריה, Hemozoin נוגדנים Fc קולטן opsonization merozoite phagocytosis THP-1
טיהור תשואה גבוהה של<em&gt; Falciparum Plasmodium</em&gt; Merozoites לשימוש בOpsonizing נוגדן מבחני
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hill, D. L., Eriksson, E. M.,… More

Hill, D. L., Eriksson, E. M., Schofield, L. High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays. J. Vis. Exp. (89), e51590, doi:10.3791/51590 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter