Summary
神経堤ヒト多能性幹細胞に由来する（NC）細胞（HPSC）は、ヒトの発生および疾患をモデル化し、細胞置換療法のための大きな可能性を有する。ここでは、現在広く使用されているのフィーダーフリー適応Abstract
ヒト多能性幹細胞（hPSCs）は皿にヒト疾患をモデル化するためと病気や事故後の再生アプリケーション用の移植可能な細胞の供給源として、人間の胚発生を研究するための大きな可能性を秘めている。神経冠（NC）細胞は、末梢神経系およびグリア、メラノサイトおよび間葉細胞からの細胞などの成体の体細胞の多種多様のための前駆体である。彼らは、細胞運命の仕様および移行を含むヒト胚発生の側面を研究する細胞の貴重な情報源である。最終分化した細胞型へNC前駆細胞のさらなる分化は、 インビトロでのヒト疾患をモデル化する病気のメカニズムを調査し、再生医療用の細胞を生成する可能性を提供する。この記事ではhPSCsからNC細胞の誘導のために現在利用可能なin vitroでの分化プロトコルの適応を提示します。この新しいプロトコルは、diffeの18日間を必要とするrentiationは、フィーダーを含まない、ヒト胚性幹細胞（ヒトES細胞）ラインだけでなく、人間の人工多能性幹細胞（hiPSC）ラインのうち、容易に拡張性の高い再現性がある。新旧両方のプロトコルが同じアイデンティティのNC細胞を得る。
Introduction
ヒト胚性幹細胞（hESC）およびヒト人工多能性幹細胞（hiPSC）は、良好な動物モデルでも、一次組織のいずれもが利用可能なヒト疾患の研究および将来の治療のための、特に、巨大な可能性を示している。ヒトES細胞/ hiPSC技術の応用例としては、以下の通りである：特定の目的の細胞は無制限数量1で、再生医療のためのhESC / hiPSCsから生成することができます。細胞は、特定の疾患を有する患者から製造し、インビトロ疾患モデル2,3 に確立するために使用することができる。このような疾患モデルは、新しい薬剤化合物の探求4並びに有効性および毒性5のための既存の薬物の試験に大規模な薬物スクリーニングに用いることができる。 インビトロ疾患モデルは、新規な病気のメカニズムの同定につながる可能性がある。ヒトES細胞/ IPSC技術のすべてのアプリケーションに対して、特定と連携することが重要で、よく定義関心対象の疾患において影響d個の細胞タイプ。このように、固体で再現性のin vitroでの分化プロトコルの利用可能性は、ヒトES細胞/ hiPSC技術のすべてのアプリケーションのために重要である。プロトコルは、ヒトES細胞/ hiPSCラインと異なる研究者間の最小の変動、時間費用、労力、難しさやコストだけでなく、最大の再現性を示すことが望ましい。
神経冠（NC）細胞は、表皮と神経上皮間脊椎動物神経胚形成の間に出現する。それらは増殖し、胚全体に広範囲に移動し、骨/軟骨、頭蓋顔面骨格、感覚神経細胞、シュワン細胞、メラニン細胞、平滑筋細胞、腸、ニューロン、自律ニューロン、クロム親和細胞を含む、子孫細胞型の印象的な多様性を生じさせる、心臓中隔細胞、歯および副腎/甲状腺腺細胞6。このため、NC細胞が魅力的な、細胞幹細胞のフィールドの型とするために重要であるこのようなヒルシュスプルング病7、家族性自律神経失調症8などの疾患、ならびに神経芽細胞腫9のような種々の癌のモデル化。さらに、それらは、 インビトロでヒト胚発生の局面を研究する可能性を提供する。
現在利用可能な、広くhESCの10,11からNC細胞の誘導のためにインビトロで分化プロトコルにおいて適用分化の35日まで必要とし、例えば、MS5細胞などの間質フィーダー細胞上で神経誘導を伴い、従って、あまり明確でない条件下で行われる。それはNC細胞を大量に生成するためにアップスケールすることができるが、ハイスループット薬剤スクリーニング4に必要な、例えば、これは、手間とコスト集約的である。さらに、再現が困難であることができる、神経ロゼットの手動継代を伴うので、それはのhESCまたはhiPSCの多種多様に適用する場合、特に、全体的な変動を受けるライン。ここでは、フィーダー細胞を含まない18日間プロトコルにおけるNC細胞の段階的な導出を示す。このメソッドは、現在使用されているプロトコルよりも短く、より定義されています。さらに、異なるhiPSC系統のうちNC細胞を生成する際に非常に堅牢である。重要なのは、それが両方のプロトコルによって得られたNC細胞は、神経ロゼット（以下と呼ばれるロゼット-NCまたはR-NC）の境界に出現することが示されている。 2つのプロトコルのうちいずれかを使用して得られた細胞は、同じNCマーカーを発現し、マイクロアレイ解析で一緒にクラスター化、形態学的に同じに見える。新しいプロトコル（R-NC）を用いてNC由来細胞は、それらが移動し、さらに神経細胞に分化することができるように古いプロトコル（MS5-R-NC）を用いてNC由来細胞と同様の機能である。したがって、細胞は、MS5-R-NC細胞と併用して用いることができる。ヒトES細胞/ IPSCからNC細胞の誘導のために、R-NCセルプロトコルは、NC系統が関与するヒトES細胞/ IPSC技術のすべてのアプリケーションに有用である。</ pの>
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1。培養培地、コーティングされた料理とhPSCsのメンテナンスの調製
1.1メディアの準備
注：最大2週間、暗所で4℃で殺菌し、ストアのすべてのメディアをフィルタリングします。試薬名、会社とカタログ番号は、 資料の表に記載されている。
- DMEM/10％FBS：DMEM 885ミリリットル、100ミリリットルのFBS 10mlのペニシリン/ストレプトマイシンおよび5mlのL-グルタミンを組み合わせる。
- HES-培地：DMEM/F12 800ミリリットル、200ミリリットルKSR 5mlのL-グルタミン5mlのペニシリン/ストレプトマイシンを10mlのMEM、最小必須アミノ酸溶液1mlのβ-メルカプトエタノールを組み合わせる。メディアをフィルタリングした後に10 ng / mlのFGF-2を追加します。
注意：β-メルカプトエタノールは毒性が、吸入、経口摂取、皮膚接触を避ける。 - KSR-分化培地：820ミリリットルノックアウトDMEM 150mlのKSR 10mlのL-グルタミンを10mlのペニシリン/ストレプトマイシンを10mlのMEM、最小必須アミノ酸溶液、1mlのβ-メルカプトエタノールを組み合わせる。
- N2-differentiati培地上：1.55グラムのグルコース、2グラム重炭酸ナトリウムおよび100mg APOヒトトランスフェリンを追加、980ミリリットルのdH 2 Oに12グラムのDMEM/F12粉末を溶かす。 25 mgのヒトインスリンおよび40μlの1N NaOHで2ミリリットルのdH 2 Oを混ぜて、媒体に溶解した溶液を加える。 100μlのプトレシン二塩酸塩を追加し、60μlの亜セレン、100μlのプロゲステロンとDH 2 Oで1リットルにボリュームを持ち出す
培養皿の1.2コーティング
- マトリゲルコーティング：雪解け1ミリリットルは、それが溶解するまで一定分量以上の19ミリリットルのDMEM/F12をピペットでマトリゲルのアリコートを凍結した。 40μmのセルストレーナーとプレート8エルフテックスcmディッシュに通して塊を除去します。室温で1時間の料理をインキュベートする。細胞を播種する直前にマトリゲルを吸引する。
注：それは4℃以上の温度で凝集することができますので、マトリゲルで素早く作業 - PO /ラム/ FNコーティング：10cmの皿に15μg/ mlのポリ-Lオルニチン臭化水素酸塩を含む1×PBSを10ミリリットルを追加します。。 37℃で一晩の料理をインキュベート一回1X PBSでプレートを洗浄し、2μg/ mlのマウスラミニン-I及び2μg/ mlのフィブロネクチンを含む1×PBSを10エルフテックスcmディッシュを追加します。 37℃で一晩の料理をインキュベート細胞を播種する前に、完全に溶液を除去し、プレートを蓋なしで組織培養フードの壁にそれらを放置して15〜20分間、室温で完全に乾燥させます。
注：1は、表面の結晶構造を見ることができる料理は（目で見える）完全に乾燥し、細胞播種の準備ができている。プレートを、この乾燥した状態で、数時間室温に保つことができる。 PO /ラム/ FN料理は2日間、事前に準備する必要があります。緊急の場合、ラム/ FNは2〜4時間インキュベートすることができます。しかし、これは次善の分化/生存結果を危険にさらすことができる。
hPSCsの1.3メンテナンス
注意：hPSCsは0.1％ゼラチンと、有糸分裂不活性化されたマウス胚性線維芽細胞上で維持されている（MHES培地中でのEF）を補充した10 ng / mlのFGF-2先に記載したよう10,12。細胞は6-8日ごとに分割する必要があります。
- 室温で5分間（マグネシウム又はカルシウムのない1×PBS中）1 mlの0.1％ゼラチンで被覆10cmディッシュ。
- 37℃の水浴中で迅速に凍結したMEFを解凍する。 10ミリリットルのDMEM/10％FBSに百万のMEFを追加します。
- ゼラチンを吸引し、細胞をプレート。少なくとも6時間、37℃でインキュベートする。
- 一回1X PBSでプレートを洗浄し、10μMのY-27632二塩酸塩を補充した10ミリリットルのHES-培地を追加し、準備されたMEFプレートからDMEM/10％のFBSを吸引除去する。培地は20分間37℃でウォームアップすることができます。
注意：hPSCsの手動分割のために埋め込まれた顕微鏡を用いて、層流フードが使用されている。しかし、細胞は、適切な代替方法を使用して継代することができる。 - 埋め込まれた顕微鏡で、層流フードの下で、セルリフターを使用して別々のコロニーを切り離し、それらをフロートしてみましょう。
- 使用浮遊コロニーを吸引し、新鮮な、暖かいMEFプレートにそれらをディスパッチする1ミリリットルの注射器。新しい皿に細胞の約四分の一を転送します。 37℃でインキュベート
- 新鮮なHES培地で毎日細胞を養う。
差別化hPSCsの2。メッキ
注意：コロニーが大きいが、それでも（ 図1（b）参照 ）、その境界での差別できるだけ少ない細胞とシャープなエッジを持っているときhPSCsは、分化のために分割またはめっきされるべきである。細胞がコロニーを継代マニュアル使用して維持されると簡単に目で見ることができる大きさでなければなりません。この時点での権利感触を得るために1を継代することなく、2週間ごとに個別のHPSCディッシュを維持し、細胞が到達見て、継代/それらを区別するための理想的な時点を渡すことができます。
- 分化を開始する前に、マトリゲル1時間で10cmの皿を準備します。成功したマトリゲルコーティングは可能4倍の倍率で検証した。
- hPSCsを分割する準備ができたら、メディアを吸引し、細胞を0.05％トリプシン-EDTAの4ミリリットルを追加。
- 1は、単一の細胞が顕微鏡下でプレートをリフトオフなどのMEFを見ることができます積極的になるまで2分間水平に料理を振る。 HPSCコロニーはコロニーとして取り付けられたまま。
- すぐに、徹底的に、トリプシンを吸引し、プレートを2-4分間、室温で放置。
- 板にHES-培地2mlを加え、P1000ピペットを用いて、細胞を剥離。
注：細胞は、容易に表面から持ち上げることができない場合は、プレートをさらに2〜3分間RTで空にインキュベートすることができる。 - 10μMのY-27632二塩酸塩を補充した8ミリリットルHES-培地に細胞を移す。
- 先に調製した10cmの皿からマトリゲルを吸引。マトリゲルプレートに：（1つの10 cmディッシュから細胞を二つ10cmの皿に分割される例えば）1:1または1:2の割合で細胞をプレート。 37℃でインキュベートする一晩のC。
注：このメッキは約10万個/ cm 2になる必 要があります。
神経分化の3。誘導
注：細胞は、90〜100％コンフルエント（ 図1Cを参照）、通常翌日である場合は分化（0日目）に開始することができる。正確な集密度がまだ達していない場合、それらが分化のための準備が整うまで、細胞を、HES培地を毎日供給することができる。代替的に、播種した細胞の最初の数を増加させることができる。
- 〜3 0日目に、0.1μMLDN193189および10μMSB431542を含む10エルフテックスCMディッシュKSR-分化培地を毎日細胞を養う。
- 4日目と5飼料75％KSR-分化培地および25％N2-分化培地で細胞がLDN193189とSB431542を含む両方。
- 6日目と7飼料に50％KSR-分化培地で細胞を、50％N2-分化培地は両方LDN193189とSB4を含む31542。
- 8日目と9飼料に25％KSR-分化培地および75％N-分化培地で細胞がLDN193189とSB431542を含む両方。
- 9日目と10日の11上の細胞の再プレーティングのために1.2.2に示すように、PO /ラム/ FNの料理を準備。
- LDN193189およびSB431542を含むN2-分化培地で一日に10フィード細胞。
NC仕様の液滴中に4。再プレー
- 11日目吸引·ラム/ FN上で予め用意され、プレートからと1.2.2で説明したように彼らは、20〜30分室温で完全に乾燥させます。
- 、分化する細胞から培地を除去1X PBSで細胞を1回洗浄し、cmディッシュaccutase/10 8ミリリットルを追加します。 37℃で20分間インキュベートする。
- セルリフターを使用して、細胞を剥離し、5ミリリットルピペットでをAccutaseで再懸濁します。 15mlチューブにサスペンションを転送します。
- 1X PBSを5ミリリットルを加え、114 X gで5分間細胞をスピン。
- 10ミリリットル1で細胞を再懸濁X PBS。単一細胞懸濁液を確保するために、40μmのセルストレーナーを介してそれらをフィルタリングし、血球計又は等価な技術を用いて細胞を数える。
- ダウン細胞をスピン100,000の濃度で200μMのアスコルビン酸（AA）、20 ng / mlのBDNF、100 ng / mlのFGF8、20 ng / mlのSHH、10μMのY-27632二塩酸塩を含むN2-分化培地で再懸濁します-150000 cells/10μL。
- 彼らは乾燥したPO /ラム/ FN 15cmの皿に触れることなく、互いに近接リピートピペッター、プレート10μlの液滴を使用して。
注：分化した細胞の1つの10 cmディッシュは、通常約2〜3倍の15cmディッシュや、約100×10μLdroplets/15のcmディッシュになる。 - N2/AA/BDNF/FGF8/SHH/Yの30ミリリットルを加え、37℃でインキュベート（液滴を乱さない）を非常に慎重に、液滴は、20〜30分間、室温で放置
- 12日目に、慎重に20 ml/15 cmディッシュのN2/AA/BDNF/FGF8/SHHで細胞を養う。
- DAからY 14-17 N2/AA/BDNF/FGF8で2日または3日ごとに細胞を養う。
- 16日目と17日にFACS選別した後、NC細胞をreplateするPO /ラム/ FNプレートを準備します。
NC細胞の5。蛍光活性化細胞選別（FACS）
注意：FACSのための細胞の調製は、約2時間を必要とします。
- 18日目に、培地を除去皿に1×PBSで細胞を1回洗浄し、12ミリリットルをAccutaseを追加。 37℃で20分間、細胞をインキュベート
- セルリフターを使用して、表面から細胞を剥離し、それらをフロートしてみましょう。 50mlチューブに転送し、1×PBS 30mlの投稿を5mlピペットを用いて懸濁液中に細胞をピペット。 114×gで5分間細胞をスピン。
- P1000ピペットを使用して、（HBSSを15mMのHEPESを含有する）を2％FBS / HBSS 1ml中に細胞を再懸濁。 2％FBS / HBSSの19ミリリットルを追加し、単一細胞懸濁液を確保するために40μmのセルストレーナーを通して細胞をフィルタリング。 15メートルのために氷上で細胞をインキュベート抗体ブロッキングのために、次に血球計数器を用いて、それらを数える。
- 細胞をスピンダウンし、2％FBS / HBSS中千万細胞/ mlの濃度で再懸濁します。
- のみを制御（APCのみと488のみ）、FACS染色染色されていない、単一染色（HNK-1のみしかP75）および二次抗体のために100万個の細胞を取って、それぞれを設定します。
- 適切なサンプルに1ミリリットル懸濁液中の1000万個の細胞あたりのP75次抗体のHNK-1および5μLの5μLを加え、氷上で20分間インキュベートする。
- 10ミリリットル1X PBS（114×gで遠心分離器5分）で細胞を洗浄し、1ミリリットルの2％FBS / HBSS中で細胞を再懸濁。適切なサンプルに、APCの2μLと1ミリリットル懸濁液中の1000万個の細胞あたり488の二次抗体の1μlを加え、暗所で氷上で20分間インキュベートする。
注：APCおよび488は、それぞれ、HNK-1およびp75染色のためにここで使用した二次抗体である。 - 10ミリリットル1X PBS中に細胞を洗浄二回、500μlの1000万個の細胞を再懸濁DAPI（0.5でのNG /μL）またはFACS分析から、死細胞を排除するために、代替の適切な生細胞染色を含む2％FBS / HBSS。
- FACSチューブを適切にサンプルを転送します。
- 細胞採取のために0.5ミリリットルの2％FBS / HBSSでFACSチューブを準備します。
注意：細胞とコレクションチューブは、ソート時間の間に暗闇の中で氷の上に保持されます。 - DAPIは、APCと488並べDAPI-/HNK-1 + / P75 +二重陽性細胞を検出することができ、レーザを用いて、細胞選別機を使用した。
注：これらの細胞は、ソートされた母集団から除外するための準備時間、細胞の処理は、細胞死のわずかな割合をもたらす、DAPI染色剤死細胞は、従って、可能にする。任意の代替生/死染色は、この目的のためにも同様に動作します。 DAPI自体が生きた細胞集団における細胞毒性を引き起こすことはありません。
6。選別された細胞の再プレート、ノースカロライナ維持·拡大
注意：FACS選別した細胞は、手でなければなりません最適な生存を確保するために特別な注意を払って導いた。それらを再プレートまで氷上に保管してください。厳しく、それらをボルテックスまたはピペットないでください。細胞は、チューブをタッピングして再懸濁することができる。
- FACSソーティングした後、それらをスピンダウンして、NC細胞をカウントし、N2-分化培地に再懸濁は、30,000細胞でそれらをreplateするために、適切な量の10 ng / mLのFGF2、20 ng / mlのEGFおよび10μMのY-27632二塩酸塩を補っ/ 10μlの滴。
- 徹底的に10cmの皿当たり約50〜70滴のPO /ラム/ FNプレートとプレート予め用意して乾燥させます。料理は、20〜30分間、室温で放置。
- 非常に慎重に滴を乱すことなくN2/FGF2/EGF/Y-27632の20エルフテックスcmディッシュを追加します。 37℃で細胞をインキュベート
- N2/FGF2/EGFで2〜3日ごとに細胞を養う。
注：これらは液滴内積み上げ起動したときのNC細胞が膨張、継代し、約4〜5日毎に、またはされています。 - 通路にNC細胞は、中、ワシントンを削除SH細胞を1回1X PBSでcmディッシュaccutase/10 8ミリリットルを追加します。 37℃で20分間インキュベートする。
- 5ミリリットルピペットを用いてプレートから細胞をピペット15mlチューブに転送。 6ミリリットル1X PBSを追加します。
- 114×gで5分間細胞をスピン。
- 液滴μlの2万cells/10を有するために、10 ng / mlのFGF2、20 ng / mlのEGFおよび10μMY-27632二塩酸塩を補充したN2-分化培地で細胞を再懸濁する。
- 乾燥したPO /ラム/ FNプレートに10μlの液滴中の細胞をReplate。料理は、20〜30分間、室温で放置。
- 慎重にN2/FGF2/EGF/Y-27632の20エルフテックスcmディッシュを追加します。 37℃でインキュベート
注：NC細胞は、比較的均質な前駆細胞集団として維持又は2週間まで拡張することができる。長い文化は、様々な子孫細胞型に分化するためにそれらをもたらす可能性がある。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
MS5-R-NCプロトコル11上のR-NCプロトコルの二つの最も重要な改善は、フィーダーを含まない、定義された分化条 件と時間の要件の全体的な短縮である。 MS5フィーダー細胞13は hESCの14から神経分化を支持することが示されているマウス骨髄由来間質細胞である。 hESCを従って、初期のヒト神経発生を模倣する、NC細胞を、10現れるそれらの周囲に、低密度フォーム上皮構造及び神経ロゼット15でMS5フィーダー細胞上で培養した。しかし、MS5フィーダー細胞から放出されるシグナル伝達分子とどのような成長因子は明らかではない。したがって、分化条件はあまりことが困難再発性実験及びHPSC線を横切って、それらを再生すること、定義されている。適切な神経誘導のために、ヒトES細胞は、MS5フィーダー細胞上に小さなコロニーに低密度で播種しなければ合併症を持っているティンスケールアップし、分化した細胞の高収量に達した。 2009年には、この方法は非常に効率的に12を hPSCsをneuralizingことを目的としていることを開発した。この方法ではhPSCsは10日間に神経誘導の高収率を達成し、MS5フィーダー細胞の非存在下で単層に高密度で播種する。私たちは、MS5-R-NC分化プロトコール（ 図1A）を適応させるこの方法のスキームに従った。 （ 図1B）MEF上で培養されたコロニーHPSCsを分散させ、高濃度（ 図1C）での単層培養における単一細胞としてマトリゲル上に播種する。分化の11日目に、細胞の大部分が首尾よく（PAX6陽性、12は図示せず）神経化ている。小滴中に高密度に細胞を再プレートする液滴内の凝縮神経ロゼット（ 図1Dおよび図2）を形成することができる。 NC細胞は、神経ロゼット（ 図1D <の境界に現れる/強い>）と液滴（ 図1E）から移動。さらに、培養7日後にNC細胞をFACS選別によって単離することができる。 HNK-1/p75 NC二重陽性細胞が20〜40％（ 図1F）の効率で単離することができる。 MS5-R-NCプロトコルは下流の様々なアプリケーションのためのR-NCセルプロトコルは、より有用なものと、35日以内に必要とするが、このプロトコルは、18日を要する。
この研究の目的は、古いNCプロトコルとして同じ細胞を得、より短い、より再現性かつ安価プロトコルNC細胞を生成することである。我々が正常に異なるHPSC線を横切るプロトコルの固体再現性を示す、患者と健常対照（データは示さない）に由来する少なくとも10のhESCおよびhiPSCラインを区別するためにこの新しいプロトコルを使用している。新しいプロトコルは、ノギン、SHHの少ない使用とMS5制作費の不足に対するLDNを使用しているため、コストを節約できます。新しいプロトコルは、35日に比べて18日間続き約5授乳ので、それらの関連するメディアコストを節約古いプロトコルでS。つのプロトコルで生成される細胞は、同様の同一性を有するかどうかを調べるために、我々は両方のプロトコルにおけるNC細胞の発達は、同じ分化パターン（ 図2）に従うことを示している。細胞は、神経ロゼット段階を通過し、FACSソートした後、同一の形態を有するのNC細胞を得る。古いプロトコルと比較して新しいプロトコルにおける神経ロゼットの小さいサイズは、11日目に再プレートした後に高い細胞密度に起因している。これとは対照的に、古いプロトコルのロゼットで凝縮したようではありませんHPSCコロニー内に形成する。 2プロトコルと派生NC細胞は、HNK-1、AP2及びネスチンと同じ生物学のNCマーカーを発現する。私たちは、世界的な遺伝子発現レベル（ 図3A）の2つのプロトコルで生成されたNC細胞を分析し、2のプロトコルで生成されたNC細胞が密接に一緒にクラスターことがわかった。属だったNC細胞wntシグナル伝達経路（のwnt-NC）の活性化およびメラノサイト16を生成する可能性を有することが示された、別々のグローバルな遺伝子発現によって分析クラスタによってテッドこれは、異なるNC集団であり得ることを示している。実際に、我々は、R-NC又はMS5-R-NC細胞（データは示していない）から、インビトロでメラニン前駆細胞を生成することができなかった。同様に、神経上皮細胞（LSB）、LDN193189とSB431542で10日間分化は明らかに異なる遺伝子発現パターンを示す。神経上皮細胞は、神経系の初期の前駆体であるので、NC細胞に比べてあまり分化しており、陰性対照集団としてここに含まれる。ここで生成されたR-NC細胞は古いプロトコルで作られた細胞に似ているかを評価するために、我々 は、in vitroスクラッチアッセイ（ 図3B）での遊走能を示しています。 48時間ソートされたR-NC細胞の融合だけでなく傷をつけた後、細胞がSCRA中に移行TCHに成功。最後に、R-NC細胞は自律神経系の細胞に分化する能力を有することを示している。細胞は自然に4日後HNK1 + / P75 +、FACSのために分化し、MASH1とのTuj1、自律神経細胞（ 図3C）に発現する遺伝子について染色した。
図1 R-NC分化プロトコルにおける重要なステップ。 。MS5-R-NC 10,11とR-NC分化プロトコルスキーム。 2つのプロトコルのうち特定の分化ステップが示されている。 MS5：フィーダー間質細胞、KSR：KSR-分化培地、N2：N2-分化培地、LDN：LDN193189、SB：SB431542、S：ソニック·ザ·ヘッジホッグ、8：FGF8、A：アスコルビン酸、B：BDNF B。未分化HPSCコロニーを示しています分化誘導前にOct-4およびDAPIで染色した。C。分化の0日目に細胞密度（90から100パーセントの密集度）、hPSCsをメッキした後、通常、1日を示しています。 開発 。 Pax6の液滴。 電子内HNK-1で染色した新興のNC細胞を染色し、神経のロゼットを示しています。液滴のエッジから出てくる液滴とNC細胞で11日目に再播種し、13日目の細胞を、示しています。F。分化の18日目で二重陽性のNC細胞をHNK-1/p75示すプロットをソートする代表的なFACS、。ゲートは未染色及び染色された単一のコントロール（図示せず）に基づいて選択した。プロットをFACSソーティング実験、HPSC線や二重陽性とシングル陽性細胞の割合の面で新旧プロトコルの使用との間で異なる場合があります。これにより、適切なNC細胞抽出されるように、二重陽性集団を単離することが重要である。 FのイメージCは、新しいR-NCプロトコルを使用して生成された。= "https://www.jove.com/files/ftp_upload/51609/51609fig1highres.jpg"ターゲット= "_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図2。MS5-R-NCまたはR-NCプロトコルで由来細胞匹敵する神経堤細胞の同一性を有する。両方のプロトコルでは、細胞が神経ロゼット段階を通過する。並べ替えNC細胞は形態によって、そのようなHNK-1とAP2などのNCマーカーの発現によって同じに見える。 NCの細胞は前駆細胞であることを示す、ネスチン陽性である。スケールバー：200μmである。すべての蛍光画像をDAPIのために対比されています。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図3。古いものと新しいプロトコルで生成されたNC細胞が同じようなアイデンティティ。Aを持っている 。 MS5-R-NCとR-NCプロトコルで誘導されたNC細胞を比較したイルミナマイクロアレイ遺伝子発現データの教師なしクラスタリング。それぞれ35日または18日目でのMS5-R-NCまたはR-NCプロトコルで誘導されたNC細胞は、イルミナ人間12オリゴヌクレオチドアレイへのハイブリダイゼーションによって三連で分析した。データ解析は、ゲノムのPartek Suiteソフトウェアを用いて行った。有意差は、0.05未満2より大きく、FDR変化倍率を持つものと定義した。 1,421の遺伝子を分析した。このような樹形の長さのためのユークリッドサンプル非類似度、平均連結クラスター法や25などのデフォルト設定は、使用された。 wntシグナル伝達（のwnt-NC）を活性化することによって誘導されたNC細胞（細胞が含まれていたのdiffereLDN193189日0-3、SB431542の日0-4でntiated、CHIR99021日0-11およびFACSはSOX10のために11日目にソートされています）16。これらの細胞のwnt-NC細胞およびR-NC細胞の異なる集団であることを示す、R-NC細胞とは別にクラスター。 LDN193189とSB431542での11日間、分化した細胞は神経上皮コントロール（LSB）として含めた。 R-NC及びMS5-R-NC細胞は、対照細胞と比較して、密接に一緒にクラスタ化する。生の遺伝子発現データは、GEO（www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）受託番号＃に用意されています。GSE50643 B。移動アッセイ。 HNK1 + / P75 +、FACSは、R-NC細胞を、96ウェルでのPO /ラム/ FN上にプレーティングし、24時間後に手動で傷た並べ替え。 0時間の映像はヘキストで染色を傷やポストの直後に撮影された。残りのウェルは、次の写真が撮影された前に48時間移動させた。スケールバー：200μmのCの。ソートされたR-NC細胞は自然に4日間分化させ、馬のために染色したSH1、のTuj1およびDAPI。スケールバー：500μmで、この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ヒトES細胞/ hiPSCsからのR-NC細胞の正常な分化のために、次の点に注意して行ってください。これは、常に無菌培養条件の下で動作することが重要である。特に、この汚染が成功分化の妨げになることから、定期的にマイコプラズマ汚染のためHPSC培養をテストすることが重要ですが、容易にHPSC培養で視覚的に検出することができません。 R-NC分化が90〜100％の細胞密度で開始されるべきである;低い細胞密度、細胞生存およびR-NC分化の効率に影響を与える。これは、経験的に、効率的なNC分化を支援するための特定のKSRに、最適濃度および試薬の一部のロット番号を検証することが重要です。細胞が液滴中11日目に再播種される場合、10μlの液滴内の細胞密度が高くあるべきであり、最高の経験的に決定される。適切なロゼットとNC-形成は、液滴中の適切な細胞密度に依存します。私たちは、obserを経験的に細胞をAccutaseを用いた治療後に少なくとも二回洗浄されたときVEDは、細胞生存を増加させた。 FACSによるR-NC細胞の正常な分離のためにこのような染色染色していない、単一の抗体および二次抗体のみ染色された細胞などの適切な実験のコントロールは、非常に重要である。死細胞はDAPI、7-AAD又はヨウ化プロピジウム染色によって除外することができる。さらに、抗体希釈液は、経験的に各特定の抗体のロットについて決定されるべきである。シングル染色は、P75陽性CNS細胞などの不要な細胞型、初期中胚葉やプラコードで、NCの人口の汚染につながる可能性があるので、それは、HNK-1およびp75との二重染色により、R-NC細胞を精製し、FACSに重要です。我々の経験では、単一のステンド集団に対する二重の割合はHPSCラインと分化実験の間で変化することができる。 R-NC細胞生存ポストFACSは賢明代わりに細胞を再懸濁するために、チューブのフリック、細胞の過酷なピペット操作を回避していることによって増加させることができる。また、R-NC FACSめっき馴化培地（細胞が、FACSの前で増加したろ過媒体）で単離された細胞は生存11を改善することが示されている。それは、効率的な中和及びロゼット形成を確実にするために11日目と14日目に、神経上皮マーカーPax6ので染色することができる並列に小さなスケールの差別化を行うことをお勧めします。このような適切なNC分化のためのロゼット段階でHNK-1またはAP2などのNCマーカーは、同様に評価すべきである。また、孤立した、R-NC細胞は、AP2、HNK-1およびネスチンなどのNCマーカー（ 図2）のために、形態および染色によって検証する必要があります。
HPSCからMS5-R-NC細胞の誘導は、Lee ら 10によって2007年に記載されている。なお、この前駆体集団が増殖し、さらにNC系統の誘導体にインビトロで分化できることが示された。 MS5-R-NC細胞が自発的に神経球法10,17を使用して分化させることができるまたはすることにより、in vitro分化に指示した。なお、MS5-R-NC細胞は末梢神経系（自律神経および感覚ニューロン）の細胞、末梢グリア（シュワン細胞）、筋線維芽細胞、間葉系幹細胞およびそれらの子孫および平滑筋10を生じさせることができることが立証された。ひよことマウスへの移植はMS5-R-NCの細胞が移動し、 生体内 10 で分化することが示された。 MS5-R-NC細胞はさらに、ヒト疾患のモデル化に関与している。遺伝病家族Disautonomia（FD）の特徴的な表現型は、患者の特定のhiPSC由来MS5-R-NC細胞2を用いてin vitroでモデル化した。そのような機能不全NC細胞の発生および移動のようNC特性の表現型は、FD患者由来の細胞ではなく、健康な対照細胞に示した。 MS5-R-NC細胞は、ヒト胚性神経堤の間の移行に影響を与える化合物の毒性試験を確立するために利用されている開発、マイナスの神経発達5に影響を与える可能性があり、将来の薬物の放出を避けるために可能性を秘めた。 HPSC技術の刺激的な適用は、ヒト疾患のための医薬の治療の選択肢のハイスループットスクリーニングおよび試験である。 MS5-R-NC細胞はIPSCベースの疾患モデル、 すなわち家族性自律神経失調症4の最初のような画面を実現するために使用された。この画面には、さらに、臨床試験で評価することができる新規化合物の同定につながった。
HPSCフィールドのすべてのアプリケーションのためには、正確で再現性のある、定義されており、利用可能なインビトロ分化プロトコールにおいて特定持つことが重要です。本稿では、hPSCsからのR-NC細胞の誘導のために確立されたin vitroでの分化プロトコルの適応を示している。報告されたプロトコルは、先に複数の定義された培養条件で10を報告した同じ細胞とshorteを生じるR時間枠。このプロトコルは、化合物スクリーニング、毒性試験及びNC系統に由来する細胞型へ向かう分化プロトコールのさらなる開発のために、NC系統の細胞に影響を及ぼすヒト疾患のためのR-NC細胞を生成するために用いることができる。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者らは、開示することなく、競合する利害関係はありません。
Acknowledgments
そしてトライ制度幹細胞イニシアチブ（スター財団）;この作品は、スイス国立科学財団からNYSTEM（C026447 C026446）からの補助金を通じて先進的な研究者のためのフェローシップでサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Gibco-Life Technologies | 11965-092 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| DMEM/F12 | Gibco-Life Technologies | 11330-032 | |
| Knockout Serum Replacement | Gibco-Life Technologies | 10828-028 | Lot should be tested |
| L-Glutamine | Gibco-Life Technologies | 25030-081 | |
| Penicinlin/Streptomycin | Gibco-Life Technologies | 15140-122 | |
| MEM minimum essential amino acids solution | Gibco-Life Technologies | 11140-050 | |
| β-Mercaptoethanol | Gibco-Life Technologies | 21985-023 | toxic |
| Recombinant human FGF basic (FGF2) | R&D Systems | 233-FB-001MG/CF | |
| Knockout DMEM | Gibco-Life Technologies | 10829-018 | |
| DMEM/F12 powder | Invitrogen | 12500-096 | |
| Glucose | Sigma | G7021 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| APO human transferrin | Sigma | T1147 | |
| Human insulin | Sigma | I2643 | |
| Putriscine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
| Selenite | Sigma | S5261 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Matrigel matrix | BD Biosciences | 354234 | |
| Poly-L Ornithin hydrobromide | Sigma | P3655 | |
| Mouse Laminin-I | R&D Systems | 3400-010-01 | |
| Fibronectin | BD Biosciences | 356008 | |
| Dispase in Hank's Balanced Salt Solution 5 U/ml | Stem Cell Technologies | 7013 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco-Life Technologies | 25300-054 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris-R&D Systems | 1254 | |
| LDN193189 | Stemgent | 04-0074 | |
| SB431542 | Tocris-R&D Systems | 1614 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A4034 | |
| BDNF | R&D Systems | 248-BD | |
| FGF8 | R&D Systems | 423-F8 | |
| Mouse recombinant sonic hedgehog (SHH) | R&D Systems | 464SH | |
| HBSS | Gibco-Life Technologies | 14170-112 | |
| HEPES | Gibco-Life Technologies | 1563-080 | |
| Human recombinant EGF | R&D Systems | 236EG | |
| gelatin (PBS without Mg/Ca) | in house | ||
| Antibodies: | |||
| Anti HNK-1/N-Cam (CD57) mIgM | Sigma | C6680-100TST | lot should be tested |
| Anti-p75 mIgG1 (Nerve Growth factor receptor) | Advanced Targeting Systems | AB-N07 | lot should be tested |
| APC rat anti-mIgM | BD Parmingen | 550676 | lot should be tested |
| AlexaFluor 488 goat anti-mouse IgG1 | Invitrogen | A21121 | lot should be tested |
| Anti Oct4 mIgG2b (used at 1:200 dilution) | Santa Cruz | sc-5279 | lot should be tested |
| Material/Equipment: | |||
| Mouse embryonic fibroblasts (7 million cells/vial) | GlobalStem | GSC-6105M | |
| Cell culture dishes: 10 cm and 15 cm plates, centrifuge tubes, FACS tubes, pipettes, pipette tips | |||
| Glass hematocytometer | |||
| Cell culture centrifuge | |||
| Cell culture incubator (CO2, humidity and temperature controlled) | |||
| Cell culture laminar flow hood with embedded microscope | |||
| Cell culture biosafety hood | |||
| Cell sorting machine, i.e. MoFlo | |||
| Inverted microscope | |||
| 1 ml TB syringe 27Gx1/2 | BD Biosciences | 309623 | |
| Cell lifter Polyethylene | Corning Incorporated | 3008 |
References
- Lee, G., Studer, L. Induced pluripotent stem cell technology for the study of human disease. Nat Methods. 7, 25-27 (2010).
- Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461, 402-406 (2009).
- Ebert, A. D., et al. Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient. Nature. 457, 277-280 (2009).
- Lee, G., et al. Large-scale screening using familial dysautonomia induced pluripotent stem cells identifies compounds that rescue IKBKAP expression. Nat Biotechnol. 30, 1244-1248 (2012).
- Zimmer, B., et al. Evaluation of developmental toxicants and signaling pathways in a functional test based on the migration of human neural crest cells. Environ Health Perspect. 120, 1116-1122 (2012).
- Dupin, E., Sommer, L. Neural crest progenitors and stem cells: from early development to adulthood. Dev Biol. 366, 83-95 (2012).
- McKeown, S. J., Stamp, L., Hao, M. M., Young, H. M. Hirschsprung disease: a developmental disorder of the enteric nervous system. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2, 113-129 (2013).
- Slaugenhaupt, S. A., et al. Tissue-specific expression of a splicing mutation in the IKBKAP gene causes familial dysautonomia. Am J Hum Genet. 68, 598-605 (2001).
- Cheung, N. K., Dyer, M. A. Neuroblastoma: developmental biology, cancer genomics and immunotherapy. Nat Rev Cancer. 13, 397-411 (2013).
- Lee, G., et al. Isolation and directed differentiation of neural crest stem cells derived from human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25, 1468-1475 (2007).
- Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. Derivation of neural crest cells from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 5, 688-701 (2010).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27, 275-280 (2009).
- Itoh, K., et al. Reproducible establishment of hemopoietic supportive stromal cell lines from murine bone marrow. Exp Hematol. 17, 145-153 (1989).
- Barberi, T., et al. Neural subtype specification of fertilization and nuclear transfer embryonic stem cells and application in parkinsonian mice. Nat Biotechnol. 21, 1200-1207 (2003).
- Elkabetz, Y., et al. Human ES cell-derived neural rosettes reveal a functionally distinct early neural stem cell stage. Genes Dev. 22, 152-165 (2008).
- Mica, Y., Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. Modeling neural crest induction, melanocyte specification, and disease-related pigmentation defects in hESCs and patient-specific iPSCs. Cell Rep. 3, 1140-1152 (2013).
- Molofsky, A. V., et al. Bmi-1 dependence distinguishes neural stem cell self-renewal from progenitor proliferation. Nature. 425, 962-967 (2003).
