Summary
Neurallisten (NC)-celler härledda från humana pluripotenta stamceller (HPSC) har stor potential för att modellera människans utveckling och sjukdom och för cellutbytesterapier. Här, en matarfria anpassningen av den för närvarande allmänt användsAbstract
Mänskliga pluripotenta stamceller (hPSCs) har stor potential för att studera mänskliga embryonala utveckling, för modellering av mänskliga sjukdomar i skålen och som en källa till transplanterbara celler för regenerativa applikationer efter sjukdom eller olycksfall. Neurallisten (NC)-celler är de prekursorer för en stor variation av vuxna somatiska celler, såsom celler från det perifera nervsystemet och glia, melanocyter och mesenkymala celler. De är en värdefull källa av celler för att studera aspekter av mänsklig embryonal utveckling, inklusive cell öde specifikation och migration. Ytterligare differentiering av NC progenitorceller i terminalt differentierade celltyper erbjuder möjligheten att modellera mänskliga sjukdomar in vitro, undersöka sjukdomsmekanismer och generera celler för regenerativ medicin. I denna artikel presenteras en anpassning av en för närvarande tillgänglig in vitro differentiering protokoll för härledning av NC-celler från hPSCs. Detta nya protokoll kräver 18 dagars differentiation är feeder-fri, skalbar och mycket reproducerbar bland mänskliga embryonala stamceller (hESC) linjer samt mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (hiPSC) linjer. Både gamla och nya protokoll ger NC-celler med samma identitet.
Introduction
Mänskliga embryonala stamceller (hESC) och mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (hiPSC) har visat enorm potential, särskilt för utredningen och framtida behandling av mänskliga sjukdomar för vilka varken bra djurmodeller eller primära vävnader finns tillgängliga. Applikationsexempel för hESC / hiPSC teknik är följande: Celler av särskilt intresse kan genereras från hESC / hiPSCs för regenerativ medicin vid obegränsad mängd 1. Celler kan tillverkas av patienter som bär en specifik sjukdom och användas för att fastställa in vitro-sjukdomsmodeller 2,3. Sådana sjukdomsmodeller kan sedan användas för storskalig drogscreening i jakten på nya läkemedelssubstanser 4 samt testning av existerande läkemedel för effektivitet och toxicitet 5. In vitro sjukdomsmodeller kan leda till identifiering av mekanismer nya sjukdoms. För alla tillämpningar av stamceller från mänskliga embryon / iPSC teknik är det viktigt att arbeta med specifika, väl definierad celltyper som påverkas i sjukdomen av intresse. Således är avgörande för alla tillämpningar av stamceller från mänskliga embryon / hiPSC teknik tillgången på fasta och reproducerbara in vitro differentieringsprotokoll. Protokoll är önskvärt att visa minimal variation, tids kostnad, ansträngning, svårighet och kostnad samt maximal reproducerbarhet bland hESC / hiPSC linjer och olika forskare.
Neurallisten (NC)-celler växa under vertebrat neurulation mellan epidermis och det neurala epitelet. De förökar sig och migrera mycket i hela det växande embryot och ge upphov till en imponerande mångfald av typer avkomma cell, inklusive ben / brosk, den kraniofaciala skelettet, sensoriska nerver, Schwann celler, melanocyter, glatta muskelceller, enterala neuroner, autonoma nervceller, kromaffinceller , hjärt septum celler, tänder och adrenal / sköldkörtelkörtelceller 6. Sålunda NC-celler är en attraktiv celltyp för stamcells fältet och viktigt förmodellering av en mängd olika sjukdomar, till exempel Hirschsprungs sjukdom 7, Familial Dysautonomia 8 samt cancrar såsom neuroblastom 9. Dessutom erbjuder de en möjlighet att studera aspekter av mänsklig embryonal utveckling in vitro.
Den nu tillgängliga och i stor utsträckning in vitro differentiering protokoll för härledning av NC-celler från hESCs 10,11 kräver upp till 35 dagar av differentiering och det innebär neurala induktion på stromaceller feeder celler såsom MS5 celler och därför utförs under dåligt definierade villkor. Även om det kan skalas upp för att generera stora kvantiteter av NC-celler, exempelvis krävs för high-throughput drug screening 4, är detta arbets-och kostnadsintensiv. Dessutom handlar det om manuell passage av neurala rosetter, som kan vara svåra att reproducera och därmed är föremål för totala variabiliteten, i synnerhet när det tillämpas på en stor variation av stamceller från mänskliga embryon eller hiPSClinjer. Här är den stegvis härledning av NC-celler i en 18-dagars protokoll som är fri från feeder-celler visas. Denna metod är kortare och mer definierat än det för närvarande använda protokoll. Vidare är det mycket robust i att generera NC-celler hos olika hiPSC linjer. Viktigt är det visat att NC-celler som uppkommer genom båda protokollen fram vid gränsen av neurala rosetter (nedan benämnd rosett-NC eller R-NC). Cellerna härledda med hjälp av någon av de två protokollen ser morfologiskt identiska, de uttrycker samma NC-markörer och kluster tillsammans i microarray analys. NC-celler som härrör använda det nya protokollet (R-NC) är funktionella, liknar NC celler härledda med hjälp av gamla protokoll (MS5-R-NC) så att de kan migrera och ytterligare differentiera till neuroner. Därför kan cellerna användas samtidigt med de MS5-R-NC-celler. Den R-NC-cell protokoll för härledning av NC-celler från stamceller från mänskliga embryon / iPSC kommer att vara användbart för alla tillämpningar av stamceller från mänskliga embryon / iPSC teknik involverar NC härstamning. </ P>
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av Kultur Media, Belagda Rätter och underhåll av hPSCs
Beredning 1,1 Media
Obs: Filter alla medier för sterilisering och förvara vid 4 ° C i mörker i upp till två veckor. Reagens namn, företags-och katalognummer listas i materialtabellen.
- DMEM/10% FBS: Kombinera 885 ml DMEM, 100 ml FBS, 10 ml Pen / Strep och 5 ml L-glutamin.
- HES-medium: Kombinera 800 ml DMEM/F12, 200 ml KSR, 5 ml L-glutamin, 5 ml pen / strep, 10 ml MEM minimala essentiella aminosyror lösning, 1 ml β-merkaptoetanol. Lägg till 10 ng / ml FGF-2 efter filtrering av mediet.
VARNING: β-Mercaptoethanol är giftigt, undvika inandning, förtäring och hudkontakt. - KSR-differentieringsmedium: Kombinera 820 ml Knockout DMEM, 150 ml KSR, 10 ml L-glutamin, 10 ml Pen / Strep, 10 ml MEM minimala essentiella aminosyror lösning och 1 ml β-merkaptoetanol.
- N2-differentiatipå medium: Lös 12 g DMEM/F12 pulver i 980 ml dH 2 O, till 1,55 g glukos, 2 g natriumbikarbonat och 100 mg APO humant transferrin. Blanda 2 ml dH 2 O med 25 mg humant insulin och 40 ^ 1 N NaOH, tillsätt den upplösta lösningen till mediet. Tillsätt 100 l putrescine dihydroklorid, 60 pl selenit, 100 ^ progesteron och få upp volymen till 1 L med dH 2 O.
1.2 Beläggning av kultur rätter
- Matrigel beläggning: Tina 1 ml fryst matrigel alikvot genom att pipettera 19 ml DMEM/F12 över alikvot tills den har lösts upp. Ta bort klumpar genom att passera den genom ett 40 | im cellfilter och plattan 8 ml/10 cm skål. Inkubera skålarna under 1 h vid RT. Aspirera matrigel omedelbart före utstrykning av cellerna.
OBS: Arbeta snabbt med matrigel eftersom det kan klumpa vid temperaturer över 4 ° C. - PO / Lam / FN beläggning: Tillsätt 10 ml 1x PBS innehållande 15 mikrogram / ml Poly-L Ornithin hydrobromid till en 10 cm skål. Inkubera skålen över natten vid 37 ° C. Tvätta plattorna med 1x PBS en gång och tillsätt 10 ml/10 cm skål i 1x PBS innehållande 2 ng / ml mus Laminin-I och 2 mikrogram / ml fibronektin. Inkubera skålarna över natten vid 37 ° C. Innan plätering cellerna, helt ta bort lösningen och låt plattorna torka ordentligt vid RT i 15-20 minuter genom att stå upp dem på vävnadsodling huva vägg utan locket på.
OBS: Rätter är helt torr och klar för cell plätering när man kan se kristallstrukturer på ytan (synliga genom ögat). Plattorna kan förvaras vid rumstemperatur under några timmar i denna torkade tillstånd. PO / Lam / FN rätter måste förberedas 2 dagar i förväg. I akuta fall Lam / FN kan inkuberas endast 2-4 timmar. Detta kan dock riskera suboptimala differentiering / överlevnadsresultat.
1.3 Underhåll av hPSCs
OBS: hPSCs bibehålls på 0,1% gelatin och mitotiskt inaktiv mus embryonala fibroblaster (MEFS) vid HES-medium kompletterat med 10 ng / ml FGF-2 som beskrivits tidigare 10,12. Cellerna bör delas varje 6-8 dagar.
- Coat en 10 cm skål med 8 ml 0,1% gelatin (i 1x PBS utan magnesium eller kalcium) vid RT under 5 min.
- Tina frysta MEFs snabbt i ett 37 ° C vattenbad. Lägg 1 miljon MEF till 10 ml DMEM/10% FBS.
- Aspirera gelatin och plattan cellerna. Inkubera vid 37 ° C under åtminstone 6 timmar.
- Aspirera DMEM/10% FBS från det beredda MEF plattan, tvätta plattan med 1 x PBS en gång och tillsätt 10 ml HES-medium kompletterat med 10 | iM Y-27632-dihydroklorid. Låt mediet värmas upp vid 37 ° C under 20 min.
Obs: För manuell delning av hPSCs ett laminärt flöde huva med en inbäddad mikroskop används. Emellertid kan cellerna passe användning av lämpliga alternativa metoder. - Under ett laminärt flöde huva med en inbäddad mikroskop, lossa separata kolonier med hjälp av en cell lyftaren och låt dem flyta.
- Använd ett1 ml spruta för att aspirera flytande kolonier och sända dem på den friska, varma MEF plattan. Överför ca en fjärdedel av cellerna för den nya skålen. Inkubera vid 37 ° C.
- Mata celler dagligen med färska HES medium.
2. Plating av hPSCs för Differentiering
OBS: hPSCs bör delas eller klädd för differentiering när kolonierna är stora, men ändå ha skarpa kanter med så lite som möjligt åtskillnad celler vid sina gränser (se Figur 1B). När cellerna upprätthålls med hjälp av manuell passage kolonierna bör vara tillräckligt stort för att lätt ses med blotta ögat. För att få rätt känsla för denna tidpunkt kan man behålla en separat HPSC skålen för två veckor utan att ympa om och titta på cellerna når och passerar den idealiska tidpunkten för passaging / differentiera dem.
- Förbered 10 cm rätter med matrigel 1 timme innan differentiering. Framgångsrik matrigel beläggning kan varaverifieras vid 4x förstoring.
- När hPSCs är klara att delas, aspirera mediet och tillsätt 4 ml av 0,05% trypsin-EDTA till cellerna.
- Skaka skålen horisontellt under 2 min kraftigt tills en kan se MEFs som enskilda celler som lyfter av plattan under mikroskop. De HPSC kolonierna sitter kvar som kolonier.
- Omedelbart och grundligt, aspirera trypsin och låt plattan stå vid RT i 2-4 minuter.
- Tillsätt 2 ml HES-medium till plattan och genom att använda en P1000 pipett lösgöra cellerna.
Notera: Om cellerna inte kan lyftas av från ytan lätt kan plattan inkuberas tom vid RT under ytterligare 2-3 min. - Överför cellerna till 8 ml HES-medium kompletterat med 10 | iM Y-27632-dihydroklorid.
- Aspirera matrigel från en tidigare framställd 10 cm skål. Plate cellerna vid en 01:01 eller 01:02-förhållande (till exempel: Cellerna från en 10 cm skål delas upp i två 10 cm skålar) på matrigel plattan. Inkubera vid 37 °C över natt.
OBS: Denna plätering bör resultera i cirka 100.000 celler / cm 2.
3. Induktion av Neural Differentiation
Obs: differentiering kan initieras (dag 0) när cellerna är 90-100% konfluenta (se figur 1C), vanligtvis följande dag. Om exakt confluency inte nås ännu, kan cellerna matas dagligen med HES-medel tills de är redo för differentiering. Alternativt kan man öka det initiala antalet celler utstrukna.
- På dag 0 till 3, mata cellerna dagligen med 10 ml/10 cm skål KSR-differentieringsmedium innehållande 0,1 pM LDN193189 och 10 | iM SB431542.
- På dag 4 och 5 foder cellerna med 75% KSR-differentiering medium och 25% N2-differentieringsmedium både innehåller LDN193189 och SB431542.
- På dag 6 och 7 foder cellerna med 50% KSR-differentiering medium och 50% N2-differentieringsmedium både innehåller LDN193189 och SB431542.
- På dag 8 och 9 foder cellerna med 25% KSR-differentiering medium och 75% N2-differentieringsmedium både innehåller LDN193189 och SB431542.
- På dag 9 och 10 förbereder PO / Lam / FN rätter som anges i 1.2.2 för nicasiling av cellerna på dag 11.
- På dag 10 foderceller med N2-differentieringsmedium innehållande LDN193189 och SB431542.
4. Nicasiling i Droppar för NC-specifikation
- På dag 11 aspirera Lam / FN från de tidigare beredda plattorna och låt dem torka helt vid RT i 20-30 min, som förklaras i 1.2.2.
- Ta bort mediet från de differentierande cellerna, tvätta cellerna en gång med 1x PBS och tillsätt 8 ml accutase/10 cm skål. Inkubera under 20 minuter vid 37 ° C.
- Med hjälp av en cell lyftaren, lossa cellerna och resuspendera dem i Accutase med en 5 ml pipett. Överför suspensionen till ett 15 ml rör.
- Tillsätt 5 ml 1 x PBS och centrifugera cellerna under 5 min vid 114 x g..
- Resuspendera cellerna i 10 ml 1x PBS. För att säkerställa en enkelcellsuspension, filtrera dem genom ett 40 | im cellfilter och räkna cellerna med en hemocytometer eller likvärdig teknik.
- Snurra cellerna ned och återsuspendera dem i N2-differentieringsmedium innehållande 200 | iM askorbinsyra (AA), 20 ng / ml BDNF, 100 ng / ml FGF8, 20 ng / ml SHH, 10 pM Y-27632-dihydroklorid i en koncentration av 100.000 -150000 celler/10 pl.
- Med hjälp av en upprepning-pipett, plattan 10 pl droppar nära varandra utan dem röra på den torkade PO / Lam / FN 15 cm rätter.
OBS: En 10 cm skål av differentierade celler resulterar normalt i cirka 2-3 gånger 15 cm rätter eller ungefär 100 x 10 ^ droplets/15 cm skål. - Låt dropparna stå vid RT under 20 till 30 minuter, därefter mycket noggrant (för att inte störa de små dropparna) tillsätt 30 ml av N2/AA/BDNF/FGF8/SHH/Y och inkubera vid 37 ° C.
- På dag 12, försiktigt mata cellerna med 20 ml/15 cm skål N2/AA/BDNF/FGF8/SHH.
- Från day 14-17 mata cellerna varannan eller var tredje dag med N2/AA/BDNF/FGF8.
- På dag 16 och 17 förbereda PO / Lam / FN-plattor till förnyad utbredning NC-celler efter FACS sortering.
5. Fluorescens Aktivt cellsortering (FACS) i NC-celler
Observera: Beredningen av cellerna för FACS kräver cirka 2 tim.
- På dag 18 remove medium, tvätta cellerna en gång med 1 x PBS i skålen och tillsätt 12 ml Accutase. Inkubera cellerna under 20 min vid 37 ° C.
- Med hjälp av en cell lyftaren, lossa cellerna från ytan och låta dem flyta. Pipettera cellerna i suspension med hjälp av en 5 ml pipett, överföra dem till ett 50 ml rör och tillsätt 30 ml 1x PBS. Centrifugera cellerna under fem minuter vid 114 x g..
- Med hjälp av en P1000 pipett, resuspendera cellerna i 1 ml 2% FBS / HBSS (HBSS innehåller 15 mM HEPES). Lägg till 19 ml av 2% FBS / HBSS och filtrera cellerna genom en 40 | im cellfilter för att säkerställa en enkelcellsuspension. Inkubera cellerna på is under 15 min för antikropps blockering och sedan räkna dem med hjälp av en hemocytometer.
- Snurra cellerna ned och återsuspendera dem i en koncentration av 10 miljoner celler / ml i 2% FBS / HBSS.
- Avsätta 1 miljon celler vardera för ofärgade, singel-färgade (HNK-1 endast och enbart p75) och sekundär antikropp färgas endast (APC endast och 488 endast) FACS styr.
- Lägg till 5 l av HNK-1 och 5 l av p75 primär antikropp per 10 miljoner celler i 1 ml suspension till rätt prover och inkubera i 20 minuter på is.
- Tvätta cellerna i 10 ml 1x PBS (centrifugera 5 min vid 114 xg) och suspendera cellerna i 1 ml 2% FBS / HBSS. Lägg 2 pl av APC och 1 | il av 488 sekundär antikropp per 10 miljoner celler i 1 ml suspension till rätt prov och inkubera i 20 minuter på is i mörker.
Notera: APC och 488 är de sekundära antikroppar används här för HNK-1 och p75 färgning, respektive. - Tvätta cellerna i 10 ml 1 x PBS två gånger, återsuspendera 10 miljoner celler i 500 | il2% FBS / HBSS innehållande DAPI (vid 0,5 ng / | il) eller en alternativ lämplig levande cell fläck att utesluta döda celler från FACS-analys.
- Överför proverna till lämpliga FACS rör.
- Förbered FACS rör med 0,5 ml 2% FBS / HBSS för cellsamling.
Anmärkning: De celler och uppsamlingsrören hölls på is i mörker under sortering tid. - Med hjälp av en cellsorteringsmaskin med lasrar som kan upptäcka DAPI, APC och 488 slag DAPI-/HNK-1 + / P75 + dubbla positiva celler.
OBS: Förberedelsetid och hantering av celler leder till en liten andel av celldöd, DAPI fläckar döda celler tillåter endast och därmed för dessa celler att uteslutas från den sorterade populationen. Alla alternativ levande / döda fläcken fungerar lika bra för detta ändamål. DAPI i sig orsakar inte cytotoxicitet i den levande cellpopulation.
6. Nicasiling av sorterade celler, NC underhåll och utbyggnad
OBS: FACS sorteras celler bör vara handledde med särskild omsorg för att säkerställa optimal överlevnad. Håll dem på is tills omstryka dem. Inte Vortexa eller pipettera dem hårt. Cellerna kan återsuspenderas genom att ställa röret.
- Efter FACS-sortering, räkna NC-celler, då spinn ner dem och återsuspendera i N2-differentiering medium kompletterat med 10 ng / ml FGF2, 20 ng / ml EGF och 10 pM Y-27632-dihydroklorid i volymen lämpligt att förnyad utbredning dem vid 30000 celler / 10 | il droppar.
- Helt torr tidigare beredda PO / Lam / FN-plattor och platt ca 50-70 droppar per 10 cm skål. Låt skålarna stå vid RT under 20 till 30 min.
- Mycket försiktigt 20 ml/10 cm skål av N2/FGF2/EGF/Y-27632 utan att störa dropparna. Inkubera cellerna vid 37 ° C.
- Mata cellerna var 2-3 dagar med N2/FGF2/EGF.
OBS: NC-celler expanderas eller passe ungefär varje 4-5 dagar eller när de börjar tornar upp inom dropparna. - För passage NC cellerna, avlägsna mediet, wash cellerna en gång med 1x PBS och tillsätt 8 ml accutase/10 cm skål. Inkubera under 20 minuter vid 37 ° C.
- Pipettera cellerna från plattan med hjälp av en 5 ml pipett och för över dem till en 15 ml tub. Lägg 6 ml 1x PBS.
- Centrifugera cellerna under fem minuter vid 114 x g..
- Resuspendera cellerna i N2-differentieringsmedium kompletterat med 10 ng / ml FGF2, 20 ng / ml EGF och 10 pM Y-27632-dihydroklorid för att få 20.000 celler/10 ^ il droppe.
- Förnyad utbredning cellerna i 10 fil droppar på torkade PO / Lam / FN-plattor. Låt skålarna stå vid RT under 20 till 30 min.
- Sätt försiktigt 20 ml/10 cm skål av N2/FGF2/EGF/Y-27632. Inkubera vid 37 ° C.
OBS: NC-celler kan bibehållas eller utökas i upp till 2 veckor som en relativt homogen gångare befolkning. Längre kultur kan leda dem att differentieras till olika avkomma cell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De två viktigaste förbättringar av R-NC-protokollet över MS5-R-NC-protokoll 11 är matarfria, definierade differentieringsförhållanden och den allmänna förkortningen av tidskravet. MS5 feeder celler 13 är murina benmärg härledda stromaceller som har visat att stödja neural differentiering från hESCs 14. HESCs odlas på MS5 feeder-celler vid låg densitet bildar epiteliala strukturer och neurala rosetter 15, vid vars periferi NC-celler växa 10, sålunda härma tidig human neural utveckling. Det är dock oklart vilka signalmolekyler och tillväxtfaktorer frigörs från MS5 feeder celler. Därför är differentieringsförhållanden dåligt definierat, vilket gör det svårt att återge dem i återkommande försök och över HPSC linjer. För adekvat neural induktion, hESCs måste seedas vid låg densitet i små kolonier på MS5 feeder celler, komplikationerting up-scaling och nå höga utbyten av differentierade celler. Under 2009 utvecklades en metod som syftar till neuralizing hPSCs mycket effektivt 12. I denna metod hPSCs sås ut med hög densitet, i monoskikt i frånvaro av MS5 matarceller, uppnå höga utbyten av neural induktion i 10 dagar. Vi följde systemet av denna metod för att anpassa MS5-R-NC differentiering protokoll (Figur 1A). HPSCs odlade i kolonier på MEF (Figur 1B) är spridda och ympas på matrigel som enskilda celler i ett monolager kultur med hög densitet (Figur 1C). Vid dag 11 av differentiering, har majoriteten av cellerna framgångsrikt neuralized (Pax6-positiv, visas inte 12). Nicasiling cellerna vid hög densitet i droppar medger bildning av kondenserade neurala rosetter inom droppen (figur 1D och figur 2). NC-celler uppstår vid gränser neurala rosetter (figur 1D </ Strong>) och vandrar ut ur droppen (figur 1E). Efter 7 dagars ytterligare odling NC-celler kan isoleras genom FACS-sortering. HNK-1/p75 dubbelpositiva NC-celler kan isoleras på effektiviteten i 20-40% (figur 1F). Detta protokoll kräver 18 dagar, medan den MS5-R-NC-protokollet kräver upp till 35 dagar, vilket gör det R-NC-cell-protokoll mer användbara för en mängd olika tillämpningar i efterföljande led.
Syftet med detta arbete är att skapa NC-celler i en kortare, mer reproducerbar och billigare protokoll, vilket ger samma celler som det gamla NC-protokollet. Vi har använt detta nya protokoll för att framgångsrikt differentiera minst 10 hESC och hiPSC linjer härledda från patienter och friska kontroller (data visas ej), som visar fast reproducerbarhet av protokollet mellan olika HPSC linjer. Det nya protokollet sparar kostnader på grund av användningen av LDN kontra noggin, mindre användning av SHH och bristen på MS5 produktionskostnader. Det nya protokollet varar 18 dagar jämfört med 35 dagarar i den gamla protokoll, vilket sparar cirka 5 matning och därmed tillhörande mediakostnader. För att undersöka om cellerna som produceras med de två protokollen har liknande identitet, visar vi att NC-cellutveckling i båda protokollen följer samma differentieringsmönster (Figur 2). Cellerna passerar genom ett neuralt rosett scen och ger NC-celler med identisk morfologi efter FACS sortering. Den mindre storleken på de neurala rosetter i det nya protokollet jämfört med det gamla protokollet beror på den höga celltätheten efter omstryka på dag 11. Däremot i de gamla protokoll rosetter bildas inom HPSC kolonier, som inte är som kondenseras. NC-celler härledda med de två protokollen uttrycka samma biologiska NC-markörer, såsom HNK-1, AP2 och nestin. Vi analyserade NC-celler som genereras med de två protokollen om ett globalt genuttryck nivå (Figur 3A) och fann att NC-celler som genereras med de två protokollen kluster nära tillsammans. NC-celler som var släktenated genom aktivering av den Wnt signalväg (WNT-NC) och visade sig ha potential att generera melanocyter 16, kluster för sig vid analys av genuttryck, vilket tyder på att detta kan vara ett annat NC-befolkning. I själva verket har vi inte kunnat generera melanocytantalet stamceller från R-NC eller MS5-R-NC-celler (data visas ej). Likaså neuroepiteliala celler (LSB), differentieras i 10 dagar i LDN193189 och SB431542 endast visar ett tydligt distinkt genuttryck mönster. Neuroepitelceller är äldsta förfäder i nervsystemet, och därmed är mindre differentierade jämfört med NC-celler och ingår här som en negativ kontroll befolkning. För att bedöma om de R-NC-celler som genereras här liknar de celler som gjorts med gamla protokoll, visar vi deras migrationskapacitet i en in vitro-scratch-analys (Figur 3B). 48 timmar efter repor ett sammanflytande väl av sorterade R-NC-celler, cellerna vandrar in i scratch framgångsrikt. Slutligen visar vi att R-NC-celler har potentialen att differentiera till celler från det autonoma nervsystemet. Cellerna spontant differentieras för fyra dagar efter HNK1 + / p75 + FACS och färgades för Mash1 och Tuj1, gener som uttrycks i autonoma neuroner (figur 3C).
Figur 1. Kritiska steg i R-NC differentieringsprotokoll. A. MS5-R-NC 10,11 och R-NC differentiering protokollschema. De specifika differentieringssteg för de två protokollen är visade. B BDNF: MS5: feeder stromaceller, KSR: KSR-differentieringsmedium, N2: N2-differentieringsmedium, LDN: LDN193189, SB: SB431542, S: Sonic Hedgehog, 8: FGF8, A: askorbinsyra, B.. Shows odifferentierade HPSC kolonier färgas med oktober-4 och DAPI före induktion av differentiering. C. Visar celltätheten (90-100% sammanflytning) på dag 0 av differentiering, typiskt 1 dag efter plätering hPSCs. D. Visar neurala rosetter färgade med Pax6 och nya NC-celler färgade med HNK-1 inom droppen. E. Visar dag 13 celler, replated vid dag 11 i droppar och NC-celler framväxande från kanten av droppen. F. Representativa FACS sortering tomt, visar HNK-1/p75 dubbla positiva NC-celler på dag 18 av differentiering. Grindarna valdes utifrån de ofärgade och enda färgade kontroller (visas ej). FACS sortering tomter kan skilja mellan experiment, HPSC linjer och användningen av den gamla eller nya protokoll när det gäller andelen dubbla positiva och enstaka positiva celler. Därför är det viktigt att isolera den dubbla positiva befolkningen för att säkerställa de rätta NC cellerna utvinns. Bilder C till F genererades med hjälp av den nya R-NC-protokollet.= "Https://www.jove.com/files/ftp_upload/51609/51609fig1highres.jpg" target = "_blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Jämförbar neurallisten cellidentitet av cellerna härledda med MS5-R-NC eller R-NC-protokollet. I båda protokollen cellerna passera en neural rosett skede. Sortera NC-celler ser identiska med morfologi och genom uttryck av NC-markörer som HNK-1 och AP2. NC-celler är nestin-positiva, visar att de är progenitorceller. Skala bar: 200 nm. Alla fluorescensbilder motfärgas för DAPI. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. NC-celler som genereras med det gamla och det nya protokollet har samma identitet. A. Oövervakad klustring av Illumina microarray genuttryck data som jämför NC-celler som härrör med MS5-R-NC-och R-NC-protokollet. NC-celler som härrör med MS5-R-NC eller R-NC-protokollet vid dag 35 eller dag respektive 18 analyserades i tre exemplar genom hybridisering till en Illumina människa 12 Oligonukleotid array. Dataanalys genomfördes med hjälp av Partek Genomisk Suite. Signifikanta skillnader definierades som de med ett veck förändring är större än 2 och FDR mindre än 0,05. 1421 gener analyserades. Standardinställningar, till exempel euklidiska prov olikhet, genomsnittlig länkklustermetoden och 25 för dendrogram längd användes. NC-celler inducerade genom att aktivera wnt signalering (WNT-NC) inkluderades (cellerna var differentiated i LDN193189 dag 0-3, SB431542 dag 0-4, CHIR99021 dag 0-11 och FACS sorteras på dag 11 för sox10) 16. Dessa celler kluster separat från R-NC-celler, vilket indikerar att wnt-NC-celler och R-NC-celler är skilda populationer. Celler differentierade under 11 dagar i LDN193189 och SB431542 ingick som en neuroepiteliala kontroll (LSB). R-NC och MS5-R-NC-celler kluster nära varandra jämfört med kontrollceller. Raw genuttryck data finns tillgängliga på GEO (www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) anslutning:. GSE50643 B. Migration assay. HNK1 + / p75 + FACS sorterade R-NC-cellerna ströks ut på PO / Lam / fn i 96-brunnar och skrapat manuellt 24 h senare. Den 0 tim bilden togs omedelbart efter repor och efter färgning med Hoechst. De återstående brunnarna tilläts att migrera under 48 h innan den andra bilden togs. Skala bar: 200 ìm C. Sorterat R-NC-celler fick spontant differentierar till 4 dagar och färgades för MaSH1, Tuj1 och DAPI. Skala bar:. 500 ^ Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
För framgångsrik differentiering av R-NC-celler från hESC / hiPSCs följande överväganden göras. Det är viktigt att arbeta under sterila odlingsförhållanden vid alla tillfällen. I synnerhet är det viktigt att testa HPSC kulturer för mykoplasmkontaminering regelbundet, eftersom denna kontaminering kommer att hindra framgångsrik differentiering, men inte lätt kan detekteras visuellt i HPSC kulturer. Den R-NC differentiering bör inledas med 90-100% celltäthet; lägre celltäthet påverkar cellöverlevnad och effektiviteten i R-NC-differentiering. Det är kritiskt att empiriskt validera optimala koncentrationer och partinumren för vissa av reagensen, i synnerhet KSR för uppbär effektiv NC differentiering. När cellerna återutströks på dag 11 i små droppar, bör celltätheten i den 10 pl droppe vara hög och är bäst empiriskt bestämd. Korrekt rosett-och NC-formation beror på lämplig celltäthet inom droppen. Vi empiriskt observacs ökad cellöverlevnad när cellerna tvättades minst två gånger efter behandling med Accutase. För framgångsrik isolering av R-NC-celler genom FACS rätt experimentella kontroller, såsom ofärgade, enda antikropp färgade och sekundär antikropp endast färgade celler är avgörande. Döda celler kan uteslutas genom DAPI, 7-AAD eller propidiumjodidfärgning. Vidare bör antikroppsspädningar bestämmas empiriskt för varje specifik antikropp mycket. Det är viktigt att FACS rena R-NC-celler genom att dubbelfärgning med HNK-1 och p75, eftersom enda färgning kan leda till förorening av NC-befolkningen med oönskade celltyper, t.ex. p75-positiva CNS-celler, tidiga mesoderm eller placode. I vår erfarenhet procentsatser av dubbel kontra enstaka färgade populationer kan variera mellan HPSC linjer och differentieringsexperiment. R-NC-cellöverlevnad inlägget FACS kan ökas genom att undvika hårda pipettering av cellerna, istället snärta av röret för att återsuspendera cellerna är tillrådligt. Också, plätering R-NC FACSisolerade celler i konditionerat medium (filtrerad medel cellerna växte in före FACS) har visat sig förbättra överlevnaden 11. Det är lämpligt att genomföra en mindre skala differentiering parallellt som kan färgas med den neurala epiteliala markör Pax6 vid dag 11 och dag 14 för att säkerställa en effektiv neutralisering och rosettbildning. NC-markörer, såsom HNK-1 eller AP2 i rosetten stadiet för korrekt NC differentiering bör bedömas också. Dessutom bör isolerade R-NC-celler valideras av morfologi och färgning för NC-markörer, såsom AP2, HNK-1 och nestin (figur 2).
Härledningen av MS5-R-NC-celler från HPSC har beskrivits i 2007 av Lee et al. 10. Det visades att denna prekursor befolkningen kan förökas och differentieras vidare in vitro till derivat av NC-härstamning. MS5-R-NC-celler kan spontant differentieras med hjälp av neurala sfären metoden 10,17eller genom riktad in vitro-differentiering. Det fastställdes att MS5-R-NC-celler kan ge upphov till celler i det perifera nervsystemet (autonoma och sensoriska neuroner), perifer glia (Schwann celler), myofibroblaster, mesenkymala stamceller och deras avkomma och glatt muskulatur 10. Transplantation i chick och möss visade att MS5-R-NC-celler migrera och differentiera in vivo 10. MS5-R-NC-celler har vidare varit inblandade i modellering av mänskliga sjukdomar. Den karakteristiska fenotyp av den genetiska sjukdomen familjär Disautonomia (FD) modellerades in vitro med hjälp av patientens specifika hiPSC-härledda MS5-R-NC-celler 2. NC karakteristiska fenotyper, såsom dysfunktionella NC-cellutveckling och migration visades i celler från FD patienter men inte hos friska kontrollceller. MS5-R-NC-celler har också använts för att fastställa toxikologisk testning av föreningar som påverkar neural crest migration under mänsklig embryonalutveckling, med potential för att undvika utsläpp av framtida läkemedel som negativt kan påverka nervsystemets utveckling 5. En spännande tillämpning av HPSC tekniken är high-throughput screening och testning av läkemedels behandlingsalternativ för mänskliga sjukdomar. MS5-R-NC-celler användes för att åstadkomma den första skärmen i en IPSC-baserade sjukdomsmodellen, dvs Familial Dysautonomia 4. Denna skärm har lett till identifiering av nya föreningar som kan utvärderas vidare i kliniska studier.
För alla tillämpningar av HPSC fältet är det viktigt att ha noggrann, reproducerbar, definierat och specifikt in vitro differentieringsprotokoll tillgängliga. I denna rapport visar vi att anpassningen av en etablerad in vitro differentiering protokoll för härledningen av R-NC-celler från hPSCs. Det redovisade protokoll ger samma celler som tidigare rapporterats 10 i mer definierade odlingsbetingelser och en shorter tidsram. Detta protokoll kan användas för att generera R-NC-celler för mänskliga sjukdomar som påverkar celler från NC-linjen, för förening screening, toxikologi testning och vidareutveckling av riktade differentieringsprotokoll till celltyper som härrör från NC härstamning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga motstridiga intressen att lämna ut.
Acknowledgments
Detta arbete fick stöd av ett stipendium för avancerade forskare från Swiss National Science Foundation och genom bidrag från NYSTEM (C026446, C026447) och Tri-institutionella stamcellsinitiativ (Starr Foundation).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Gibco-Life Technologies | 11965-092 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| DMEM/F12 | Gibco-Life Technologies | 11330-032 | |
| Knockout Serum Replacement | Gibco-Life Technologies | 10828-028 | Lot should be tested |
| L-Glutamine | Gibco-Life Technologies | 25030-081 | |
| Penicinlin/Streptomycin | Gibco-Life Technologies | 15140-122 | |
| MEM minimum essential amino acids solution | Gibco-Life Technologies | 11140-050 | |
| β-Mercaptoethanol | Gibco-Life Technologies | 21985-023 | toxic |
| Recombinant human FGF basic (FGF2) | R&D Systems | 233-FB-001MG/CF | |
| Knockout DMEM | Gibco-Life Technologies | 10829-018 | |
| DMEM/F12 powder | Invitrogen | 12500-096 | |
| Glucose | Sigma | G7021 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| APO human transferrin | Sigma | T1147 | |
| Human insulin | Sigma | I2643 | |
| Putriscine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
| Selenite | Sigma | S5261 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Matrigel matrix | BD Biosciences | 354234 | |
| Poly-L Ornithin hydrobromide | Sigma | P3655 | |
| Mouse Laminin-I | R&D Systems | 3400-010-01 | |
| Fibronectin | BD Biosciences | 356008 | |
| Dispase in Hank's Balanced Salt Solution 5 U/ml | Stem Cell Technologies | 7013 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco-Life Technologies | 25300-054 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris-R&D Systems | 1254 | |
| LDN193189 | Stemgent | 04-0074 | |
| SB431542 | Tocris-R&D Systems | 1614 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A4034 | |
| BDNF | R&D Systems | 248-BD | |
| FGF8 | R&D Systems | 423-F8 | |
| Mouse recombinant sonic hedgehog (SHH) | R&D Systems | 464SH | |
| HBSS | Gibco-Life Technologies | 14170-112 | |
| HEPES | Gibco-Life Technologies | 1563-080 | |
| Human recombinant EGF | R&D Systems | 236EG | |
| gelatin (PBS without Mg/Ca) | in house | ||
| Antibodies: | |||
| Anti HNK-1/N-Cam (CD57) mIgM | Sigma | C6680-100TST | lot should be tested |
| Anti-p75 mIgG1 (Nerve Growth factor receptor) | Advanced Targeting Systems | AB-N07 | lot should be tested |
| APC rat anti-mIgM | BD Parmingen | 550676 | lot should be tested |
| AlexaFluor 488 goat anti-mouse IgG1 | Invitrogen | A21121 | lot should be tested |
| Anti Oct4 mIgG2b (used at 1:200 dilution) | Santa Cruz | sc-5279 | lot should be tested |
| Material/Equipment: | |||
| Mouse embryonic fibroblasts (7 million cells/vial) | GlobalStem | GSC-6105M | |
| Cell culture dishes: 10 cm and 15 cm plates, centrifuge tubes, FACS tubes, pipettes, pipette tips | |||
| Glass hematocytometer | |||
| Cell culture centrifuge | |||
| Cell culture incubator (CO2, humidity and temperature controlled) | |||
| Cell culture laminar flow hood with embedded microscope | |||
| Cell culture biosafety hood | |||
| Cell sorting machine, i.e. MoFlo | |||
| Inverted microscope | |||
| 1 ml TB syringe 27Gx1/2 | BD Biosciences | 309623 | |
| Cell lifter Polyethylene | Corning Incorporated | 3008 |
References
- Lee, G., Studer, L. Induced pluripotent stem cell technology for the study of human disease. Nat Methods. 7, 25-27 (2010).
- Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461, 402-406 (2009).
- Ebert, A. D., et al. Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient. Nature. 457, 277-280 (2009).
- Lee, G., et al. Large-scale screening using familial dysautonomia induced pluripotent stem cells identifies compounds that rescue IKBKAP expression. Nat Biotechnol. 30, 1244-1248 (2012).
- Zimmer, B., et al. Evaluation of developmental toxicants and signaling pathways in a functional test based on the migration of human neural crest cells. Environ Health Perspect. 120, 1116-1122 (2012).
- Dupin, E., Sommer, L. Neural crest progenitors and stem cells: from early development to adulthood. Dev Biol. 366, 83-95 (2012).
- McKeown, S. J., Stamp, L., Hao, M. M., Young, H. M. Hirschsprung disease: a developmental disorder of the enteric nervous system. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2, 113-129 (2013).
- Slaugenhaupt, S. A., et al. Tissue-specific expression of a splicing mutation in the IKBKAP gene causes familial dysautonomia. Am J Hum Genet. 68, 598-605 (2001).
- Cheung, N. K., Dyer, M. A. Neuroblastoma: developmental biology, cancer genomics and immunotherapy. Nat Rev Cancer. 13, 397-411 (2013).
- Lee, G., et al. Isolation and directed differentiation of neural crest stem cells derived from human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25, 1468-1475 (2007).
- Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. Derivation of neural crest cells from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 5, 688-701 (2010).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27, 275-280 (2009).
- Itoh, K., et al. Reproducible establishment of hemopoietic supportive stromal cell lines from murine bone marrow. Exp Hematol. 17, 145-153 (1989).
- Barberi, T., et al. Neural subtype specification of fertilization and nuclear transfer embryonic stem cells and application in parkinsonian mice. Nat Biotechnol. 21, 1200-1207 (2003).
- Elkabetz, Y., et al. Human ES cell-derived neural rosettes reveal a functionally distinct early neural stem cell stage. Genes Dev. 22, 152-165 (2008).
- Mica, Y., Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. Modeling neural crest induction, melanocyte specification, and disease-related pigmentation defects in hESCs and patient-specific iPSCs. Cell Rep. 3, 1140-1152 (2013).
- Molofsky, A. V., et al. Bmi-1 dependence distinguishes neural stem cell self-renewal from progenitor proliferation. Nature. 425, 962-967 (2003).
