Voedingsvrije Afleiding van neurale stamcellen uit humane pluripotente stamcellen

Summary

Neurale lijst (NC) cellen afkomstig van menselijke pluripotente stamcellen (HPSC) hebben een groot potentieel voor het modelleren van de menselijke ontwikkeling en ziekte en voor celvervangingstherapieën. Hier, een voedingsvrije aanpassing van de momenteel gebruikte

Abstract

Humane pluripotente stamcellen (hPSCs) hebben een groot potentieel voor het bestuderen van humane embryonale ontwikkeling, voor het modelleren van menselijke ziekten in de schaal en als een bron van te transplanteren cellen voor regeneratieve toepassingen na ziekte of ongeval. Neurale (NC) cellen zijn de voorlopers van een grote verscheidenheid aan volwassen somatische cellen, zoals cellen van het perifere zenuwstelsel en glia, melanocyten en mesenchymale cellen. Ze zijn een waardevolle bron van cellen om aspecten van de menselijke embryonale ontwikkeling, met inbegrip van lot van de cel specificatie en migratie te bestuderen. Verdere differentiatie van NC progenitorcellen in terminaal gedifferentieerde celtypes biedt de mogelijkheid om menselijke ziekten te modelleren vitro onderzoeken ziektemechanismen en het genereren van cellen voor regeneratieve geneeskunde. Dit artikel presenteert de aanpassing van een op dit moment beschikbaar in vitro differentiatie protocol voor de afleiding van NC cellen uit hPSCs. Dit nieuwe protocol vereist 18 dagen van verschilrentiation, is-feeder gratis, eenvoudig schaalbaar en zeer reproduceerbaar onder menselijke embryonale stamcellen (hESC) lijnen alsook humane geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC) lijnen. Zowel oude als nieuwe protocollen opleveren NC cellen van gelijke identiteit.

Introduction

Menselijke embryonale stamcellen (hESC) en humane geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC) hebben laten zien een enorm potentieel, met name voor het onderzoek en de toekomstige behandeling van menselijke ziekten waarvoor geen goede diermodellen noch primaire weefsels beschikbaar zijn. Toepassingsvoorbeelden voor de hESC / hiPSC technologie zijn de volgende: Cellen van bijzonder belang kunnen worden gegenereerd uit hESC / hiPSCs voor regeneratieve geneeskunde aan onbeperkte hoeveelheid ^1. Cellen kunnen worden verkregen uit patiënten die een bepaalde ziekte en dienen om ten in vitro ziektemodellen ^2,3. Dergelijke ziekte modellen kunnen vervolgens worden gebruikt voor grootschalige screening van geneesmiddelen in de zoektocht naar nieuwe geneesmiddelen verbindingen ^4, alsmede het testen van bestaande geneesmiddelen voor de werkzaamheid en toxiciteit ^5. In vitro modellen ziekte kan leiden tot de identificatie van nieuwe ziektemechanismen. Voor alle toepassingen van hESC / iPSC technologie is het belangrijk om met specifieke, goed definiërend celtypen betrokken bij de ziekte van belang. Aldus, de beschikbaarheid van vaste en reproduceerbare in vitro differentiatie protocollen is cruciaal voor alle toepassingen van de hESC / hiPSC technologie. Protocollen zijn gewenst die minimale variabiliteit tijd kosten, inspanning, moeite en kosten en maximale reproduceerbaarheid onder hESC / hiPSC lijnen en andere onderzoekers tonen.

Neurale lijst (NC) cellen ontstaan ​​tijdens gewervelde neurulatie tussen de opperhuid en de neurale epitheel. Ze prolifereren en migreren veel door het ontwikkelende embryo en aanleiding geven tot een indrukwekkende verscheidenheid nakomelingen celtypen, waaronder bot / kraakbeen, het craniofaciale skelet, sensorische zenuwen, Schwann cellen, melanocyten, gladde spiercellen, enterische neuronen, autonome neuronen, chromaffinecellen , cardiale septum cellen, tanden en bijnier / schildklier kliercellen ^6. Aldus NC cellen een aantrekkelijk celtype voor het veld stamcel en belangrijk voor demodellering van een verscheidenheid van ziekten, zoals de ziekte van Hirschsprung ^7, familiale Dysautonomia ⁸ en kanker zoals neuroblastoma ^9. Bovendien bieden zij de mogelijkheid aspecten van menselijke embryonale ontwikkeling in vitro bestuderen.

De momenteel beschikbare en schaal toegepast in vitro differentiatie protocol voor de afleiding van NC cellen van hESCs ^10,11 is maximaal 35 dagen van differentiatie en het gaat neurale inductie stromale feeder-cellen zoals MS5 cellen en derhalve uitgevoerd onder slecht gedefinieerde omstandigheden. Hoewel het kan worden opgeschaald tot grote hoeveelheden NC te genereren, zoals vereist voor hoge-doorvoer screening van geneesmiddelen ^4, dit is arbeidsintensief en kostbaar. Bovendien vereist handmatige passage van neurale rozetten, die moeilijk te reproduceren zijn en is dus onderhevig aan totale variabiliteit, met name wanneer het wordt toegepast op een grote verscheidenheid van hESC of hiPSClijnen. Hier wordt de stapsgewijze afleiding van NC cellen per 18 dagen protocol dat zonder voedercellen weergegeven. Deze methode is korter en gedefinieerd dan de momenteel gebruikte protocol. Bovendien is zeer robuust genereren NC cellen tussen verschillende hiPSC lijnen. Belangrijk is, wordt aangetoond dat de NC-cellen leverde door beide protocollen ontstaan ​​op de grens van neurale rozetten (hierna genoemd rozet-NC of R-NC). De cellen afgeleid met behulp van een van de twee protocollen kijken morfologisch identiek, drukken zij dezelfde NC markers en cluster samen in microarray analyse. NC cellen afgeleid met behulp van het nieuwe protocol (R-NC) zijn functioneel, vergelijkbaar met NC cellen afgeleid met behulp van het oude protocol (MS5-R-NC), zodanig dat ze kunnen migreren en verder differentiëren tot neuronen. Derhalve kunnen de cellen gelijktijdig worden gebruikt met de MS5-R-NC cellen. De R-NC cel protocol voor de afleiding van NC cellen van hESC / IPSC nuttig zal zijn voor alle toepassingen van de hESC / IPSC technologie waarbij het NC geslacht zijn. </ P>

Protocol

1. Voorbereiding van Cultuur Media, Coated Schotels en onderhoud van hPSCs

1.1 Media voorbereiding

Opmerking: Filter alle media voor sterilisatie en opslag bij 4 ° C in het donker tot 2 weken. Reagens, bedrijfsnamen en catalogus staan ​​vermeld in de tabel Materials.

1. DMEM/10% FBS: Combineer 885 ml DMEM, 100 ml FBS, 10 ml Pen / Strep en 5 ml L-glutamine.
2. HES-medium: Combineer 800 ml DMEM/F12, 200 ml KSR, 5 ml L-glutamine, 5 ml Pen / Strep, 10 ml MEM minimum essentiële aminozuren oplossing, 1 ml β-mercapto-ethanol. Voeg 10 ng / ml FGF-2 na verfijning het medium.
   LET OP: β-Mercaptoethanol is giftig, vermijd inademing, inslikken en huidcontact.
3. KSR-differentiatiemedium: Combineer 820 ml Knockout DMEM, 150 ml KSR, 10 ml L-glutamine, 10 ml Pen / Strep, 10 ml MEM minimum essentiële aminozuren oplossing en 1 ml β-mercapto-ethanol.
4. N2-differentiatiop medium: Los 12 g DMEM/F12 poeder in 980 ml ​​dH ₂ O, voeg 1,55 g glucose, 2 g natriumbicarbonaat en 100 mg APO humaan transferrine. Meng 2 ml dH ₂ O 25 mg humane insuline en 40 ui 1 N NaOH, voeg de opgeloste oplossing aan het medium. Voeg 100 ul putrescine dihydrochloride, 60 pi seleniet, 100 ul progesteron en breng het volume tot 1 L met dH ₂ O.

1.2 Coating van kweekschalen

1. Matrigel coating: Dooi 1 ml bevroren matrigel aliquot door pipetteren 19 ml DMEM/F12 over de hoeveelheid totdat het is opgelost. Verwijder de bosjes door het door een 40 um cel zeef en plaat 8 ml/10 cm schotel. Incubeer de gerechten voor 1 uur bij kamertemperatuur. Zuig het Matrigel onmiddellijk vóór het uitplaten van de cellen.
   Opmerking: Werk snel met matrigel omdat het kan klonteren bij temperaturen boven 4 ° C.
2. PO / Lam / FN coating: Voeg 10 ml 1x PBS met 15 pg / ml Poly-L Ornithin hydrobromide een 10 cm schotel. Incubeer de schotel een nacht bij 37 ° C. Was platen met 1x PBS eens en voeg 10 ml per 10 cm schotel van 1x PBS met 2 ug / ml muis Laminin-I en 2 ug / ml fibronectine. Incubeer de schotels een nacht bij 37 ° C. Voordat plating de cellen, de oplossing volledig te verwijderen en laat de platen drogen bij kamertemperatuur gedurende 15-20 minuten door op te staan ​​ze op de weefselkweek kap muur zonder het deksel op.
   Opmerking: De gerechten zijn volledig droog en klaar voor mobiele plating wanneer men kristalstructuren kan zien op het oppervlak (zichtbaar met het blote oog). De platen kunnen bij kamertemperatuur worden bewaard gedurende een paar uur in de droge toestand. PO / Lam / FN gerechten hebben 2 dagen van tevoren worden voorbereid. In noodgevallen kan Lam / FN worden gedurende slechts 2-4 uur. Dit kan echter het risico suboptimale differentiatie / survival resultaten.

1.3 Onderhoud van hPSCs

Opmerking: hPSCs worden gehandhaafd op 0,1% gelatine en mitotisch geïnactiveerd muis embryonale fibroblasten (MEF) HES-medium aangevuld met 10 ng / ml FGF-2 zoals eerder beschreven ^10,12. De cellen moeten worden gesplitst om de 6-8 dagen.

1. Bekleed een 10 cm schaal met 8 ml 0,1% gelatine (in 1x PBS zonder calcium of magnesium) bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
2. Ontdooi bevroren MEF snel in een 37 ° C waterbad. Voeg 1.000.000 MEF tot 10 ml DMEM/10% FBS.
3. Zuig de gelatine en de plaat van de cellen. Incubeer bij 37 ° C gedurende ten minste 6 uur.
4. Zuig het DMEM/10% FBS uit de voorbereide MEF plaat, wassen plaat met 1x PBS eens en voeg 10 ml HES-medium aangevuld met 10 uM Y-27632 dihydrochloride. Het medium laten warmen bij 37 ° C gedurende 20 minuten.
   Opmerking: Voor handmatige splitsing van hPSCs een laminaire stroming kap met een ingebouwde microscoop wordt gebruikt. Echter, kunnen de cellen worden gepasseerd behulp van geschikte alternatieve methoden.
5. Onder een laminaire stroming kap met een ingebouwde microscoop, los aparte kolonies behulp van een mobiele tillift en laat ze zweven.
6. Gebruik een1 ml spuit met de drijvende kolonies te zuigen en dezelve op de verse, warme MEF plaat. Breng ongeveer een kwart van de cellen om de nieuwe schotel. Incubeer bij 37 ° C.
7. Feed cellen dagelijks met verse HES medium.

2. Plating van hPSCs voor differentiatie

Opmerking: hPSCs te splitsen of bedekt differentiatie bij de kolonies groot, maar nog scherpe randen met zo weinig mogelijk differentiëren cellen bij hun grenzen (zie figuur 1B). Wanneer de cellen worden gehandhaafd met handmatige passage de kolonies groot genoeg om gemakkelijk zichtbaar oog. Om het juiste gevoel voor dit tijdstip te krijgen kan men een aparte HPSC gerecht voor twee weken te handhaven zonder passage van en kijken naar de cellen te bereiken en passeren het ideale tijdstip voor passage / differentiëren hen.

1. Bereid 10 cm schalen met matrigel 1 uur voor aanvang van de differentiatie. Succesvolle Matrigel coating kan wordengeverifieerd 4x vergroting.
2. Wanneer de hPSCs klaar te verdelen, zuig het medium en voeg 4 ml van 0,05% trypsine-EDTA op de cellen.
3. Schud de schotel horizontaal gedurende 2 minuten krachtig totdat men de MEF zien als enkele cellen tillen de plaat onder de microscoop. De HPSC kolonies bevestigd blijven als kolonies.
4. Onmiddellijk en grondig, zuig het trypsine en laat de plaat staan ​​bij kamertemperatuur gedurende 2-4 minuten.
5. Voeg 2 ml van HES-medium op de plaat en het gebruik van een P1000 pipet, los van de cellen.
   Opmerking: Als de cellen niet gemakkelijk kan worden gelicht, kan de plaat leeg worden geïncubeerd bij kamertemperatuur gedurende nog 2-3 min.
6. Breng de cellen 8 ml HES-medium aangevuld met 10 pM Y-27632 dihydrochloride.
7. Zuig het matrigel van een eerder bereide 10 cm schotel. Plaat de cellen bij een 1:1 of 1:2 (bijvoorbeeld: De cellen ve 10 cm schotel zijn verdeeld in twee schalen van 10 cm) op de Matrigel plaat. Incubeer bij 37 °C 's nachts.
   Opmerking: Deze laag dient daarbij op ongeveer 100.000 cellen / cm ^2.

3. Inductie van neurale differentiatie

Opmerking: Het onderscheid kan worden gestart (dag 0) als de cellen 90-100% confluent (zie figuur 1C), meestal de volgende dag. Als de nauwkeurige confluentie nog niet is bereikt, kunnen de cellen dagelijks worden gevoed met HES-medium tot ze klaar zijn voor differentiatie. Als alternatief kan het oorspronkelijke aantal cellen uitgeplaat verhoogd.

1. Op dag 0-3, voeden de cellen dagelijks met 10 ml per 10 cm schotel KSR-differentiatie medium dat 0,1 uM LDN193189 en 10 uM SB431542.
2. Op dag 4 en 5-feed van de cellen met 75% KSR-differentiatie medium en 25% N2-differentiatiemedium zowel met LDN193189 en SB431542.
3. Op dag 6 en 7-feed van de cellen met 50% KSR-differentiatie medium en 50% N2-differentiatiemedium zowel met LDN193189 en SB431.542.
4. Op dag 8 en 9 voeden de cellen met 25% KSR-differentiatie medium en 75% N2-differentiatiemedium zowel met LDN193189 en SB431542.
5. Op dag 9 en 10 te bereiden PO / Lam / FN gerechten zoals aangegeven in 1.2.2 replating van de cellen op dag 11.
6. Op dag 10-feed cellen met N2-differentiatie medium dat LDN193189 en SB431542.

4. Replating in Druppels voor NC Specificatie

1. Op dag 11 verzamelbak Lam / FN uit de eerder bereide platen en laat ze drogen bij kamertemperatuur gedurende 20-30 minuten, zoals beschreven in 1.2.2.
2. Verwijder medium uit de differentiërende cellen, was de cellen eenmaal met 1x PBS en voeg 8 ml accutase/10 cm schotel. Incubeer gedurende 20 minuten bij 37 ° C.
3. Gebruik van een mobiele tillift, los van de cellen en resuspendeer ze in Accutase met een pipet 5 ml. Breng de suspensie naar een 15 ml buis.
4. Voeg 5 ml 1x PBS en spin de cellen gedurende 5 minuten bij 114 x g.
5. Resuspendeer de cellen in 10 ml 1x PBS. Om een ​​enkele celsuspensie te waarborgen, te filteren door een 40 um cel zeef en tel de cellen met een hemocytometer of gelijkwaardige techniek.
6. Draai de cellen af ​​en resuspendeer ze in N2-differentiatie medium dat 200 uM ascorbinezuur (AA), 20 ng / ml BDNF, 100 ng / ml FGF8, 20 ng / ml SHH, 10 pM Y-27632 dihydrochloride in een concentratie van 100.000 -150.000 cellen/10 pi.
7. Met behulp van een repeat-pipet, plaat 10 pl druppels dicht bij elkaar, zonder ze aan te raken op de gedroogde PO / Lam / FN 15 cm schalen.
   Opmerking: Een 10 cm schotel van gedifferentieerde cellen leidt normaal tot ongeveer 2-3 keer 15 cm schalen of ongeveer 100 x 10 pl droplets/15 cm schotel.
8. Laat de druppels staan ​​bij kamertemperatuur gedurende 20-30 minuten, daarna voorzichtig (de druppeltjes niet te verstoren) 30 ml N2/AA/BDNF/FGF8/SHH/Y en incubeer bij 37 ° C.
9. Op dag 12, zorgvuldig voeden de cellen met 20 ml/15 cm schotel N2/AA/BDNF/FGF8/SHH.
10. Van day 14-17 voeden de cellen elke tweede of derde dag met N2/AA/BDNF/FGF8.
11. Op dag 16 en 17 voor te bereiden PO / Lam / FN platen om NC cellen replate na FACS sortering.

5. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) van NC cellen

Opmerking: De voorbereiding van de cellen voor FACS vereist ongeveer 2 uur.

1. Op dag 18 verwijderen medium, was de cellen eenmaal met 1x PBS in de schaal en voeg 12 ml Accutase. Incubeer de cellen gedurende 20 minuten bij 37 ° C.
2. Gebruik van een mobiele tillift, los van de cellen van het oppervlak en laat ze zweven. Pipetteer de cellen in suspensie met een pipet 5 ml, overbrengen naar een 50 ml buis en voeg 30 ml 1x PBS. Draai de cellen gedurende 5 minuten bij 114 x g.
3. Met een pipet P1000, resuspendeer de cellen in 1 ml 2% FBS / HBSS (de HBSS bevat 15 mM HEPES). Voeg 19 ml 2% FBS / HBSS en filtreer de cellen door een 40 urn zeef cel een enkele celsuspensie te waarborgen. Incubeer de cellen op ijs gedurende 15 min voor antilichamen blokkeren en vervolgens tel ze met behulp van een hemocytometer.
4. Draai de cellen af ​​en resuspendeer ze bij een concentratie van 10 miljoen cellen / ml in 2% FBS / HBSS.
5. Zet opzij 1.000.000 cellen elk voor de ongekleurde, single-gekleurd (HNK-1 en alleen p75) en secundair antilichaam gekleurd alleen (APC alleen en 488 alleen) FACS controleert.
6. Voeg 5 ul van HNK-1 en 5 pl p75 primair antilichaam per 10 miljoen cellen in 1 ml suspensie op de juiste monsters en incubeer gedurende 20 minuten op ijs.
7. Was de cellen in 10 ml 1x PBS (centrifugeer 5 min bij 114 xg) en resuspendeer de cellen in 1 ml 2% FBS / HBSS. Voeg 2 pi van APC en 1 pi 488 secundair antilichaam per 10 miljoen cellen in 1 ml suspensie op de juiste monsters en incubeer gedurende 20 minuten op ijs in het donker.
   Opmerking: APC en 488 zijn de secundaire antilichamen hier voor de HNK-1 en p75 kleuring respectievelijk.
8. Was de cellen in 10 ml 1x PBS tweemaal resuspendeer 10 miljoen cellen in 500 ui2% FBS / HBSS met DAPI (bij 0,5 ng / ul) of alternatieve geschikte levende cellen vlek om dode cellen te sluiten van de FACS-analyse.
9. Breng de monsters naar FACS buizen eigenen.
10. Bereid FACS buizen met 0,5 ml 2% FBS / HBSS voor mobiele collectie.
    Opmerking: De cellen en de collectie buizen worden op ijs in het donker gehouden tijdens het sorteren van de tijd.
11. Gebruik van een mobiele sorteermachine met lasers die kan detecteren DAPI, APC en 488 sorteer DAPI-/HNK-1 + / P75 + dubbele positieve cellen.
    Opmerking: Bereiding tijd en behandeling van de cellen leidt tot een klein percentage celdood, DAPI dode cellen kleurt alleen toestaat en daarmee voor deze cellen uit de gesorteerde populatie worden uitgesloten. Elke alternatieve live / dead vlek werkt net zo goed voor dit doel. DAPI zelf niet cytotoxiciteit veroorzaken in de levende cellen bevolking.

6. Replating van gesorteerde cellen, NC onderhoud en uitbreiding

Opmerking: FACS gesorteerde cellen moeten met de handleidde met speciale zorg voor een optimale overleving te verzekeren. Houd ze op ijs tot opnieuw platen hen. Niet vortex of pipet ze hard. De cellen kunnen worden gesuspendeerd in door de buis.

1. Na FACS sortering, tellen de NC cellen, dan draaien ze op en resuspendeer in N2-differentiatie medium aangevuld met 10 ng / ml FGF2, 20 ng / ml EGF en 10 uM Y-27632 dihydrochloride in het juiste volume te replate bij 30.000 cellen / 10 ul druppels.
2. Goed droog eerder bereide PO / Lam / FN platen en plaat ongeveer 50-70 druppels per 10 cm schotel. Laat de gerechten staan ​​bij kamertemperatuur gedurende 20-30 minuten.
3. 20 ml/10 cm schotel van N2/FGF2/EGF/Y-27632 zeer zorgvuldig toe te voegen zonder de druppels. Incubeer de cellen bij 37 ° C.
4. Voeden de cellen om de 2-3 dagen met N2/FGF2/EGF.
   Opmerking: NC cellen worden uitgebreid of gepasseerd ongeveer om de 4-5 dagen of wanneer ze beginnen opstapelen binnen de druppels.
5. Om de passage van de NC cellen, verwijder het medium, wash de cellen eenmaal met 1x PBS en voeg 8 ml accutase/10 cm schotel. Incubeer gedurende 20 minuten bij 37 ° C.
6. Pipetteer de cellen van de plaat met behulp van een pipet 5 ml en overbrengen naar een 15 ml buis. Voeg 6 ml 1x PBS.
7. Draai de cellen gedurende 5 minuten bij 114 x g.
8. Resuspendeer de cellen in N2-differentiatie medium aangevuld met 10 ng / ml FGF2, 20 ng / ml EGF en 10 uM Y-27632 dihydrochloride om 20.000 cellen/10 ul druppel hebben.
9. Replate de cellen in 10 pl druppels op gedroogde PO / Lam / FN platen. Laat de gerechten staan ​​bij kamertemperatuur gedurende 20-30 minuten.
10. Voeg 20 ml/10 cm schotel van N2/FGF2/EGF/Y-27632 zorgvuldig. Incubeer bij 37 ° C.
    Opmerking: NC cellen kunnen worden gehandhaafd of uitgebreid tot 2 weken als een relatief homogene populatie voorlopercellen. Langere cultuur kan ertoe leiden dat ze differentiëren in verschillende celtypes nageslacht.

Representative Results

De twee belangrijkste verbeteringen van de R-NC-protocol over de MS5-R-NC-protocol ¹¹ zijn de feeder-vrij, gedefinieerd differentiatie voorwaarden en de algemene verkorting van de eis. MS5 feeder cellen ¹³ zijn muriene beenmerg afgeleide stromale cellen is aangetoond dat neurale differentiatie steun van hESCs ^14. HESCs gekweekt op MS5 feeder-cellen bij lage dichtheid vorm epitheel en neurale structuren rozetten ^15, aan de omtrek waarvan NC cellen ontstaan ^​​10, waardoor nabootsen vroege menselijke neurale ontwikkeling. Het is echter niet duidelijk welke signalerende moleculen en groeifactoren vrijkomen uit MS5 voedercellen. Daarom worden de differentiatie omstandigheden slecht gedefinieerd, waardoor het moeilijk te reproduceren terugkerende experimenten en over HPSC lijnen. Voor voldoende neurale inductie, hESCs moeten worden gezaaid met lage dichtheid in kleine kolonies op MS5 feeder cellen, complicatiesTing up-scaling en het bereiken van hoge opbrengsten van gedifferentieerde cellen. In 2009, werd een methode ontwikkeld die gericht zijn op neuralizing hPSCs zeer efficiënt ^12. Bij deze werkwijze hPSCs worden gezaaid met een hoge dichtheid, in monolagen bij afwezigheid van MS5 voedingscellen, het bereiken van hoge opbrengsten van neurale inductie bij 10 dagen. We volgden de regeling van deze methode in het aanpassen van de MS5-R-NC differentiatie protocol (Figuur 1A). HPSCs gekweekt in kolonies op MEF (Figuur 1B) zijn verspreid en gezaaid op matrigel als enkele cellen in een monolaag cultuur bij hoge dichtheid (figuur 1C). Op dag 11 van differentiatie, heeft de meerderheid van de cellen met succes neuralized (Pax6-positieve, niet afgebeeld ^12). Opnieuw uitplaten van de cellen bij hoge dichtheid in druppeltjes maakt de vorming van gecondenseerde neurale rozetten in de druppel (figuur 1D en figuur 2). NC cellen ontstaan ​​aan de grenzen van neurale rozetten (figuur 1D </ Strong>) en migreren van de druppel (figuur 1E). Na 7 dagen van verdere kweek NC cellen kunnen worden geïsoleerd door FACS-sortering. HNK-1/p75 dubbele positieve NC cellen kunnen worden geïsoleerd aan de efficiëntie van 20-40% (Figuur 1F). Dit protocol vereist 18 dagen, terwijl de MS5-R-NC protocol vereist tot 35 dagen, waardoor de R-NC cel protocol nuttiger voor verschillende stroomafwaartse toepassingen.

Het doel van dit werk is NC te genereren in een kortere, meer reproduceerbaar en goedkoper protocol, waarbij dezelfde cellen als het oude NC protocol. We hebben dit nieuwe protocol worden gebruikt om minstens 10 hESC en hiPSC lijnen afkomstig van patiënten en gezonde controles (gegevens niet getoond) met succes te onderscheiden, waaruit blijkt solide reproduceerbaarheid van het protocol over verschillende HPSC lijnen. Het nieuwe protocol bespaart kosten door het gebruik van LDN versus noggin, minder gebruik van SHH en het ontbreken van MS5 productiekosten. Het nieuwe protocol duurt 18 dagen in vergelijking met 35 dagens in het oude protocol, waarvan ongeveer 5 voedingen en dus de bijbehorende media kosten bespaart. Om te onderzoeken of het product met de twee protocollen cellen soortgelijke identiteit tonen we NC celontwikkeling in beide protocollen volgens hetzelfde differentiatie patroon (figuur 2). De cellen gaan door een neuraal rozet podium en opleveren NC cellen met identieke morfologie na FACS sortering. De kleinere omvang van de neurale rozetten in het nieuwe protocol vergeleken met de oude protocol door de hoge celdichtheid na opnieuw platen op dag 11. Daarentegen, in het oude protocol rozetten vormen binnen HPSC kolonies, die niet zijn gecondenseerd. NC cellen verkregen met de twee protocollen maken hetzelfde NC biologische markers, zoals HNK-1, AP2 en nestine. We analyseerden NC cellen gegenereerd met de twee protocollen op mondiaal niveau van genexpressie (figuur 3A) en vond dat NC cellen gegenereerd met de twee protocollen nauw samen clusteren. NC cellen die generated door activatie van de Wnt-signaalroute (wnt-NC) en werden de mogelijkheden van het genereren melanocyten ^16, cluster afzonderlijk wanneer geanalyseerd met globale genexpressie geeft aan dat dit een ander NC populatie zijn. We hebben inderdaad niet melanocyt progenitorcellen in vitro genereren van R-NC of MS5-R-NC-cellen (gegevens niet getoond) zijn. Evenzo, neuro-cellen (LSB), gedifferentieerd voor 10 dagen in LDN193189 en SB431542 alleen tonen een duidelijk onderscheiden genexpressiepatroon. Neuro cellen vroege voorlopers van het zenuwstelsel, en zijn dus minder gedifferentieerd vergelijking met NC cellen en worden hier als een negatieve controle omvatte. Om te beoordelen of de R-NC cellen hier gegenereerd lijken op de cellen die met de oude protocol tonen we de migratie vermogen in een in vitro scratch test (Figuur 3B). 48 uur na het krassen een samenvloeiing goed gesorteerde R-NC cellen, de cellen migreren in de scratch succes. Tenslotte laten we zien dat R-NC cellen de potentie om te differentiëren tot cellen van het autonome zenuwstelsel. De cellen werden spontaan gedifferentieerd voor 4 dagen na HNK1 + / P75 + FACS en gekleurd voor Mash1 en Tuj1, genen die worden uitgedrukt in autonome neuronen (figuur 3C).

Figuur 1. Kritische stappen van de R-NC differentiatie protocol. Een. MS5-R-NC ^10,11 en R-NC differentiatie protocol regeling. De differentiatie stappen van de beide protocollen worden getoond. MS5: feeder stromale cellen, KSR: KSR-differentiatiemedium, N2: N2-differentiatiemedium, LDN: LDN193189, SB: SB431542, S: sonic hedgehog, 8: FGF8, A: ascorbinezuur, B:. BDNF B. Toont ongedifferentieerde HPSC kolonies gekleurd met oktober-4 en DAPI vóór inductie van differentiatie. C. Geeft de celdichtheid (90-100% confluentie) op dag 0 van differentiatie, meestal 1 dag na plating hPSCs. D. Toont neurale rozetten gekleurd met PAX6 en opkomende NC cellen gekleurd met HNK-1 in de druppel. E. Toont dag 13 cellen opnieuw uitgeplaat op dag 11 in druppels en NC cellen die uit de rand van de druppel. F. Representatieve FACS sortering plot, tonen HNK-1/p75 dubbele positieve NC cellen op dag 18 van differentiatie. De poorten werden gekozen op basis van de ongekleurde en single bevlekt controles (niet getoond). FACS sortering percelen kunnen verschillen tussen experimenten, HPSC lijnen en het gebruik van de oude of nieuwe protocol in termen van het percentage van de dubbele positieve en enkele positieve cellen. Het is dus belangrijk om een ​​dubbele positieve populatie isoleren het zorgen voor de NC cellen worden geëxtraheerd. Afbeeldingen C tot en met F werden gegenereerd met behulp van de nieuwe R-NC-protocol.= "Https://www.jove.com/files/ftp_upload/51609/51609fig1highres.jpg" target = "_blank"> Klik hier voor een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 2. Vergelijkbare neurale lijst cel identiteit van de cellen die zijn afgeleid met de MS5-R-NC of de R-NC-protocol. In beide protocollen de cellen gaan door een neuraal rozet podium. Gesorteerd NC cellen zien er identiek door morfologie en door expressie van NC merkers zoals HNK-1 en AP2. NC cellen zijn nestine-positief, waaruit blijkt dat ze stamcellen. Schaal bar: 200 micrometer. Alle fluorescentie foto's zijn tegengekleurd voor DAPI. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 3. NC cellen gegenereerd met het oude en het nieuwe protocol hebben dezelfde identiteit. A. Unsupervised clustering van Illumina microarray genexpressie data vergelijken NC cellen, afkomstig van het MS5-R-NC en de R-NC-protocol. NC cellen, afkomstig van het MS5-R-NC of de R-NC-protocol op dag 35 of respectievelijk dag 18 werden in drievoud geanalyseerd door hybridisatie met een Illumina mens 12 oligonucleotide array. Data-analyse werd uitgevoerd met behulp van de Partek Genomic Suite-software. Significante verschillen werden gedefinieerd als die met een factor van verandering van meer dan 2 en minder dan 0,05 FDR. 1.421 genen werden geanalyseerd. Standaardinstellingen, zoals Euclidische monster ongelijkheid, gemiddelde koppeling cluster methode en 25 voor dendrogram lengte werden gebruikt. NC cellen geïnduceerd door het activeren van Wnt signaaltransductie (wnt-NC) werden opgenomen (de cellen waren differentiated in LDN193189 dag 0-3, SB431542 dag 0-4, CHIR99021 dag 0-11 en FACS gesorteerd op dag 11 voor SOX10) ^16. Deze cellen apart cluster van R-NC cellen, wat aangeeft dat wnt-NC cellen en R-NC cellen zijn verschillende populaties. Cellen gedifferentieerd voor 11 dagen LDN193189 en SB431542 opgenomen als neuro controle (LSB). R-NC en MS5-R-NC cellen cluster nauw samen in vergelijking met de controlecellen. Ruwe genexpressie gegevens beschikbaar over GEO (www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) toetreding #:. GSE50643 B. Migratie assay. HNK1 + / p75 + FACS gesorteerd R-NC cellen werden uitgeplaat op PO / Lam / FN in 96-wells handmatig krassen 24 uur later. De 0 hr foto is genomen onmiddellijk na krabben en na kleuring met Hoechst. De overige wells mochten migreren voor 48 uur voor de tweede foto werd genomen. Schaal bar: 200 micrometer C. Gesorteerd R-NC cellen liet men spontaan differentiëren 4 dagen en werden gekleurd voor MaSH1, Tuj1 en DAPI. Schaalbalk:. 500 pm Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Discussion

Voor de succesvolle differentiatie van R-NC cellen van hESC / hiPSCs de volgende overwegingen worden gemaakt. Het is cruciaal om te werken onder steriele kweek omstandigheden bewaard. In het bijzonder is het belangrijk HPSC culturen mycoplasmabesmetting testen geregeld, aangezien deze verontreiniging Succesvolle differentiatie belemmert, maar niet gemakkelijk visueel in HPSC kweken gedetecteerd. De R-NC differentiatie moeten bij 90-100% celdichtheid worden gestart; lagere celdichtheid beïnvloedt overleving van de cel en de efficiëntie van de R-NC differentiatie. Het is cruciaal om empirisch valideren optimale concentraties en partijnummer voor sommige reagentia, met name voor KSR op efficiënte NC differentiatie. Wanneer de cellen worden opnieuw uitgeplaat op dag 11 in druppeltjes, moet de celdichtheid in de 10 ul druppel hoog zijn en kan het best empirisch bepaald. Proper rozet-en NC-vorming hangt af van de juiste cel dichtheid binnen de druppel. We empirisch opmerved verhoogde celoverleving wanneer de cellen ten minste tweemaal na behandeling met Accutase gewassen. Voor de succesvolle isolatie van R-NC-cellen door FACS de juiste experimentele controles, zoals onbesmet, enkel antilichaam gekleurd en secundair antilichaam alleen gekleurde cellen zijn cruciaal. Dode cellen kunnen worden uitgesloten DAPI, 7-AAD of propidiumjodide kleuring. Bovendien moet antilichaam verdunningen empirisch worden bepaald voor elk specifiek antilichaam partij. Het is belangrijk FACS zuiveren R-NC-cellen door dubbele kleuring met HNK-1 en p75, aangezien enkele kleuring kan leiden tot verontreiniging van de NC bevolking ongewenste celtypes, zoals p75-positieve CNS-cellen, vroeg mesoderm of placode. In onze ervaring percentages van dubbele versus enkele gebrandschilderde populatie kan variëren tussen HPSC lijnen en differentiatie experimenten. R-NC celoverleving na FACS kan worden vergroot door het vermijden van harde pipetteren van de cellen, in plaats flicking de buis resuspendeer de cellen is wenselijk. Ook plating R-NC FACSgeïsoleerde cellen in geconditioneerd medium (gefilterd medium de cellen groeiden in voordat FACS) is aangetoond dat de overleving ¹¹ verbeteren. Het is raadzaam om het uitvoeren van een kleinere schaal differentiatie in parallel kunnen worden gekleurd met de neurale epitheel marker Pax6 op dag 11 en dag 14 efficiënte neutralisatie en rozet vorming garanderen. NC merkers, zoals HNK-1 en AP2 in de rozet podium voor goede NC differentiatie dient te worden geëvalueerd. Bovendien moet geïsoleerde R-NC cellen worden gevalideerd door de morfologie en kleuring voor NC merkers, zoals AP2, HNK-1 en nestine (figuur 2).

De afleiding van MS5-R-NC cellen van HPSC werd in 2007 beschreven door Lee et al.. ^10. Er werd aangetoond dat deze precursor populatie kan worden vermeerderd en verder gedifferentieerd in vitro in derivaten van de NC lijn. MS5-R-NC cellen kunnen spontaan worden onderscheiden met behulp van de neurale bol methode ^10,17of door gerichte in vitro differentiatie. Vastgesteld werd dat MS5-R-NC cellen teweeg kan brengen cellen van het perifere zenuwstelsel (autonome en sensorische neuronen), perifere glia (Schwann-cellen), myofibroblasten, mesenchymale stamcellen en hun nakomelingen en gladde spieren ^10. Transplantatie in kuiken en muizen toonde aan dat MS5-R-NC cellen migreren en differentiëren in vivo ^10. MS5-R-NC cellen zijn verder betrokken bij de modellering van menselijke ziekten. De karakteristieke fenotype van de genetische ziekte Familial Disautonomia (FD) werd gemodelleerd in vitro gebruik van patiënt-specifieke hiPSC-afgeleide MS5-R-NC cellen ^2. NC eigenschap fenotypes, zoals disfunctionele NC celontwikkeling en migratie werden in cellen afkomstig van FD patiënten, maar niet bij gezonde controlecellen. MS5-R-NC-cellen zijn ook gebruikt voor toxicologisch onderzoek van verbindingen die neurale migratie in menselijke embryonale vastgesteldontwikkeling, met het potentieel om de vrijlating van toekomstige geneesmiddelen die een negatieve invloed kunnen neurodevelopment voorkomen ^5. Een spannende toepassing van de HPSC technologie is high-throughput screening en het testen van farmaceutische behandelingen voor menselijke ziekten. MS5-R-NC-cellen werden gebruikt om het eerste scherm in een IPSC-gebaseerde ziektemodel, dwz Familial Dysautonomia ⁴ volbrengen. Dit scherm leidde tot de identificatie van nieuwe verbindingen die verder kunnen worden onderzocht in klinische onderzoeken.

Voor alle toepassingen van het veld HPSC is het essentieel om nauwkeurige, reproduceerbare, gedefinieerd en specifiek in vitro differentiatie protocollen beschikbaar hebben. In dit rapport, tonen we de aanpassing van een bestaande in vitro differentiatie protocol voor de afleiding van R-NC cellen van hPSCs. De gemelde protocol levert dezelfde cellen zoals eerder gemeld ¹⁰ in meer gedefinieerd kweekomstandigheden en een shorter tijdsbestek. Dit protocol kan worden gebruikt om R-NC cellen voor humane ziekten cellen van de stam NC, voor samengestelde screening, toxicologie testen en verdere ontwikkeling van gerichte differentiatie protocollen celtypen afkomstig van de NC lijn genereren.

Disclosures

De auteurs hebben geen conflicterende belangen te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door een beurs voor gevorderde onderzoekers van de Zwitserse National Science Foundation en door subsidies van NYSTEM (C026446, C026447) en de Tri-institutionele stamcel initiatief (Starr Foundation).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Gibco-Life Technologies	11965-092
Fetal Bovine Serum (FBS)	Atlanta Biologicals	S11150
DMEM/F12	Gibco-Life Technologies	11330-032
Knockout Serum Replacement	Gibco-Life Technologies	10828-028	Lot should be tested
L-Glutamine	Gibco-Life Technologies	25030-081
Penicinlin/Streptomycin	Gibco-Life Technologies	15140-122
MEM minimum essential amino acids solution	Gibco-Life Technologies	11140-050
β-Mercaptoethanol	Gibco-Life Technologies	21985-023	toxic
Recombinant human FGF basic (FGF2)	R&D Systems	233-FB-001MG/CF
Knockout DMEM	Gibco-Life Technologies	10829-018
DMEM/F12 powder	Invitrogen	12500-096
Glucose	Sigma	G7021
Sodium Bicarbonate	Sigma	S5761
APO human transferrin	Sigma	T1147
Human insulin	Sigma	I2643
Putriscine dihydrochloride	Sigma	P5780
Selenite	Sigma	S5261
Progesterone	Sigma	P8783
Matrigel matrix	BD Biosciences	354234
Poly-L Ornithin hydrobromide	Sigma	P3655
Mouse Laminin-I	R&D Systems	3400-010-01
Fibronectin	BD Biosciences	356008
Dispase in Hank's Balanced Salt Solution 5 U/ml	Stem Cell Technologies	7013
Trypsin-EDTA	Gibco-Life Technologies	25300-054
Y-27632 dihydrochloride	Tocris-R&D Systems	1254
LDN193189	Stemgent	04-0074
SB431542	Tocris-R&D Systems	1614
Accutase	Innovative Cell Technologies	AT104
Ascorbic Acid	Sigma	A4034
BDNF	R&D Systems	248-BD
FGF8	R&D Systems	423-F8
Mouse recombinant sonic hedgehog (SHH)	R&D Systems	464SH
HBSS	Gibco-Life Technologies	14170-112
HEPES	Gibco-Life Technologies	1563-080
Human recombinant EGF	R&D Systems	236EG
gelatin (PBS without Mg/Ca)	in house
Antibodies:
Anti HNK-1/N-Cam (CD57) mIgM	Sigma	C6680-100TST	lot should be tested
Anti-p75 mIgG1 (Nerve Growth factor receptor)	Advanced Targeting Systems	AB-N07	lot should be tested
APC rat anti-mIgM	BD Parmingen	550676	lot should be tested
AlexaFluor 488 goat anti-mouse IgG1	Invitrogen	A21121	lot should be tested
Anti Oct4 mIgG2b (used at 1:200 dilution)	Santa Cruz	sc-5279	lot should be tested
Material/Equipment:
Mouse embryonic fibroblasts (7 million cells/vial)	GlobalStem	GSC-6105M
Cell culture dishes: 10 cm and 15 cm plates, centrifuge tubes, FACS tubes,  pipettes, pipette tips
Glass hematocytometer
Cell culture centrifuge
Cell culture incubator (CO2, humidity and temperature controlled)
Cell culture laminar flow hood with embedded microscope
Cell culture biosafety hood
Cell sorting machine, i.e. MoFlo
Inverted microscope
1 ml TB syringe 27Gx1/2	BD Biosciences	309623
Cell lifter Polyethylene	Corning Incorporated	3008

References

1. Lee, G., Studer, L. Induced pluripotent stem cell technology for the study of human disease. Nat Methods. 7, 25-27 (2010).
2. Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461, 402-406 (2009).
3. Ebert, A. D., et al. Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient. Nature. 457, 277-280 (2009).
4. Lee, G., et al. Large-scale screening using familial dysautonomia induced pluripotent stem cells identifies compounds that rescue IKBKAP expression. Nat Biotechnol. 30, 1244-1248 (2012).
5. Zimmer, B., et al. Evaluation of developmental toxicants and signaling pathways in a functional test based on the migration of human neural crest cells. Environ Health Perspect. 120, 1116-1122 (2012).
6. Dupin, E., Sommer, L. Neural crest progenitors and stem cells: from early development to adulthood. Dev Biol. 366, 83-95 (2012).
7. McKeown, S. J., Stamp, L., Hao, M. M., Young, H. M. Hirschsprung disease: a developmental disorder of the enteric nervous system. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2, 113-129 (2013).
8. Slaugenhaupt, S. A., et al. Tissue-specific expression of a splicing mutation in the IKBKAP gene causes familial dysautonomia. Am J Hum Genet. 68, 598-605 (2001).
9. Cheung, N. K., Dyer, M. A. Neuroblastoma: developmental biology, cancer genomics and immunotherapy. Nat Rev Cancer. 13, 397-411 (2013).
10. Lee, G., et al. Isolation and directed differentiation of neural crest stem cells derived from human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25, 1468-1475 (2007).
11. Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. Derivation of neural crest cells from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 5, 688-701 (2010).
12. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27, 275-280 (2009).
13. Itoh, K., et al. Reproducible establishment of hemopoietic supportive stromal cell lines from murine bone marrow. Exp Hematol. 17, 145-153 (1989).
14. Barberi, T., et al. Neural subtype specification of fertilization and nuclear transfer embryonic stem cells and application in parkinsonian mice. Nat Biotechnol. 21, 1200-1207 (2003).
15. Elkabetz, Y., et al. Human ES cell-derived neural rosettes reveal a functionally distinct early neural stem cell stage. Genes Dev. 22, 152-165 (2008).
16. Mica, Y., Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. Modeling neural crest induction, melanocyte specification, and disease-related pigmentation defects in hESCs and patient-specific iPSCs. Cell Rep. 3, 1140-1152 (2013).
17. Molofsky, A. V., et al. Bmi-1 dependence distinguishes neural stem cell self-renewal from progenitor proliferation. Nature. 425, 962-967 (2003).

Tags

Neurowetenschappen embryonale stamcellen (SER) pluripotente stamcellen geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) neurale perifeer zenuwstelsel (PNS) pluripotente stamcellen neurale cellen, ziektemodel differentiatie protocol menselijke embryonale stamcellen pluripotente menselijke stamcellen