Abstract
ज़ेबरा चिड़िया (Taeniopygia guttata) विष विज्ञान 1, 2, व्यवहार 3, और स्मृति सहित और 4,5,6 सीखने अनुसंधान के कई क्षेत्रों में एक तेजी से महत्वपूर्ण जीव मॉडल बन गया है. एक अनुक्रम जीनोम के साथ ही Songbird के रूप में, ज़ेबरा चिड़िया विकासात्मक अध्ययन में इस्तेमाल के लिए काफी संभावना है; हालांकि, ज़ेबरा चिड़िया विकास के प्रारंभिक दौर में अच्छी तरह से अध्ययन नहीं किया गया. ज़ेबरा चिड़िया विकास में शोध की कमी के कारण छोटे अंडे और भ्रूण विदारक की कठिनाई के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है. निम्नलिखित विच्छेदन विधि भ्रूण के विकास के सभी चरणों में आकारिकी और जीन अभिव्यक्ति की जांच के लिए अनुमति देता है जो भ्रूण के ऊतकों को नुकसान, कम से कम. इस उज्ज्वल क्षेत्र दोनों परमिट और भ्रूण के प्रतिदीप्ति गुणवत्ता इमेजिंग, ऐसे सीटू संकरण (ISH), सेल प्रसार assays, और इस तरह के मात्रात्मक इसकी वजह के रूप में मात्रात्मक assays के लिए शाही सेना निकासी में के रूप में आणविक प्रक्रियाओं में उपयोगएल समय पीसीआर (qtRT पीसीआर). इस तकनीक जांचकर्ताओं का उपयोग करने के लिए पहले से मुश्किल थे कि विकास की प्रारंभिक अवस्था का अध्ययन करने के लिए अनुमति देता है.
Introduction
इस तकनीक के समग्र लक्ष्य के विकास के अध्ययन की एक विस्तृत श्रृंखला में प्रयोग के लिए embryogenesis के शुरुआती दौर से ज़ेबरा चिड़िया (Taeniopygia guttata) भ्रूण प्राप्त करने के लिए है. ज़ेबरा चिड़िया प्रमुख Songbird मॉडल जीव बन गए हैं और विष विज्ञान 1,2, व्यवहार 3, स्मृति और 4,5,6, तुलनात्मक neuroanatomy 7,8, सीखने और भाषा के विकास 9,10 सहित विभिन्न क्षेत्रों में बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है . एक अनुक्रम जीनोम के साथ ही Songbird के रूप में, ज़ेबरा चिड़िया ज्ञात पक्षी प्रजातियों 11, 12,13 के 50% से अधिक का प्रतिनिधित्व करता है जो Passeriformes आदेश, आणविक और आनुवंशिक अध्ययन की अनुमति देता है.
क्षेत्र की एक विविध सरणी में वयस्क और किशोर ज़ेबरा चिड़िया के उपयोग के बावजूद, कुछ अध्ययनों से विशेष रूप से विकास के प्रारंभिक दौर के दौरान, ज़ेबरा चिड़िया भ्रूण पर प्रदर्शन किया गया है. यह अपने अंडे एक छोटे आकार के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता हैएन डी भ्रूण, और चिकन (Gallus gallus डोमेस्टिकस) पहले से एक प्रमुख मॉडल प्रणाली 17,18,19,20,21 के रूप में इस्तेमाल किया गया था, जिसमें अध्ययन के लिए एक मॉडल जीव 14,15,16 के रूप में अपने नए स्थिति. हालांकि, गैर मुखर शिक्षार्थियों के रूप में, मुर्गियों मुखर सीखने, मुखर सीखने, आनुवांशिकता, व्यवहार, और मोटर 10 को सीखने में शामिल cortical-बेसल ganglia circuitry के विकास के आनुवंशिक आधार के अध्ययन के लिए एक उपयुक्त मॉडल प्रणाली नहीं कर रहे हैं.
यह ज़ेबरा चिड़िया भ्रूण बहुत अधिक नाजुक और अधिक आसानी से क्षतिग्रस्त विच्छेदन और आणविक प्रक्रियाओं के दौरान लड़की भ्रूण से कर रहे हैं कि नोट करना महत्वपूर्ण है. ज़ेबरा चिड़िया भ्रूण पर permeabilization चरणों का प्रदर्शन जब विशेष रूप से, अधिक से अधिक देखभाल की आवश्यकता होती है. एक लड़की भ्रूण को नुकसान नहीं होगा कि मजबूत डिटर्जेंट और एंजाइमों ज़ेबरा चिड़िया भ्रूण को नुकसान पहुंचा सकते हैं. सामान्य देखभाल के मामले में, यह एक मशीन में नियुक्ति से पहले छोटे कप में ज़ेबरा चिड़िया अंडे डाल करने के लिए आवश्यक हैरोलिंग जब ऊष्मायन के दौरान टूटने से उन्हें रोकने के लिए.
ज़ेबरा चिड़िया आसानी से और prolifically कैद में साल के दौर नस्ल, व्यवहार के अध्ययन के लिए उत्तरदायी हैं, और मुखर सीखते हैं. इन विशेषताओं ज़ेबरा चिड़िया का उपयोग विकास, आनुवांशिकी, और भाषा का व्यवहार सभी पहलुओं को एकीकृत एक मॉडल जीव की आवश्यकता का पता करने के लिए अनुमति देते हैं. ज़ेबरा चिड़िया 22 को विशिष्ट एक हाल ही में विकसित मचान गाइड के साथ संयुक्त नीचे विस्तृत dissections के तरीकों, ज़ेबरा चिड़िया एक तेजी से उपयोगी मानकीकृत विकासात्मक जीव मॉडल बनाते हैं. हालांकि, प्रारंभिक अवस्था में भ्रूण प्राप्त करने के कठिन हो सकता है. इस प्रोटोकॉल जांचकर्ताओं आसानी प्रारंभिक चरण भ्रूण प्राप्त करने के लिए अनुमति देता है. ज़ेबरा चिड़िया में जटिल व्यवहार, या अन्य छोटे में विकास पर जहर प्रभाव के प्रारंभिक विकास और आणविक विकासात्मक आधार की जांच के अध्ययन, गौरैया पक्षी इस विच्छेदन पद्धति उपयोगी पाएंगे.
Protocol
आचार विवरण: तरीकों विलियम और मरियम के कॉलेज में प्रजनन कॉलोनी से पालतू ज़ेबरा फिन्चेस के साथ आयोजित किया गया. सभी प्रक्रियाओं RSPCA दिशा निर्देश 23 पीछा किया और विलियम और मरियम के OLAW (प्रयोगशाला पशु कल्याण कार्यालय) पशु कल्याण आश्वासन (# A3713-01) के कॉलेज द्वारा अनुमोदित किया गया है और (# 2013-06 संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) अनुमोदन किया था -02-8721-dacris).
1. अंडा संग्रह और ऊष्मायन
- अंधेरे चक्र: एक 14:10 प्रकाश पर ज़ेबरा चिड़िया जोड़े स्थापित करना. भोजन, पानी, घास, और एक घोंसला बॉक्स यथेच्छ आपूर्ति. नोट: ज़ेबरा फिन्चेस के लिए नियमित देखभाल और प्रजनन अच्छी तरह से 23 में वर्णित किया गया है.
- झुकने अलमारियों के साथ एक मानक लड़की इनक्यूबेटर तैयार करें. नोट: एक दैनिक आधार पर इनक्यूबेटर की तह तक पानी जोड़कर 95% नमी - - 80 के साथ डिग्री सेल्सियस (1 /) 37.5 पर कृत्रिम इनक्यूबेटर बनाए रखें. इनक्यूबेटर दो दिनों के लिए संतुलित करने की अनुमति देंउपयोग करने से पहले.
- इनक्यूबेटर में अंडे पकड़ करने के लिए कम से कम 2.5 सेमी गहरी छोटे फ़ीड कप (5 एक्स 7.6 सेमी) का चयन करें. अभी भी अंडे आसानी से रोल करने के लिए अनुमति देता है, जबकि रेखा के नीचे और कागज तौलिया की दो परतों के साथ कप के निचले किनारों कप, गद्देदार है कि इतनी. इनक्यूबेटर का झुकाव अलमारियों पर इन कप जगह. नोट: बहुत ज्यादा गद्दी रोलिंग बाधित कर सकते हैं, की वजह से खोल इंटीरियर के लिए भ्रूण आसंजन को सफल ऊष्मायन कर पाएगा जो.
- प्रकाश चक्र की शुरुआत निम्न दो घंटे में अंडे ले लीजिए. नोट: यह पैतृक ऊष्मायन के कारण एक दिया ऊष्मायन समय के लिए विकास के चरण में विसंगतियों को कम करता है.
- धीरे से अंडे की लंबाई के साथ टिप और आधार पर अंगूठे और तर्जनी के साथ अंडे उठाओ. घोंसले से एकत्र रखी तारीख और समय लेबल करने के लिए एक सुस्त, मुलायम 4B ग्रेफाइट पेंसिल का प्रयोग करें. नोट: नरम 4B पेंसिल नाजुक खोल तोड़ने पेंसिल का खतरा कम करता है.
- प्रत्येक सी में 5 लेबल अंडे - 1.3.2) 1 जगहइनक्यूबेटर में अंडे आज़ादी खोल के इंटीरियर के लिए भ्रूण आसंजन को रोकने के लिए रोल कर सकते हैं कि इतना ऊपर. नोट: एक कप में 5 से अधिक अंडे रखकर व्यक्ति अंडे की रोलिंग को रोकने और भ्रूण की व्यवहार्यता को कम कर सकते हैं.
अंडे से भ्रूण के 2. निकालना
- , विच्छेदन के लिए तैयार निम्नलिखित सामग्री इकट्ठा करने के लिए: एक स्वच्छ स्केलपेल, ठीक इत्तला दे दी संदंश, और दो अतिरिक्त ठीक इत्तला दे दी संदंश. 10 x 10 सेमी विच्छेदन के लिए एक स्वच्छ, गैर शोषक सतह प्रदान करने के लिए विदारक गुंजाइश के आधार पर कागज का वजन रखें. नोट: यह जर्दी का आसान हेरफेर की अनुमति देता है और एक स्केलपेल के साथ नाजुक झिल्ली को काटने के लिए सबसे अच्छा सतह है क्योंकि तौलना कागज महत्वपूर्ण है.
- एक 50 एमएल polypropylene ट्यूब में फॉस्फेट बफर खारा (1X पीबीएस) के एक विभाज्य तैयार करें, और कम से कम तीन हस्तांतरण pipettes और एक छोटे अपशिष्ट बाल्टी अधिग्रहण. भ्रूण फिक्सिंग, तो 4% paraformaldehyde (पीएफए) के एक विभाज्य तैयार सावधानी:. पीएफए वाष्पकणों विषाक्त कर रहे हैं, एकडी पीएफए से जुड़े सभी कदम जोखिम को कम करने के लिए एक धूआं हुड के अंदर किया जाना चाहिए. फ़्लैश भ्रूण ठंड है, तरल नाइट्रोजन प्राप्त और विदारक गुंजाइश के पास रहते हैं. बाँझपन इस विच्छेदन प्रोटोकॉल के लिए एक मुद्दा नहीं है, लेकिन सभी सामग्री साफ कर रहे हैं सुनिश्चित करते हैं.
- ज़ेबरा चिड़िया मचान गाइड 22 में वर्णित के रूप में वांछित स्तर के लिए आवश्यक समय बिंदु पर इनक्यूबेटर से अंडे निकालें. नोट: 22 12 भ्रूण (चित्रा 3) चरण काटना चरण 6 भ्रूण (चित्रा -4 ए) 22 टुकड़े करना और ऊष्मायन के 56 घंटे के बाद अंडे को दूर करने के लिए ऊष्मायन के 36 घंटे के बाद अंडे निकालें.
- एक फाइबर ऑप्टिक प्रकाशक दीपक का प्रयोग, इंटीरियर रोशन करने के लिए अंडे के माध्यम से अपने ऊर्ध्वाधर अक्ष और चमक प्रकाश के साथ पकड़े द्वारा अंडे मोमबत्ती. अंडे के पीछे प्रकाश की नोक प्लेस और जर्दी और विकासशील भ्रूण का पता लगाने.
- जर्दी विपरीत पक्ष पर छुरी स्थिति और टिप से अंडे के साथ काटाबेहोश दबाव के साथ बेस.
- ध्यान से अंगूठे और तर्जनी के साथ अंडे की नोक और आधार पर दबाव लागू करने, या धीरे संदंश के साथ कटौती के साथ eggshell अलग prying द्वारा द्वारा अंडे की सामग्री निकालें. जर्दी धीरे बाहर रोल इतना है कि सीधे तौलना कागज के ऊपर अंडे खोलें.
- भ्रूण विकास encircling एक बेहोश सफेद अंगूठी के रूप में दिख रहा है और भ्रूण केंद्र में स्थित है, इसलिए है कि अतिरिक्त ठीक उपयोग कर जर्दी संदंश इत्तला दे दी पूरबी जो जंक्शन का सफेद क्षेत्र के लिए जर्दी जांच करते हैं.
नोट: जर्दी की सतह पर एक बेहोश सफेद वृत्त नहीं मनाया जाता है, तो ठीक संदंश ले और धीरे भ्रूण की जर्दी के शीर्ष पर है जब तक की जर्दी पर रोल. नोट: चरणों के लिए 1 - 9 22, भ्रूण डिस्क व्यास में कम से कम 6 मिमी है और जर्दी की सतह पर एक बेहोश, थोड़ा अपारदर्शी डिस्क के रूप में दिखाई दे रहा है - संदर्भ के लिए चित्रा 1 देखें. चरणों के लिए 10 और बड़ी उम्र के 22, रक्त पूल में सुधार वी की अनुमतिभ्रूण की isibility, लेकिन इस मुश्किल भ्रूण लगाने बनाता है, जर्दी थैली puncturing से बचने के लिए ध्यान रखना.
अतिरिक्त भ्रूण ऊतक से भ्रूण के 3. पृथक्करण
- दबाव (चित्रा 1 बी) को राहत देने की जर्दी के किनारों पंचर, और भ्रूण डिस्क के साथ की जर्दी व्यास की लंबाई भर में ही कटौती कर. भ्रूण युक्त जर्दी की धारा सफलतापूर्वक (चित्रा 1 बी) अलग किया गया है, जब तक इन विकर्ण लाइनों बनाने दोहराएँ. नोट: यह चरण की जर्दी जन बरकरार रहने के लिए अनुमति देता है, लेकिन भ्रूण संरचनाओं को नुकसान को रोकने, भ्रूण के आसपास जब काटने की जर्दी की सतह पर कम दबाव अधिक परिशुद्धता के लिए अनुमति देता है.
- एक हस्तांतरण विंदुक के साथ की जर्दी के किनारों निकालें. जितना संभव हो उतना जर्दी निकालें, लेकिन भ्रूण तौलना कागज और आंसू की शुष्क सतह का पालन नहीं करता है तो एक छोटी राशि छोड़: ध्यान दें.
- Dispens द्वारा भ्रूण डिस्क धो लेंभ्रूण के नीचे की दिशा में एक 45 डिग्री के कोण पर 1X पीबीएस आईएनजी. अगले करने वाली नहीं ऊपर भ्रूण डिस्क हस्तांतरण पिपेट की नोक रखें. जर्दी अतिरिक्त जरूरतों को हटाया जा सके हैं, पेट्री डिश के लिए भ्रूण स्थानांतरित करने से पहले तौलना कागज पर छुरी के साथ किसी भी जर्दी अलग. नोट: इस विधि का वजन कागज की सतह से भ्रूण को हटा.
- एक छोटा सा, प्लास्टिक पेट्री डिश के लिए 1X पीबीएस की एक न्यूनतम मात्रा के साथ एक हस्तांतरण पिपेट का उपयोग भ्रूण स्थानांतरण. भ्रूण, पर सीधे नहीं पेट्री डिश में अधिक 1X पीबीएस जोड़ने और निकट 1X पीबीएस टपकता है, लेकिन द्वारा भ्रूण धो लें. पेट्री डिश हस्तांतरण विंदुक के साथ बेकार 1X पीबीएस धोने और हटाने अवशिष्ट जर्दी, पेट्री डिश झुकाव, और दूर करने के लिए जल का भँवर.
नोट: 1X पीबीएस निकाल दिया जाता है प्लास्टिक की सतह अवशिष्ट 1X पीबीएस के साथ फिसलन है, क्योंकि भ्रूण आमतौर पर पेट्री डिश के नीचे का पालन नहीं करता है. भ्रूण पकवान से चिपक हालांकि, अगर अधिक 1X पीबीएस जोड़ा जा सकता है.
अगर फिक्सिंग टीवह भ्रूण, कदम 3.5 और 3.6 का पालन करें. फ़्लैश भ्रूण ठंड है, तो तुरंत 3.8 कदम को छोड़. - स्वस्थानी संकरण में के लिए भ्रूण फिक्सिंग, तो तुरंत भ्रूण डूब पेट्री डिश के लिए 4% पीएफए जोड़ें. इसे समतल करने के क्रम में भ्रूण के शीर्ष पर सीधे 4% पीएफए ड्रिप; इस कर्लिंग से भ्रूण रोकता है. 12 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 4% पीएफए में भ्रूण को ठीक करें.
- निर्धारण के बाद, वर्गीकृत मेथनॉल 100% MeOH में -20 डिग्री सेल्सियस पर (MeOH) समाधान और दुकान में भ्रूण निर्जलीकरण.
- भ्रूण चरणों 1 के बीच है - 8, 22, भ्रूण का पालन पीतक झिल्ली को हटा दें. नोट: यह चरण निर्धारण के दौरान या बाद में किया जा सकता है. वे पीतक झिल्ली का पालन करना है, क्योंकि चरण 8 से 22 की तुलना में छोटी भ्रूण आसानी चित्रा 2A में देखा के रूप में महत्वपूर्ण संरचनाओं ढक कल्पना नहीं कर रहे हैं.
- पकड़ अतिरिक्त ठीक संदंश के साथ जंक्शन के क्षेत्र से परे फैली हुई है कि झिल्ली के किनारे. Carefully अवशिष्ट जर्दी कणिकाओं दूर धोने के लिए और पीतक झिल्ली को भ्रूण डिस्क का पालन ढीला करने के लिए कई बार से अधिक भ्रूण फ्लिप. नोट: इस भ्रूण संरचनाओं को नुकसान होगा, जैसा कि भ्रूण की केंद्र को छुआ तक नहीं.
- एक अंतराल जंक्शन के क्षेत्र और पीतक झिल्ली के बीच प्रकट नहीं होता है, तो धीरे अतिरिक्त ठीक से जंक्शन के क्षेत्र पीतक झिल्ली से ढीला करने के संदंश इत्तला दे दी खरोंच. पकड़ अतिरिक्त ठीक से पीतक झिल्ली संदंश इत्तला दे दी और धीरे दूर भ्रूण से यह पुल. यदि आवश्यक हो, धीरे जंक्शन के क्षेत्र में भ्रूण डिस्क के परिधीय बढ़त उत्साहित से दूर पीतक झिल्ली से भ्रूण खींच.
- हटाने के बाद biohazard 1 अपशिष्ट (जैव सुरक्षा स्तर 1) में पीतक झिल्ली त्यागें.
- लड़की भ्रूण 24, 25 के लिए मानक पूरे माउंट ISH प्रोटोकॉल का पालन, लेकिन निम्नलिखित सुझावों पर विचार, युवा भ्रूण चरणों पर एक ISH परख का आयोजन करते हैं.
- भ्रूण चरण 0 - 6 22, कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 1X PTW में 5 ग्राम / एमएल proteinase कश्मीर के साथ व्यवहार करते हैं. पृष्ठभूमि धुंधला कम करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 1X PTW में 12 22 10 के साथ ग्राम / एमएल proteinase कश्मीर - भ्रूण 7 मंचन समझो.
- 12 घंटे के लिए 10 माइक्रोग्राम / एमएल जांच एकाग्रता के साथ सेते हैं, 10 से 22 - चरणों 1 में जीन की अभिव्यक्ति के निम्न स्तर का पता लगाने के लिए पर्याप्त रंग की प्रतिक्रिया का उत्पादन करने के लिए. पुराने दौर के लिए, 1 & # साथ सेते956, 60 डिग्री सेल्सियस पर ग्राम / मिलीलीटर जांच एकाग्रता
4. Edu सेल प्रसार परख. निगमन और ज़ेबरा चिड़िया भ्रूण में edu की जांच.
- भ्रूण या जर्दी का पता लगाने के लिए एक फाइबर ऑप्टिक प्रकाशक दीपक का उपयोग अंडा मोमबत्ती.
- भ्रूण microinjection प्रक्रिया के दौरान क्षतिग्रस्त नहीं है कि यह सुनिश्चित करने के लिए अंडे के भीतर भ्रूण या जर्दी के स्थान पर अंडा विपरीत की ओर निशान.
- रेखा वांछित अभिविन्यास में अंडे पकड़ करने के लिए एक कटोरी के आकार में क्ले मॉडलिंग और मोल्ड इसके साथ एक 60 मिमी प्लास्टिक पकवान. उल्लेखनीय स्थान होना चाहिएmicromanipulator का उपयोग microinjection सुई की प्रविष्टि की अनुमति के लिए उन्मुख. नोट: मिट्टी microinjection के दौरान और कदम 4.11 में ऊष्मायन के दौरान अंडा स्थिर होगा.
- दो गिलास केशिका microinjection सुई खींचो. उल्लेखनीय मौके पर अंडे में एक छेद प्रहार करने के लिए एक सुई कुंद. खनिज तेल के साथ यह backloading और microinjector में डालने से इंजेक्शन के लिए दूसरा microinjection सुई तैयार करें.
- Microinjector पर 59.8 नाथन को इंजेक्शन प्रति जारी कर समाधान की मात्रा निर्धारित करें.
- 10 मिमी शेयर edu समाधान के साथ microinjection सुई लोड.
- खोल चकनाचूर या अंडा गुहा में खोल के टुकड़े ड्रॉप नहीं, देखभाल करने के पा गिलास केशिका के साथ चिह्नित स्थान पर खोल में एक छेद बना. छेद microinjection सुई की जर्दी या भ्रूण को गुहा के माध्यम से सीधे सम्मिलित करने के लिए अनुमति देता है, एक 45 डिग्री के कोण पर इतना है कि अंडा पूरबी.
- Micromanipulator का उपयोग, सम्मिलितलगभग 1.0 सेमी गुहा में सुई भरा हुआ है.
- सीधे विकासशील भ्रूण या जर्दी पर edu समाधान के वांछित राशि इंजेक्षन. नोट: edu के 478 NL अधिकतम भ्रूण मौत में जिसके परिणामस्वरूप बिना इंजेक्शन जा सकता है.
- इसके तत्काल बाद अंडा और ऊष्मायन के दौरान भ्रूण के शुष्क्ीकरण को रोकने के लिए पकवान कवर करने के लिए प्लास्टिक की चादर के कई परतों के साथ अंडा और मिट्टी धारक लपेटो. प्लास्टिक के टेप किनारों ऊष्मायन के दौरान unwrapping से प्लास्टिक को रोकने के लिए पकवान की तह तक लपेटो. नोट: प्लास्टिक की चादर के ही विच्छेदन से पहले तुरंत हटाया जाना चाहिए.
- वांछित स्तर तक पहुँच जाता है जब तक नव proliferating कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर अंडे incubating द्वारा edu को शामिल करने की अनुमति दें. इंजेक्शन के बाद इनक्यूबेटर में अलमारियों झुकने को अंडा वापस नहीं करते. इनक्यूबेटर अंदर स्थिर सतह पर प्लास्टिक लिपटे मिट्टी अटे पकवान.
- प्लास्टिक की चादर निकालें और aforementioned प्रोटोकॉल के बाद भ्रूण काटना.4% पीएफए में भ्रूण फिक्स और ऊपर वर्णित के रूप में 4 डिग्री सेल्सियस 12 घंटा सेते हैं. निर्धारण के बाद, आगे के विश्लेषण तक -20 डिग्री सेल्सियस पर ताजा 100% EtOH में 5 मिनट और दुकान के लिए 100% इथेनॉल (EtOH) से धो लें.
5. Edu रिएक्शन प्रोटोकॉल "क्लिक"
निम्नलिखित कदम सभी कांच की शीशियों में प्रदर्शन कर रहे हैं.
- निम्न में से लगातार 5 मिनट washes के साथ भ्रूण rehydrate:
- EtOH, 75% EtOH और 25% बाँझ विआयनीकृत 25% EtOH और 75% 1x PTW, 100% 1x PTW, (SDD) पानी, 50% EtOH और 50% SDD पानी आसुत
- 10 मिनट प्रत्येक के लिए 100% 1x PTW में तीन बार धोएं.
- 9 भागों में 10X स्टॉक बफर समाधान (10 μl) के 1 भाग के संयोजन से प्रतिक्रिया बफर additive (किट घटक एफ) पतला पानी (90 μl) SDD.
- मिश्रण से एक अलग ट्यूब में प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार करें निम्नलिखित: 100 μl पतला प्रतिक्रिया बफर additive के 875 μl 1X पीबीएस, 20 μl CuSO 4, 5 μl azide,.नोट: प्रतिक्रिया मिश्रण की मात्रा नीचे पहुंचा जा सकता है. भ्रूण पूरी तरह से प्रतिक्रिया मिश्रण में कवर किया जाता है, तो प्रतिक्रिया काम करेंगे. तुरंत उपयोग करने से पहले पतला प्रतिक्रिया बफर additive (5.3 कदम) जोड़ें. सभी बाद के चरणों अंधेरे में प्रदर्शन कर रहे हैं. प्रकाश से बचाने के लिए पन्नी के साथ भ्रूण को कवर.
- एल्यूमीनियम पन्नी के साथ शीशियों को कवर, और एक nutator से जुड़ी एक स्टायरोफोम रैक में उन्हें रखने के द्वारा दो घंटे के लिए कमरे के तापमान पर खड़ी उन्हें सेते हैं.
- 10 मिनट प्रत्येक के लिए ताजा 1X पीबीएस में भ्रूण 3 बार धोएं.
- 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात ताजा 4% पीएफए में भ्रूण सेते
- 4 डिग्री सेल्सियस पर ताजा 1X पीबीएस में 10 मिनट प्रत्येक और दुकान के लिए 1X पीबीएस में 3 बार धोएं आगे के विश्लेषण तक पन्नी के साथ भ्रूण को कवर.
Representative Results
पीतक झिल्ली (ए) से जुड़ी है और जर्दी (बी) से भ्रूण को अलग करने के लिए उचित विधि का प्रदर्शन करते हुए चित्र 1 में diagrammed कदम भ्रूण की उपस्थिति का संकेत मिलता है. भ्रूण पीतक झिल्ली से बहुत हल्का है जो जंक्शन के क्षेत्र से पहचाना जा सकता है. जर्दी दूर कट जाता है जब तक भ्रूण में ही भेद अक्सर मुश्किल होता है. भ्रूण अंडे से विच्छेदित हो जाने के बाद यह तय किया जा सकता है या फ़्लैश भविष्य में उपयोग के लिए जमे हुए. स्वस्थानी संकरण में एक विच्छेदित भ्रूण के लिए योजना बनाई गई है, तो यह जंक्शन के क्षेत्र के माध्यम से भ्रूण का पालन किया है कि पीतक झिल्ली को दूर करने के लिए आवश्यक है. इस झिल्ली (सी) निकाले जाने के बाद 2 भ्रूण के बेहतर दृश्यता दिखाता है चित्रा, और पीतक झिल्ली (ए, बी) छील करने के लिए उचित तरीका है. विच्छेदन और निर्धारण के बाद, पूरे स्वस्थानी संकरण में माउंट चित्रा 3 (ए, ए ', बी, बी के रूप में देखा गया था प्रदर्शन') और चित्रा 4 (ए, ए', बी, बी ') और चित्रा 5 (ए, बी, सी) orthodenticle homeobox 2 developmentally methylmercury की कम मात्रा के संपर्क में भ्रूण में (Otx2) अभिव्यक्ति में अंतर का पता लगाने के लिए. 5 दिखाता है भावना जांच के परिणाम, पृष्ठभूमि के प्रदर्शन की कमी है. नियंत्रण भ्रूण 6 22 (ए, एक मंच के लिए विकसित किया है, जबकि चित्रा 4 में, एक ही समय बिंदु पर अंडे से विच्छेदित होने के बावजूद, developmentally methylmercury (MeHg) के संपर्क में भ्रूण, चरण 5 22 (बी, बी ') के लिए आगे बढ़े '). विच्छेदित और 4 चित्र में दिखाया भ्रूण के समूह घोंसला से एकत्र की है और एक ही समय में इनक्यूबेटर से लिया गया था. कुछ प्राकृतिक विभिन्नता विकास में मौजूद है हालांकि, पिछले विच्छेदन डेटा पर आधारित है, यह इनक्यूबेटर में तापमान के उतार चढ़ाव केवल 2.4 पीपीएम methylmercury भ्रूण विकास होने का कारण होता है कि संभावना नहीं हैpmentally देरी. चरणों में मतभेद developmentally methylmercury के संपर्क में भ्रूण में सेल प्रसार में परिवर्तन का संकेत मिलता है.
विच्छेदन से पहले, edu एक दिन 2 अंडे में इंजेक्ट किया और रातोंरात सेते की अनुमति दी थी. चरण 16 से 22 भ्रूण का विच्छेदन और निर्धारण के बाद, edu चित्रा 6 (ए, बी, सी) के रूप में देखा proliferating कोशिकाओं का पता लगाने की अनुमति, रसायन शास्त्र "पर क्लिक करें" का उपयोग कल्पना की गई थी. यह विकास की प्रगति को बाधित कर सकते methylmercury के लिए जोखिम के रूप में, इनक्यूबेटर में और dissections के दौरान अंडे रखने या edu परख प्रदर्शन जब ध्यान से समय बिंदुओं पर नजर रखने के लिए महत्वपूर्ण है. जल्द से जल्द इंजेक्शन 1.3 चरण में निर्दिष्ट के रूप में संग्रह का दिन था जो दिन 0, पर प्रदर्शन किया गया था. इस भ्रूण लगभग 38 घंटे बाद (चरण 7 22) विच्छेदित किया गया था. जीवित रहने की दर के रूप में लंबे समय के इंजेक्शन राशि 478 NL तहत किया गया था के रूप में लगभग 90% (नियंत्रण भ्रूण के रूप में एक ही दर) हो पाया था.
से 22 भ्रूण विदारक के बाद, एक शाही सेना निकासी 7 चित्र के रूप में देखा, कोई अनुकूलन की आवश्यकता के साथ निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार किया गया था. पीतक झिल्ली को हटाने की शाही सेना निकासी और बाद में QRT-पीसीआर अनुप्रयोगों के लिए अनावश्यक था.
नोट: पूर्वकाल और कूल्हों क्षेत्रों क्रमशः, छवियों के ऊपर और नीचे इतना है कि सभी भ्रूण आंकड़े उन्मुख होते हैं.
चित्रा 1. ज़ेबरा चिड़िया भ्रूण लगाने और विदारक के लिए प्रक्रिया, 1-10 22 चरणों. बेहोश सफेद डिस्क (ए) स्पष्ट है जब तक धीरे जर्दी रोलिंग द्वारा भ्रूण का पता लगा. एक बारभ्रूण की जर्दी के केंद्र में स्थित है, जर्दी पहली कट (1) और बाद में कटौती (2) है जो जंक्शन (ZJ) का क्षेत्र सीमा पीतक झिल्ली के दबाव से राहत मिलती है, जहां एक stepwise फैशन (बी) में विच्छेदित है पीतक झिल्ली का पालन किया. स्केल सलाखों 1 मिमी का प्रतिनिधित्व करते हैं.
पीतक झिल्ली और भ्रूण संरचनाओं की दृश्यता का चित्रा 2. निकालना. 4% पीएफए युक्त एक पेट्री डिश में जर्दी से भ्रूण को हटाने, जगह भ्रूण के बाद. स्वस्थानी संकरण में एक प्रदर्शन की जरूरत है, तो भ्रूण संरचनाओं की दृश्यता आवश्यक है और पीतक झिल्ली (ए) को हटाने के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है. पकड़ अतिरिक्त ठीक से पीतक झिल्ली संदंश इत्तला दे दी और यदि आवश्यक हो तो धीरे, सबसे बाहरी किनारे पर सीधे भ्रूण से निपटने के द्वारा दूर भ्रूण से यह छील(बी). Vitelline झिल्ली हटाने भ्रूण संरचनाओं की स्पष्टता बढ़ जाती है, और भ्रूण स्वस्थानी संकरण (सी) में साथ imaged या संसाधित करने की अनुमति देता है. स्केल सलाखों 1 मिमी का प्रतिनिधित्व करते हैं. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 3. पूरे माउंट स्वस्थानी संकरण में विकासात्मक orthodenticle homeobox 2 (Otx2) की methylmercury. अभिव्यक्ति पैटर्न को उजागर ज़ेबरा चिड़िया भ्रूण पर प्रदर्शन 0.0 पीपीएम methylmercury (ए, ए ') और 2.4 पीपीएम methylmercury (बी, बी के संपर्क में भ्रूण में विशेषता थे ') पैतृक आहार के माध्यम से. Dorsal (ए) और Otx2 के उदर (ए ') अभिव्यक्ति इलाज समूह भ्रूण एक ही समय बिंदु पर विच्छेदित किए गए. चरण 12 22 के दौरान मध्यमस्तिष्क और ऑप्टिक पुटिका भर में दिख रहा है, लेकिन developmentally (बी) पृष्ठीय के रूप में देखा देरी हुई और चरण 11 22 संकेताक्षर के लक्षण हैं, जो सिर संरचनाओं, के उदर (बी) देखें:. MB, मध्यमस्तिष्क; सेशन, ऑप्टिक पुटिका. स्केल सलाखों 1 मिमी का प्रतिनिधित्व करते हैं.
चित्रा 4. पूरे माउंट बगल में संकरण developmentally orthodenticle homeobox 2 (Otx2) की methylmercury. अभिव्यक्ति पैटर्न को उजागर ज़ेबरा चिड़िया भ्रूण पर प्रदर्शन चरण 6 22 Embry में विशेषता थे ओएस 0.0 पीपीएम methylmercury (ए, ए ') और चरण 2.4 पीपीएम methylmercury (बी, बी के संपर्क में 5 से 22 भ्रूण' पैतृक आहार के माध्यम से) से अवगत कराया. लघुरूप: बजे, mesoderm के पूर्वकाल मार्जिन; नहीं, पृष्ठदंड, पृष्ठरज्जु mesoderm; पीओ, proamnion, पूर्वकाल ब्लास्टोपोर; पुनश्च, आदिम लकीर 22. स्केल सलाखों 1 मिमी का प्रतिनिधित्व करते हैं.
चित्रा 5. पूरे बगल में माउंट संकरण भावना जांच का उपयोग ज़ेबरा चिड़िया भ्रूण पर प्रदर्शन किया. (ए) स्टेज 5 22 भ्रूण. (बी) के प्रारंभिक चरण 6 22 भ्रूण. (सी) स्टेज 11 22 भ्रूण. स्केल सलाखों 1 मिमी का प्रतिनिधित्व करते हैं.
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चित्रा 6. Edu समावेश और ज़ेबरा चिड़िया भ्रूण में डे tection. Edu रसायन शास्त्र एक चरण 16 से 22 भ्रूण (ए, बी, सी) में proliferating कोशिकाओं का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया था "क्लिक". Edu thymidine 26, 27 के स्थान पर डीएनए में शामिल किया है और क्लिक रसायन शास्त्र में 27 का उपयोग कर पाया है. प्रसार somites के पार्श्व किनारों, और tailbud में स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहा है. पैनल एक भ्रूण के पीछे में विशेष रूप से होने वाली प्रसार से पता चलता है और यह भी व्यक्तिगत proliferative कोशिकाओं से पता चलता है. पैनल बी पूरे भ्रूण में proliferative स्थानों से पता चलता है. पैनल सी पूर्वकाल क्षेत्र से पता चलता है, और अधिक से अधिक विस्तार में अत्यधिक proliferative telencephalon (ते) से पता चलता है. लघुरूप: वायु सेना, एमनियोटिक गुना; flb, forelimb कली; HLB, hindlimb कली; Le, लेंस पुटिका; एमएस, mesencephalon; MT, Metencephalon; OPC, ऑप्टिक कप; देहात, ग्रसनी आर्क; एसएम, विखंड mesoderm; टीबी, tailbud; ते, telencephalon. स्केल सलाखों 1 मिमी का प्रतिनिधित्व करते हैं. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
विच्छेदित ज़ेबरा चिड़िया भ्रूण. नियंत्रण (0.0 पीपीएम) और 1.2 पीपीएम methylmercury भ्रूण से निकाले शाही सेना के 7 चित्रा. गुणवत्ता विच्छेदित और कदम 3.8 में वर्णित के रूप में फ्लैश जमे हुए थे. प्रत्येक लेन प्रत्येक उपचार समूह से दो homogenized भ्रूण से निकाले शाही सेना से पता चलता है.
Discussion
एक embryological मचान गाइड 22 और जीनोम एनोटेशन की हाल ही में विकास ज़ेबरा चिड़िया विकास अध्ययन के लिए एक वांछनीय जीव मॉडल बनाते हैं. हालांकि, चरणों 1 में 3 से 7 मिमी लेकर ज़ेबरा चिड़िया भ्रूण के छोटे आकार और कमजोरी - 10 से 22, 11, 14 dissections कठिन बना सकते हैं. पता लगाने और सफाई की जर्दी की सतह से भ्रूण को हटाने चुनौतीपूर्ण हो सकता है. इस प्रोटोकॉल आसानी से कार्यविधि को पूरा करने के लिए पर्याप्त विस्तार प्रदान करता है. इस प्रोटोकॉल एक सफल विच्छेदन सुनिश्चित करने के लिए आम तौर पर ज्ञात नहीं कर रहे हैं, लेकिन जरूरी है कि महत्वपूर्ण कदम दर्शाता है. उदाहरण के लिए, यह भ्रूण और चिपके रोकता कागज तौलना की चादर के बीच की जर्दी के एक छोटे से परत छोड़ने के लिए आवश्यक है.
भ्रूण की पहचान और हटाने दोनों मुश्किल हो सकता है. यह है के बाद जर्दी की सतह पर भ्रूण की पहचान करने के निवारण के लिए सीधे जर्दी ऊपर प्रकाश चमकअंडे से निकाल दिया, और भ्रूण को खोजने के लिए एक 45 डिग्री के कोण पर जर्दी पर देखने के लिए किया गया. भ्रूण स्थित है, एक बार भ्रूण आंसू नहीं देखभाल करने के लिए कागज का वजन पर जर्दी काटा.
संरचनाओं के बेहतर दृश्य के लिए 8 से 22 - आगे अनुप्रयोगों संरचनात्मक स्वस्थानी संकरण में मतभेद,, या सेल प्रसार assays के लिए इमेजिंग शामिल हैं, तो यह चरण 1 में पीतक झिल्ली को दूर करने के लिए महत्वपूर्ण है. प्रारंभिक दौर में जर्दी या पीतक झिल्ली को हटाने जब कठिनाइयों का सामना करते हैं, तो भ्रूण कमजोरी को कम करने के लिए 1x पीबीएस में इसे धोने से पहले 4% पीएफए में भ्रूण को ठीक. वर्णित के रूप में पहली विच्छेदन के दौरान पीतक झिल्ली को दूर करके, संरचनाओं स्वस्थानी संकरण में एक प्रदर्शन के बाद स्पष्ट रूप से ज़ेबरा चिड़िया भ्रूण में दिखाई और बरकरार हैं.
Edu की एक सीमा है कि भ्रूण विपत्ति को 478 NL सुराग से अधिक खुराक संस्करणों की है कि प्रशासन है. हालांकि, विशाल खुराक रेंज varyin अनुमति देता हैproliferative सेल टैगिंग के ग्राम स्तरों.
इस किट में इस्तेमाल किया "क्लिक" प्रतिक्रिया कॉपर (आई) उत्प्रेरित-alkyne-अब्द-cycloaddition (घन (आई) एएसी) है. इस विशेष प्रतिक्रिया में, एक alkyne युक्त thymidine एनालॉग अणु (edu) सक्रिय रूप से कोशिकाओं को विभाजित करके शामिल किया है. edu में alkyne समूह डीएनए के पेचदार संरचना से protrudes, और मुक्त alkyne समूह को बांधता है, जो एक हरे रंग, फ्लोरोसेंट अणु संयुग्मित एक azide अणु के लिए जोखिम का पता चला है. हरी प्रतिदीप्ति भ्रूण में नव proliferating कोशिकाओं से पता चलता है. इन प्रतिक्रियाशील प्रजातियों के जीवों में स्वाभाविक रूप से मौजूद नहीं हैं क्योंकि azide की जैव orthogonality और alkyne समूह गैर विशिष्ट धुंधला रोकता है. डीएनए होने के लिये प्रतिक्रिया के लिए आदेश में विकृत करने की आवश्यकता नहीं है, क्योंकि आगे डीएनए निर्भर विश्लेषण आसानी से 27 किया जा सकता है.
इस पद्धति का एक अंतर्निहित सीमा छोटे आकार और frag हैज़ेबरा चिड़िया भ्रूण की ility. सावधानी के साथ प्रदर्शन नहीं तो 15 से 22 हानिकारक भ्रूण संरचनाओं में परिणाम कर सकते हैं - भ्रूण की पीतक झिल्ली निकाल रहा है 1 चरणों. हालांकि, इस प्रोटोकॉल जांचकर्ताओं पहले से गहराई में अध्ययन नहीं किया गया है कि संरचनात्मक विसंगतियों और जीन अभिव्यक्ति की जांच करने के लिए जल्दी भ्रूण चरणों का उपयोग करने की अनुमति, विच्छेदन विधि सरल करता है. इस प्रोटोकॉल जांचकर्ताओं वयस्क phenotypes के विकास की मूल निर्धारित करने की अनुमति देगा कि सेलुलर आणविक assays के एक बहुतायत के लिए रास्ता खुल जाता है. उदाहरण के लिए, यह जीन अभिव्यक्ति विभिन्न पर्यावरणीय परिस्थितियों में मुखर सीखने में फंसा या विकास 28, 29,30,31 के प्रारंभिक चरणों में औषधीय उपचार के बाद जांच के लिए संभव हो जाएगा. इस पत्र में प्रदर्शन नहीं हालांकि, इस विधि संभावित ज़ेबरा चिड़िया ऊतक वर्गों और electroporation / ओवर्स में स्वस्थानी संकरण में इस तरह के रेडियोधर्मी रूप में अन्य प्रक्रियाओं के लिए अनुमति देता हैओ सर्जरी 32, 33,34. ज़ेबरा चिड़िया साहित्य का एक विशाल शरीर के भीतर एक महत्वपूर्ण मॉडल जीव के रूप में स्थापित किया गया है यह देखते हुए कि इस तरह के अध्ययन, वयस्क शरीर विज्ञान और व्यवहार के साथ विकास तंत्र संपर्क भाषा 7, 9 की विशेष रूप से विकास करने के लिए अप्रयुक्त अवसर प्रदान.
Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
लेखक अपने धन स्रोतों, विलियम और मरियम के कॉलेज को हॉवर्ड ह्यूजेस मेडिकल इंस्टीट्यूट स्नातक विज्ञान शिक्षा कार्यक्रम धन्यवाद; अनुदान प्रायोजक: एनआईएच (एमएसएस); अनुदान संख्या: R15NS067566. उन्होंने यह भी जानवरों की देखभाल के साथ सहायता के लिए कला और विज्ञान के विलियम और मरियम के कॉलेज, जीव विज्ञान विभाग और कॉलेज से समर्थन को स्वीकार करते हैं.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chicken egg incubator | We use a Picture Window Hova-Bator Incubator, Circulated Air Model | ||
| Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging kit | Invitrogen | C10337 | Detection of cell proliferation. |
| Dissection microscope | We use Olympus SZ61 | ||
| 7'' Drummond capillary for Nanoject II injector | Drummond | 3-00-203-G/X | |
| Drummond Nanoject II microinjector | Drummond | ||
| Dumont Tweezers #55 | World Precision Instruments | 14099 | |
| Ethanol (EtOH) | |||
| 50 ml Falcon tube (polypropylene) | Fisher Scientific | 06-443-18 | |
| FastPrep Lysis Matrix H tubes | MP biomedicals | 6917-100 | Used for RNA extraction, used to homogenize embryos |
| Fiber optic illuminator lamps (High Intensity Illuminator) | Dolan-Jenner Industries | Fiber-Lite MI-150 | |
| Glass vials with screw cap (DEPC treated) | Fisher Scientific | 03-338A | |
| Microcentrifuge eppe tube (1.5 ml) | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M-8410 | |
| Modeling Clay | Any brand | ||
| Narshige PB-7 needle puller | Narshige | ||
| Omni Bead Ruptor Homogenizer | OMNI International | 19-010 | Used for RNA extraction |
| 4% Paraformaldehyde (4% PFA): 20 ml 8% PFA (32 g paraformaldehyde, 350 ml sdd H2O, adjust pH to 7.6, 400 ml sdd H2O), 20 ml 2x PBS | Fixation of embryos. Caution, is harmful and do not inhale. | ||
| Phosphate buffered saline (1x PBS): 200 ml 10x PBS, 1,800 ml Barnstead H2O, adjust pH to 7.4 | |||
| Phosphate buffered saline (10x PBS): 800 ml Barnstead, 2.013 g KCL, 80.063 g NaCl, 2.722 g KH2PO4 monobasic, 14.196 g Na2HPO4 dibasic, 200 ml Barnstead H2O, adjust pH to 6.5 | |||
| Phosphate buffered saline with 0.1% Tween-20 (1x PTw): 1,800 ml Barnstead H2O, 200 ml 10x PBS, adjust pH to 7.4, 2 ml Tween-20 | |||
| 35 ml Plastic Petri dish | Fisher Scientific | 08-757-100A | |
| plastic wrap | Any brand | ||
| Prepease RNA Spin Kit | PrepEase, Affymetrix | 78766 1 KT | Used for RNA extraction, used to homogenize embryos |
| Reaction Mix: 875 μl 1xPBS, 100 mM 20 μl CuSO4 (Kit Component E), 5 μl Alexa Fluor 488 azide (Kit Component B), 100 μl diluted reaction buffer additive (Kit Component F) | Invitrogen | C10337 | Detection of cell proliferation. |
| sdd H2O | |||
| Seed cup | We use it as a container when incubating eggs | ||
| Stainless steel scalpel | |||
| Standard nest box | We use Abba Plastic Finch Nestboxes | ||
| 4 ml, Teflon Lined Cap, Glass Vials | Fisher Scientific | 02-912-352 | |
| Transfer pipettes (polyethylene) | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| 4 x 4 weigh paper | Fisher Scientific | 09-898-12B |
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