Att mäta antikroppsfunktion är nyckeln till att förstå immunitet mot Plasmodium falciparum malaria. Denna metod avser rening av livskraftiga merozoites, och mätning av opsonisering beroende fagocytos med flödescytometri.
Plasmodium falciparum merozoite antigener är under utveckling som potentiella malariavaccin. En aspekt av immunitet mot malaria är att avlägsna fria merozoiter från blodet genom fagocytceller. Men att bedöma den funktionella effekten av merozoite specifika opsoniserande antikroppar är en utmaning på grund av den korta halveringstiden för merozoites och variationen av primära fagocytceller. Beskrivs i detalj häri är en metod för att generera viabla merozoiter med användning av E64-proteasinhibitor, och en analys av merozoit opsonin beroende fagocytos med hjälp av den pro-monocytiska cellinjen THP-1. E64 förhindrar schizont bristning samtidigt som utvecklingen av merozoites som frigörs genom filtrering av behandlade schizonter. Etidiumbromid märkta merozoites är opsoniserad med humana plasmaprover och läggs till THP-1-celler. Fagocytos bedöms av en standardiserad hög genomströmning protokoll. Livskraftiga merozoiter är en värdefull resurs för att bedöma numerOU aspekter av P. falciparum biologi, inklusive bedömning av immunförsvaret. Antikroppsnivåerna mäts av denna analys är förknippade med klinisk immunitet mot malaria i naturligt utsatta individer. Analysen kan också vara till användning för att bedöma vaccin inducerade antikroppar.
Betydelsen av antikroppar för immunitet mot Plasmodium falciparum malaria visades för 40 år sedan, när immunglobulin från hyperimmuna vuxna var passivt överföras till barn som lider av svår malaria resulterar i lindras sjukdom 1. Följaktligen har stora ansträngningar försökt att identifiera mål för skyddande malariaimmunitet, främst genom att mäta antikroppstitrar till peptider eller bakteriellt uttryckta proteiner med ELISA. ELISA baserad serologi har också visat sig vara mycket varierande mellan studierna, och tar inte upp antikropps funktionalitet 2. Många malariaantigener inducera en cytophilic IgG1 och IgG3 antikroppsprofil, särskilt merozoite ytantigenerna 3. Denna underklass partiskhet antyder att antikropp-Fc-receptor (FcR) interaktioner med fagocyter är viktiga för effektorfunktionerna för opsoniserande antimerozoite antikroppar 4. Flera merozoit antigen vaccin under utveckling är utformade för attframkalla phagocyte effektorfunktioner 5, 6 och även om betydande bevis för betydelsen av antikropps-FcR interaktioner i modeller av gnagare malaria existerar 7-9, och några nya studier stöder betydelsen av funktionella antikroppar och phagocyte effektorfunktioner för immunitet mot malaria hos människor 10, 11, förblir detta område dåligt undersökta. Studie i merozoite specifika opsoniserande antikroppar har begränsats av två faktorer; svårigheten att isolera god kvalitet merozoites; och variabla fagocytos svar från primära celler.
Fram till nyligen var höghastighetscentrifugering eller Percoll densitetsgradienter utnyttjas för att isolera merozoiter från odlingssupernatanter av bristning schizont kulturer. Dessa merozoites var sällan lönsamt, och ofta ytterligare manipuleras genom densitetscentrifugering och flera tvättsteg 12, eller frysförvaring 11 före användning i analyser. Dessa proccesser potentiellt loss många perifert associerade proteiner från merozoite ytan, proteiner som är kända för att vara antigena mål för malaria immunitet 13. Nyligen cysteinet proteasinhibitor trans Epoxysuccinyl-L-leucylamido (4-guanidino) butan (E64) har använts för att generera viabla merozoiter. E64 förhindrar schizont bristning, genererar membran bifogade merozoites 14, som kan störas av filtrering för att frigöra livskraftiga merozoites 15, 16. Denna teknik har lett till den rumsliga upplösningen i många proteiner under erytrocyt invasionen 15, 17-19 och har klar scenen specifik effekt av flera läkemedel mot malaria 16, 20. Men uppkomsten av livskraftiga merozoites fortfarande tekniskt utmanande. För att underlätta spridningen av denna teknik och tillämpning av funktionella analyser av immunitet, ett detaljerat protokoll för livskraftig merozoit rening och deras användning i ettstandardiserad funktionell analys av antikropps: cellulär samarbete opsonisering och fagocytos beskrivs här.
Denna teknik visar ett stort framsteg jämfört med tidigare analyser in vitro av merozoit opsonization såsom neutrofila respiratory burst, antikroppsberoende cellulär Inhibition (ADCI), och alternativa merozoit fagocytos analyser. Dessa analyser är dåligt reproducerbar beroende på variation i parasit ingångar och aktiviteten av primära fagocytiska celler 11, 21. Förorenande hemozoin kan också grunden påverka fagocytfunktionen 22. En nyligen rapporterat robust och reproducerbar merozoit fagocytos analys 23 utnyttjar promonocytic cellinje THP-1 24. Detta är en idealisk celltyp för hög genomströmning flödescytometri analyser eftersom det är icke-vidhäftande och specifikt utför Fc-receptorförmedlad fagocytos 25, 26. En ytterligare komplexitet samtidigt som investeraretigating fagocytos är att graden av fagocytos är beroende av det antal merozoiter i förhållande till THP-1-celler och plasmakoncentration. För att säkerställa reproducerbarhet mellan experiment, bör merozoites räknas upp och en definierad koncentration som används. På grund av sin ringa storlek, flödescytometrisk kvantifiering krävs.
Det förfarande som beskrivs här tar bort hemozoin och skapar livskraftiga merozoites, och beskriver en tillämpning av dessa merozoites för flödescytometrisk räkning av merozoites följt av opsonisering och fagocytos. Även tekniskt krävande, kan den teknik som beskrivs vara användbar för att belysa bidrag merozoit yta specifikt antikroppssvar på naturligt förvärvad och vaccin inducerad immunitet.
För att mäta merozoit fagocytos, är goda kunskaper i två tekniker som krävs: rening av merozoites och THP-1 fagocytos analysen. De mest kritiska stegen för att kombinera dessa två tekniker är: 1) Mycket synkroniserade parasiter; 2) Lägga E64 vid rätt tidpunkt för att ge membran slutna merozoites; 3) Avlägsnande hemozoin att undvika kross; 4) Exakt merozoit räkna med flödescytometri; 5) utspädning av plasma som används; och 6) att upprätthålla låg celldensitet och passagenummer av THP-1-celler. Noggrant övervägande av dessa viktiga aspekter kommer att säkerställa robusta fagocytos svar observeras.
Även om, som beskrivs här är att förbereda merozoites för bedömning av fagocytos, kan tekniken användas för ett brett spektrum av applikationer. Oberoende av den nedströms metodik, optimala merozoite beredningar beror på korrekt timing E64 förutom i syfte att generera merozoiter. Den E64 metod som beskrivs här har visat sig yield invasiva merozoites för användning i hög upplösning mikroskopi av invasion händelser och drogkänslighetsanalyser 15-20. Medan merozoit viabilitet är inte väsentlig för fagocytos, krävs för integriteten hos merozoit yta päls. Därför E64 metod som beskrivs här möjliggör högkvalitativa merozoites skall tas fram för bedömning av antikroppssvar till ytan pälsen. Som visas i figur 1, om E64 läggs för tidigt eller för sent membran slutna merozoiter bildas inte. Av detta skäl är mycket synkrona parasitkulturer krävs. Här är användningen av sorbitol och heparinbehandlingar att tätt synkronisera D10-GFP parasitkulturer till ett fönster av 2 tim beskrivs. Heparin kan främja gametocytogenesis i andra labb isolat, och därför bör användas försiktigt. Alternativa synkroniseringsmetoder såsom alanin kan också användas, förutsatt att tätt synkroniserade parasiter produceras 29. Om E64 läggs till asynkrona parasiter, en lägre proportion av membraninneslutna merozoites kommer att produceras och resterande parasit-infekterade RBC kommer antingen brista normalt eller utveckla onormal morfologi. Förekomsten av parasiter som inte har utvecklats till membraninneslutna merozoites leder till igensättning av filtret och avsevärt minska merozoite avkastning erhålls.
Vid filtrering av membraninneslutna merozoites är hemozoin befriad från mag vakuoler och är närvarande som fria kristaller i lösningen. Hemozoin är mycket proinflammatoriska och har rapporterats att modulera monocyter och makrofager fagocytos svar 30, 31. Förutom att modulera fagocytos, såsom visas i fig 2, kan hemozoin bilda aggregat med merozoiter i lösning. Som THP-1 celler kan phagocytose dessa aggregat, kan detta vara ett stort confounder för upplösningen av antikroppsmedierad fagocytos. Därför är det nödvändigt att avlägsna hemozoin i denna analys till AVoid ytterligare komplexitet hemozoin på fagocytsystemet biologi. Dessutom kan underlåtenhet att ta bort hemozoin också vara skadlig när du använder denna teknik för att generera fria merozoites för andra tillämpningar, i synnerhet när det krävs merozoit kvantifiering.
Såsom beskrivs översiktligt i fig 4 var antalet merozoiter tillsatt i analysen kan påverka graden av fagocytos av THP-1-celler. Även flödescytometri möjliggör räkning av merozoit koncentration, noggrann pipettering och replikera räkningar av merozoites är nödvändiga för att förbättra noggrannheten. Detta är särskilt viktigt om flera parasitlinjer ska testas sida vid sida. Det har tidigare visats att plasma från semi-immuna barn från PNG signifikant kan spädas före responser avböja 23. Beskrivs här är den optimala utspädning av plasma (1/120, 000 slutlig spädning av plasma) för en kohort av 5 – 12 år gamla PNG barn som producerade det stora utbudet av phagocyt. Osis svar som beskrivs i Figur 5 Detta intervall tillåts för stratifiering av svaren i fyra grupper (0 – 19%, 20-39%, 40-59% och 60-79% fagocytos), och regressionsmodellering visade att opsoniserande svar var associerade med skydd mot klinisk sjukdom och hög densitet parasitemin 10 För olika kohortstudier det kan vara nödvändigt att justera plasmaspädning för att säkerställa att fagocytos av THP-1-celler inte är mättad eller under nivån för detektering.
Flödescytometri möjliggör snabb och kvantifierbara fagocytos med förbättrad noggrannhet över mikroskopi. Detta protokoll är en hög genomströmning, platta baserad och automatiserad förvärv av 96 brunnars plattor för att studera naturligt förvärvad humoral immunitet. Metoden kräver färgning av merozoiter med etidiumbromid, men alternativa DNA-fläckar som SYBRGreen, DAPI och propidium jod, membran fläckar eller proteinfläckar kunde utnyttjas. Denna analys skulle vara mottaglig för priy monocyter eller neutrofiler, och skulle kunna anpassas om fagocytsystemet eller FcR biologi var av intresse. Primära celler eller THP-1 celler differentierade in vitro med PMA kan användas för att studera fagocytos i malaria och andra patogener 12, 32-34. Men med hjälp av primära celler kan vara en utmaning eftersom dessa celler är vidhäftande och även visa icke-antikroppsmedierad fagocytos 35. Dessutom variabilitet i renhet, viabilitet och funktionalitet är några viktiga begränsningar för användning av primära fagocytiska celler. De Fc-receptorer som är inblandade i merozoit fagocytos förblir uncharacterized, och därför använder blockerande antikroppar till specifika Fc receptorer skulle kunna belysa bidraget från varje Fc-receptorn till merozoite fagocytos. Som THP-1 fagocytos är FcR beroende, gör denna enkla tolkning av fagocytos iakttas. Denna analys lämpar sig också för att ta itu med den antigen specificitet opsoniserande antikroppar som skulle kunna uppnås genom utilizing knock-out parasiter för merozoit ytantigener, eller med hjälp av affinitets renade humana antikroppar mot merozoite ytproteiner. Dessutom, i djupstudier av cytokinsvar efter merozoit fagocytos saknas, och kan uppnås med hjälp av denna analys.
Dessa två tekniker är betydande förskott till studiet av funktionella antimerozoite antikroppar. Reningen av högkvalitativa merozoites är fördelaktigt att använda frysförvarade merozoites eller fluorescerande mikrosfärer belagda med merozoite antigener. Även om denna analys har använts som ett verktyg för att utvärdera naturligt förvärvad immunitet, kan det visa sig vara ett viktigt verktyg för att ta itu med förvärvet av immunitet som svar på vaccination. Även om det har nyligen visat att fagocytos eller opsonised merozoites är förknippad med skydd mot klinisk malaria, är det inte möjligt att dra direkta slutsatser från in vitro-THP-1 fagocytos till in vivo phagocytosis av merozoites som fagocytos i denna analys sker under statiska förhållanden och i avsaknad av konkurrerande röda blodkroppar. De potentiella anpassningar av denna analys kan därmed ge ett mångsidigt verktyg för vidare förståelse av malaria och merozoit fagocytos.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill erkänna barn och vuxna plasmagivare, och personalen på Papua Nya Guinea institutet för medicinsk forskning. Författarna vill tacka Amandine B Carmagnac, Catherine Q Nie, Danny W Wilson, Ivo Mueller och Diana S Hansen för deras bidrag till utvecklingen av denna teknik, och tacka den australiska Röda korset för blod-och serum förpackningar. Detta arbete har gjorts möjlig genom viktoriansk delstater Operational Infrastruktur Support och australiska regeringen NHMRC IRIISS. Detta arbete stöddes av National Health och medicinska forskningsråd beviljar # 1031212 och # 637.406, och National Institutes of Health bidrag # AI089686.
THP-1 cell line | American Type Culture Collection | TIB-202 | |
RPMI-1640 | Gibco | 31800-089 | |
Fetal Calf Serum (FCS) | Invitrogen | 10099-141 | |
2-mercapthoethanol | Sigma-Aldrich | M6250-100ML | Use in Fume Hood |
Pen/Strep Solution (100x) | Sigma | P0781 | |
HEPES | SAFC | 90909C | Cell culture grade |
hypoxanthine | Calbiochem | 4010 | |
Human Serum | Donation from Autralian Red Cross | Available commercially (i.e. Invitrogen) | |
sodium bicarbonate (NaHCO3) | Merck | 1.06329.0500 | |
gentamycin | Pfizer | 61022027 | Injection Quality |
heparin Sodium BP (5000IU/mL) | Pfizer | procine origin | |
Blasticidin S-hydrochloride | Sigma-Aldrich | 15205 | |
D-sorbitol | Sigma-Aldrich | 50-70-4 | |
E64 Protease Inhibitor | Sigma-Aldrich | E3132-10MG | |
KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 98281-100G | Use for phosphate buffer |
Na2HPO4.2H20 | Merck | 10383.4G | Use for phosphate buffer |
Giemsa's azur eosin methylene blue solution | Merck | 1.09204.0500 | 1:10 dilution in 6.7mN Phosphate buffer (make fresh each stain) |
EDTA disodium salt | Merck | 10093.5V | 0.1M, pH 7.2 |
Acrodisc Syringe Filters 1.2-μm/32-mm | Pall Life Sciences | 4656 | |
QuadroMACS Separator (for small column) | MACS Miltenyi BioTec | 130-091-051 | Interchangeable with MidiMACS |
VarioMACS Separator (for large columns) | MACS Miltenyi BioTec | 130-090-282 | |
MACS MultiStand | MACS Miltenyi BioTec | 130-042-303 | |
LS Column (small magnetic column) | MACS Miltenyi BioTec | 130-042-401 | |
large magnetic column | MACS Miltenyi BioTec | 130-041-305 | |
Ethidium Bromide | Bio-Rad | 1510433 | Cytotoxic |
CountBright Absolute Counting Beads | Invitogen | C36950 | |
BD FACSCalibur Flow Cytometer with HTS plate reader | BD Biopsciences | ||
EDTA disodium salt | Merck | 10093.5V | 0.1M, pH 7.2 |
FlowJo cytometry analysis software | Tree Star |