Abstract
Den zebra fink (Taeniopygia guttata) har blivit en allt viktigare modellorganism inom många forskningsområden, inklusive toxikologi 1, 2, beteende 3, och minne och inlärnings 4,5,6. Som enda songbirden med en sekvenserade genomet har SEBRAFINCH stor potential för användning i utvecklingsstudier; emellertid de tidiga stadierna av SEBRAFINCH utveckling har inte studerats väl. Bristen på forskning i SEBRAFINCH utveckling kan hänföras till svårigheten att dissekera litet ägg och embryo. Följande dissektion metod minimerar embryonala vävnadsskada, som möjliggör undersökning av morfologi och genuttryck i alla stadier av embryonal utveckling. Detta möjliggör både ljusa fält och fluorescens bildkvalitet av embryon, användning i molekylära procedurer såsom in situ hybridisering (ISH), cellproliferationsanalyser, och RNA-extraktion för kvantitativa analyser såsom kvantitativa real-time PCR (qtRT-PCR). Denna teknik gör det möjligt för utredarna att studera tidiga utvecklingsstadier som tidigare var svåra att komma åt.
Introduction
Det övergripande målet med denna teknik är att få zebra finch (Taeniopygia guttata) embryon från de tidigaste stadierna av embryogenes för användning i ett brett spektrum av utvecklingsstudier. Zebra fink har blivit den dominerande songbird modellorganism och har använts flitigt i en mängd olika områden, bland annat toxikologi 1,2, beteende 3, minne och inlärning 4,5,6, jämförande neuroanatomi 7,8, och språkutveckling 9,10 . Som enda songbirden med en sekvenserade genomet medger SEBRAFINCH molekylära och genetiska studier av Passeriformes ordning, vilket motsvarar mer än 50% av kända fågelarter 11, 12,13.
Trots användningen av vuxna och unga zebra finch i en mångfald av områden, har få studier gjorts på zebra finch embryon, särskilt under tidiga stadier av utveckling. Detta kan bero på den begränsade storleken på sina ägg and embryon, och deras nyare status som modellorganism 14,15,16 för studier där hönan (Gallus gallus domesticus) har tidigare använts som ett dominerande modellsystem 17,18,19,20,21. Men som icke-vokala elever, kycklingar är inte ett lämpligt systemmodell för att studera den genetiska grunden för röst-lärande, utveckling av röst-lärande, ärftlighet, beteende, och den kortikala-basala ganglierna kretsar inblandade i motorisk inlärning 10.
Det är viktigt att notera att SEBRAFINCH embryon är mycket mer känslig och lättare skadas än kycklingembryon under dissekering och molekylära förfaranden. Framför allt är större försiktighet krävs när du utför permeabilization steg på zebra finch embryon. Starka rengöringsmedel och enzymer som inte skulle skada ett kycklingembryo kan skada zebra finch embryon. När det gäller allmän vård, är det nödvändigt att sätta zebra finch ägg i små koppar innan placering i en inkubatorför att hindra dem från att bryta när rullande under inkubationstiden.
Zebra fink är mottagliga för beteendestudier, enkelt och produktivt föda året runt i fångenskap, och är högljudda elever. Dessa egenskaper tillåter användning av zebra finch att tillgodose behovet av en modellorganism som integrerar utveckling, genetik, och beteendemässiga aspekter av språk. Dissektioner metoder som beskrivs nedan, i kombination med en nyutvecklad staging guide specifikt för zebra finch 22, gör zebra finch en alltmer användbar standardiserad utvecklingsmodellorganism. Men kan få embryon i ett tidigt skede vara skrämmande. Detta protokoll gör att utredarna att lätt få embryon tidigt stadium. Studier som undersöker den tidiga utvecklingen och den molekylära utvecklings grund av komplexa beteenden i zebra finch, eller de toxikologiska effekterna på utvecklingen i andra små, kommer tättingar hitta denna dissektion metoden användbar.
Protocol
Etik Uttalande: Metoderna fördes med domestice sebrafink från avelskoloni vid College of William and Mary. Alla förfaranden som följs RSPCA riktlinjerna 23 och godkändes av College of William and Mary OLAW (Office of Laboratory Animal Welfare) Djurskydd Assurance (# A3713-01) och hade Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) godkännande (# 2013-06 -02 till 8721-Dacris).
1. Ägg Insamling och inkubation
- Upprätta zebra finch par på en 14:10 ljus: mörker-cykel. Supply mat, vatten, hö, och en holk efter behag. OBS: Rutinmässig skötsel och avel för zebra finkar har väl beskrivits 23.
- Förbered en standard chick inkubator med lutande hyllor. Anm: Bibehåll artificiell inkubator vid 37,5 (+ / - 1) ° C med 80-95% fuktighet genom tillsats av vatten till bottnen av inkubatorn på en daglig basis. Tillåt inkubatorn till jämvikt under två dagarföre användning.
- Välj små foderkoppar (5 x 7,6 cm) på minst 2,5 cm djupt för att hålla äggen i inkubatorn. Linje botten och nedre kanterna på koppen med två lager av hushållspapper så att koppen är vadderad, men ändå låta äggen att enkelt rulla. Placera dessa koppar på tippnings hyllorna i inkubatorn. OBS: För mycket utfyllnad kan hämma rullande, som kommer att förhindra lyckad odling på grund av embryonal vidhäftning till skalet interiör.
- Samla äggen vid två timmar efter starten av ljuscykel. OBS: Detta minimerar avvikelser i scenen utveckling för en viss inkubationstid grund av föräldrarnas inkubation.
- Plocka upp ägg försiktigt med tummen och pekfingret vid spetsen och basen utmed längden av ägget. Använd en matt, mjuk 4B blyerts för att märka det datum som och tid hämtas från boet. Anmärkning: Den mjukare 4B penna minskar risken för pennan att bryta den sköra äggskal.
- 1.3.2) Placera 1-5 märkta ägg i varje cupp i inkubatorn, så att äggen kan fritt rulla att förhindra embryonal vidhäftning till det inre av skalet. Obs: Placering mer än 5 ägg i en kopp kan förhindra rullning av de enskilda äggen och minska lönsamheten av embryon.
2. Borttagning av Embryo från Egg
- För att förbereda sig för dissektion, montera följande material: en ren skalpell, fin spets pincett, och två extra fina tippas pincett. Placera 10 x 10 cm väger papper på basen av dissekera omfattning för att ge en ren, icke-absorberande underlag för dissekering. Obs: väga papperet är mycket viktigt eftersom det möjliggör enkel manipulering av gulan och är den bästa ytan för att skära den känsliga membran med en skalpell.
- Framställ en alikvot av fosfatbuffrad saltlösning (1X PBS) i ett 50 ml polypropylenrör, och förvärva åtminstone tre överföringspipetter och en liten avfallshink. Om fastställande av embryon, förbereda en delmängd av 4% paraformaldehyd (PFA) Varning:. PFA ångor är giftiga, end alla steg som involverar PFA bör göras i ett dragskåp för att minimera exponeringen. Om blixten frysa embryon, få flytande kväve och hålla den nära dissekera omfattning. Sterilitet är inte en fråga för denna dissektion protokoll, men se till att alla material är rena.
- Avlägsna ägg från inkubatorn vid den tidpunkt som behövs för den önskade scenen som beskrivs i SEBRAFINCH staging guide 22. OBS: Ta bort ägg efter 36 timmar av inkubation att dissekera stadium 6 embryon (Figur 4A) 22 och ta bort äggen efter 56 timmar av inkubation att dissekera stadium 12 embryon (Figur 3A) 22.
- Med hjälp av en fiberoptisk belysningsanordning lampa, ljus ägget genom att hålla den längs sin vertikala axel och lysa ljus genom ägget för att lysa upp interiören. Placera spetsen på ljuset bakom ägget och placera äggulan och det växande embryot.
- Placera skalpell på sidan motsatt gulan och skär längs ägget från spets tillbas med svagt tryck.
- Ta bort innehållet i ägget genom att noggrant anbringa tryck på spetsen och basen av ägget med tummen och pekfingret, eller genom att försiktigt bända isär äggskalet längs skåran med pincett. Öppna ägget direkt ovanför väger papperet så att äggulan rullar försiktigt ut.
- Undersök äggulan för den vita zonen av korsningen, vilket syns som en svagt vit ring omslutande embryonal utveckling och orientera gulan med hjälp av extra fin tippade pincett så att embryot ligger i centrum.
OBS: Om en svag vit cirkel på ytan av äggulan inte observeras, ta fin pincett och försiktigt rulla äggulan över tills embryot är ovanpå äggulan. OBS: För stegen 1 - 9 22, är den embryonala disken mindre än 6 mm i diameter och syns som ett svagt, svagt ogenomskinlig skiva på ytan av äggulan - se figur 1 som referens. För stegen 10 och äldre 22, pooler blod tillåter förbättrad visibility av embryot, men se till att undvika att punktera gulesäcken, eftersom detta gör att lokalisera embryot svårt.
3. Separering av Embryo från extra embryonal vävnad
- Punktera kanterna på gulan för att minska trycket (Figur 1B), och göra enstaka snitt över längden på äggulan diametern vid sidan av embryonala disken. Upprepa göra dessa diagonala linjer tills den del av äggulan innehåller embryot har framgångsrikt separerade (Figur 1B). OBS: Detta steg tillåter äggulan massa för att förbli intakt, men det reducerade trycket på ytan av äggulan tillåter större precision vid skärning runt embryot, vilket förhindrar skador på embryonala strukturer.
- Avlägsna kanterna av äggula med en överföringspipett. OBS: Ta bort så mycket äggula som möjligt, men lämna en liten mängd så att embryot inte följer den torra yta väger papper och tår.
- Tvätta embryonala disken med dispensing 1X PBS i 45 ° vinkel mot botten av embryot. Placera spetsen på överföringspipetten intill-inte ovan-den embryonala skivan. Om ytterligare äggula behöver tas bort, separera varje äggula med skalpell på väga papperet innan du överför embryot till petriskål. Notera: Denna metod tar bort embryot från ytan av den väger papper.
- Överför embryot med användning av en överföringspipett tillsammans med en minimal volym av 1 x PBS till en liten plastpetriskål. Tvätta embryot genom att tillsätta mer 1X PBS i petriskålen och droppande 1X PBS nära, men inte direkt på, embryot. Snurra petriskål för att tvätta och ta bort resterande äggula, luta petriskål, och ta bort avfall 1X PBS med överföringspipetten.
ANMÄRKNING: När 1X PBS avlägsnas embryot vanligtvis inte fäster till botten av petriskålen, eftersom plastytan är hal med en återstående 1X PBS. Emellertid kan mer 1X PBS tillsättas om embryot fastnar på skålen.
Om fixerings than embryo, följ steg 3.5 och 3.6. Om blixten frysa embryot, vidare till steg 3,8 omedelbart. - Om fastställande av embryot för in situ hybridisering, omedelbart lägga 4% PFA till petriskålen att dränka embryot. Droppa 4% PFA direkt på toppen av embryot för att platta till den; detta förhindrar embryot från curling. Fixa embryot i 4% PFA vid 4 ° C under 12 timmar.
- Efter fixering dehydratisera embryon i graderad metanol (MeOH) lösningar och förvara vid -20 ° C i 100% MeOH.
- Om embryot är mellan stegen 1 - 8 22, ta bort vitellinmembranet följs embryot. OBS: Detta steg kan göras under eller efter fixering. Embryon yngre än etapp 8 22 är inte lätt visualiseras för att de ansluter sig till vitellinmembranet, skymmer viktiga strukturer som visas i figur 2A.
- Ta tag i kanten av membranet som sträcker sig utanför den zonen av korsningen med extra fin pincett. Carefully vända embryot över flera gånger för att tvätta bort rester av äggula granulat och lossa vidhäftning av embryonala disken till vitellinmembranet. Obs: Ta inte på mitten av embryot, eftersom detta kommer att skada embryonala strukturer.
- Om en lucka inte visas mellan zon korsningen och vitellinmembranet, försiktigt skrapa zon korsningen med extra fin tippade pincett för att lossa den från vitellinmembranet. Grip vitellinmembranet med extra fin tippade pincett och dra försiktigt bort den från embryot. Om det är nödvändigt att försiktigt dra i embryot från vitellinmembranet genom att gripa den perifera kanten av den embryonala skivan vid zonen för korsning.
- Kasta vitellinmembranet i biohazard 1 avfall (skyddsnivå 1) efter avlägsnande.
- Vid genomförande av en ISH-analys på unga embryonala stadier, följ normala hela mount ISH-protokoll för kycklingembryon 24, 25, men beakta följande förslag.
- För embryon stadium 0-6 22, behandla med 5 | ig / ml proteinas K i 1 x PTW under 5 min vid rumstemperatur. Treat embryon iscensatt 7-12 22 med 10 | ig / ml proteinas K i 1 x PTW under 10 min vid 37 ° C för att minska bakgrundsfärgning.
- För att producera en tillräcklig färgreaktion för att detektera låga nivåer av genexpression i stadier 1-10 22, inkubera med 10 ^ g / ml sond-koncentrationen för 12 timmar. För äldre stadier, inkubera med 1 & #956, g / ml sond koncentration vid 60 ° C.
4. Edu cellproliferationsanalys. Bolagsbildning och detektion av Edu i Zebra Finch embryon.
- Candle ägget med hjälp av en fiberoptisk belysningslampa för att lokalisera embryot eller äggula.
- Märk den sida av ägget som är motsatt platsen för embryot eller äggula i ägg för att säkerställa att embryot inte skadas vid mikroinjektion processen.
- Linje en 60 mm plastskål med modellera och mögel det i form av en skål för att hålla ägg i den önskade orienteringen. Den markerade plats bör varaorienterad att medge införing av mikroinjektion nålen med hjälp av mikromanipulator. Obs: lera stabiliseras ägget under mikroinjektion och under hela inkubationen i steg 4,11.
- Dra två glas kapillär mikroinjektion nålar. Blunt en nål att sticka ett hål i ägget vid den markerade platsen. Förbered andra mikroinjektion nål för injektion genom backloading den med mineralolja och sätter in det i microinjector.
- Ställ in volymen på lösningen frigörs per injektion till 59,8 nl på microinjector.
- Ladda mikroinjektion nålen med 10 mM lager EDU-lösning.
- Skapa ett hål i skalet på den markerade platsen med den trubbiga glaskapillär, var noga med att inte krossa skalet eller tappa bitar av skalet in i ägget hålighet. Rikta ägget så att hålet är vid en 45 ° vinkel, vilket gör att mikroinjektion nål som skall införas direkt genom håligheten för att gulan eller embryo.
- Använda mikromanipulator, sätt inladdad nål ca 1,0 cm in i kaviteten.
- Injicera önskad mängd av EDU lösningen direkt på det utvecklande embryot eller äggula. OBS: Maximalt 478 nl av Edu kan injiceras utan resulterar i embryonal död.
- Omedelbart linda ägget och leran hållare med flera lager av plastfolie för att täcka äggen och skålen för att förhindra uttorkning av embryot under inkuberingen. Tejp kanterna av plastfolie till botten av skålen för att hindra plasten från uppackning under inkuberingen. Obs! Plastfolie bör endast tas bort omedelbart före dissekering.
- Låt de nyligen prolifererande celler att inkorporera ENE genom inkubering av ägg vid 37 ° C tills den önskade stadiet har nåtts. Efter injektionen, inte tillbaka ägget att luta hyllor i kuvös. Placera plastklädda lera fodrad maträtt på stabil yta inne i inkubatorn.
- Ta bort plastfolie och dissekera embryot efter det ovannämnda protokollet.Fixa embryot i 4% PFA och inkubera 12 timmar vid 4 ° C såsom beskrivits ovan. Efter fixering, tvätta med 100% etanol (EtOH) under 5 min och förvara i färsk 100% EtOH vid -20 ° C fram till vidare analys.
5. Edu "Klicka på" Reaktion Protocol
Följande steg är alla utförda i glasflaskor.
- Rehydrera embryon med varandra 5 min tvättar av följande:
- EtOH, 75% EtOH och 25% sterilt avjoniserat destillerat (SDD) vatten, 50% EtOH och 50% sdd vatten, 25% EtOH och 75% 1X PTW, 100% 1X Ptw
- Tvätta tre gånger i 100% 1X PTW för 10 min vardera.
- Späd reaktionsbufferttillsats (Kit Komponent F) genom att kombinera en del av 10X lager buffertlösning (10 | il) till 9 delar sdd vatten (90 pl).
- Framställ reaktionsblandning i ett separat rör genom att blanda följande: 875 | il 1 X PBS, 20 jil CuSO 4, 5 | il azid, 100 ^ il utspädda reaktionsbuffert tillsats.Anm: Volym av reaktionsblandningen kan skalas ner. Reaktionen kommer att fungera om embryot är helt täckt i reaktionsblandningen. Lägg den utspädda reaktionsbuffert tillsats (steg 5,3) omedelbart före användning. Alla efterföljande steg utförs i mörker. Täck embryon med folie för att skydda mot ljus.
- Täck rören med aluminiumfolie, och inkubera dem vertikalt vid rumstemperatur i två timmar genom att placera dem i en styrofoam kuggstång fäst vid en nutator.
- Tvätta embryon tre gånger i färskt 1X PBS under 10 min vardera.
- Inkubera embryon i färsk 4% PFA över natten vid 4 ° C.
- Tvätta 3 gånger i 1 x PBS under 10 min vardera och lagra i färskt 1X PBS vid 4 ° C. Täck embryon med folie tills vidare analys.
Representative Results
Stegen i diagramform i Figur 1 indikerar förekomsten av embryot medan fäst vitellinmembranet (A) och visar den rätta metoden att separera embryot från gulan (B). Embryot kan identifieras genom zonen för övergången, vilket är mycket lättare än vitellinmembranet. Embryot själv är ofta svårt att skilja tills äggulan är bortskuren. När embryot dissekerades från ägget, kan den vara fast eller frystes för framtida användning. Om en in situ-hybridisering är planerad till dissekerades embryo, är det nödvändigt att avlägsna vitellinmembranet som är vidhäftat till embryot via zon av korsning. Figur 2 illustrerar den förbättrade synligheten av embryot när detta membran avlägsnas (C), och det rätta sättet att skala vitellinmembranet (A, B). Efter dissekering och fixering, hela montera in situ-hybridisering utfördes såsom framgår av fig. 3 (A, A ', B, B') Och Figur 4 (A, A', B, B ') och fig 5 (A, B, C) för att upptäcka skillnader i orthodenticle homeobox 2 (Otx2) expression i embryon utvecklingsmässigt exponerats för låga doser av metylkvicksilver. Figur 5 visar sensproben resultat, vilket visar bristande bakgrund. I fig. 4, trots att dissekeras från ägget vid samma tidpunkt, embryot utvecklingsmässigt exponeras för metylkvicksilver (MeHg) utvecklats till stadiet 5 22 (B, B '), medan kontroll embryot utvecklas till steg 6 22 (A, A '). Den grupp av embryon dissekerades och visas i Figur 4 togs från boet och tas från inkubatorn vid samma tidpunkter. Även om en del naturlig variation är närvarande under utveckling, baserat på tidigare dissektion uppgifter, är det osannolikt att temperaturvariationer i inkubatorn skulle orsaka endast 2,4 ppm metylkvicksilver embryon som utveckpmentally försenad. Skillnaderna i stegen indikerar förändringar i celltillväxt i embryon utvecklingsmässigt exponerats för metylkvicksilver.
Innan dissektionen ades EDU injiceras i en dag två ägg och fick inkubera över natt. Efter dissektion och fixering av scenen 16 22 embryo var EDU visualiserades med användning av "klick"-kemi, vilket möjliggör detektering av prolifererande celler såsom framgår av fig. 6 (A, B, C). Det är viktigt att noga följa tidpunkter när du placerar äggen i inkubatorn och under dissektioner, som exponering för metylkvicksilver eller utföra EDU-analysen kan störa utvecklings progression. Den tidigaste injektionen utfördes på dag 0, vilket var den dag då insamlingen som anges i steg 1.3. Detta embryo dissekerades cirka 38 timmar senare (etapp 7 22). Överlevnadsgraden visade sig vara cirka 90% (samma takt som embryon kontroll), så länge som insprutningsmängden var under 478 nl.
22 embryon gjordes en RNA-extraktion utfördes i enlighet med tillverkarens protokoll med ingen optimering krävs, såsom framgår av fig. 7. Avlägsnandet av vitellinmembranet var onödig för RNA-extraktion och senare QRT-PCR-tillämpningar.
Obs: Alla embryoSiffrorna är orienterade så att de främre och bakre områdena är vid toppen och botten av bilderna, respektive.
Figur 1. Förfarande för att lokalisera och dissekera SEBRAFINCH embryon, steg 1-10 22. Leta embryo med mjukt böljande äggulan tills det svaga vita skivan är uppenbart (A). Närembryot är beläget i centrum av äggulan, är äggulan dissekeras stegvis (B), där det första snittet lindrar trycket vitellinmembranet (1) och efterföljande nedskärningar (2) gränsar till zonen av korsningen (ZJ), som är vidhäftad till vitellinmembranet. Skalstrecken representerar 1 mm.
Figur 2. Avlägsnande av vitellinmembranet och synlighet av embryonala strukturer. Efter avlägsnande av embryot från gulan, ställe embryo i en petriskål med 4% PFA. Om en in situ hybridisering behöver utföras, är synligheten av de embryonala strukturer viktigt och kan uppnås genom att ta bort vitellinmembranet (A). Grip vitellinmembranet med extra fint tippade pincett och försiktigt dra bort den från embryot genom att hantera embryot direkt på den yttersta kanten, om det behövs(B). Vitellinmembranet avlägsnande ökar tydligheten i embryonala strukturer och tillåter embryon som skall avbildas eller bearbetas med in situ-hybridisering (C). Skalstrecken representerar 1 mm. klicka god här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Whole mount in situ-hybridisering utfördes på Sebrafinkar embryon utvecklingsmässigt exponerats för metylkvicksilver. Expressionsmönster orthodenticle homeobox 2 (Otx2) karaktäriserades med embryon som exponerats för 0,0 ppm metylkvicksilver (A, A ') och 2,4 ppm metylkvicksilver (B, B ') via föräldra diet. Det görRsal (A) och ventrala (A ') expression av Otx2 är synlig i hela mitthjärnan och optiska vesiklar under steg 12 22. Embryona behandlingsgrupperna dissekerades vid samma tidpunkt, men som utvecklingsmässigt fördröjd såsom ses i den dorsala (B) och ventrala (B ') syn på huvudstrukturer, som är karakteristiska för etapp 11 22 Förkortningar:. mb, mitthjärnan; op, optisk vesikler. Skalstrecken representerar 1 mm.
Figur 4. Whole mount in situ hybridisering utförs på embryon zebra finch utvecklingsmässigt exponerats för metylkvicksilver. Expression mönster av orthodenticle homeobox 2 (Otx2) karakteriserades i steg 6 22 embry os exponerade för 0,0 ppm metylkvicksilver (A, A ') och etapp 5 22 embryon som exponerats för 2,4 ppm metylkvicksilver (B, B') via föräldra kost. Förkortningar: am, främre marginal av mesoderm; nej, notochord, notokord mesoderm; po, proamnion, främre blastopore; ps, primitivstrimman 22. Skalstrecken representerar 1 mm.
Figur 5. Hela montera in situ hybridisering utförs på zebra finch embryon med hjälp av förnuft sond. (A) Steg 5 22 embryo. (B) Tidigt 6 22 embryo. (C) Steg 11 22 embryo. Skalstrecken representerar 1 mm.
6 "src =" / files/ftp_upload/51596/51596fig6highres.jpg "/>
Edu inkorporering och de skydd i Sebrafinkar embryon. Edu "klick" kemi användes för att detektera celler som förökar sig i ett skede 16 22 embryo (A, B, C). Figur 6. Edu införlivas i DNA i stället för tymidin 26, 27 och detekteras med hjälp av klick kemi 27. Proliferation syns tydligt i sidokanter somites samt tailbud. Panel A visar spridning förekommer enbart i den bakre av embryot och visar enskilda proliferativa celler också. Panel B visar de proliferativa platser i hela embryot. Fält C visar den främre regionen, och visar den starkt proliferativt telencefalon (te) i större detalj. Förkortningar: af, fostervatten veck; FLB, forelimb knopp; HLB, bakben knopp; le, lins vesikler; ms, mesencephalon; mt, Metencephalon; opc, optisk kopp; pa, svalg valv; sm, somit mesoderm; tb, tailbud; TE, telencephalon. Skalstrecken representerar 1 mm. klicka god här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7. Kvaliteten på RNA extraherat från dissekerade SEBRAFINCH embryon. Kontroller (0,0 ppm) och 1,2 ppm metylkvicksilver embryon dissekerades och frystes såsom beskrivits i steg 3,8. Varje fält visar RNA extraherat från två homogeniserad embryon från varje behandlingsgrupp.
Discussion
Den senaste utvecklingen av en embryo iscensättning Guide 22 och genom anteckning gör zebra finch en önskvärd modell organism för utvecklingsstudier. Men den lilla storleken och bräcklighet av zebra finch embryon, som sträcker sig från 3 till 7 mm i steg 1 - kan 10 22, gör dissektioner svårt 11, 14. Lokalisera och rent ta bort embryon från ytan av äggulan kan vara en utmaning. Detta protokoll ger tillräckligt detaljerad för att utföra proceduren med lätthet. Detta protokoll visar de kritiska steg som inte är normalt känt, men är nödvändiga för att säkerställa en framgångsrik dissektion. Till exempel är det viktigt att lämna ett litet skikt av äggula mellan embryot och ark av väga papperet för att förhindra att klibba.
Både identifiera och ta bort embryot kan vara svårt. Att felsöka identifiera embryot på ytan av äggulan, lysa ljus direkt ovanför äggulan efter att den hartagits bort från ägget, och titta på gulan vid 45 ° vinkel för att hitta embryot. När embryot är belägen, klippa äggulan på väger papper noga med att inte riva embryot.
Om ytterligare tillämpningar innefattar bildåtergivning för anatomiska skillnader, in situ hybridisering, eller cellproliferationsanalyser, är det viktigt att avlägsna vitellinmembranet i steg 1-8 22 för bättre visualisering av strukturer. Om svårigheter när du tar bort gulan eller vitellinmembranet i tidiga skeden, fixera embryot i 4% PFA innan du tvättar den i 1X PBS för att minska embryonala bräcklighet. Genom att först ta bort vitellinmembranet under dissekering som beskrivs, strukturer är klart synliga och intakt i zebra finch embryon efter att ha utfört en in situ hybridisering.
En begränsning av Edu är att administrering av doseringsvolymer över 478 nl leder till embryonal dödsfall. Dock gör det stora dosintervallet varying nivåer av proliferativ cell märkning.
Den "klicka" reaktion som används i detta kit är koppar (I)-katalyserad-alkynen-azid-Cykloaddition (Cu (I) AAC). I denna specifika reaktion är en alkyn-innehållande tymidinanalog molekyl (EDU) införlivas genom aktivt delande celler. Den alkyn grupp i EDU skjuter ut från den spiralformiga strukturen hos DNA: t och detekteras genom exponering för en azid-molekyl konjugerad till en grön, fluorescerande molekyl som binder till den fria alkyn-grupp. Den gröna fluorescensen visar de nyligen prolifererande celler i embryot. Den bio-ortogonalitet av aziden och alkynen grupper förhindrar icke-specifik färgning, eftersom dessa reaktiva species är inte naturligt närvarande i organismer. Också, eftersom DNA behöver inte skall denatureras för att reaktionen skall ske, kan ytterligare DNA-beroende analys vara lätt utföras 27.
En inneboende begränsning med denna metod är den lilla storleken och fragbilitet av zebra finch embryon. Ta bort vitellinmembranet av embryon steg 1 - 15 22 kan leda till skadliga embryonala strukturer om de inte utförs med försiktighet. Dock förenklar detta protokoll dissektion metoden, vilket gör att utredarna att använda tidiga embryonala stadier för att undersöka strukturella anomalier och genuttryck som inte har undersökts grundligt. Detta protokoll öppnar vägen för en uppsjö av cellulära-molekylära analyser som gör att utredarna att fastställa utvecklings ursprung vuxna fenotyper. Till exempel kommer det att vara möjligt att undersöka genuttryck inblandad i sång lärande under olika miljöförhållanden eller efter farmakologisk behandling vid de tidigaste utvecklingsstadierna 28, 29,30,31. Även om inte visat i denna uppsats, denna metod potentiellt möjliggör andra förfaranden såsom radioaktiv in situ hybridisering på zebra finch vävnadssnitt och elektroporation / i OVo kirurgi 32, 33,34. Med tanke på att zebra finch har etablerats som en viktig modellorganism inom en stor mängd litteratur, sådana studier ger outnyttjade möjligheter att knyta utvecklingsmekanismer med vuxna fysiologi och beteende, i synnerhet utvecklingen av språket 7, 9.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Författarna tackar sina finansieringskällor, Howard Hughes Medical Institute Grundutbildning Science Education Program till högskolan av William och Mary; Grant sponsor: NIH (MSS); Bidragsnummer: R15NS067566. De erkänner också stöd från College of William and Mary, Institutionen för biologi och College of Arts and Sciences för hjälp med djurvård.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chicken egg incubator | We use a Picture Window Hova-Bator Incubator, Circulated Air Model | ||
| Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging kit | Invitrogen | C10337 | Detection of cell proliferation. |
| Dissection microscope | We use Olympus SZ61 | ||
| 7'' Drummond capillary for Nanoject II injector | Drummond | 3-00-203-G/X | |
| Drummond Nanoject II microinjector | Drummond | ||
| Dumont Tweezers #55 | World Precision Instruments | 14099 | |
| Ethanol (EtOH) | |||
| 50 ml Falcon tube (polypropylene) | Fisher Scientific | 06-443-18 | |
| FastPrep Lysis Matrix H tubes | MP biomedicals | 6917-100 | Used for RNA extraction, used to homogenize embryos |
| Fiber optic illuminator lamps (High Intensity Illuminator) | Dolan-Jenner Industries | Fiber-Lite MI-150 | |
| Glass vials with screw cap (DEPC treated) | Fisher Scientific | 03-338A | |
| Microcentrifuge eppe tube (1.5 ml) | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M-8410 | |
| Modeling Clay | Any brand | ||
| Narshige PB-7 needle puller | Narshige | ||
| Omni Bead Ruptor Homogenizer | OMNI International | 19-010 | Used for RNA extraction |
| 4% Paraformaldehyde (4% PFA): 20 ml 8% PFA (32 g paraformaldehyde, 350 ml sdd H2O, adjust pH to 7.6, 400 ml sdd H2O), 20 ml 2x PBS | Fixation of embryos. Caution, is harmful and do not inhale. | ||
| Phosphate buffered saline (1x PBS): 200 ml 10x PBS, 1,800 ml Barnstead H2O, adjust pH to 7.4 | |||
| Phosphate buffered saline (10x PBS): 800 ml Barnstead, 2.013 g KCL, 80.063 g NaCl, 2.722 g KH2PO4 monobasic, 14.196 g Na2HPO4 dibasic, 200 ml Barnstead H2O, adjust pH to 6.5 | |||
| Phosphate buffered saline with 0.1% Tween-20 (1x PTw): 1,800 ml Barnstead H2O, 200 ml 10x PBS, adjust pH to 7.4, 2 ml Tween-20 | |||
| 35 ml Plastic Petri dish | Fisher Scientific | 08-757-100A | |
| plastic wrap | Any brand | ||
| Prepease RNA Spin Kit | PrepEase, Affymetrix | 78766 1 KT | Used for RNA extraction, used to homogenize embryos |
| Reaction Mix: 875 μl 1xPBS, 100 mM 20 μl CuSO4 (Kit Component E), 5 μl Alexa Fluor 488 azide (Kit Component B), 100 μl diluted reaction buffer additive (Kit Component F) | Invitrogen | C10337 | Detection of cell proliferation. |
| sdd H2O | |||
| Seed cup | We use it as a container when incubating eggs | ||
| Stainless steel scalpel | |||
| Standard nest box | We use Abba Plastic Finch Nestboxes | ||
| 4 ml, Teflon Lined Cap, Glass Vials | Fisher Scientific | 02-912-352 | |
| Transfer pipettes (polyethylene) | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| 4 x 4 weigh paper | Fisher Scientific | 09-898-12B |
References
- Eng, M. L., Elliott, J. E., MacDougall-Shackleton, S. A., Letcher, R. J., Williams, T. D. Early exposure to 2,2',4,4',5-pentabromodiphenyl ether (BDE-99) affects mating behavior of zebra finches. Toxicol Sci. 127, 269-276 (2012).
- Winter, V., Elliott, J. E., Letcher, R. J., Williams, T. D. Validation of an egg-injection method for embryotoxicity studies in a small, model songbird, the zebra finch (Taeniopygia guttata). Chemosphere. 90, 125-131 (2013).
- Maney, D. L., Goodson, J. L.
- Kirn, J. R. The relationship of neurogenesis and growth of brain regions to song learning. Brain and Language. 115, 29-44 (2010).
- Fisher, S. E., Scharff, C. FOXP2 as a molecular window into speech and language. Trends in Genetics. 25, 166-167 (2009).
- Tokarev, K., Tiunova, A., Scharff, C., Anokhin, K. Food for Song: Expression of C-Fos and ZENK in the Zebra Finch Song Nuclei during Food Aversion Learning. PLoS One. 6, (2011).
- Vargha-Khadem, F., Gadian, D. G., Copp, A., Mishkin, M. FOXP2 and the neuroanatomy of speech and language. Nat Rev Neurosci. 6, 131-138 (2005).
- Schulz, S. B., Haesler, S., Scharff, C., Rochefort, C. Knockdown of FoxP2 alters spine density in Area X of the zebra finch. Genes, Brain and Behavior. 9, 732-740 (2010).
- Jarvis, E. D., et al. Avian brains and a new understanding of vertebrate brain evolution. Nat Rev Neurosci. 6, 151-159 (2005).
- Brainard, M. S., Doupe, A. J. Translating birdsong: songbirds as a model for basic applied medical research. Annu Rev Neurosci. 36, 489-517 (2013).
- Mayer, U., Watanabe, S., Bischof, H. J. Spatial memory and the avian hippocampus: Research in zebra finches. J Physiol Paris. , (2012).
- Warren, W. C., et al.
- Agate, R. J., Scott, B., Haripal, B., Lois, C., Nottebohm, F. Transgenic songbirds offer an opportunity to develop a genetic model for vocal learning. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 17963-17967 (2009).
- Birkhead, T. R., et al. Internal incubation and early hatching in brood parasitic birds. Proceedings of the Royal Society Biological Sciences. 278, 1019-1024 (2011).
- Haesler, S., et al. FoxP2 expression in avian vocal learners and non-learners. J Neurosci. 24, 3164-3175 (2004).
- Godsave, S. F., Lohmann, R., Vloet, R. P. M., Gahr, M. Androgen receptors in the embryonic zebra finch hindbrain suggest a function for maternal androgens in perihatchingsurvival. Journal of Comparative Neurology. 453, 57-70 (2002).
- Stern, C. D. The chick; a great model system becomes even greater. Dev Cell. 8, 9-17 (2005).
- Kuenzel, W. J., Medina, L., Csillag, A., Perkel, D. J., Reiner, A. The avian subpallium: new insights into structural and functional subdivisions occupying the lateral subpallial wall and their embryological origins. Brain Research. 1424, 67-101 (2011).
- Tickle, C. The contribution of chicken embryology to the understanding of vertebrate limb development. Mech Dev. 121, 1019-1029 (2004).
- Vergara, M. N., Canto-Soler, M. V. Rediscovering the chick embryo as a model to study retinal development. Neural Development. 7, (2012).
- Davey, M. G., Tickle, C. The chicken as a model for embryonic development. Cytogenet Genome Research. 117, 231-239 (2007).
- Murray, J. R., Varian-Ramos, C. W., Welch, Z. S., Saha, M. S. Embryological staging of the zebra finch, Taeniopygia guttata. J Morphol. , (2013).
- Hawkins, P., Morton, D. B., Cameron, D., Cuthill, I., Francis, R., Freire, R., Gosler, A., Healy, S., Hudson, A., Inglis, I., Jones, A., Kirkwood, J., Lawton, M., Monaghan, P., Sherwin, C., Townsend, P. Laboratory birds: refinements in husbandry and procedures. Fifth report of BVAAWF/FRAME /RSPCA/UFAW Joint Working Group on Refinement. Lab Anim. , (2001).
- Pearse II, R. V., Esshaki, D., Tabin, C. J., Murray, M. M. Genome-wide expression analysis of intra- and extraarticular connective tissue. Journal of Orthopaedic Research. 27, 427-434 (2009).
- Pizard, A., et al. Whole-mount in situ hybridization and detection of RNAs in vertebrate embryos and isolated organs. Current Protocols in Molecular Biology. 66, (2004).
- Warren, M., Puskarczyk, K., Chapman, S. C. Chick embryo proliferation studies using EdUlabeling. Developmental Dynamics. 238, 944-949 (2009).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA syntesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 105, 2415-2420 (2008).
- Hoogesteijn, A. L., DeVoogd, T. J., Quimby, F. W., De Caprio, T., Kollias, G. V. Reproductive impairment in zebra finches (Taeinopygia guttata). Environmental Toxicology and Chemistry. 24, 219-223 (2005).
- Winter, V., Williams, T. D., Elliott, J. E. A three-generational study of In ovo exposure to PBDE-99 in the zebra finch. Environmental Toxicology and Chemistry. 32, 562-568 (2013).
- Kitulagodage, M., Buttemer, W. A., Astheimer, L. B. Adverse effects of fipronil on avian reproduction and development: maternal transfer of fipronil to eggs in zebra finch Taeinopygia guttata and in ovo exposure in chickens Gallus domesticus. Ecotoxicology. 20, 653-660 (2011).
- Hallinger, K. K., Zabransky, D. J., Kazmer, K. A., Cristol, D. A. Birdsong differs between mercury-polluted and reference sites. The Auk. 127, 156-161 (2010).
- Chen, C. C., Wada, K., Jarvis, E. D. Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue. Journal of Visualized Experiments. , (2012).
- Chen, C. C., Balaban, E., Jarvis, E. D. Interspecies Avian Brain Chimeras Reveal That Large Brain Size Differences Are Influenced by Cell–Interdependent Processes. PLoS One. 7, (2012).
- Chen, C. C., Winkler, C. M., Pfenning, A. R., Jarvis, E. D. Molecular profiling of the developing avian telencephalon: Regional timing and brain subdivision continuities. The Journal of Comparative Neurology. 521, 3666-3701 (2013).
