Summary
Las células de la cresta neural (NC) derivadas de células madre pluripotentes humanas (HPSC) tienen un gran potencial para modelar el desarrollo humano y las enfermedades y para las terapias de reemplazo celular. Aquí, una adaptación libre del alimentador ampliamente utilizado en la actualidadAbstract
Células madre pluripotentes humanas (hPSCs) tienen un gran potencial para el estudio de desarrollo embrionario humano, para el modelado de enfermedades humanas en el plato y como una fuente de células trasplantables para aplicaciones de regeneración después de la enfermedad o accidentes. Células de la cresta neural (NC) son los precursores para una gran variedad de células somáticas adultas, tales como células del sistema nervioso periférico y glía, melanocitos y células mesenquimales. Ellos son una valiosa fuente de células para estudiar aspectos del desarrollo embrionario humano, incluida la especificación del destino celular y la migración. Además diferenciación de las células progenitoras NC en tipos de células diferenciadas terminalmente ofrece la posibilidad de modelar enfermedades humanas in vitro, investigar mecanismos de la enfermedad y generar células para la medicina regenerativa. En este artículo se presenta la adaptación de un protocolo vitro disponibles actualmente en la diferenciación para la derivación de células NC desde hPSCs. Este nuevo protocolo requiere 18 días de diferenciación, es-alimentador libre, fácilmente escalable y altamente reproducible entre células madre embrionarias humanas (hESC) líneas, así como células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSC) líneas. Ambos viejos y nuevos protocolos producen células NC de igual identidad.
Introduction
Las células madre embrionarias (células madre) y las células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSC) han demostrado un enorme potencial, en particular para la investigación y el tratamiento futuro de enfermedades humanas para las que están disponibles ni los buenos modelos animales ni los tejidos primarios. Ejemplos de aplicación de la tecnología de células madre / hiPSC son los siguientes: Las células de especial interés pueden ser generados a partir de células madre / hiPSCs para la medicina regenerativa en cantidad ilimitada 1. Las células pueden producirse a partir de pacientes portadores de una enfermedad específica y se utiliza para establecer en modelos de enfermedad in vitro 2,3. Tales modelos de enfermedad pueden ser empleados para la detección de drogas a gran escala en la búsqueda de nuevos compuestos farmacológicos 4, así como las pruebas de los medicamentos existentes para la eficacia y la toxicidad 5. Modelos in vitro de enfermedades pueden conducir a la identificación de los mecanismos de las enfermedades nuevas. Para todas las aplicaciones de la tecnología de células madre / IPSC es importante trabajar con específica, bien definirtipos d células afectadas en la enfermedad de interés. Por lo tanto, la disponibilidad de protocolos de diferenciación in vitro sólidas y reproducibles en es crucial para todas las aplicaciones de la tecnología de células madre / hiPSC. Los protocolos son deseables que muestran una variabilidad mínima, gasto de tiempo, esfuerzo, dificultad y costo, así como la reproducibilidad máxima entre las líneas de células madre / hiPSC y diferentes investigadores.
Las células de la cresta neural (NC) emergen durante neurulation vertebrados entre la epidermis y el epitelio neural. Ellos proliferan y migran ampliamente en todo el embrión en desarrollo y dan lugar a una impresionante diversidad de tipos de células progenie, incluyendo el hueso / cartílago, el esqueleto craneofacial, los nervios sensoriales, las células de Schwann, melanocitos, células de músculo liso, las neuronas entéricas, las neuronas autónomas, células cromafines , células cardiacas tabique, los dientes y las células glandulares suprarrenal / tiroideas 6. Por lo tanto, las células NC son un tipo de célula atractivo para el campo de células madre e importante para lamodelización de una variedad de enfermedades, como la enfermedad de Hirschsprung 7, disautonomía familiar 8, así como cánceres tales como el neuroblastoma 9. Además, ofrecen la posibilidad de estudiar los aspectos del desarrollo embrionario humano in vitro.
El actualmente disponibles y ampliamente aplicado en protocolo de diferenciación in vitro para la derivación de células NC de hESCs 10,11 requiere hasta 35 días de diferenciación y que implica la inducción neural en células alimentadoras tales como células del estroma MS5 y por lo tanto se lleva a cabo bajo condiciones de mal definidos. Si bien puede ser en mayor escala para generar grandes cantidades de células NC, por ejemplo se requiere para la detección de drogas de alto rendimiento 4, se trata de mano de obra y costos de obra. Además, se trata de pases manual de las rosetas de los nervios, que pueden ser difíciles de reproducir y por lo tanto está sujeta a la variabilidad general, en particular cuando se aplica a una gran variedad de células madre o hiPSClíneas. Aquí, se muestra la derivación gradual de células NC en un protocolo de 18 días que está libre de células alimentadoras. Este método es más corto y más definido que el protocolo utilizado actualmente. Además, es muy robusto en la generación de células NC entre diferentes líneas hiPSC. Es importante destacar que se ha demostrado que las células NC producidas por ambos protocolos surgen en la frontera de los rosetones de los nervios (en lo sucesivo denominado roseta-NC o R-NC). Las células derivadas utilizando cualquiera de los dos protocolos parecen morfológicamente idénticas, expresan los mismos marcadores NC y se agrupan en el análisis de microarrays. NC células derivadas usando el nuevo protocolo (R-NC) son funcionales, similar a las células derivadas NC usando el protocolo antiguo (MS5-R-NC) tal que pueden migrar y diferenciarse en neuronas más. Por lo tanto, las células se pueden utilizar simultáneamente con las células MS5-R-NC. El protocolo de células R-NC para la derivación de células NC de células madre / IPSC será útil para todas las aplicaciones de la tecnología de células madre / IPSC que implica el linaje NC. </ P>
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Protocol
1. Preparación de medios de cultivo, placas revestidas y Mantenimiento de hPSCs
Preparación 1.1 Medios
Nota: todos los medios de filtro para la esterilización y se almacenan a 4 ° C en la oscuridad durante un máximo de 2 semanas. Números de los nombres de Reactivos para la empresa y catálogo se listan en la Tabla de Materiales.
- DMEM/10% de SFB: Combinar 885 ml DMEM, FBS 100 ml, 10 ml penicilina / estreptomicina y 5 ml de L-glutamina.
- HES-medio: Combinar 800 ml de DMEM/F12, KSR 200 ml, 5 ml de L-glutamina, 5 ml de penicilina / estreptomicina, 10 ml de MEM mínimo de solución aminoácidos esenciales, 1 ml β-mercaptoetanol. Añadir 10 ng / ml de FGF-2 después de filtrar el medio.
PRECAUCIÓN: β-mercaptoetanol es tóxico, evitar la inhalación, ingestión y contacto con la piel. - Medio KSR-diferenciación: Combinar 820 ml Knockout DMEM, 150 ml KSR, 10 ml de L-glutamina, 10 ml penicilina / estreptomicina, 10 ml MEM mínima solución aminoácidos esenciales y 1 ml β-mercaptoetanol.
- N2-differentiatien un medio: Disolver 12 g de polvo en 980 ml de DMEM/F12 dH 2 O, añadir 1,55 g de glucosa, 2 g Bicarbonato sódico y 100 mg APO transferrina humana. Mezclar 2 ml de dH2O con 25 mg de insulina humana y 40 l de NaOH 1 N, añadir la solución disuelta para el medio. Añadir 100 l de dihidrocloruro de putrescina, 60 l de selenito, 100 l progesterona y llevar el volumen hasta 1 litro con dH 2 O.
1.2 Recubrimiento de placas de cultivo
- Revestimiento Matrigel: Descongelar 1 ml congelados alícuota matrigel al vaso 19 ml DMEM/F12 sobre la alícuota hasta que se haya disuelto. Eliminar grumos haciéndola pasar a través de un filtro de células de 40 micras y la placa 8 ml/10 cm plato. Incubar los platos durante 1 hora a TA. Aspirar el matrigel inmediatamente antes placas las células.
Nota: Trabaje rápidamente con matrigel porque puede agruparse a temperaturas superiores a 4 ° C. - Recubrimiento PO / Lam / FN: Añadir 10 ml de 1x PBS que contenía 15 mg / ml bromhidrato de poli-L ornitina a una placa de 10 cm. Incubar la placa durante la noche a 37 ° C. Lavar las placas con PBS 1x vez y añadir 10 ml/10 cm plato de 1x PBS que contenía 2 mg / ml ratón laminina-I y 2 mg / ml de fibronectina. Incubar los platos durante la noche a 37 ° C. Antes de placas las células, eliminar completamente la solución y deje que los platos se sequen completamente a temperatura ambiente durante 15 a 20 minutos en pie para arriba en la pared campana de cultivo de tejidos sin la tapa puesta.
Nota: Los platos son completamente seca y lista para la siembra celular cuando uno puede ver las estructuras de cristal en la superficie (visible a simple vista). Las placas se pueden mantener a temperatura ambiente durante unas pocas horas en este estado seco. Platos PO / Lam / FN tienen que estar preparados 2 días antes de tiempo. En casos de emergencia Lam / FN puede incubarse por tan solo 2-4 horas. Sin embargo, esto puede poner en riesgo los resultados de la diferenciación / supervivencia subóptimos.
1.3 Mantenimiento de hPSCs
Nota: hPSCs se mantienen en el 0,1% de gelatina y el ratón mitóticamente inactivados fibroblastos embrionarios (MEFS) en HES-medio suplementado con 10 ng / ml de FGF-2 como se describe previamente 10,12. Las células deben dividirse cada 6-8 días.
- Escudo un plato de 10 cm con 8 ml de 0,1% de gelatina (en 1x PBS sin magnesio o calcio) a TA durante 5 min.
- Descongele MEFs congelados rápidamente en un baño de agua a 37 ° C. Añadir 1 millón de MEFs a 10 ml de DMEM/10% de FBS.
- Aspirar la gelatina y la placa de las células. Incubar a 37 ° C durante al menos 6 horas.
- Aspirar el FBS DMEM/10% de la placa de MEF preparado, lavar la placa con 1x PBS una vez y añadir 10 ml de HES-medio suplementado con 10 mM de Y-27632 dihidrocloruro. Dejar que el medio se caliente a 37 ° C durante 20 min.
Nota: Para la división manual hPSCs se utiliza una campana de flujo laminar con un microscopio incorporado. Sin embargo, las células pueden ser pasadas utilizando métodos alternativos apropiados. - Bajo una campana de flujo laminar con un microscopio incorporado, separar colonias separadas de utilizar una grúa móvil y permiten flotar.
- Utilice un1 ml jeringa para aspirar las colonias flotantes y enviarlos a la placa MEF fresco, cálido. Transferir aproximadamente un cuarto de las células para el nuevo plato. Se incuba a 37 ° C.
- Alimente células diariamente con medio HES fresco.
2. Plating de hPSCs de Diferenciación
Nota: hPSCs deben dividir o chapada de diferenciación cuando las colonias son grandes, pero todavía tienen bordes afilados con tan poco como posibles células que se diferencian en sus fronteras (véase la Figura 1B). Cuando las células se mantienen utilizando pases manual de las colonias deben ser lo suficientemente grandes para ser fácilmente visto por el ojo. Para conseguir la sensación adecuada para este punto en el tiempo se puede mantener un plato HPSC separada por dos semanas sin pases y ver las células alcanzan y pasar el punto de tiempo ideal para pases / diferenciarlas.
- Preparar platos de 10 cm con matrigel 1 hora antes de iniciar la diferenciación. Revestimiento de matrigel acertada puede serverificado en la magnificación de 4x.
- Cuando los hPSCs están listos para ser dividido, aspirar el medio y añadir 4 ml de 0,05% de tripsina-EDTA a las células.
- Agite el plato horizontalmente durante 2 min vigorosamente hasta que uno puede ver los MEFs como células individuales de elevación de la placa bajo el microscopio. Las colonias HPSC permanecen unidos como colonias.
- Inmediatamente ya fondo, aspirar la tripsina y dejar reposar la placa a temperatura ambiente durante 2-4 min.
- Añadir 2 ml de HES-medio a la placa y el uso de una pipeta P1000, separar las células.
Nota: Si las células no se pueden levantar fácilmente la superficie, la placa se puede incubar vacío a TA durante otros 2-3 min. - Transferir las células a 8 ml de HES-medio suplementado con 10 mM de Y-27632 dihidrocloruro.
- Aspirar el Matrigel a partir de un preparado previamente placa de 10 cm. Placa las células a una proporción de 1:1 o 1:2 (por ejemplo: Las células de una placa de 10 cm se dividen en dos placas de 10 cm) en la placa de Matrigel. Incubar a 37 °C durante la noche.
Nota: Este chapado debe dar lugar a aproximadamente 100.000 células / cm 2.
3. La inducción de la diferenciación neuronal
Nota: La diferenciación puede ser iniciado (día 0) cuando las células son confluentes al 90-100% (véase la Figura 1C), por lo general el día siguiente. Si la confluencia exacta no se alcanza, sin embargo, las células pueden ser alimentados diariamente con HES-medio hasta que estén listos para la diferenciación. Alternativamente, el número inicial de células sembradas se puede aumentar.
- En el día 0 a 3, alimentar a las células diariamente con 10 ml/10 cm plato medio KSR-diferenciación que contiene 0,1 LDN193189 mu M y 10 M SB431542.
- En el día 4 y 5 de alimentación de las células con 75% de medio KSR-diferenciación y 25% medio N2-diferenciación tanto que contiene LDN193189 y SB431542.
- En el día 6 y 7 de alimentación de las células con 50% de medio KSR-diferenciación y 50% medio N2-diferenciación tanto que contiene LDN193189 y SB431542.
- En el día 8 y 9 de alimentación de las células con 25% de medio KSR-diferenciación y 75% medio N2-diferenciación tanto que contiene LDN193189 y SB431542.
- El día 9 y 10 se preparan platos PO / Lam / FN, como se indica en el punto 1.2.2 para replating de las células en el día 11.
- El día 10 las células de alimentación con medio N2-diferenciación que contiene LDN193189 y SB431542.
4. Replating en Gotitas por NC Especificaciones
- El día 11 de aspirado Lam / FN de las placas preparadas con anterioridad y deje que se sequen por completo a temperatura ambiente durante 20 a 30 min, como se explica en el punto 1.2.2.
- Retire medio de las células diferenciadoras, se lavan las células una vez con PBS 1x y añadir 8 ml accutase/10 cm plato. Incubar durante 20 minutos a 37 ° C.
- Utilizando un elevador de celular, separar las células y resuspender en accutase con una pipeta de 5 ml. Transferir la suspensión a un tubo de 15 ml.
- Añadir 5 ml de 1x PBS y girar las células durante 5 min a 114 x g.
- Resuspender las células en 10 ml de 1x PBS. Para garantizar una única suspensión de células, filtrado a través de un filtro de células de 40 micras y contar las células usando un hemocitómetro o una técnica equivalente.
- Girar las células hacia abajo y volver a suspender en medio N2-diferenciación que contiene 200 mM de ácido ascórbico (AA), 20 ng / ml de BDNF, 100 ng / ml de FGF8, 20 ng / ml de SHH, 10 mM de Y-27632 de dihidrocloruro a la concentración de 100 000 -150.000 células/10 l.
- Usando una pipeta de repetición-, placa 10 l gotitas cerca uno del otro sin que toquen a la PO seca / Lam / FN 15 cm de platos.
Nota: Una placa de 10 cm de células diferenciadas que normalmente se traduce en aproximadamente 2-3 veces 15 cm de platos o de aproximadamente 100 x 10 cm l droplets/15 plato. - Deje que las gotitas de pie a temperatura ambiente durante 20 a 30 min, luego con mucho cuidado (no molestar a las gotas) añadir 30 ml de N2/AA/BDNF/FGF8/SHH/Y y se incuba a 37 ° C.
- El día 12, se alimentan con cuidado las células con 20 ml/15 cm N2/AA/BDNF/FGF8/SHH plato.
- De day 14-17 alimentar las células cada dos o tres días con N2/AA/BDNF/FGF8.
- El día 16 y 17 de la preparación / placas Lam / FN PO a replate NC células después de la separación FACS.
5. Fluorescencia de células activadas clasificación (FACS) de células NC
Nota: La preparación de las células para FACS requiere aproximadamente 2 horas.
- El día 18 a medio quitar, lavar las células una vez con PBS 1x en el plato y añadir 12 ml accutase. Se incuban las células durante 20 min a 37 ° C.
- Utilizando un elevador de celular, separar las células de la superficie y permiten flotar. Pipetear las células en suspensión utilizando una pipeta de 5 ml, transferir a un tubo de 50 ml y añadir 30 ml de PBS 1x. Haga girar las células durante 5 minutos a 114 x g.
- Usando una pipeta P1000, resuspender las células en 1 ml de 2% de FBS / HBSS (el HBSS contiene 15 mM de HEPES). Añadir 19 ml de 2% de FBS / HBSS y filtrar las células a través de un filtro de células de 40 micras para asegurar una suspensión de células individuales. Se incuban las células en hielo durante 15 men para el bloqueo de anticuerpos y luego contarlos utilizando un hemocitómetro.
- Girar las células hacia abajo y resuspender a la concentración de 10 millones de células / ml en FBS al 2% / HBSS.
- Ponga a un lado 1 millón de células cada uno por la mancha, de un solo manchado (HNK-1 sólo y únicamente p75) y anticuerpo secundario manchado solamente (APC solamente y 488 solamente) FACS controla.
- Añadir 5 l de HNK-1 y 5 l de p75 anticuerpo primario por 10 millones de células en 1 ml de suspensión a las muestras adecuadas y se incuba durante 20 min en hielo.
- Lavar las células en 10 ml de PBS 1x (centrífuga 5 min a 114 xg) y resuspender las células en 1 ml de 2% de FBS / HBSS. Añadir 2 l de APC y 1 l de anticuerpo secundario 488 por 10 millones de células en 1 ml de suspensión a las muestras adecuadas y se incuba durante 20 min en hielo en la oscuridad.
Nota: APC y 488 son los anticuerpos secundarios utilizados aquí para la tinción HNK-1 y p75, respectivamente. - Se lavan las células en 10 ml de 1x PBS dos veces, volver a suspender 10 millones de células en 500 l de2% de FBS / HBSS que contenía DAPI (a 0,5 ng / l) o tinción de células alternativa apropiada en vivo para excluir las células muertas del análisis FACS.
- Transferir las muestras de apropiarse tubos de FACS.
- Preparar tubos de FACS con 0,5 ml de FBS al 2% / HBSS para la recolección de células.
Nota: Las células y los tubos de recogida se mantienen en hielo en la oscuridad durante el tiempo de clasificación. - Usando una máquina de clasificación de células con rayos láser que pueden detectar DAPI, APC y 488 especie DAPI-/HNK-1 + / P75 + células dobles positivas.
Nota: El tiempo de preparación y la manipulación de las células conduce a un pequeño porcentaje de muerte celular, DAPI manchas células muertas sólo por lo que permite a estas células para ser excluidos de la población ordenada. Cualquier mancha en vivo / muerto alternativa funciona igual de bien para este propósito. DAPI en sí no causa citotoxicidad en la población de células vivas.
6. Replating de células clasificadas, Mantenimiento NC y Expansión
Nota: las células FACS ordenados deben ser parteconducido con especial cuidado para asegurar la supervivencia óptima. Manténgalos en hielo hasta resiembra ellos. No agite ni pipetear con dureza. Las células se pueden resuspendieron accionando el tubo.
- Después de la separación FACS, contar las células NC, a continuación, girar hacia abajo y resuspender en medio N2-diferenciación suplementado con 10 ng / ml de FGF2, 20 ng / ml de EGF y 10 mM de dihidrocloruro de Y-27632 en el volumen apropiado para replate ellos en 30.000 células / 10 gotas mu l.
- Seque bien previamente preparado / placas Lam / FN PO y placa aproximadamente 50 a 70 gotas por placa de 10 cm. Deje que los platos se destacan a temperatura ambiente durante 20 a 30 min.
- Añadir mucho cuidado 20 ml/10 cm plato de N2/FGF2/EGF/Y-27632 sin molestar a las gotas. Se incuban las células a 37 ° C.
- Alimentar a las células cada 2-3 días con N2/FGF2/EGF.
Nota: NC células se expanden o se pasaron aproximadamente cada 4-5 días o cuando empiezan a acumular dentro de las gotitas. - Para el paso de las células NC, eliminar el medio, wash las células una vez con PBS 1x y añadir 8 ml accutase/10 cm plato. Incubar durante 20 minutos a 37 ° C.
- Pipetear las células de la placa usando una pipeta de 5 ml y transferir a un tubo de 15 ml. Añadir 6 ml 1x PBS.
- Haga girar las células durante 5 minutos a 114 x g.
- Resuspender las células en medio N2-diferenciación suplementado con 10 ng / ml de FGF2, 20 ng / ml de EGF y 10 mM de dihidrocloruro de Y-27632 con el fin de tener 20.000 células/10 l gotita.
- Replate las células en 10 gotas mu l en placas de PO / Lam / FN secas. Deje que los platos se destacan a temperatura ambiente durante 20 a 30 min.
- Añadir con cuidado 20 ml/10 cm plato de N2/FGF2/EGF/Y-27632. Se incuba a 37 ° C.
Nota: NC células pueden mantenerse o ampliarse hasta por 2 semanas como progenitoras población relativamente homogénea. Cultura ya puede llevarlos a diferenciarse en diversos tipos de células progenie.
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Representative Results
Las dos mejoras más importantes del protocolo R-NC a través del protocolo MS5-R-NC 11 son las condiciones de diferenciación, definidos libres de alimentador y el acortamiento general del requisito de tiempo. Células alimentadoras MS5 13 son de médula ósea células del estroma derivadas murinas que han sido mostrados para apoyar la diferenciación neural de hESCs 14. Células madre embrionarias humanas cultivadas sobre células alimentadoras MS5 en estructuras de baja densidad de formulario epiteliales y neuronales rosetas 15, en la periferia de los cuales emergen las células NC 10, imitando así temprano desarrollo neural humana. Sin embargo, no está claro lo que las moléculas de señalización y factores de crecimiento son liberados de células alimentadoras MS5. Por lo tanto, las condiciones de diferenciación no están bien definidos, por lo que es difícil de reproducir en experimentos recurrentes ya través de líneas HPSC. Para la inducción neural adecuado, hESCs tienen que sembrarse en baja densidad en pequeñas colonias en células alimentadoras MS5, complicating aumento de escala y alcanzar altos rendimientos de células diferenciadas. En 2009, se desarrolló un método que apunta a neuralizing hPSCs muy eficiente 12. En este método hPSCs se siembran a alta densidad, en monocapas en ausencia de células alimentadoras MS5, el logro de altos rendimientos de inducción neural en 10 días. Seguimos el esquema de este método en la adaptación del protocolo de diferenciación MS5-R-NC (Figura 1A). HPSCs cultivadas en colonias en MEFs (Figura 1B) se dispersan y se sembraron sobre Matrigel como células individuales en un cultivo en monocapa de alta densidad (Figura 1C). Al día 11 de la diferenciación, la mayoría de las células han Neuralized éxito (Pax6-positivo, que no se muestra 12). Replating las células en alta densidad en gotitas permite la formación de rosetas neuronales condensados dentro de la gotita (Figura 1D y la Figura 2). NC células surgen en las fronteras de rosetas neural (Figura 1D </ Strong>) y migrar fuera de la gota (Figura 1E). Después de 7 días de cultivo adicional las células NC se pueden aislar mediante separación FACS. HNK-1/p75 células dobles positivas NC pueden aislarse en la eficiencia de 20-40% (Figura 1F). Este protocolo requiere 18 días, mientras que el protocolo de MS5-R-NC requiere hasta 35 días, por lo que el protocolo de células R-NC más útil para una variedad de aplicaciones posteriores.
El objetivo de este trabajo es generar células NC en un protocolo más corto, más reproducible y más barato, dando las mismas células que el antiguo protocolo NC. Hemos usado este nuevo protocolo para diferenciar con éxito al menos 10 células madre y hiPSC líneas derivadas de pacientes y controles sanos (datos no mostrados), que muestra la reproducibilidad sólida del protocolo a través de diferentes líneas de HPSC. El nuevo protocolo ahorra costes debido a la utilización de LDN frente noggin, un menor uso de SHH y la falta de MS5 los costes de producción. El nuevo protocolo de una duración de 18 días en comparación con 35 díass en el antiguo protocolo, lo que ahorra aproximadamente 5 comidas y por lo tanto sus costos de comunicación asociados. Para investigar si las células que se producen con los dos protocolos tienen identidad similares, se muestra que el desarrollo de células NC en ambos protocolos sigue el mismo patrón de diferenciación (Figura 2). Las células pasan a través de un estado de roseta neural y producen células NC con morfología idéntica después de la separación FACS. El tamaño más pequeño de las rosetas de los nervios en el nuevo protocolo en comparación con el protocolo antiguo es debido a la alta densidad de las células después de resiembra en el día 11. En contraste, en los viejos rosetas forma de protocolo dentro de las colonias HPSC, que no son tan condensada. NC células derivadas de los dos protocolos expresan los mismos marcadores biológicos NC, como HNK-1, AP-2 y nestin. Se analizaron las células NC generados con los dos protocolos sobre un nivel de expresión génica global (Figura 3A) y encontramos que las células NC generados con los dos protocolos agrupan estrechamente. NC células que eran génerosTed por la activación de la vía de señalización Wnt (Wnt-NC) y se demostrado tener el potencial de los melanocitos de generación 16, clúster separado cuando se analizaron por la expresión génica global, lo que indica que esto puede ser una población NC diferente. De hecho, no hemos sido capaces de generar células progenitoras melanocitos in vitro a partir de células (datos no presentados) R-NC o MS5-R-NC. Del mismo modo, las células neuroepiteliales (LSB), diferenciados por 10 días en LDN193189 y SB431542 sólo muestran un patrón de expresión de genes claramente distintas. Células neuroepiteliales son progenitores tempranos del sistema nervioso, y por lo tanto son menos diferenciada en comparación con las células NC y se incluyen aquí como una población control negativo. Para evaluar si las células R-NC generados aquí son similares a las células que se producen con el antiguo protocolo, se muestra su capacidad de migración en un ensayo scratch in vitro (Figura 3B). 48 horas después de rascarse un pozo confluente de células R-NC ordenados, las células migran a la scratch éxito. Por último, se muestra que las células R-NC tienen el potencial de diferenciarse en células del sistema nervioso autónomo. Las células se diferenciaron espontáneamente durante 4 días después de la HNK1 + / p75 + FACS y se tiñeron para Mash1 y Tuj1, los genes que se expresan en las neuronas autónomas (Figura 3C).
Figura 1. Pasos críticos en el protocolo de diferenciación R-NC. A MS5-R-NC 10,11 y R-NC esquema de protocolo de diferenciación.. Se muestran los pasos de diferenciación específicos de los dos protocolos. MS5: las células del estroma de alimentación, KSR: media KSR-diferenciación, N2: medio N2-diferenciación, LDN: LDN193189, SB: SB431542, S: sonic hedgehog, 8: FGF8, A: ácido ascórbico, B:. BDNF B. Muestra colonias indiferenciadas HPSC manchado de Octubre-4 y DAPI antes de la inducción de la diferenciación. C. Muestra la densidad de células (90-100% de confluencia) en el día 0 de la diferenciación, típicamente 1 día después de la siembra hPSCs. D. Muestra rosetas neuronales teñidas con Pax6 y células NC emergentes teñidas con HNK-1 dentro de la gota. E. Muestra el día 13, las células se volvieron a sembrar en el día 11 en gotas y células NC emergentes desde el borde de la gota. F. FACS representativos clasificación trama, mostrando HNK-1/p75 células dobles positivas NC en el día 18 de diferenciación. Las puertas se eligieron sobre la base de los controles teñidas y no teñidas individuales (no mostrados). Clasificación FACS parcelas pueden diferir entre los experimentos, líneas HPSC y el uso del viejo o nuevo protocolo en términos del porcentaje de células positivas e individuales dobles. Por lo tanto, es importante para aislar la población doble positiva para garantizar las células NC adecuados se extraen. Imágenes C a F se generaron utilizando el nuevo protocolo R-NC.= "Https://www.jove.com/files/ftp_upload/51609/51609fig1highres.jpg" target = "_blank"> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Comparable la cresta neural identidad de la célula de las células derivadas con la MS5-R-NC o el protocolo de R-NC. En ambos protocolos de las células pasan a través de un estado de roseta neuronal. NC células Ordenado parecen idénticos por la morfología y por la expresión de marcadores de NC como HNK-1 y AP-2. NC células son-nestin positivo, demostrando que son las células progenitoras. Barra de escala: 200 m. Todas las imágenes de fluorescencia se counterstained para DAPI. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. NC células generadas con el viejo y el nuevo protocolo tienen una identidad similar. A. Clustering no supervisado de Illumina microarrays datos de expresión génica que comparan células derivadas NC con el MS5-R-NC y el protocolo R-NC. NC células derivadas con el MS5-R-NC o el protocolo R-NC en el día 35 o el día 18, respectivamente, fueron analizadas por triplicado mediante hibridación con una matriz de oligonucleótidos Illumina humana 12. El análisis de datos se realizó utilizando el software Partek Genómica Suite. Las diferencias significativas se definieron como aquellos con un cambio veces mayor que 2 y FDR menos de 0,05. Se analizaron 1.421 genes. Se utilizan los ajustes predeterminados, como la disimilitud muestra euclidiana, el método de vinculación promedio clúster y 25 de longitud dendrograma. NC células inducida por la activación de la señalización de Wnt (WNT-NC) se incluyeron (las células eran diferentiated en día LDN193189 0-3, 0-4 días SB431542, CHIR99021 días 0-11 y FACS ordenados en el día 11 para SOX10) 16. Estas células se agrupan por separado de las células R-NC, lo que indica que las células Wnt-NC y células R-NC son poblaciones distintas. Las células diferenciadas durante 11 días en LDN193189 y SB431542 se incluyeron como control neuroepiteliales (LSB). Células R-NC y MS5-R-NC se agrupan estrechamente juntos en comparación con las células de control. Se dispone de datos de expresión génica primas en GEO (www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) adhesión #:. GSE50643 B. Migración de ensayo. HNK1 + / p75 + FACS células R-NC se sembraron en PO / Lam / FN en 96 pozos y se rascaban manualmente 24 horas más tarde. La imagen 0 hr fue tomada inmediatamente después de arañazos y manchas post con Hoechst. Los pozos restantes se les permitió emigrar durante 48 horas antes de tomar la segunda fotografía. Barra de escala: 200 m C. Células R-NC Ordenado se les permitió diferenciarse espontáneamente durante 4 días y se tiñeron para Mash1, Tuj1 y DAPI. Barra de escala:. 500 m Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Para la diferenciación de las células exitosa R-NC de células madre / hiPSCs deben hacerse las siguientes consideraciones. Es fundamental trabajar en condiciones de cultivo estériles en todo momento. En particular, es importante para poner a prueba las culturas HPSC para contaminación por micoplasma regularmente, ya que esto impedirá la contaminación diferenciación exitosa, pero no puede fácilmente ser detectado visualmente en cultivos de HPSC. La diferenciación R-NC debe iniciarse con la densidad celular 90-100%; menor densidad celular afecta la supervivencia celular y la eficiencia de la I-NC diferenciación. Es crítico para validar empíricamente concentraciones óptimas y números de lote de algunos de los reactivos, en particular, KSR para apoyar la diferenciación eficiente NC. Cuando las células se volvieron a sembrar en el día 11 en gotitas, la densidad de las células dentro de la gotita 10 l debe ser alto y se determina mejor empíricamente. Roseta-y NC-formación adecuada depende de la densidad celular apropiada dentro de la gotita. Empíricamente obserVed aumento de la supervivencia celular cuando las células se lavan al menos dos veces después del tratamiento con Accutase. Para el éxito en el aislamiento de las células R-NC por FACS los adecuados controles experimentales, como la mancha de anticuerpos, solo manchada y anticuerpo secundario células teñidas sólo son cruciales. Las células muertas se pueden excluir por DAPI, 7-AAD o la tinción de yoduro de propidio. Además, las diluciones de anticuerpos deben ser determinadas empíricamente para cada lote de anticuerpos específicos. Es importante FACS purificar células R-NC mediante tinción doble con HNK-1 y p75, desde tinción sola puede conducir a la contaminación de la población NC con tipos de células no deseadas, tales como células del SNC positivas para p75, mesodermo temprano o placoda. En nuestra experiencia porcentajes de doble frente a las poblaciones de colores individuales pueden variar entre líneas HPSC y experimentos de diferenciación. R-NC enviar la supervivencia celular FACS se puede aumentar evitando dura de pipeteado de las células, en lugar parpadeo del tubo para volver a suspender las células es aconsejable. También, chapado FACS R-NCcélulas aisladas en medio condicionado (medio filtrado las células crecieron antes FACS) se ha demostrado mejorar la supervivencia 11. Es aconsejable llevar a cabo una diferenciación menor escala en paralelo que puede ser manchada con la Pax6 marcador epitelial neural en el día 11 y el día 14 para asegurar la neutralización eficaz y la formación de rosetas. Marcadores NC, como HNK-1 o AP2 en el estado de roseta para la diferenciación NC adecuada deben ser evaluados también. Además, las células R-NC aislados deben ser validados por la morfología y tinción para los marcadores NC, tales como AP2, HNK-1 y nestina (Figura 2).
La derivación de células MS5-R-NC de HPSC ha sido descrita en 2007 por Lee et al. 10. Se demostró que esta población precursora puede ser propagado y aún más diferenciada in vitro en derivados del linaje NC. Células MS5-R-NC se pueden diferenciar de forma espontánea con el ámbito neuronal método de 10,17o por dirigida en la diferenciación in vitro. Se estableció que las células MS5-R-NC pueden dar lugar a células del sistema nervioso periférico (neuronas autónomas y sensoriales), glía periférica (células de Schwann), miofibroblastos, células madre mesenquimales y su progenie y el músculo liso 10. Trasplante en polluelo y ratones mostraron que las células MS5-R-NC migran y se diferencian in vivo 10. Células MS5-R-NC más han sido implicados en el modelado de enfermedades humanas. El fenotipo característico de la enfermedad genética familiar Disautonomia (FD) fue modelada in vitro utilizando células MS5-R-NC-derivados hiPSC específica del paciente 2. NC fenotipos característicos, tales como disfuncional desarrollo de las células NC y la migración se muestran en las células derivadas de pacientes FD pero no en las células control sanas. Células MS5-R-NC también se han utilizado para establecer los ensayos toxicológicos de los compuestos que afectan a la migración de la cresta neural durante embrionaria humanadesarrollo, con el potencial para evitar la liberación de futuros fármacos que puedan afectar negativamente el desarrollo neurológico 5. Una aplicación interesante de la tecnología de HPSC es la detección y el ensayo de opciones farmacéuticas de tratamiento para las enfermedades humanas de alto rendimiento. Células MS5-R-NC se utilizaron para llevar a cabo la primera pantalla en un modelo de la enfermedad a base de IPSC, es decir, disautonomía familiar 4. Esta pantalla condujo a la identificación de nuevos compuestos que puedan ser evaluadas en detalle en ensayos clínicos.
Para todas las aplicaciones del campo HPSC que es fundamental contar con exacto, reproducible, definida y específica en protocolos de diferenciación in vitro disponible. En este informe, se muestra la adaptación de un in vitro protocolo establecido en la diferenciación para la derivación de células R-NC de hPSCs. El protocolo reportado produce las mismas celdas que previamente reportados 10 en condiciones de cultivo más definidas y un shorter marco de tiempo. Este protocolo se puede utilizar para generar células R-NC para las enfermedades humanas que afectan a las células del linaje Carolina del Norte, para la investigación de compuestos, las pruebas de toxicología y el desarrollo de protocolos de diferenciación dirigidos a tipos de células derivadas del linaje NC.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses a revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por una beca para investigadores avanzados de la Fundación Nacional de Ciencia de Suiza y por medio de donaciones de NYSTEM (C026446; C026447) y la iniciativa de células madre Tri-institucional (Fundación Starr).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Gibco-Life Technologies | 11965-092 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| DMEM/F12 | Gibco-Life Technologies | 11330-032 | |
| Knockout Serum Replacement | Gibco-Life Technologies | 10828-028 | Lot should be tested |
| L-Glutamine | Gibco-Life Technologies | 25030-081 | |
| Penicinlin/Streptomycin | Gibco-Life Technologies | 15140-122 | |
| MEM minimum essential amino acids solution | Gibco-Life Technologies | 11140-050 | |
| β-Mercaptoethanol | Gibco-Life Technologies | 21985-023 | toxic |
| Recombinant human FGF basic (FGF2) | R&D Systems | 233-FB-001MG/CF | |
| Knockout DMEM | Gibco-Life Technologies | 10829-018 | |
| DMEM/F12 powder | Invitrogen | 12500-096 | |
| Glucose | Sigma | G7021 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| APO human transferrin | Sigma | T1147 | |
| Human insulin | Sigma | I2643 | |
| Putriscine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
| Selenite | Sigma | S5261 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Matrigel matrix | BD Biosciences | 354234 | |
| Poly-L Ornithin hydrobromide | Sigma | P3655 | |
| Mouse Laminin-I | R&D Systems | 3400-010-01 | |
| Fibronectin | BD Biosciences | 356008 | |
| Dispase in Hank's Balanced Salt Solution 5 U/ml | Stem Cell Technologies | 7013 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco-Life Technologies | 25300-054 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris-R&D Systems | 1254 | |
| LDN193189 | Stemgent | 04-0074 | |
| SB431542 | Tocris-R&D Systems | 1614 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A4034 | |
| BDNF | R&D Systems | 248-BD | |
| FGF8 | R&D Systems | 423-F8 | |
| Mouse recombinant sonic hedgehog (SHH) | R&D Systems | 464SH | |
| HBSS | Gibco-Life Technologies | 14170-112 | |
| HEPES | Gibco-Life Technologies | 1563-080 | |
| Human recombinant EGF | R&D Systems | 236EG | |
| gelatin (PBS without Mg/Ca) | in house | ||
| Antibodies: | |||
| Anti HNK-1/N-Cam (CD57) mIgM | Sigma | C6680-100TST | lot should be tested |
| Anti-p75 mIgG1 (Nerve Growth factor receptor) | Advanced Targeting Systems | AB-N07 | lot should be tested |
| APC rat anti-mIgM | BD Parmingen | 550676 | lot should be tested |
| AlexaFluor 488 goat anti-mouse IgG1 | Invitrogen | A21121 | lot should be tested |
| Anti Oct4 mIgG2b (used at 1:200 dilution) | Santa Cruz | sc-5279 | lot should be tested |
| Material/Equipment: | |||
| Mouse embryonic fibroblasts (7 million cells/vial) | GlobalStem | GSC-6105M | |
| Cell culture dishes: 10 cm and 15 cm plates, centrifuge tubes, FACS tubes, pipettes, pipette tips | |||
| Glass hematocytometer | |||
| Cell culture centrifuge | |||
| Cell culture incubator (CO2, humidity and temperature controlled) | |||
| Cell culture laminar flow hood with embedded microscope | |||
| Cell culture biosafety hood | |||
| Cell sorting machine, i.e. MoFlo | |||
| Inverted microscope | |||
| 1 ml TB syringe 27Gx1/2 | BD Biosciences | 309623 | |
| Cell lifter Polyethylene | Corning Incorporated | 3008 |
References
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