Abstract
얼룩말 핀치 (Taeniopygia의 guttata)는 독성 1, 2, 문제 3, 메모리를 포함하고 4,5,6 학습 연구의 많은 분야에서 점점 더 중요한 모델 생물이되고있다. 시퀀스 게놈을 가진 유일한 가수로, 얼룩말 핀치 발달 연구에 사용하기 위해 큰 잠재력을 가지고; 그러나, 얼룩말 핀치 개발의 초기 단계는 잘 연구되지 않았습니다. 얼룩말 핀치 개발에 연구의 부족은 작은 계란과 배아를 해부의 어려움에 기인 할 수있다. 다음 해부 방법은 배아 발달의 모든 단계에서 형태와 유전자 발현의 조사를 허용 배아 조직의 손상을 최소화 할 수 있습니다. 이것은 시야를 모두 허용하고 배아의 형광 품질의 영상은, 같은 현장 하이브리드 (ISH), 세포 증식 분석, 이러한 양적 정말이에요 정량적 분석을위한 RNA 추출에서와 같이 분자 절차에 사용L 타임 PCR (qtRT-PCR)를.이 기술은 연구자가 접근하기 이전에 어려웠다 개발의 초기 단계를 연구 할 수 있습니다.
Introduction
이 기술의 전반적인 목표는 개발 연구의 넓은 범위에서 사용하기위한 배아의 초기 단계에서 얼룩말 핀치 (Taeniopygia의 guttata) 배아를 획득하는 것입니다. 얼룩말 핀치 주된 송 버드 모델 생물이되었으며 독성 1, 2, 문제 3, 메모리, 4,5,6, 7,8 비교 신경 해부학을 배우고, 언어 발달 9,10 등 다양한 분야에서 광범위하게 사용되어왔다 . 시퀀스 게놈을 가진 유일한 가수로, 얼룩말 핀치 알려진 조류 11, 12, 13의 50 % 이상을 나타내는 Passeriformes 순서의 분자 유전 연구를 할 수 있습니다.
필드의 다양한 배열의 성인 및 청소년 얼룩말 핀치의 사용에도 불구하고, 몇 가지 연구는 특히 개발 초기 단계에서, 얼룩말 핀치 배아에서 수행되었다. 이것은 그들의 계란의 작은 크기에 기인 할 수있다차 배아, 그리고 닭고기가 (갈 루스 루스 인 domesticus) 이전에 지배적 인 모델 시스템 17,18,19,20,21로 사용하는 연구를위한 모델 생물의 14,15,16 그들의 새로운 상태. 그러나, 비 보컬 학습자로, 닭 보컬 학습, 보컬 학습, 유전, 동작 및 모터 (10)를 학습에 관련된 대뇌 피질 - 기저핵 회로의 개발의 유전 적 기초를 공부에 적합한 모델 시스템이 아닙니다.
그것은 얼룩말 핀치 배아 훨씬 더 섬세하고 더 쉽게 손상 해부 및 분자 과정에서 병아리 배아보다하는 것이 중요합니다. 얼룩말 핀치 배아 permeabilization 단계를 수행 할 때 특히 더주의가 필요합니다. 병아리 배아를 해치지 않을 것이다 강한 세제 효소는 얼룩말 핀치 배아를 손상시킬 수 있습니다. 일반 배려의 측면에서, 그것은 인큐베이터에 배치하기 전에 작은 컵에 얼룩말 핀치 달걀을 넣어하는 것이 필요하다회전 할 때 배양 중에 파손되는 것을 방지하기 위해.
얼룩말 핀치 쉽고 다산 포로 연중 번식, 행동 연구에 순종하고, 보컬 학습자입니다. 이러한 특성은 얼룩말 핀치의 사용은 발전, 유전학 및 언어의 행동 양상을 통합 모델 생물을위한 필요성을 해결하는 것을 허용한다. 얼룩말 핀치 (22)에 특정 최근에 개발 준비 가이드와 함께 아래에 자세히 해부 방법은, 얼룩말 핀치 점점 유용 표준화 된 개발 모델 생물합니다. 그러나, 초기 단계에서 배아를 획득하는 것은 어려운하실 수 있습니다. 이 프로토콜은 연구자가 쉽게 초기 단계의 배아를 얻을 수 있습니다. 얼룩말 핀치의 복잡한 행동, 또는 다른 작은 개발에 독성 영향의 초기 개발 및 분자 개발 기초 조사 연구, 연작 조류이 절개 방법이 유용합니다.
Protocol
윤리 문 : 방법은 윌리엄과 메리의 대학에서 사육 식민지에서 길 들여진 얼룩말 핀치와 함께 실시했다. 모든 절차는 RSPCA의 가이드 라인 (23)을 따라 윌리엄과 메리의 OLAW (실험 동물 복지 사무소) 동물 복지 보증 (# 1 A3713-01)의 대학에 의해 승인되었고 (# 2013-06 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을했다 - 02-8721 - dacris).
1. 달걀 수집 및 창업 보육
- 어두운주기 : 14시 10분 빛에 얼룩말 핀치 쌍을 설정합니다. 음식, 물, 건초, 그리고 둥지 상자 임의로 공급. 참고 : 얼룩말 핀치에 대한 일반 관리 및 번식이 잘 (23)를 설명하고있다.
- 경사 선반 표준 병아리 부화기를 준비합니다. 참고 : 매일 인큐베이터의 바닥에 물을 첨가하여 95 %의 습도 - - 80와 C ° (1 + / -) 37.5에서 인공 부화기를 유지한다. 인큐베이터 이틀 동안 평형을 허용사용하기 전에.
- 인큐베이터에서 계란을 저장하기에 적어도 2.5 cm 깊이의 작은 공급 컵 (5 × 7.6 cm)를 선택합니다. 아직도 계란이 쉽게 롤을 허용하면서 선은 바닥 및 종이 타월의 2 개의 층을 가진 컵의 아래 가장자리는 컵, 패딩되도록. 인큐베이터의 경사 선반에이 컵을 놓습니다. 참고 : 너무 많은 패딩 롤링을 억제 할 수 인해 쉘 내부에 배아 접착에 성공적으로 부화를 방지 할 수있다.
- 빛주기의 발병 다음 두 시간 동안 계란을 수집합니다. 참고 :이 부모의 배양에 의한 소정의 배양 시간에 대한 개발 단계의 차이를 최소화 할 수 있습니다.
- 부드럽게 계란의 길이를 따라 팁과 기지에서 엄지와 집게 손가락으로 계란을 선택합니다. 둥지에서 수집 마련 날짜와 시간에 레이블을 둔 부드러운 4B 흑연 연필을 사용합니다. 참고 : 부드러운 4B 연필 깨지기 쉬운 달걀 껍질을 깨는 연필의 위험을 줄일 수 있습니다.
- 각 C의 5 표시된 계란 - 1.3.2) 배치 1인큐베이터에서 계란 자유롭게 쉘의 내부에 배아의 부착을 방지하기 위해 롤백 할 수 있도록 최대. 참고 : 한 잔에 5 개 이상의 계란을 배치하면 개별 계란의 흔들림을 방지하고 태아의 생존 능력을 감소시킬 수있다.
난자에서 배아의 2. 제거
- , 절개를 준비 다음과 같은 물질 조립하려면 깨끗한 메스, 뾰족한 집게, 두 개의 별도의 뾰족한 집게를. 10 × 10 cm의 절개를 위해 깨끗하고 비 흡수성 표면을 제공하는 해부 범위의 기초에 종이의 무게를 놓습니다. 참고 : 노른자를 쉽게 조작 할 수 있으며 메스 섬세한 막 절단을위한 최고의 표면이기 때문에 무게 용지가 중요합니다.
- 50 ㎖의 폴리 프로필렌 튜브에 인산염 완충 생리 식염수 (1X PBS)의 분취 량을 준비하고, 적어도 세 가지 전송 피펫와 작은 쓰레기 통을 획득. 배아를 고정하는 경우, 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)의 분취 량을 준비주의 :. PFA 증기는 독성,D PFA와 관련된 모든 단계는 노출을 최소화하는 흄 후드 내부에서 수행되어야한다. 플래시는 배아를 냉동하면, 액체 질소를 획득하고 해부 범위 근처에 보관. 불임이 해부 프로토콜에 대한 문제가되지 않지만 모든 자료가 깨끗한 확인합니다.
- 얼룩말 핀치 준비 가이드 (22)의 설명에 따라 원하는 단계에 필요한 시점에서 인큐베이터에서 계란을 제거합니다. 참고 : 22 12 배아 (그림 3A) 단계를 해부하는 6 단계의 배아 (그림 4A) (22)를 해부하고 배양 56 시간 후 알을 제거하기 위해 배양 36 시간 후 알을 제거합니다.
- 광섬유 조명 램프를 사용하여 내부를 조명하는 계란을 통해 수직 축에 빛나는 빛을 따라 그것을 잡고 계란을 촛불. 계란 뒤에 빛의 끝을 놓고 노른자와 배아를 찾습니다.
- 노른자 반대 측면에 메스를 위치에 끝에서 계란을 따라 절단희미한 압력 기본.
- 조심스럽게 엄지 손가락과 집게 손가락으로 계란의 팁과 기초에 압력을가하거나, 부드럽게 집게로 잘라 함께 껍질을 따로 올리하여 계란의 내용을 제거합니다. 노른자가 부드럽게 구르고 있도록 직접 무게 종이 위의 계란을 엽니 다.
- 배아 발달을 둘러싸고있는 희미한 흰색 링으로 볼 수 있으며 태아가 중앙에 위치하도록 여분의 벌금을 사용하여 노른자 집게를 기울 방향 접합의 흰색 영역의 노른자를 검사합니다.
참고 : 노른자의 표면에 희미한 흰색 원이 관찰되지 않는 경우, 미세 집게을 부드럽게 배아는 노른자 위에 때까지 노른자위를 통해 롤. 참고 : 단계의 경우 1 - 9 (22), 배아 디스크는 직경이 6 mm 미만이며, 노른자의 표면에 희미한 약간 불투명 디스크로 볼 수 있습니다 - 참조 그림 1을 참조하십시오. 단 10 세 이상 22, 혈액 풀을 향상 V에게 허용배아의 isibility하지만,이 어려운 배아의 위치를 만들면서, 난황을 천공하지 않도록주의하십시오.
여분의 배아 조직에서 배아의 3. 분리
- 압력 (그림 1B)를 해소하기 위해 노른자의 가장자리에 구멍을, 그리고 배아 디스크와 함께 노른자 지름의 길이에 걸쳐 하나의 상처를 확인합니다. 배아를 포함하는 노른자의 섹션이 성공적으로 (그림 1B)로 구분 될 때까지이 대각선 라인을 만드는 반복합니다. 주의 :이 단계는 난황 질량이 본래대로 할 수 있지만 배아 구조물의 손상을 방지 배아 주위 절단시 노른자의 표면에 감압 더 정밀도 허용한다.
- 전송 피펫으로 노른자의 가장자리를 제거합니다. 가능한 한 많은 노른자를 제거하지만 배아 무게 종이와 눈물의 건조한 표면에 부착되지 않도록 소량을 남겨 참고.
- 도포를하여 배아 디스크를 세척배의 바닥을 향해 45도 각도로 1X PBS를 주입. 다음에이 아니라 위에서 배아 디스크 전송 피펫의 팁을 놓으십시오. 추가 노른자 요구 사항이 제거 될 경우, 페트리 접시에 배아를 전송하기 전에 무게를 종이에 메스 어떤 노른자를 분리합니다. 참고 :이 방법은 무게 종이의 표면에서 배아를 제거합니다.
- 작은 플라스틱 배양 접시에 1X PBS의 최소한의 볼륨과 함께 전송 피펫을 사용하여 배아를 전송합니다. 배아에 직접하지 페트리 접시에 더 많은 1X PBS를 추가하고 근처 1X PBS 떨어지는, 그러나에 의해 배아를 씻으십시오. 페트리 접시 전송 피펫으로 폐기물 1X PBS를 씻어 제거 잔류 노른자, 페트리 접시를 기울하고 제거하는 소용돌이 친다.
NOTE : 1X PBS를 제거하면 플라스틱 표면이 잔류 1X PBS와 함께 미끄러 때문에, 배아 일반적 배양 접시의 바닥에 부착하지 않는다. 배아 접시 붙어 그러나 더 1X PBS를 첨가 할 수있다.
만약 고정 t그는 배아 단계 3.5 및 3.6을 따릅니다. 플래시 배아를 냉동 경우, 즉시 3.8 단계로 이동합니다. - 현장 하이브리드 화에 대한 배아를 고정하는 경우, 즉시 배아를 잠수함 페트리 접시에 4 % PFA를 추가합니다. 평평하게하기 위해 배아의 상단에 직접 4 % PFA 드립; 이 컬링에서 배아를 방지 할 수 있습니다. 12 시간 동안 4 ° C에서 4 % PFA의 배아를 수정.
- 고정 후, 등급 메탄올 100 % 메탄올에서 -20 ° C에서 (메탄올) 솔루션과 저장소에있는 배아를 탈수.
- 배아 단계 1 사이에 있으면 - 8 22 배에 부착 된 난황 막 제거합니다. 주의 :이 단계는 정착 동안 또는 후에 수행 될 수있다. 그들은 난황 막에 부착하기 때문에 스테이지 (8) 22 세 미만의 태아는 쉽게 그림 2A에서 볼 수있는 것처럼 키 구조를 모호하게 가시화되지 않습니다.
- 그립 여분의 미세 집게와 접합의 영역을 넘어 확장 멤브레인의 가장자리. Carefully 잔류 난황 과립을 씻어하고 난황 막에 배아 디스크의 준수를 느슨하게 여러 번에 배아를 플립. 참고 :이 배아 구조를 손상시킬 수로, 배아의 중심을 만지지 마십시오.
- 간격이 접합의 영역과 난황 막 사이에 나타나지 않는 경우, 부드럽게 여분의 벌금 접합 영역이 난황 막에서 느슨하게 집게를 밀고 스크래치. 그립 여분의 벌금 난황 막 집게를 스쳐 부드럽게 떨어져 배아에서 당깁니다. 필요한 경우, 부드럽게 접합의 영역에서 배아 디스크의 주연을 그립에 의해 멀리 난황 막에서 배아를 잡아 당깁니다.
- 제거 후 생물 1 폐기물 (바이오 안전성 레벨 1)에서 난황 막 폐기하십시오.
- 병아리 배아 (24, 25)에 대한 표준 전체 마운트 ISH 프로토콜을 따라야하지만, 다음과 같은 제안을 고려, 젊은 배아 단계에 ISH 분석을 실시합니다.
- 배아 단계를 0 - 6 22, 실온에서 5 분 1X PTW 5 ㎍ / ㎖의 단백질 분해 효소 K로 처리. 배경 염색을 줄이기 위해 37 ° C에서 10 분 동안 1X PTW 12 22 10와 ㎍ / ㎖의 단백질 분해 효소 K를 - 배아는 7 단계적 치료.
- 12 시간 동안 10 ㎍ / ml의 프로브 농도로 배양, 10 (22) - 1 단계에서 유전자 발현의 낮은 수준을 검출하기 위해 충분한 발색 반응을 생성한다. 이전 단계의 경우, 1 & #로 배양956, 60 ℃에서 g / ㎖ 프로브 농도
4. 에듀 세포 증식 분석. 법인 설립 및 얼룩말 핀치 배아 에듀 감지.
- 배아 또는 노른자를 찾기 위해 광섬유 조명 램프를 사용하여 계란을 촛불.
- 배아 미세 주입 공정 중에 손상되지 않도록 난자 내의 배아 또는 난황의 위치를 알 반대측의면을 표시한다.
- 라인 원하는 방향으로 계란을 보유하는 그릇 모양의 점토와 곰팡이를 가진 60mm 플라스틱 접시. 표시된 지점이 있어야한다미세 조작기를 사용하여 마이크로 인젝션 용 바늘의 삽입을 허용하도록 지향. 참고 : 점토가 미세 주입하는 동안 단계 4.11에서 배양을 통해 계란을 안정됩니다.
- 두 개의 유리 모세관 미세 주사 바늘을 빼냅니다. 표시된 지점에 달걀에 구멍을 찌를 하나의 바늘을 무디게. 미네랄 오일로 backloading 및 microinjector에 삽입하여 주입 제 마이크로 인젝션 용 바늘을 준비한다.
- microinjector에 59.8 NL에 주입 당 발표 솔루션의 볼륨을 설정합니다.
- 10 mM의 주식 에듀 솔루션을 미세 주사 바늘을 넣습니다.
- 쉘을 무너 뜨리거나 달걀 공동으로 쉘의 조각을 드롭하지 않도록주의하면서 무딘 유리 모세관로 표시된 자리에서 껍질에 구멍을 만듭니다. 구멍이 미세 주사 바늘이 노른자 또는 태아에 구멍을 통해 직접 삽입 할 수 있도록 45도 각도가되도록 계란의 방향.
- 미세 조작기를 사용하여 삽입약 1.0 cm 구멍으로 바늘을로드.
- 직접 개발 배아 또는 노른자위에 에듀 솔루션의 원하는 양을 주입. 참고 : EDU 478 NL의 최대 배아 사망을 초래하지 않고 주입 할 수있다.
- 즉시 계란 부화하는 동안 태아의 탈수를 방지하기 위해 접시를 커버하는 플라스틱 포장의 여러 계층과 계란과 점토 홀더를 포장. 플라스틱 테이프 가장자리가 배양 중에 풀기에서 플라스틱을 방지하기 위해 접시의 바닥에 포장. 참고 : 플라스틱 포장은 해부하기 전에 즉시 제거해야합니다.
- 원하는 단계에 도달 할 때까지 새로 증식하는 세포가 37 ° C에서 알을 배양하여 에듀를 통합 할 수 있습니다. 주사 후, 인큐베이터에있는 선반을 기울이기로 계란을 반환하지 않습니다. 인큐베이터 안에 안정된 표면에 플라스틱 포장 점토 늘어선 접시를 놓습니다.
- 플라스틱 포장을 제거하고 상기 프로토콜 다음 배아를 해부하다.4 % PFA의 배아를 수정하고 상술 한 바와 같이 4 ° C에서 12 시간을 배양한다. 고정 후, 추가 분석 할 때까지 -20 ° C에서 신선한 100 % EtOH로 5 분 및 저장을위한 100 % 에탄올 (EtOH로)로 세척.
5. 에듀 반응 프로토콜을 "클릭"
다음 단계는 모든 유리 병에서 수행됩니다.
- 다음의 연속 5 분 세척과 배아를 재수 :
- EtOH로 75 % EtOH로 25 % 살균 탈은 25 % EtOH로 75 % 1X PTW, 100 % 1X PTW (SDD) 물, 50 % EtOH로 50 %의 SDD의 증류수
- 10 분마다 100 % 1X PTW에 세 번 씻으십시오.
- 구 부분 10X 콘텐츠 버퍼 용액 (10 μL)의 한 부분을 결합하여 반응 완충액 첨가제 (키트 부품 F)를 희석하여, 물 (90 μL)을 SDD.
- 혼합하여 별도의 관에서의 반응 믹스를 준비 다음 100 ㎕의 희석 반응 버퍼 첨가제 875 μL 1X PBS 20 μL CuSO 4, 5 ㎕의 아 지드를.참고 : 반응 혼합물의 부피가 축소 될 수있다. 배아가 완전히 반응 혼합물에 포함되는 경우 반응이 작동합니다. 사용 직전에 희석 된 반응 버퍼 첨가제 (단계 5.3)를 추가합니다. 이후의 모든 단계는 어둠 속에서 수행됩니다. 빛으로부터 보호하기 위해 호일로 배아를 커버.
- 알루미늄 호일로 바이알을 커버하고 nutator 부속 스티로폼 랙에 배치하여 2 시간 동안 실온에서 세로로 배양한다.
- 10 분마다 신선한 1X PBS에서 배아를 3 회 반복한다.
- 4 ℃에서 하룻밤 신선한 4 % PFA의 배아를 품어
- 4 ° C에서 신선한 1X PBS에서 10 분 각각의 저장소에 대한 1X PBS로 3 회 세척 추가 분석을 할 때까지 호일로 배아를 커버.
Representative Results
난황 막 (A)에 부착 노른자 (B)에서 배아를 분리하는 적절한 방법을 설명하면서 그림 1에 도시 된 단계는 배아의 모양을 나타냅니다. 태아는 난황 막에 비해 훨씬 가볍고 접합의 영역을 식별 할 수 있습니다. 노른자는 버려야 될 때까지 배아 자체는 구별하기 어려운 경우가 많습니다. 배아는 난자에서 해부되면, 고정 할 수 있습니다 또는 플래시는 나중에 사용하기 위해 냉동. 현장 하이브리드의가 해부 배아에 계획되어있는 경우,이 접합의 영역을 통해 태아에 부착 난황 막 제거 할 필요가있다.이 막은 (C) 제거되면 2 배의 향상된 가시성을 보여줍니다 그림, 그리고 난황 막 (A, B)를 벗겨하는 적절한 방법. 해부 및 고정 후, 전체 현장 하이브리드에 탑재 그림 3 (A, A ', B, B에서와 같이 실시 하였다') 및 그림 4 (A, A', B, B ')와 그림 5 (A, B, C) orthodenticle의 호 메오 박스 (homeobox) 2 발달 메틸 수은의 낮은 복용량에 노출 된 배아 (의 Otx2) 발현의 차이를 감지하기 위해. 5는 그림 센스 조사 결과, 배경의 시연 부족. 제어 배아는 6 22 (A, 무대 위해 개발하는 동안 그림 4, 같은 시점에서 알 해부에도 불구하고, 발달 메틸 수은 (메틸 수은)에 노출 된 태아는 5 단계 22 (B, B ')으로 진행 '). 해부 그림 4와 같이 배아의 그룹은 둥지에서 수집하고 같은 시간에 인큐베이터에서 촬영했다. 일부 천연 변이는 개발에 존재하더라도, 이전의 해부 된 데이터에 근거하여, 인큐베이터에서 온도 변동은 2.4 ppm으로 메틸 배아가 develo의 원인이 될 것 같지는 않다pmentally 지연. 단계에서의 차이는 발달 메틸 수은에 노출 된 배아에서 세포 증식의 변화를 나타냅니다.
해부하기 전에, EDU는 하루 2 알에 주입하고 밤새 배양시켰다. 스테이지 (16) (22) 태아의 해부 및 고정 후, EDU는 그림 6 (A, B, C)에서와 같이 증식하는 세포의 검출을 허용, 화학을 "클릭"을 사용하여 시각화 하였다. 그것은 개발 진행을 방해 할 수 메틸 수은에 노출로, 인큐베이터 및 해부하는 동안 계란을 배치하거나 EDU 분석을 수행 할 때주의 깊게 시점을 모니터링하는 것이 중요합니다. 초기 주입 단계 1.3에 지정된 컬렉션의 날이었다 0 일에 실시 하였다. 이 배아는 약 38 시간 후 (7 단 22) 해부했다. 생존율만큼 분사량 478 NL 하에서되면서 약 90 % (대조군의 배아와 같은 비율)로 밝혀졌다.
22 배아를 해부 한 후, RNA 추출은 그림 7에서 볼 수있는 것처럼, 더 최적화가 필요로 제조 업체의 프로토콜에 따라 수행되었다. 난황 막의 제거는 RNA 추출 및 저장 QRT-PCR의 응용 프로그램에 대한 필요했다.
참고 : 전방 및 후방 지역은 각각 이미지의 상단과 하단에 있도록 모든 배아 수치가 지향하고 있습니다.
그림 1. 얼룩말 핀치 배아를 찾기 및 해부 절차는 1-10 22 스테이지. 희미한 흰색 디스크 (A) 알 수있을 때까지 부드럽게 노른자를 압연하여 배아를 찾습니다. 일단배아는 노른자의 중심에 위치하고 있으며, 노른자는 첫 번째 컷 (1) 이후의 인하 (2) 인 접합 (ZJ)의 영역을 국경 난황 막 압력을 완화 단계적으로 (B)의 해부 난황 막에 부착. 스케일 바는 1mm를 나타냅니다.
난황 막과 배아 구조의 가시성의 그림 2. 제거. 4 % PFA를 포함하는 페트리 접시에 노른자에서 배아의 제거, 장소 배아 다음과 같습니다. 동일계 하이브리드 화를 수행 할 필요가있는 경우, 배아 구조의 시인성이 필수적이며 난황 막 (A)를 제거함으로써 달성 될 수있다. 그립 여분의 벌금 난황 막 집게를 밀고하고 필요한 경우 부드럽게, 바깥 쪽 가장자리에 직접적으로 배아를 처리하여 멀리 배아를 벗겨(B). 난황 막 제거는 배아 구조의 선명도를 증가하고, 배아는 현장 하이브리드 (C)에 몇 군데 나 처리 할 수 있습니다. 스케일 바는 1mm를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 전체 마운트 현장 하이브리드에이 발달 orthodenticle의 호 메오 박스 (homeobox) 2 (의 Otx2)의 메틸 수은. 발현 패턴에 노출 얼룩말 핀치 배아에서 수행은 0.0 ppm으로 메틸 수은 (A, A ')와 2.4 ppm으로 메틸 수은 (B, B에 노출 된 배아를 특징으로했다 ') 부모의 다이어트를 통해. 할 일rsal (A)과의 Otx2의 복측 (A ') 표현은 치료 그룹의 배아가 동일한 시점에서 해부 하였다. 스테이지 (12) (22) 중에 중뇌 및 광섬유 소체 전체에 표시되지만 발달 (B) 등쪽에서 본 지연된 무대 11 22 약어의 특징 인 헤드 구조의 복부 (B ')보기 :. MB, 중뇌; 영업 이익, 눈 소포. 스케일 바는 1mm를 나타냅니다.
그림 4. 전체 마운트 원래의 장소에 하이브리드가 발달 orthodenticle의 호 메오 박스 (homeobox) 2 (의 Otx2)의 메틸 수은. 발현 패턴에 노출 얼룩말 핀치 배아에서 수행은 6 단계 22 엠브리 특징으로했다 OS는 0.0 ppm으로 메틸 수은 (A, A ')와 단계 2.4 ppm으로 메틸 수은 (B, B에 노출 5 22 배아'부모의 다이어트를 통해)에 노출. 약어 : 오전, 중배엽의 전연; 아니, 척색, 척색 중배엽; PO, proamnion, 전방 blastopore; PS, 원시 행진 22. 스케일 바는 1mm를 나타냅니다.
그림 5. 전체가 현장에서 마운트 하이브리드가 감지 프로브를 사용하여 얼룩말 핀치 배아에서 수행. (A) 5 단계 22 배아. (B) 초기 단계 6 22 배. (C) 단계 11에서 22 배. 스케일 바는 1mm를 나타냅니다.
6 "SRC ="/ files/ftp_upload/51596/51596fig6highres.jpg "/>
그림 6. 에듀 설립 얼룩말 핀치 배아 드 tection. 에듀 화학이 스테이지 (16) 22 배아 (A, B, C)에서 증식하는 세포를 감지하는 데 사용했다 "클릭". EDU는 티미 딘 (26, 27)의 위치에 DNA에 통합되고, 클릭 화학 (27)를 사용하여 감지됩니다. 대량 살상 무기 확산은 somites의 측면 모서리 및 tailbud에서 명확하게 볼 수 있습니다. 패널 A는 태아의 후방에 독점적으로 발생 확산을 보여주고 개별 증식 세포를 보여줍니다. 패널 B는 전체 배아의 증식 위치를 보여줍니다. 패널 C는 전방 지역을 보여주고, 더 자세히에서 높은 증식 telencephalon (TE)를 보여줍니다. 요약 : AF, 양수 배; FLB, 앞다리 봉오리; HLB, 뒷다리 봉오리; 르, 렌즈 소포; MS, 중뇌; MT, metencephalon; OPC, 눈 컵; PA, 인두 아치; SM, 체절 중배엽; 결핵, tailbud; 테, telencephalon. 스케일 바는 1mm를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
해부 얼룩말 핀치 배아. 제어 (0.0 ppm)를 1.2 ppm으로 메틸 수은의 배아에서 추출한 RNA의 그림 7. 품질은 해부 단계 3.8의 설명에 따라 플래시가 동결되었다. 각 레인은 각 치료 그룹에서 두 균질화 된 배아에서 추출한 RNA를 보여줍니다.
Discussion
배아 준비 가이드 (22)와 게놈 주석의 최근 발전은 얼룩말 핀치 개발 연구를위한 바람직한 모델 생물합니다. 그러나, 단계 1에서 3-7밀리미터 범위 얼룩말 핀치 배아의 작은 크기와 취약성 - 10 22, 11, 14 해부 어렵게 만들 수 있습니다. 위치과 청결 노른자의 표면에서 배아를 제거하는 것은 도전이 될 수 있습니다. 이 프로토콜은 쉽게 절차를 수행하기 위해 충분한 세부 사항을 제공한다. 이 프로토콜은 성공적으로 절개를 보장하기 위해 일반적으로 알려져 있지 않습니다 만, 필요한 중요한 단계를 보여줍니다. 예를 들어, 배아 및 나와 배제 용지의 무게의 시트 사이 노른자의 작은 층을 남겨두기 위하여 필수적이다.
배아의 식별 및 제거 모두 어려울 수 있습니다. 이 후 난황의 표면에 배아를 식별 해결하기 위해, 직접 노른자 위에 빛을계란에서 제거하고 배아를 찾기 위해 45 ° 각도로 노른자보고되었습니다. 배아가 위치한되면, 배아를 찢어지지주의하면서 종이의 무게에 노른자를 잘라.
구조의 더 나은 시각화를 위해 8 22 - 추가 응용 프로그램은 해부학 현장 하이브리드의 차이, 또는 세포 증식 시험 법에 대한 이미지를 포함하는 경우는 1 단계에서 난황 막 제거하는 것이 중요합니다. 초기 단계에서 노른자 또는 난황 막 제거 할 때 문제가 발생하는 경우, 배아 취약성을 줄이기 위해 1X PBS로 세척하기 전에 4 % PFA의 배아를 수정. 설명 된대로 첫 해부 동안 난황 막을 제거함으로써, 구조 현장 하이브리드의를 수행 한 후 명확하게 얼룩말 핀치 배아에 보이는 그대로입니다.
EDU의 한계는 배아 사망에 478 NL 리드에 투여 볼륨의 관리입니다. 그러나 광대 한 복용량 범위는 varyin 수 있습니다증식 세포 태그의 g 수준.
이 키트에 사용되는 "클릭"반응은 구리 (I) - 촉매 - 알킨 - 아 지드 - 사이클로 (구리 (I) AAC)입니다. 이러한 특정 반응에서, 알킨 함유 티미 딘 아날로그 분자 (EDU)가 적극적으로 셀을 분할하여 통합된다. 듀의 알킨 그룹 DNA의 나선 구조로부터 돌출 한 자유 알킨 그룹에 바인딩 녹색 형광 분자에 접합 지드 분자에 노출에 의해 검출된다. 녹색 형광 배아에서 새로 증식하는 세포를 보여줍니다. 이러한 반응 종은 생물에 자연적으로 존재하지 않기 때문에 아 지드의 바이오 직교성과 알킨 그룹이 아닌 특정 얼룩을 방지 할 수 있습니다. DNA가 발생하는 반응의 순서 변성 할 필요가 없으므로, 상기 DNA 의존성 분석은 쉽게 27을 행할 수있다.
이 방법의 고유 제한은 작은 크기와 파편입니다얼룩말 핀치 배아의 ility. 주의 수행이되지 않을 경우 15 22 손상 배아 구조가 발생할 수 있습니다 - 배아의 난황 막 제거 1 단계입니다. 그러나이 프로토콜은 조사자 이전 깊이 연구되지 않은 구조적 기형 및 유전자 발현을 조사하는 초기 배아 단계를 사용할 수 있도록 절개 방법을 단순화한다. 이 프로토콜은 수사관 성인 표현형의 발달 기원을 확인 할 수 세포 분자 분석의 과다에 대한 방법을 엽니 다. 예를 들어, 유전자 발현은 다양한 환경 조건에서 보컬 학습에 연루 또는 개발 28, 29,30,31의 초기 단계에서 약물 치료를 다음 검사 할 수있을 것이다. 이 글에서 설명하지 않지만,이 방법은 잠재적으로 얼룩말 핀치 조직 섹션과 일렉트로 / OV에 대한 현장 하이브리드의 방사성 등의 절차를 허용O 수술 32, 33, 34. 얼룩말 핀치 문학의 광대 한 본문 내에서 중요한 모델 생물로 설립 된 것을 감안할 때, 이러한 연구는 성인 생리학과 행동 발달 메커니즘을 연결 언어 7, 9의 특히 발전에 숨은 기회를 제공합니다.
Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
저자는 자신의 자금 출처, 윌리엄과 메리의 대학 하워드 휴즈 의학 연구소 학부 과학 교육 프로그램을 감사한다; 보조금 스폰서 : NIH (MSS) 허가 번호 : R15NS067566. 또한 동물 보호에 대한 지원은 예술과 과학의 윌리엄 앤 메리 대학 생물학과 대학에서 지원을 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chicken egg incubator | We use a Picture Window Hova-Bator Incubator, Circulated Air Model | ||
| Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging kit | Invitrogen | C10337 | Detection of cell proliferation. |
| Dissection microscope | We use Olympus SZ61 | ||
| 7'' Drummond capillary for Nanoject II injector | Drummond | 3-00-203-G/X | |
| Drummond Nanoject II microinjector | Drummond | ||
| Dumont Tweezers #55 | World Precision Instruments | 14099 | |
| Ethanol (EtOH) | |||
| 50 ml Falcon tube (polypropylene) | Fisher Scientific | 06-443-18 | |
| FastPrep Lysis Matrix H tubes | MP biomedicals | 6917-100 | Used for RNA extraction, used to homogenize embryos |
| Fiber optic illuminator lamps (High Intensity Illuminator) | Dolan-Jenner Industries | Fiber-Lite MI-150 | |
| Glass vials with screw cap (DEPC treated) | Fisher Scientific | 03-338A | |
| Microcentrifuge eppe tube (1.5 ml) | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M-8410 | |
| Modeling Clay | Any brand | ||
| Narshige PB-7 needle puller | Narshige | ||
| Omni Bead Ruptor Homogenizer | OMNI International | 19-010 | Used for RNA extraction |
| 4% Paraformaldehyde (4% PFA): 20 ml 8% PFA (32 g paraformaldehyde, 350 ml sdd H2O, adjust pH to 7.6, 400 ml sdd H2O), 20 ml 2x PBS | Fixation of embryos. Caution, is harmful and do not inhale. | ||
| Phosphate buffered saline (1x PBS): 200 ml 10x PBS, 1,800 ml Barnstead H2O, adjust pH to 7.4 | |||
| Phosphate buffered saline (10x PBS): 800 ml Barnstead, 2.013 g KCL, 80.063 g NaCl, 2.722 g KH2PO4 monobasic, 14.196 g Na2HPO4 dibasic, 200 ml Barnstead H2O, adjust pH to 6.5 | |||
| Phosphate buffered saline with 0.1% Tween-20 (1x PTw): 1,800 ml Barnstead H2O, 200 ml 10x PBS, adjust pH to 7.4, 2 ml Tween-20 | |||
| 35 ml Plastic Petri dish | Fisher Scientific | 08-757-100A | |
| plastic wrap | Any brand | ||
| Prepease RNA Spin Kit | PrepEase, Affymetrix | 78766 1 KT | Used for RNA extraction, used to homogenize embryos |
| Reaction Mix: 875 μl 1xPBS, 100 mM 20 μl CuSO4 (Kit Component E), 5 μl Alexa Fluor 488 azide (Kit Component B), 100 μl diluted reaction buffer additive (Kit Component F) | Invitrogen | C10337 | Detection of cell proliferation. |
| sdd H2O | |||
| Seed cup | We use it as a container when incubating eggs | ||
| Stainless steel scalpel | |||
| Standard nest box | We use Abba Plastic Finch Nestboxes | ||
| 4 ml, Teflon Lined Cap, Glass Vials | Fisher Scientific | 02-912-352 | |
| Transfer pipettes (polyethylene) | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| 4 x 4 weigh paper | Fisher Scientific | 09-898-12B |
References
- Eng, M. L., Elliott, J. E., MacDougall-Shackleton, S. A., Letcher, R. J., Williams, T. D. Early exposure to 2,2',4,4',5-pentabromodiphenyl ether (BDE-99) affects mating behavior of zebra finches. Toxicol Sci. 127, 269-276 (2012).
- Winter, V., Elliott, J. E., Letcher, R. J., Williams, T. D. Validation of an egg-injection method for embryotoxicity studies in a small, model songbird, the zebra finch (Taeniopygia guttata). Chemosphere. 90, 125-131 (2013).
- Maney, D. L., Goodson, J. L.
- Kirn, J. R. The relationship of neurogenesis and growth of brain regions to song learning. Brain and Language. 115, 29-44 (2010).
- Fisher, S. E., Scharff, C. FOXP2 as a molecular window into speech and language. Trends in Genetics. 25, 166-167 (2009).
- Tokarev, K., Tiunova, A., Scharff, C., Anokhin, K. Food for Song: Expression of C-Fos and ZENK in the Zebra Finch Song Nuclei during Food Aversion Learning. PLoS One. 6, (2011).
- Vargha-Khadem, F., Gadian, D. G., Copp, A., Mishkin, M. FOXP2 and the neuroanatomy of speech and language. Nat Rev Neurosci. 6, 131-138 (2005).
- Schulz, S. B., Haesler, S., Scharff, C., Rochefort, C. Knockdown of FoxP2 alters spine density in Area X of the zebra finch. Genes, Brain and Behavior. 9, 732-740 (2010).
- Jarvis, E. D., et al. Avian brains and a new understanding of vertebrate brain evolution. Nat Rev Neurosci. 6, 151-159 (2005).
- Brainard, M. S., Doupe, A. J. Translating birdsong: songbirds as a model for basic applied medical research. Annu Rev Neurosci. 36, 489-517 (2013).
- Mayer, U., Watanabe, S., Bischof, H. J. Spatial memory and the avian hippocampus: Research in zebra finches. J Physiol Paris. , (2012).
- Warren, W. C., et al.
- Agate, R. J., Scott, B., Haripal, B., Lois, C., Nottebohm, F. Transgenic songbirds offer an opportunity to develop a genetic model for vocal learning. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 17963-17967 (2009).
- Birkhead, T. R., et al. Internal incubation and early hatching in brood parasitic birds. Proceedings of the Royal Society Biological Sciences. 278, 1019-1024 (2011).
- Haesler, S., et al. FoxP2 expression in avian vocal learners and non-learners. J Neurosci. 24, 3164-3175 (2004).
- Godsave, S. F., Lohmann, R., Vloet, R. P. M., Gahr, M. Androgen receptors in the embryonic zebra finch hindbrain suggest a function for maternal androgens in perihatchingsurvival. Journal of Comparative Neurology. 453, 57-70 (2002).
- Stern, C. D. The chick; a great model system becomes even greater. Dev Cell. 8, 9-17 (2005).
- Kuenzel, W. J., Medina, L., Csillag, A., Perkel, D. J., Reiner, A. The avian subpallium: new insights into structural and functional subdivisions occupying the lateral subpallial wall and their embryological origins. Brain Research. 1424, 67-101 (2011).
- Tickle, C. The contribution of chicken embryology to the understanding of vertebrate limb development. Mech Dev. 121, 1019-1029 (2004).
- Vergara, M. N., Canto-Soler, M. V. Rediscovering the chick embryo as a model to study retinal development. Neural Development. 7, (2012).
- Davey, M. G., Tickle, C. The chicken as a model for embryonic development. Cytogenet Genome Research. 117, 231-239 (2007).
- Murray, J. R., Varian-Ramos, C. W., Welch, Z. S., Saha, M. S. Embryological staging of the zebra finch, Taeniopygia guttata. J Morphol. , (2013).
- Hawkins, P., Morton, D. B., Cameron, D., Cuthill, I., Francis, R., Freire, R., Gosler, A., Healy, S., Hudson, A., Inglis, I., Jones, A., Kirkwood, J., Lawton, M., Monaghan, P., Sherwin, C., Townsend, P. Laboratory birds: refinements in husbandry and procedures. Fifth report of BVAAWF/FRAME /RSPCA/UFAW Joint Working Group on Refinement. Lab Anim. , (2001).
- Pearse II, R. V., Esshaki, D., Tabin, C. J., Murray, M. M. Genome-wide expression analysis of intra- and extraarticular connective tissue. Journal of Orthopaedic Research. 27, 427-434 (2009).
- Pizard, A., et al. Whole-mount in situ hybridization and detection of RNAs in vertebrate embryos and isolated organs. Current Protocols in Molecular Biology. 66, (2004).
- Warren, M., Puskarczyk, K., Chapman, S. C. Chick embryo proliferation studies using EdUlabeling. Developmental Dynamics. 238, 944-949 (2009).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA syntesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 105, 2415-2420 (2008).
- Hoogesteijn, A. L., DeVoogd, T. J., Quimby, F. W., De Caprio, T., Kollias, G. V. Reproductive impairment in zebra finches (Taeinopygia guttata). Environmental Toxicology and Chemistry. 24, 219-223 (2005).
- Winter, V., Williams, T. D., Elliott, J. E. A three-generational study of In ovo exposure to PBDE-99 in the zebra finch. Environmental Toxicology and Chemistry. 32, 562-568 (2013).
- Kitulagodage, M., Buttemer, W. A., Astheimer, L. B. Adverse effects of fipronil on avian reproduction and development: maternal transfer of fipronil to eggs in zebra finch Taeinopygia guttata and in ovo exposure in chickens Gallus domesticus. Ecotoxicology. 20, 653-660 (2011).
- Hallinger, K. K., Zabransky, D. J., Kazmer, K. A., Cristol, D. A. Birdsong differs between mercury-polluted and reference sites. The Auk. 127, 156-161 (2010).
- Chen, C. C., Wada, K., Jarvis, E. D. Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue. Journal of Visualized Experiments. , (2012).
- Chen, C. C., Balaban, E., Jarvis, E. D. Interspecies Avian Brain Chimeras Reveal That Large Brain Size Differences Are Influenced by Cell–Interdependent Processes. PLoS One. 7, (2012).
- Chen, C. C., Winkler, C. M., Pfenning, A. R., Jarvis, E. D. Molecular profiling of the developing avian telencephalon: Regional timing and brain subdivision continuities. The Journal of Comparative Neurology. 521, 3666-3701 (2013).
