وتنص هذه المادة على بروتوكول لاستخراج السم من العناكب استخدام التحفيز الكهربائي ل1) إجراء توصيف بروتيوميك، 2) تنشيط غدة السم التعبير الجيني، و3) إجراء دراسات وظيفية من السموم. ويلي ذلك وصف لmicrodissections غدة السم للدراسات التعبير الجيني.
السموم هي كيميائيا إفرازات معقدة تتألف عادة العديد من البروتينات والببتيدات مع الأنشطة الفسيولوجية المختلفة. التوصيف الوظيفي للبروتينات السم له التطبيقات الطبية الحيوية الهامة، بما في ذلك تحديد من الخيوط المخدرات أو تحقيقات لمستقبلات الخلوية. العناكب هي معظم الأنواع كليد غنية من الكائنات الحية السامة، ولكن من السموم فقط عدد قليل من الأنواع وفهمها جيدا، ويرجع ذلك جزئيا إلى صعوبة المرتبطة بجمع كميات ضئيلة من السم من الحيوانات الصغيرة. تعرض هذه الورقة على بروتوكول لجمع السم من العناكب استخدام التحفيز الكهربائي، مما يدل على الإجراء على الأرملة السوداء الغربية (كوكب الزهرة الزوع). السم جمعت مفيد للتحليلات المصب متنوعة بما في ذلك التعرف المباشر البروتين عن طريق قياس الطيف الكتلي، المقايسات الفنية، وتحفيز التعبير الجيني السم للدراسات transcriptomic. هذا الأسلوب له ميزة على البروتوكولات التي ISOأواخر السم من الخليط الغدة بأكملها، والتي لا تفصل مكونات السم حقيقية من البروتينات الخلوية التي لا تفرز كجزء من السم. وتظهر نتائج ممثلة الكشف عن الببتيدات السم المعروف من العينة التي تم جمعها باستخدام مطياف الكتلة. ويعقب عملية جمع السم بأي بروتوكول لتشريح الغدد سم العنكبوت، وكانت النتائج تدل على أن هذا يؤدي إلى توصيف البروتينات والببتيدات وأعرب السم على مستوى التسلسل.
السموم هي إفرازات الحيوانات المحقونة في الغالب إلى حيوان آخر لأغراض الدفاع أو الافتراس، ولها أيضا تطبيقات البيولوجية الهامة ذات الأهمية الطبية الحيوية 1-3. فقط بعض الحيوانات تركب السم، ولكن إنتاجها على نطاق واسع في جميع أنحاء تصنيفيا اللافقاريات (مثل الكائنات المجوفة والقواقع المخروطية والعقارب، والعناكب) والفقاريات (مثل الثعابين، وبعض الأسماك والثدييات)، لأنها تطورت بشكل مستقل عدة مرات 1،4 . توصيف الكيمياء الحيوية من السموم عادة ما تظهر أنها تتألف من مجموعة واسعة من البروتينات والببتيدات، والتي تعمل بشكل كبير على الدورة الدموية والجهاز العصبي للحيوانات المحقونة لتسليم بسرعة السموم المكونة 1. وهناك نسبة ضئيلة من الحيوانات السامة قد تشكل خطرا على البشر، وخاصة الأنواع ذات التوزيعات synanthropic 5. وقد لعبت دراسة تكوين السم والأنشطة الوظيفية دورا هاما فيتوصيف وظيفي لمكونات الخلية الفقارية (خاصة القنوات الأيونية العصبية) 6 و في توضيح العمليات الخلوية الأساسية (مثل إفراز عصبي) 7. وعلاوة على ذلك، حدد الببتيدات السم لها خصائص مفيدة في سياقات الطبية الحيوية، بما في ذلك استخداماتها انها علاج لمرض السرطان وآلام 8،9، والملغومة ليؤدي المخدرات مرشح والتنمية للسم. السموم أيضا أن تلعب أدوارا بارزة في مجال البحوث البيئية والتطورية 1،4،10،11، وبالتالي جمع هذه الإفرازات الخطرة والعديد من المرافق العامة.
هناك> 40،000 الأنواع وصف العنكبوت (أمر الرتيلاوات)، ولكن كل واحدة من الأسر العنكبوت أكثر من 100 يقترن تمتلك غدد السم التي تنتهي في 12 الأنياب. تنوع الأنواع عالية من العناكب يوحي بأنها تمثل أكبر كليد من الكائنات السامة. ومع ذلك، وتوصيف الكيمياء الحيوية للسموم العنكبوت لديه لتتركز argely على عدد قليل من الأنواع في أغلب الأحيان المرتبطة التأثر بزعاف الحشرات البشري. دراسات البروتين وtranscriptomic الأخيرة من سموم العنكبوت تشير إلى أنها تحتوي عادة على العديد من البروتينات والببتيدات 2،13،14 فريدة من نوعها. التقدم في الإنتاجية العالية التسلسل [كدنا] وقياس الطيف الكتلي الببتيد البصمات قد سهلت كثيرا من اكتشاف هذه البروتينات 15 سم. ومع ذلك، يبدأ هذا العمل في جمع ما يكفي من السم و / أو غدد السم من العناكب، وثائق مفصلة عن هذه التقنيات هي قليلة (16).
تعرض هذه الورقة على بروتوكول لجمع السم والغدد السم من العناكب الأرملة السوداء، التي يمكن تطبيقها على العناكب ذات الحجم المماثل. جمع السم بشكل منفصل من الغدد يمكن تحديد البروتينات التي تفرز في السم بدلا من البروتينات أداء الوظائف الخلوية الأخرى. الأرامل السود وغيرهم Lيتم التعرف على الأنواع atrodectus على نطاق واسع على أنها من بين أخطر العناكب بسبب السم أعصاب عالية، والذي يسبب آلاما شديدة في البشر، والذي يترافق أحيانا التعرق الغزير، تقلصات العضلات، ارتفاع ضغط الدم، وصعوبة في التنفس وشلل غير مكتمل 5. بروتوكول جمع السم المقدمة هنا يستخدم التحفيز الكهربائي لتوصيل التيار الكهربائي إلى العناكب تخدير للحصول تقلصات العضلات والافراج عن السم. وتجمع قطرات السم بسرعة مع الشعيرات الدموية الصغيرة والاستغناء في أنابيب لتخزين الفريزر. لأن البروتوكول يتضمن إجراءات الخطرة، يجب فقط أن يتم تنفيذ ذلك من قبل الأفراد المدربين تدريبا جيدا وحثت الحذر في الخطوات الرئيسية. السم جمعت له العديد من الاستخدامات، مثل توصيف وعزل الجزيئات المكونة 2، لإجراء التجارب الفسيولوجية أو المقايسات الفنية 18، وإلى تحفيز التعبير الجيني 11 سم. ويخلص بروتوكول مع description من تشريح غدة السم والحفاظ مفيد لاستنساخ الجينات السم محددة، والتعبير عن التي ثبت حدوثها 2-3 أيام بعد نضوب سم العناكب في مختلف 10،11.
السموم تمثل مصدرا هاما للبروتينات رد الفعل من الناحية الفسيولوجية، والببتيدات والجزيئات الأخرى مع تطبيقات لاكتشاف المخدرات، فضلا عن الجوانب الأساسية للخليوي والبحوث البيئية 1-3. ومع ذلك، فإن مجموعة من السم، وخاصة من الحيوانات الخطرة أو صغيرة، هو مهمة صعبة. يوضح هذا البروتوكول كيف يمكن جمع السم والغدد السم من العناكب الأرملة السوداء، ويؤكد نجاح هذا النهج عن طريق الجمع بين التحليل MuDPIT من السم وقاعدة بيانات البروتين المشتق من cDNAs المستنسخة من السم الغدد 21. في حين أن هذا البروتوكول يعمل بشكل جيد للأرامل السوداء والعناكب متوسطة الحجم، وقد استخدمت تقنيات أخرى لجمع السم mygalomorph أكبر العناكب (مثل الرتيلاء)، مثل التطلع المباشر من السم من الأنياب في الزجاج الماصات على سبيل المثال، 24. وهذا النهج الأخير، ومع ذلك ، لن تعمل بشكل جيد لالعناكب الصغيرة الحجم التي لا aggressiهاء.
أحد الجوانب البالغة الأهمية وخاصة البروتوكول جمع السم الموصوفة هنا هي المراحل الأولية للإعداد وتعظيم الاستفادة من عملية جمع بحيث يصبح أكثر روتينية، بما يتفق وأسرع. بروتوكول يمثل تحديا في البداية لسيده، ولكن مع التجارب المتكررة، فإنه يصبح أسهل وأسرع. وحثت الحذر أيضا في كل المراحل الحرجة التي تنطوي على التعامل مع العناكب الخطرة، واستخدام التيار الكهربائي، والزجاج غرامة نقطة الشعيرات الدموية الدقيقة، وإبر حقنة. من المهم أن ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة مثل القفازات النتريل، معطف المختبر، والسراويل الطويلة والأحذية المغلقة، وكذلك النظارات عند تشكيل الشعيرات الدموية الدقيقة.
جانب آخر تحديا لجمع السم هو كمية صغيرة من السم التي تنتجها أي العنكبوت واحد، وخاصة الأنواع الزوع، والتي من المبالغ التي تم جمعها قد تكون لىmited إلى 1-2 ميكرولتر لكل فرد في أحسن الأحوال. الحصول على ما يكفي من السم لتطبيقات المصب، مثل البروتين والمواد الهلامية أو المقايسات الفنية قد تتطلب مزيج من السم من أفراد متعددين في أنبوب واحد. في مثل هذه الحالات، يجب فقط أن الجمع بين السم من الأفراد من نفس الجنس، مرحلة التخلق، وإعطاء السكان الاعتراف تقلب خنوثي، التنموي والجغرافي في بعض السموم 25 و 26. قد العناكب أيضا يحمل تباين كبير في كمية السم أنتجت بين الأفراد، حيث قد يعكس كميات أقل استنزاف مؤخرا للغدة. وبالتالي قد يكون من المستحسن لجمع السم بعد عدة أيام التغذية الآخيرة. إذا تم الإفراج السم قليلا، لا ينبغي أن يطبق التيار المفرط للعنكبوت، مما قد يتسبب في تمزق بشرة، مما يؤدي إلى تلوث السم مع الدملمف أو الموت.
تلوث عينات من سم العنكبوت مع سيوينبغي أيضا تجنب LK الإنسان أو مصادر من خلال استخدام معدات معقمة أو نظيفة. على الرغم من هذه التحديات، وجمع من السم النقي، وترك العنكبوت على قيد الحياة، هو أفضل من الأساليب التي تحصل السم من الخليط الغدة (التي لا فصل مكونات السم من البروتينات الخلوية الأخرى) وقتل العنكبوت. ومن الأهمية بمكان أيضا لضمان أن يتم تجميد العينات بسرعة لمنع تدهور البروتين.
استخراج السم يعزز إنتاج السم لاحقا، وبالتالي تحفيز السم التعبير الجيني في غدة السم. في وقت لاحق وهكذا، لأن هذا البروتوكول يسمح للالعناكب من أجل البقاء استنزاف السم، يمكن تشريح الغدد على عدة أيام (قتل العنكبوت) عند نقطة حيث من المتوقع أن تكون كافية للدراسات الجينية، مثل نسخة الاستنساخ 10،11 سم التعبير الجيني. يجب أيضا أن تؤخذ عدة احتياطات مهمة في تشريح غدة السم. وينبغي التركيز على استخدام المختبر equipmوالأنف والحنجرة والكواشف بحيث تكون خالية من RNases التي تحط من الحمض النووي الريبي. وبالتالي فمن المستحسن أن يمسح ملقط وغيرها من المعدات غير القابل للتصرف والسطوح مع الحلول التي تقضي على ريبونوكلياز الحمض النووي والتلوث. ينبغي إجراء التشريح في أسرع وقت ممكن والمجمدة مباشرة لزيادة ضمان سلامة الحمض النووي الريبي من الأنسجة. أخيرا، يجب فقط أن يؤديها على تشريح العناكب تخدير، بعد أن يتم فصل مقدمة الرأس والبطن بسرعة.
في الختام، تنص هذه المادة على بروتوكول التحقق من الحصول على العنكبوت السم السم والغدد. السم السم والغدد تسمح لعزل وتوصيف مكونات البروتين والببتيد وذلك باستخدام نهج البروتين وtranscriptomic. بالإضافة إلى ذلك، قد عينات السم تمثل نقطة الانطلاق من المقايسات الفنية، التي تحدد إمكانية الحيوية الطبية والدوائية من الجزيئات المكونة لها. ما يقرب من جميع العناكب تنتج السم، والغواص واسعةSITY مكونات السم توليفها من الأنواع الفردية يوحي وبعد أن اكتشف التنوع الهائل للجزيئات السم 13. وفقا لذلك، وهذا البروتوكول يوفر أدوات للتحقيق في مصدر غني من الجزيئات النشطة بيولوجيا الموجودة في سموم العنكبوت.
The authors have nothing to disclose.
أشكر الأشخاص التالية أسماؤهم لمساعدتهم في تطوير هذا البروتوكول: تشاك كريستنسن، غريتا بينفورد، اليكس ك لانكستر، كونراد Zinsmaier، وميس عماد. تم الحصول على بيانات قياس الطيف الكتلي والبروتينات التي البروتيوميات اتحاد أريزونا بدعم من منحة ES06694 NIEHS إلى SWEHSC، منحة CA023074 المعاهد الوطنية للصحة / NCI إلى AZCC ومعهد BIO5 من جامعة أريزونا. وقدمت التمويل لهذا العمل من المعاهد الوطنية للصحة (المعهد الوطني للطب العام) من المنح 1F32GM83661-01 و1R15GM097714-01 لجيسيكا E. غارب.
Nerve and muscle stimulator (electro-stimulator) | Grass Technologies | SD9 | http://www.grasstechnologies.com/products/stimulators/stimsd9.html |
Voltmeter | RadioShack | 22-223 | any generic voltmeter/multimeter can be substituted |
Pointed Featherweight Forceps | Bioquip | 4748 | |
Plasti Dip | Performix | Available at Ace Hardware | |
21 G X 1 1/2in Precision Glide hypodermic syringe needle | BD Medical | 305190 | |
Vacuum filter flask 1L | Nalgene | DS4101-1000 | smaller flask sizes may also work |
Buchner Two Piece funnel, 90 mm | Nalgene | 4280-0900 | |
5 microlitter Capillary Bores (Micro capillaries) | VWR | 53508-375 | |
Mounting putty strip | Loctite | Available at Ace Hardware | |
Fisherbrand* General-Purpose Extra-Long Forceps Length: 11-13/16 in. | Fisher | 10-316C | |
SSC Buffer, 20X (pH 7.0), Molecular Grade | Promega | V4261 | can be made from stock chemicals (150 mM NaCl, 15 mM sodium citrate) |
Eppendorf safe-lock tubes 0.5 mL tubes (cryogenic safe) | Eppendorf | 22363611 | |
Nalgene Dewar, 1L, HDPE, Liquid nitrogen benchtop flask | Thermo Scientific | 4150-1000 | |
Rnase Away | VWR | 53225-514 | |
Ultra Fine Tweezers (dissecting forceps) | EMS | 78310-0 | similar high-quality fine point forceps can be substituted |
Foot switch/pedal | Linemaster Switch Corp. | 491-S | |
Two-pronged extension clamp, with vinyl covered sleeves, 8.5 inches | VWR | 21570-007 | similar models could be substituted |
Clamp Holder | VWR | 89084-746 | similar models could be substituted, must accommodate diameter of extension clamp rod |
Magnetic base (holds extension clamp via clamp holder) | VWR | 300042-270 | similar apparatus able to securely hold extension clamp in fixed position may be substituted |
Plastic Collecting Vials (large/40 dram) | Bioquip | 8940 | |
Cotton sewing thread | Threadart.com | THRCOT9 | similar product could be substituted |