Summary
Cresta neurale (NC), le cellule derivate da cellule umane staminali pluripotenti (HPSC) hanno un grande potenziale per modellare lo sviluppo umano e la malattia e per le terapie di sostituzione cellulare. Qui, un libero adattamento-feeder della tuttora ampiamente utilizzateAbstract
Le cellule umane staminali pluripotenti (hPSCs) hanno un grande potenziale per lo studio dello sviluppo embrionale umano, per modellare malattie umane nel piatto e come fonte di cellule trapiantabili per applicazioni rigenerative dopo malattie o incidenti. Cresta (NC), le cellule neurali sono i precursori per una grande varietà di cellule somatiche adulte, come le cellule del sistema nervoso periferico e glia, melanociti e cellule mesenchimali. Essi sono una preziosa fonte di cellule per studiare gli aspetti dello sviluppo embrionale umana, inclusa la specificazione destino delle cellule e la migrazione. Ulteriore differenziazione delle cellule progenitrici NC in tipi di cellule terminalmente differenziate offre la possibilità di modellare malattie umane in vitro, studiare meccanismi di malattia e di generare cellule per la medicina rigenerativa. Questo articolo presenta l'adattamento di un protocollo vitro attualmente disponibile nella differenziazione per la derivazione di cellule NC da hPSCs. Questo nuovo protocollo richiede 18 giorni di differentiation, è facilmente scalabile e altamente riproducibile tra cellule staminali embrionali umane (hESC) linee così come cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC) linee privo di alimentatore. Entrambi i protocolli vecchi e nuovi producono celle NC di uguale identità.
Introduction
Le cellule staminali embrionali umane (hESC) e le cellule staminali umane pluripotenti indotte (hiPSC) hanno mostrato un potenziale immenso, in particolare per la ricerca e il trattamento futuro delle malattie umane per i quali sono disponibili né modelli animali buoni né i tessuti primari. Esempi di applicazione per la tecnologia hESC / hiPSC sono i seguenti: Celle di particolare interesse possono essere generati da hESC / hiPSCs per la medicina rigenerativa in quantità illimitata 1. Le cellule possono essere prodotti da pazienti portatori di una malattia specifica e usati per stabilire in modelli di malattia vitro 2,3. Tali modelli di malattia possono poi essere utilizzati per lo screening di stupefacenti su larga scala nella ricerca di nuovi composti farmacologici 4, nonché la sperimentazione di farmaci esistenti per l'efficacia e la tossicità 5. Modelli in vitro di malattia può portare alla identificazione di nuovi meccanismi di malattia. Per tutte le applicazioni della tecnologia hESC / iPSC è importante lavorare con specifici e ben definiretipi d cellule colpite nella malattia di interesse. Pertanto, la disponibilità di protocolli di differenziazione solidi e riproducibili in vitro è fondamentale per tutte le applicazioni della tecnologia hESC / hiPSC. I protocolli sono desiderabili che mostrano la variabilità minima, spese tempo, fatica, difficoltà e costi, nonché la riproducibilità massima tra le linee hESC / hiPSC e diversi ricercatori.
Cresta neurale (NC), le cellule emergono durante neurulazione vertebrati tra l'epidermide e l'epitelio neurale. Essi proliferano e migrano ampiamente in tutto l'embrione in via di sviluppo e danno luogo a una varietà impressionante di tipi di cellule progenie, tra cui ossa / cartilagine, lo scheletro cranio-facciale, nervi sensoriali, cellule di Schwann, melanociti, cellule muscolari lisce, i neuroni enterici, i neuroni autonomici, cellule cromaffini , cellule setto cardiaco, denti e surrenale / tiroide cellule ghiandolari 6. Così, le cellule NC sono un tipo cellulare attraente per il campo delle cellule staminali e importante per lamodellazione di una varietà di malattie, come la malattia di Hirschsprung 7, familiare Disautonomia 8 nonché tumori come il neuroblastoma 9. Inoltre, offrono la possibilità di studiare aspetti dello sviluppo embrionale umano in vitro.
Il attualmente disponibili e ampiamente applicato in protocollo di differenziazione in vitro per la derivazione di cellule NC da hESCs 10,11 richiede fino a 35 giorni di differenziazione e comporta l'induzione neurale delle cellule stromali di alimentazione come le cellule MS5 e viene così eseguita in condizioni scarsamente definiti. Mentre può essere up-scalata a generare grandi quantità di celle NC, ad esempio necessaria per high throughput screening farmacologico 4, questo è il lavoro e costosi. Inoltre, esso comporta passaging manuale di rosette neurali, che possono essere difficili da riprodurre e quindi è soggetta a variabilità complessiva, in particolare quando viene applicato ad una grande varietà di hESC o hiPSClinee. Qui, viene mostrata la derivazione graduale delle cellule NC in un protocollo di 18 giorni che è privo di cellule di alimentazione. Questo metodo è più breve e più definito rispetto al protocollo attualmente utilizzato. Inoltre, è molto robusto nel generare celle NC tra diverse linee hiPSC. Importante, è dimostrato che le cellule CN prodotti dai entrambi i protocolli emergono al confine di rosette neurali (qui di seguito denominato rosetta-NC o R-NC). Le cellule derivate utilizzando uno dei due protocolli appaiono morfologicamente identici, esprimono gli stessi marcatori NC e si raggruppano in analisi di microarray. Celle NC derivate utilizzando il nuovo protocollo (R-NC) sono funzionali, simili alle cellule derivate NC utilizzando il vecchio protocollo (MS5-R-NC) tale che possono migrare e ulteriormente differenziarsi in neuroni. Pertanto, le cellule possono essere usati contemporaneamente con le cellule MS5-R-NC. Il protocollo di cellule R-NC per la derivazione di cellule NC da cellule staminali embrionali umane / iPSC sarà utile per tutte le applicazioni della tecnologia hESC / iPSC che coinvolge il lignaggio NC. </ P>
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Protocol
1. Preparazione della Cultura Media, piatti rivestiti e manutenzione di hPSCs
Preparazione 1.1 supporti
Nota: Filtrare tutti i media per la sterilizzazione e conservare a 4 ° C al buio per un massimo di due settimane. Numeri nomi dei reagenti, della società e catalogo sono elencati nella tabella dei materiali.
- % FBS DMEM/10: Unire 885 ml DMEM, 100 ml FBS, 10 ml Pen / Strep e 5 ml di L-glutammina.
- HES-medio: Combine 800 ml DMEM/F12, 200 ml KSR, 5 ml di L-glutammina, 5 ml Pen / Strep, 10 ml di MEM minimo di soluzione aminoacidi essenziali, 1 ml β-mercaptoetanolo. Aggiungere 10 ng / ml di FGF-2 dopo filtrazione il mezzo.
ATTENZIONE: β-mercaptoetanolo è tossico, evitare l'inalazione, ingestione e contatto con la pelle. - Medio KSR-differenziazione: Combine 820 ml Knockout DMEM, 150 ml KSR, 10 ml L-glutammina, 10 ml Pen / Strep, 10 ml di MEM minima soluzione di amminoacidi essenziali e 1 ml di β-mercaptoetanolo.
- N2-differentiatisu supporto: sciogliere 12 g DMEM/F12 polvere in 980 ml di dH 2 O, aggiungere 1,55 g di glucosio, 2 g di bicarbonato di sodio e 100 mg APO transferrina umana. Mescolare 2 ml dH 2 O con 25 mg di insulina umana e 40 microlitri 1 N NaOH, aggiungere la soluzione disciolta al mezzo. Aggiungere 100 microlitri dicloridrato putrescina, 60 microlitri selenite, 100 microlitri progesterone e portare al volume di 1 litro con dH 2 O.
1.2 Rivestimento di piatti della cultura
- Rivestimento Matrigel: Thaw 1 ml congelati matrigel aliquota pipettando 19 ml DMEM/F12 sul aliquota fino a quando non si è sciolta. Togliere macchie passando attraverso un colino cella 40 micron e piastra 8 ml/10 cm piatto. Incubare i piatti per 1 ora a RT. Aspirare il matrigel immediatamente prima placcatura le cellule.
Nota: Lavorate rapidamente con matrigel perché può aggregarsi a temperature superiori a 4 ° C. - Rivestimento PO / Lam / FN: Aggiungere 10 ml di 1x PBS contenente 15 mg / ml Poly-L ornitina hydrobromide ad un piatto 10 centimetri. Incubare il piatto per una notte a 37 ° C. Lavare le piastre con PBS 1x volta e aggiungere 10 ml/10 cm piatto di 1x PBS contenente 2 mg / ml topo laminina-I e 2 mg / ml di fibronectina. Incubare i piatti per una notte a 37 ° C. Prima placcatura le cellule, rimuovere completamente la soluzione e lasciare asciugare completamente le piastre a temperatura ambiente per 15-20 min da loro piedi sulla parete cappa coltura tissutale senza il coperchio.
Nota: I piatti sono completamente asciutte e pronte per la placcatura cellulare quando si può vedere strutture cristalline sulla superficie (visibile ad occhio). Le piastre possono essere conservati a temperatura ambiente per qualche ora in questo stato essiccato. Piatti PO / Lam / FN devono essere preparati due giorni prima del tempo. In casi di emergenza Lam / FN può essere incubato per solo 2-4 ore. Tuttavia, questo può rischiare di non ottimali risultati differenziazione / sopravvivenza.
1.3 Manutenzione di hPSCs
Nota: hPSCs sono mantenute su 0,1% di gelatina e mouse mitoticamente inattivato fibroblasti embrionali (MEFS) nelle HES-medium supplementato con 10 ng / ml di FGF-2 come descritto in precedenza 10,12. Le cellule devono essere divise ogni 6-8 giorni.
- Coat un piatto 10 centimetri con 8 ml di 0,1% di gelatina (in 1x PBS senza calcio o magnesio) a temperatura ambiente per 5 min.
- Scongelare MEF congelati rapidamente in un bagno d'acqua a 37 ° C. Aggiungi milione MEF a 10 ml% FBS DMEM/10.
- Aspirare la gelatina e piastra le cellule. Incubare a 37 ° C per almeno 6 ore.
- Aspirare il FBS DMEM/10% dalla piastra MEF preparato, lavare piatto con 1x PBS una volta e aggiungere 10 ml HES-medium supplementato con 10 mM Y-27632 dicloridrato. Lasciar riscaldare a 37 ° C per 20 min.
Nota: Per splitting manuale di hPSCs viene utilizzata una cappa a flusso laminare con un microscopio incorporato. Tuttavia, le cellule possono essere diversi passaggi utilizzando opportuni metodi alternativi. - Sotto una cappa a flusso laminare con un microscopio incorporato, staccare colonie separate utilizzando un sollevatore cella e far galleggiare.
- Utilizzare unSiringa da 1 ml per aspirare le colonie galleggianti e li spedisce sul caldo piatto MEF fresca. Trasferire circa un quarto delle cellule al nuovo piatto. Incubare a 37 ° C.
- Concime cellule quotidianamente con fresco medio HES.
2. Placcatura di hPSCs di Differenziazione
Nota: hPSCs dovrebbero essere raggruppati o placcati per la differenziazione, quando le colonie sono grandi, ma hanno ancora margini taglienti con il meno possibile le cellule di differenziazione alle frontiere (vedi Figura 1B). Quando le cellule sono mantenuti utilizzando passaging manuale colonie dovrebbero essere abbastanza grandi da essere facilmente visibile ad occhio. Per ottenere la giusta sensazione per questo punto di tempo si può mantenere un piatto HPSC separata per due settimane senza passaging e guardare le cellule raggiungono e passare il punto di tempo ideale per passaging / li differenzia.
- Preparare 10 centimetri piatti con matrigel 1 ora prima di avviare la differenziazione. Rivestimento matrigel successo può essereverificate a 4 ingrandimenti.
- Quando le hPSCs sono pronti per essere diviso, aspirare il terreno e aggiungere 4 ml di 0,05% tripsina-EDTA alle cellule.
- Agitare il piatto orizzontale per 2 minuti energicamente fino a quando si può vedere il MEF come singole cellule sollevare la piastra sotto il microscopio. Le colonie HPSC rimangono attaccati come colonie.
- Immediatamente e accuratamente, aspirare il tripsina e lasciare che la piastra di riposare a temperatura ambiente per 2-4 min.
- Aggiungere 2 ml di HES-medio alla piastra e con una pipetta P1000, staccare le cellule.
Nota: Se le cellule non possono essere sollevati dalla superficie facilmente, la piastra può essere incubato vuoto a temperatura ambiente per altri 2-3 min. - Trasferire le cellule a 8 ml HES-medium supplementato con 10 mM Y-27632 dicloridrato.
- Aspirare il matrigel da 10 cm piatto precedentemente preparato. Piastra le cellule con un rapporto di 1:1 o 01:02 (per esempio: le cellule da un piatto 10 centimetri sono divisi in due 10 centimetri piatti) sulla piastra matrigel. Incubare a 37 °C durante la notte.
Nota: Questo placcatura dovrebbe portare a circa 100.000 cellule / cm 2.
3. Induzione della differenziazione neurale
Nota: La differenziazione può essere iniziata (giorno 0) quando le cellule sono 90-100% confluenti (vedere Figura 1C), di solito il giorno seguente. Se la confluenza preciso non è ancora raggiunto, le cellule possono essere alimentati quotidianamente con HES-medio finché non sono pronti per la differenziazione. In alternativa, il numero iniziale di cellule piastrate può essere aumentata.
- Il giorno 0-3, nutrire le cellule al giorno con 10 ml/10 cm servire a medio KSR-differenziazione contenente 0,1 micron LDN193189 e 10 micron SB431542.
- Il giorno 4 e 5 alimenti le cellule con il 75% di media KSR-differenziazione e il 25% a medio N2-differenziazione entrambi contenenti LDN193189 e SB431542.
- Il giorno 6 e 7 mangimi le cellule con 50% medio KSR-differenziazione e 50% N2 medio-differenziazione entrambi contenenti LDN193189 e SB431542.
- Il giorno 8 e 9 nutrire le cellule con il 25% di media KSR-differenziazione e il 75% a medio N2-differenziazione entrambi contenenti LDN193189 e SB431542.
- Il giorno 9 e 10 preparare piatti PO / Lam / FN come indicato in 1.2.2 per replating delle cellule il giorno 11.
- Il giorno 10 celle di alimentazione a media N2-differenziazione contenente LDN193189 e SB431542.
4. Replating in Goccioline per NC Specifica
- Il giorno 11 aspirato Lam / FN dalle piastre precedentemente preparati e lasciarli asciugare completamente a temperatura ambiente per 20-30 minuti, come spiegato in 1.2.2.
- Rimuovere mezzo dalle cellule differenziazione, lavare le cellule una volta con PBS 1x e aggiungere 8 ml accutase/10 cm piatto. Incubare per 20 minuti a 37 ° C.
- Utilizzando un sollevatore cella, staccare le cellule e risospendere in accutase con una pipetta da 5 ml. Trasferire la sospensione in una provetta da 15 ml.
- Aggiungere 5 ml di PBS 1x e far girare le cellule per 5 min a 114 x g.
- Risospendere le cellule in 10 ml 1x PBS. Per garantire una sospensione di cellule singole, li filtrare attraverso un colino cella 40 pm e contare le cellule utilizzando un emocitometro o tecnica equivalente.
- Spin le cellule giù e risospendere in mezzo N2-differenziazione contenente 200 mM Acido ascorbico (AA), 20 ng / ml BDNF, 100 ng / ml FGF8, 20 ng / ml SHH, 10 pM Y-27632 dicloridrato alla concentrazione di 100.000 -150.000 cells/10 microlitri.
- Utilizzando un repeat-pipetta, piatto 10 gocce microlitri vicini gli uni agli altri senza toccarli sul PO essiccati / Lam / FN 15 centimetri piatti.
Nota: Un 10 centimetri piatto di cellule differenziate normalmente si traduce in piatti cm o circa 100 x 10 microlitri droplets/15 cm piatto circa 2-3 volte 15. - Lasciate che le goccioline stanno a temperatura ambiente per 20-30 minuti, poi con molta attenzione (per non disturbare le goccioline) aggiungere 30 ml di N2/AA/BDNF/FGF8/SHH/Y e incubare a 37 ° C.
- Il giorno 12, con attenzione nutrire le cellule con 20 ml/15 cm piatto N2/AA/BDNF/FGF8/SHH.
- Da day 14-17 nutrire le cellule ogni secondo o terzo giorno con N2/AA/BDNF/FGF8.
- Il giorno 16 e 17 preparare PO / piastre Lam / FN per replate celle NC dopo FACS ordinamento.
5. Fluorescence Activated Cell (FACS) di celle NC
Nota: La preparazione delle cellule per FACS richiede circa 2 ore.
- Il giorno 18 di media rimuovere, lavare le cellule una volta con PBS 1x nel piatto e aggiungere 12 ml accutase. Incubare le cellule per 20 min a 37 ° C.
- Utilizzando un sollevatore cellulare, staccare le cellule dalla superficie e lasciarli galleggiare. Pipettare le cellule in sospensione con una pipetta da 5 ml, trasferirli in una provetta da 50 ml e aggiungere 30 ml di 1x PBS. Centrifugare le cellule per 5 min a 114 x g.
- Usando una pipetta P1000, risospendere le cellule in 1 ml di 2% FBS / HBSS (il HBSS contenente 15 mM HEPES). Aggiungere 19 ml di 2% FBS / HBSS e filtrare le cellule attraverso un colino cella 40 micron per garantire una sospensione di cellule singole. Incubare le cellule in ghiaccio per 15 min per gli anticorpi di blocco e poi contare utilizzando un emocitometro.
- Spin le cellule verso il basso e risospendere alla concentrazione di 10 milioni di cellule / ml a 2% FBS / HBSS.
- Mettere da parte 1 milione di celle ciascuno per la macchia, single-macchiato (HNK-1 solo e soltanto p75) e anticorpo secondario macchiato solo (APC solo ed esclusivamente 488) FACS controlla.
- Aggiungere 5 ml di HNK-1 e 5 ml di p75 anticorpo primario per 10 milioni di cellule in 1 ml di sospensione ai campioni adeguati e incubare per 20 min in ghiaccio.
- Lavare le cellule in 10 ml di PBS 1x (centrifuga 5 min a 114 xg) e risospendere le cellule in 1 ml 2% FBS / HBSS. Aggiungere 2 ml di APC e 1 ml di 488 anticorpo secondario per 10 milioni di cellule in 1 ml di sospensione ai campioni adeguati e incubare per 20 min in ghiaccio al buio.
Nota: APC e 488 sono gli anticorpi secondari utilizzati qui per la HNK-1 e p75 colorazione, rispettivamente. - Lavare le cellule in 10 ml 1x PBS due volte, risospendere 10 milioni di cellule in 500 ml di2% FBS / HBSS contenente DAPI (a 0.5 ng / ml) o opportuno macchia cellule vive alternativa di escludere le cellule morte dalla analisi FACS.
- Trasferire i campioni di appropriarsi tubi FACS.
- Preparare tubi FACS con 0,5 ml 2% FBS / HBSS per la raccolta delle cellule.
Nota: Le celle e tubi di raccolta sono tenuti in ghiaccio al buio durante il tempo di ordinamento. - Utilizzando una macchina di smistamento delle cellule con il laser in grado di rilevare DAPI, APC e 488 specie DAPI-/HNK-1 + / P75 + cellule doppie positive.
Nota: Tempo di preparazione e manipolazione delle cellule porta ad una piccola percentuale di cellule morte, macchie DAPI cellule morte permette solo e quindi per queste cellule per essere esclusi dalla popolazione ordinato. Qualsiasi alternativa macchia dal vivo / morto funziona altrettanto bene per questo scopo. DAPI sé non causa citotossicità nella popolazione di cellule vivo.
6. Replating di cellule ordinati, NC manutenzione ed espansione
Nota: le cellule FACS ordinati dovrebbero essere a manocondotto con particolare cura per garantire la sopravvivenza ottimale. Tenerli in ghiaccio fino al loro replating. Non vortex o pipettare loro duramente. Le cellule possono essere risospese muovendo il tubo.
- Dopo FACS ordinamento, contare le celle NC, poi girare giù e risospendere in mezzo N2 differenziazione integrato con 10 ng / ml FGF2, 20 ng / ml EGF e 10 micron Y-27632 dicloridrato nel volume appropriato per loro replate a 30.000 cellule / 10 gocce microlitri.
- Asciugare accuratamente preparata in precedenza PO piastre / Lam / FN e piatto circa 50-70 gocce per 10 centimetri piatto. Lasciate che i piatti si distinguono a temperatura ambiente per 20-30 min.
- Aggiungere molto attentamente 20 ml/10 cm piatto di N2/FGF2/EGF/Y-27632 senza disturbare le goccioline. Incubare le cellule a 37 ° C.
- Nutrire le cellule ogni 2-3 giorni con N2/FGF2/EGF.
Nota: le cellule NC vengono espanse o diversi passaggi circa ogni 4-5 giorni o quando iniziano ad accumularsi all'interno delle goccioline. - Per il passaggio delle cellule NC, rimuovere il mezzo, wash le cellule una volta con PBS 1x e aggiungere 8 ml accutase/10 cm piatto. Incubare per 20 minuti a 37 ° C.
- Pipettare le cellule dalla piastra con una pipetta 5 ml e trasferirli in una provetta da 15 ml. Aggiungere 6 ml di PBS 1X.
- Centrifugare le cellule per 5 min a 114 x g.
- Risospendere le cellule in mezzo N2-differenziazione addizionato con 10 ng / ml FGF2, 20 ng / ml EGF e 10 pM Y-27632 dicloridrato per avere 20.000 cells/10 microlitri gocciolina.
- Replate le cellule in 10 gocce microlitri sulle secche piatti PO / Lam / FN. Lasciate che i piatti si distinguono a temperatura ambiente per 20-30 min.
- Aggiungere con cautela 20 ml/10 cm piatto di N2/FGF2/EGF/Y-27632. Incubare a 37 ° C.
Nota: le cellule NC possono essere mantenuti o ampliati per un massimo di due settimane come una popolazione progenitore relativamente omogenea. Cultura più può portare loro di differenziarsi in vari tipi di cellule progenie.
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Representative Results
I due più importanti miglioramenti del protocollo R-NC tramite il protocollo MS5-R-NC 11 sono le condizioni differenziazione definite libero-feeder e la riduzione complessiva del requisito tempo. Cellule di alimentazione MS5 13 sono di midollo osseo cellule stromali derivate murine che hanno dimostrato di sostenere differenziamento neurale da hESC 14. HESCs coltivati su cellule di alimentazione MS5 presso le strutture epiteliali bassa densità di forma e rosette neurali 15, alla periferia di cui le cellule NC emergono 10, imitando così precoce sviluppo neurale umana. Tuttavia, non è chiaro quale molecole di segnalazione e fattori di crescita vengono rilasciati dalle cellule feeder MS5. Pertanto, le condizioni di differenziazione sono mal definiti, il che rende difficile riprodurle in esperimenti ricorrenti e attraverso le linee HPSC. Per un'adeguata induzione neurale, hESC devono essere seminati a bassa densità in piccole colonie su cellule di alimentazione MS5, complicanzeting up-scaling e raggiungendo alte rese di cellule differenziate. Nel 2009, un metodo è stato sviluppato che mira a neuralizing hPSCs molto efficiente 12. In questo metodo hPSCs vengono seminate ad alta densità, in monostrati in assenza di cellule feeder MS5, raggiungere alte rese di induzione neurale in 10 giorni. Abbiamo seguito lo schema di questo metodo per adattare il protocollo di differenziazione MS5-R-NC (Figura 1A). HPSCs coltivati in colonie su MEF (Figura 1B) sono dispersi e seminate su Matrigel come singole cellule in coltura monostrato ad alta densità (Figura 1C). Al giorno 11 di differenziazione, la maggioranza delle cellule sono neuralized successo (Pax6-positive, non mostrato 12). Replating le celle ad alta densità in goccioline permette la formazione di rosette neurali condensati all'interno della gocciolina (Figura 1D e Figura 2). Celle NC emergono ai confini di rosette neurali (Figura 1D </ Strong>) e migrare fuori della goccia (Figura 1E). Dopo 7 giorni di coltura le cellule ulteriore NC possono essere isolate mediante FACS ordinamento. HNK-1/p75 doppie celle NC positivi possono essere isolati alla efficienza del 20-40% (Figura 1F). Questo protocollo richiede 18 giorni, mentre il protocollo MS5-R-NC richiede fino a 35 giorni, rendendo il protocollo cella R-NC più utile per una varietà di applicazioni a valle.
Lo scopo di questo lavoro è quello di generare cellule NC in un protocollo più riproducibile ed economico corta, ottenendo le stesse cellule come il vecchio protocollo NC. Abbiamo usato questo nuovo protocollo per differenziare successo almeno 10 hESC e hiPSC linee derivate da pazienti e controlli sani (dati non mostrati), che mostra solido riproducibilità del protocollo attraverso diverse linee HPSC. Il nuovo protocollo riduce i costi dovuti all'uso di LDN rispetto zucca, meno uso di SHH e la mancanza di MS5 costi di produzione. Il nuovo protocollo dura 18 giorni rispetto ai 35 giornis nel vecchio protocollo, che consente di risparmiare circa 5 poppate e quindi i costi multimediali associati. Per studiare se le cellule prodotte con i due protocolli hanno un'identità simile, mostriamo che lo sviluppo delle cellule NC in entrambi i protocolli segue lo stesso modello di differenziazione (Figura 2). Le cellule passano attraverso una fase di rosetta neurale e producono celle NC con morfologia identica dopo FACS ordinamento. La ridotta dimensione delle rosette neurali nel nuovo protocollo rispetto al vecchio protocollo è dovuto alla elevata densità cellulare dopo replating al giorno 11. Al contrario, nei vecchi rosette protocollo formano colonie all'interno HPSC, che non sono come condensato. NC cellule derivate con i due protocolli esprimono gli stessi marcatori NC biologici, come HNK-1, AP2 e nestin. Abbiamo analizzato le cellule NC generati con i due protocolli a livello di espressione genica globale (Figura 3A) e abbiamo trovato che le cellule NC generati con i due protocolli si raggruppano in stretta collaborazione. Celle NC che erano generited per l'attivazione della via di segnalazione Wnt (Wnt-NC) e sono stati dimostrato di avere il potenziale di melanociti che generano 16, grappolo separatamente quando analizzato da espressione genica globale, indicando che puo 'essere una diversa popolazione NC. Infatti, siamo stati in grado di generare cellule progenitrici melanociti in vitro da cellule (dati non riportati) R-NC o MS5-R-NC. Analogamente, cellule neuroepiteliale (LSB), differenziato per 10 giorni in LDN193189 e SB431542 mostrano soltanto un modello di espressione genica chiaramente distinti. Cellule roepiteliale sono progenitori del sistema nervoso, e quindi sono meno differenziate rispetto alle cellule NC e sono qui inclusi come una popolazione di controllo negativo. Per valutare se le cellule R-NC generati qui sono simili alle cellule fatte con il vecchio protocollo, mostriamo loro capacità di migrazione in un graffio saggio in vitro (Figura 3B). 48 ore dopo aver grattato un pozzo confluente di cellule R-NC ordinati, le cellule migrano nel SCRAtch con successo. Infine, mostriamo che le cellule R-NC hanno la potenzialità di differenziarsi in cellule del sistema nervoso autonomo. Le cellule sono state spontaneamente differenziate per 4 giorni dopo HNK1 + / p75 + FACS e colorate per Mash1 e TUJ1, geni che sono espressi in neuroni autonomi (Figura 3C).
Figura 1. Passaggi critici nel protocollo di differenziazione R-NC. A MS5-R-NC 10,11 e R-NC regime. Protocollo di differenziazione. Sono mostrate le fasi di differenziazione specifiche dei due protocolli. MS5: cellule stromali alimentatore, KSR: medio KSR-differenziazione, N2: medio N2-differenziazione, LDN: LDN193189, SB: SB431542, S: sonic hedgehog, 8: FGF8, A: acido ascorbico, B:. BDNF B. Mostra colonie indifferenziati HPSC colorati con Oct-4 e DAPI prima induzione del differenziamento. C.. Indica la densità cellulare (90-100% confluenza) al giorno 0 di differenziazione, di solito 1 giorno dopo la placcatura hPSCs. D.. Mostra rosette neurali colorati con Pax6 e celle NC emergenti colorate con HNK-1 entro la goccia. E. Spettacoli giorno 13 celle, ripiastrate al giorno 11 in goccioline e celle NC emergenti dal bordo della goccia. F. FACS Rappresentante ordinamento trama, mostrando HNK-1/p75 doppie celle NC positive al giorno 18 di differenziazione. I cancelli sono stati scelti sulla base di controlli non colorati macchiati e singoli (non mostrati). FACS ordinamento trame possono differire tra esperimenti, linee HPSC e l'uso del protocollo vecchio o nuovo in termini di percentuale di cellule doppio positive e singole positivi. Pertanto, è importante isolare il doppio popolazione positive per garantire le cellule adeguate NC vengono estratti. Immagini da C a F sono stati generati utilizzando il nuovo protocollo R-NC.= "Https://www.jove.com/files/ftp_upload/51609/51609fig1highres.jpg" target = "_blank"> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Paragonabile neural l'identità delle cellule cresta delle cellule derivate con il MS5-R-NC o il protocollo R-NC. In entrambi i protocolli le cellule passano attraverso una fase di rosetta neurale. Celle NC ordine sembrano identici per morfologia e per l'espressione di marcatori NC come HNK-1 e AP2. Celle NC sono nestin-positivi, dimostrando che sono cellule progenitrici. Scala bar: 200 micron. Tutte le immagini di fluorescenza sono contrastate per DAPI. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Cellule Figura 3. NC generati con il vecchio e il nuovo protocollo hanno un'identità simile. A. Il clustering non supervisionato dei microarray Illumina dati di espressione genica di confronto celle NC derivate con il MS5-R-NC e il protocollo R-NC. Celle NC derivate con il MS5-R-NC o il protocollo R-NC a giorno 35 o, rispettivamente, il giorno 18 sono stati analizzati in triplicato mediante ibridazione in una matrice di Illumina umana 12 oligonucleotidi. L'analisi dei dati è stata condotta utilizzando il software Partek Genomic Suite. Differenze significative sono stati definiti come quelli con un fold change maggiore di 2 e FDR inferiore a 0,05. 1.421 geni sono stati analizzati. Sono state utilizzate le impostazioni predefinite, come ad esempio dissomiglianza campione euclidea, metodo della media del cluster linkage e 25 per la lunghezza dendrogramma. Celle NC indotte attivando segnalazione Wnt (Wnt-NC) sono stati inclusi (le cellule sono state differentiated in LDN193189 giorno 0-3, SB431542 giorno 0-4, CHIR99021 giorno 0-11 e FACS ordinati al giorno 11 per SOX10) 16. Queste cellule si raggruppano separatamente dalle cellule R-NC, indicando che le cellule Wnt-NC e cellule R-NC sono popolazioni distinte. Cellule differenziate per 11 giorni in LDN193189 e SB431542 sono stati inclusi come controllo neuroepiteliale (LSB). Cellule R-NC e MS5-R-NC raggruppano in stretta collaborazione rispetto alle cellule di controllo. Sono disponibili dati di espressione genica grezzi su GEO (www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) adesione #:. GSE50643 B. Test di migrazione. HNK1 + / p75 + FACS ordinati cellule R-NC sono stati piastrati su PO / Lam / FN in 96-pozzetti e graffiato manualmente 24 ore più tardi. La foto è stata scattata 0 ore subito dopo graffi e post colorazione con Hoechst. I restanti pozzi sono stati autorizzati a migrare per 48 ore prima che la seconda foto è stata scattata. Barra della scala: 200 micron C. Cellule R-NC ordine sono stati autorizzati a differenziare spontaneamente per 4 giorni e sono state colorate per MaSH1, TUJ1 e DAPI. Barra della scala:. 500 micron cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Per la differenziazione di successo di cellule R-NC da hESC / hiPSCs devono essere effettuate le seguenti considerazioni. E 'fondamentale per lavorare in condizioni di coltura sterili in ogni momento. In particolare, è importante testare culture HPSC per contaminazione micoplasma regolarmente, poiché questa contaminazione ostacolerà differenziazione successo, ma non può essere facilmente rilevata visivamente in culture HPSC. La differenziazione R-NC deve essere iniziato al 90-100% della densità cellulare; densità cella inferiore colpisce la sopravvivenza e l'efficienza di R-NC differenziamento cellulare. E 'fondamentale per validare empiricamente concentrazioni ottimali ei numeri di lotto di alcuni dei reagenti, in particolare KSR per sostenere efficiente differenziazione NC. Se le cellule sono ripiastrate al giorno 11 in goccioline, la densità cellulare all'interno della gocciolina 10 microlitri dovrebbe essere alto ed è meglio determinati empiricamente. La corretta rosetta-e NC-formazione dipende dalla densità cella appropriata all'interno della gocciolina. Noi empiricamente osved aumentata sopravvivenza cellulare quando le cellule vengono lavate almeno due volte dopo il trattamento con accutase. Per l'isolamento di successo di cellule R-NC mediante FACS controlli sperimentali adeguati, come le cellule solo macchiati macchia, singolo colorati con anticorpo e anticorpi secondari sono cruciali. Le cellule morte possono essere esclusi dal DAPI, 7-AAD o ioduro di propidio colorazione. Inoltre, diluizioni di anticorpi devono essere determinati empiricamente per ogni lotto anticorpo specifico. È importante FACS purificare cellule R-NC da doppia colorazione con HNK-1 e p75, poiché singola colorazione può portare alla contaminazione della popolazione NC con tipi di cellule indesiderate, come le cellule del SNC p75-positive, mesoderma presto o placode. Nella nostra esperienza le percentuali di doppia rispetto a singole popolazioni macchiati può variare tra le linee HPSC ed esperimenti di differenziazione. R-NC postali sopravvivenza cellulare FACS può essere aumentata evitando dura pipettaggio delle cellule, invece sfogliando del tubo di risospendere le cellule è consigliabile. Inoltre, placcatura FACS R-NCcellule isolate in mezzo condizionato (medium filtrato le cellule cresciute in prima FACS) ha dimostrato di migliorare la sopravvivenza 11. Si consiglia di effettuare una differenziazione scala minore in parallelo che può essere trattata con l'neurale Pax6 marcatore epiteliale al giorno 11 e al giorno 14 per garantire la neutralizzazione efficiente e la formazione di rosette. Marcatori NC, come HNK-1 o AP2 in fase di rosetta per una corretta differenziazione NC devono essere valutate pure. Inoltre, isolate le cellule R-NC devono essere convalidati dalla morfologia e colorazione per i marcatori NC, come AP2, HNK-1 e nestin (Figura 2).
La derivazione di cellule MS5-R-NC da HPSC è stata descritta nel 2007 da Lee et al. 10. È stato dimostrato che questa popolazione precursore può essere propagato e ulteriormente differenziate in vitro in derivati del lineage NC. Cellule MS5-R-NC possono essere differenziati spontaneamente utilizzando il metodo neurale sfera 10,17o diretto nel differenziamento vitro. Si è stabilito che le cellule MS5-R-NC possono dare origine a cellule del sistema nervoso periferico (neuroni autonomi e sensoriali), glia periferico (cellule di Schwann), miofibroblasti, cellule staminali mesenchimali e loro progenie e nel muscolo liscio 10. Trapianti in pulcino e topi hanno mostrato che le cellule MS5-R-NC migrano e si differenziano in vivo 10. Cellule MS5-R-NC sono stati ulteriormente implicati nella modellazione delle malattie umane. Il fenotipo caratteristico della malattia genetica familiare Disautonomia (FD) è stato modellato in vitro utilizzando specifico paziente cellule MS5-R-NC hiPSC-derivati 2. NC fenotipi caratteristici quali disfunzionale sviluppo delle cellule NC e migrazione sono stati mostrati in cellule derivate da pazienti FD ma non nelle cellule di controllo sani. Cellule MS5-R-NC sono stati utilizzati per stabilire il test tossicologico dei composti che influenzano la migrazione cresta neurale durante embrionali umanesviluppo, con la possibilità di evitare il rilascio di futuri farmaci che potrebbero influire negativamente neurodevelopment 5. Un emozionante applicazione della tecnologia HPSC è high-throughput screening e test di opzioni di trattamento farmaceutici per malattie umane. Cellule MS5-R-NC sono stati usati per realizzare il primo tale schermo in un modello di malattia basato iPSC, cioè familiare Dysautonomia 4. Questa schermata ha portato alla identificazione di nuovi composti che potrebbero essere ulteriormente valutato in studi clinici.
Per tutte le applicazioni del settore HPSC è fondamentale avere accurate, riproducibili, definito e specifico nei protocolli di differenziamento in vitro disponibili. In questa relazione, vi mostriamo l'adattamento di un protocollo stabilito in vitro la differenziazione per la derivazione di cellule R-NC da hPSCs. Il protocollo riportato produce le stesse celle come precedentemente riportati 10 in condizioni di coltura più definite e un shorter lasso di tempo. Questo protocollo può essere impiegato per generare cellule R-NC per le malattie umane che colpisce le cellule della stirpe NC, per lo screening composto, test tossicologici e l'ulteriore sviluppo di protocolli di differenziazione dirette a tipi di cellule derivate dal lignaggio NC.
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Disclosures
Gli autori non hanno interessi in conflitto da dichiarare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da una borsa di studio per ricercatori avanzati dal Fondo nazionale svizzero e attraverso sovvenzioni NYSTEM (C026446, C026447) e l'iniziativa di cellule staminali Tri-istituzionale (Starr Foundation).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Gibco-Life Technologies | 11965-092 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| DMEM/F12 | Gibco-Life Technologies | 11330-032 | |
| Knockout Serum Replacement | Gibco-Life Technologies | 10828-028 | Lot should be tested |
| L-Glutamine | Gibco-Life Technologies | 25030-081 | |
| Penicinlin/Streptomycin | Gibco-Life Technologies | 15140-122 | |
| MEM minimum essential amino acids solution | Gibco-Life Technologies | 11140-050 | |
| β-Mercaptoethanol | Gibco-Life Technologies | 21985-023 | toxic |
| Recombinant human FGF basic (FGF2) | R&D Systems | 233-FB-001MG/CF | |
| Knockout DMEM | Gibco-Life Technologies | 10829-018 | |
| DMEM/F12 powder | Invitrogen | 12500-096 | |
| Glucose | Sigma | G7021 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| APO human transferrin | Sigma | T1147 | |
| Human insulin | Sigma | I2643 | |
| Putriscine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
| Selenite | Sigma | S5261 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Matrigel matrix | BD Biosciences | 354234 | |
| Poly-L Ornithin hydrobromide | Sigma | P3655 | |
| Mouse Laminin-I | R&D Systems | 3400-010-01 | |
| Fibronectin | BD Biosciences | 356008 | |
| Dispase in Hank's Balanced Salt Solution 5 U/ml | Stem Cell Technologies | 7013 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco-Life Technologies | 25300-054 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris-R&D Systems | 1254 | |
| LDN193189 | Stemgent | 04-0074 | |
| SB431542 | Tocris-R&D Systems | 1614 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A4034 | |
| BDNF | R&D Systems | 248-BD | |
| FGF8 | R&D Systems | 423-F8 | |
| Mouse recombinant sonic hedgehog (SHH) | R&D Systems | 464SH | |
| HBSS | Gibco-Life Technologies | 14170-112 | |
| HEPES | Gibco-Life Technologies | 1563-080 | |
| Human recombinant EGF | R&D Systems | 236EG | |
| gelatin (PBS without Mg/Ca) | in house | ||
| Antibodies: | |||
| Anti HNK-1/N-Cam (CD57) mIgM | Sigma | C6680-100TST | lot should be tested |
| Anti-p75 mIgG1 (Nerve Growth factor receptor) | Advanced Targeting Systems | AB-N07 | lot should be tested |
| APC rat anti-mIgM | BD Parmingen | 550676 | lot should be tested |
| AlexaFluor 488 goat anti-mouse IgG1 | Invitrogen | A21121 | lot should be tested |
| Anti Oct4 mIgG2b (used at 1:200 dilution) | Santa Cruz | sc-5279 | lot should be tested |
| Material/Equipment: | |||
| Mouse embryonic fibroblasts (7 million cells/vial) | GlobalStem | GSC-6105M | |
| Cell culture dishes: 10 cm and 15 cm plates, centrifuge tubes, FACS tubes, pipettes, pipette tips | |||
| Glass hematocytometer | |||
| Cell culture centrifuge | |||
| Cell culture incubator (CO2, humidity and temperature controlled) | |||
| Cell culture laminar flow hood with embedded microscope | |||
| Cell culture biosafety hood | |||
| Cell sorting machine, i.e. MoFlo | |||
| Inverted microscope | |||
| 1 ml TB syringe 27Gx1/2 | BD Biosciences | 309623 | |
| Cell lifter Polyethylene | Corning Incorporated | 3008 |
References
- Lee, G., Studer, L. Induced pluripotent stem cell technology for the study of human disease. Nat Methods. 7, 25-27 (2010).
- Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461, 402-406 (2009).
- Ebert, A. D., et al. Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient. Nature. 457, 277-280 (2009).
- Lee, G., et al. Large-scale screening using familial dysautonomia induced pluripotent stem cells identifies compounds that rescue IKBKAP expression. Nat Biotechnol. 30, 1244-1248 (2012).
- Zimmer, B., et al. Evaluation of developmental toxicants and signaling pathways in a functional test based on the migration of human neural crest cells. Environ Health Perspect. 120, 1116-1122 (2012).
- Dupin, E., Sommer, L. Neural crest progenitors and stem cells: from early development to adulthood. Dev Biol. 366, 83-95 (2012).
- McKeown, S. J., Stamp, L., Hao, M. M., Young, H. M. Hirschsprung disease: a developmental disorder of the enteric nervous system. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2, 113-129 (2013).
- Slaugenhaupt, S. A., et al. Tissue-specific expression of a splicing mutation in the IKBKAP gene causes familial dysautonomia. Am J Hum Genet. 68, 598-605 (2001).
- Cheung, N. K., Dyer, M. A. Neuroblastoma: developmental biology, cancer genomics and immunotherapy. Nat Rev Cancer. 13, 397-411 (2013).
- Lee, G., et al. Isolation and directed differentiation of neural crest stem cells derived from human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25, 1468-1475 (2007).
- Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. Derivation of neural crest cells from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 5, 688-701 (2010).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27, 275-280 (2009).
- Itoh, K., et al. Reproducible establishment of hemopoietic supportive stromal cell lines from murine bone marrow. Exp Hematol. 17, 145-153 (1989).
- Barberi, T., et al. Neural subtype specification of fertilization and nuclear transfer embryonic stem cells and application in parkinsonian mice. Nat Biotechnol. 21, 1200-1207 (2003).
- Elkabetz, Y., et al. Human ES cell-derived neural rosettes reveal a functionally distinct early neural stem cell stage. Genes Dev. 22, 152-165 (2008).
- Mica, Y., Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. Modeling neural crest induction, melanocyte specification, and disease-related pigmentation defects in hESCs and patient-specific iPSCs. Cell Rep. 3, 1140-1152 (2013).
- Molofsky, A. V., et al. Bmi-1 dependence distinguishes neural stem cell self-renewal from progenitor proliferation. Nature. 425, 962-967 (2003).
