この記事では、プロテオミクス特性評価を実施し、1)順番に電気刺激を使用してクモから毒液を抽出するためのプロトコルを提供します2)毒液腺遺伝子発現を刺激し、そして3)毒の機能研究を行う。これは、遺伝子発現研究のための毒液腺microdissectionsの記述が続く。
毒は、化学的に、典型的には多様な生理活性を有する多数のタンパク質およびペプチドを含む複合体の分泌物である。毒液タンパク質の機能的特徴付けは、細胞受容体に対する薬物リードまたはプローブの識別を含む重要な生物医学的用途を有する。スパイダーは毒の生物のほとんどの種が豊富クレードですが、ほんの数種の毒は、小さな動物から毒の微量を集めることに伴う困難のために部分的には、よく理解されている。本論文では、西部ブラックウィドウ( ゴケグモ属のHesperusの )上の手順を実証し、電気刺激を使用してクモから毒液を収集するためのプロトコルを提示します。収集された毒は、質量分析を経由して直接タンパク質同定、機能アッセイ、およびトランスクリプトーム研究のため毒遺伝子発現の刺激を含む様々な下流の解析に有用です。この技術は、そのイソプロトコルよりも有利である毒の一部として分泌されない細胞タンパク質から本物の毒成分を分離しない全体腺ホモジネート、後半から毒液。代表的な結果は、質量分析を使用して採取された試料からの既知の毒ペプチドの検出を実証する。毒収集手順は、結果は、これは配列レベルでの毒 – 発現されたタンパク質およびペプチドの特性をもたらすことを実証して、クモ毒腺を切開するためのプロトコルが続く。
毒は主に捕食や防衛のために別の動物に注射し、動物の分泌物であり、また、生物医学関連性1-3との重要な生物学的なアプリケーションを持っている。唯一の特定の動物は毒を合成するが、それは進化して独立しているため、その生産は、無脊椎動物( 例えば 、刺胞動物、コーンカタツムリ、サソリ、クモ)および脊椎動物( 例えば 、ヘビ、いくつかの魚や哺乳類)全体の分類学的に広まっている複数回1,4 。毒の生化学的特徴付けは、典型的には、主に急速に構成毒素1を送達するために注入された動物の循環系および神経系に作用するタンパク質およびペプチドの多様な、から構成されて示されている。有毒動物のごく一部には、ヒト、synanthropic分布5で特に種に脅威を与えることがあります。毒組成および機能活性の研究が重要な役割を果たしてきました機能的な脊椎動物の細胞成分(特に、神経細胞のイオンチャネル)6の特性と基本的な細胞プロセスを解明する( 例えば神経分泌)7。また、選択毒ペプチドは、癌および疼痛8,9の治療としてのそれらの使用を含む生物医学の文脈において有用な特性を有する、候補薬物リードおよび抗毒素の開発のために採掘されている。毒はまた従って、これらの危険な分泌物の収集は多くのユーティリティを持って、生態学と進化の研究1,4,10,11において顕著な役割を果たしている。
そこに蜘蛛(クモ目秩序)の>4万説明し種があり、100以上のクモファミリーの1つを除くすべてが牙12で終端ペア毒腺を持っている。クモの高い種の多様性は、彼らが毒の生物の最大のクレードを表すことを示唆している。しかし、クモ毒の生化学的特徴付けは、Lを有しargely最も頻繁に人間毒物注入に関連した種の数が少ないに集中した。クモ毒の最近のプロテオミクスとトランスクリプトーム研究は、彼らは通常、多くのユニークなタンパク質およびペプチド2,13,14を含んで示している。高スループットcDNAの配列決定および質量分析ペプチドフィンガープリントの進歩は著しく、これらの毒タンパク質15の発見を容易にした。それにもかかわらず、このような作業は、このような技術のためのクモから十分な毒および/ または毒液腺の収集、および詳細なドキュメントで始まり、いくつかの16である。
本論文では、同様のサイズのクモに適用することができ、黒の未亡人のスパイダーからの毒と毒腺の収集のためのプロトコルを提示します。別々腺からの毒のコレクションは、他の細胞の機能を実行するタンパク質とは対照的に、毒液中に分泌されるタンパク質の同定を可能にする。黒い未亡人や他のL種atrodectus広く、時には多量の発汗、筋肉の収縮、高血圧、呼吸困難や斑状麻痺5が付属して、ヒトでの激しい痛みを引き起こす彼らの非常に神経毒性毒に起因最も危険なクモ、間にあるものとして認識されている。ここで紹介する毒収集プロトコルは、筋収縮と毒のリリースを引き出すために麻酔をかけ、スパイダーに電流を提供するために電気刺激を使用しています。毒滴が迅速にマイクロキャピラリーを用いて収集し、冷凍保存のためのチューブに分注される。プロトコルは危険な手順が含まれているので、それだけで十分な訓練を受けた個人によって行われるべきであると注意が重要なステップで付勢されている。収集された毒は、生理学的実験または機能アッセイ18のためのこのような構成分子2の特徴付け及び単離のような多くの用途を有し、そして毒遺伝子発現11を刺激すること。プロトコルはDESCRで締めくくり毒特異的遺伝子のクローニングに有用な毒液腺解剖と保存のiptionは、の発現が異なるクモ10,11における毒枯渇後の2-3日に起こることが示されている。
毒は、生理学的反応性タンパク質、ペプチドおよび薬物発見のための用途を有する他の分子の重要な供給源、ならびに携帯用や生態研究1-3の基本的な側面を表す。しかし、特に危険または小動物からの毒のコレクションは、困難な作業である。このプロトコルは、毒と毒腺が黒い未亡人のクモから採取することができる方法を示し、そして毒のMuDPIT分析と21腺毒液からクローン化cDNA由来タンパク質データベースとの組み合わせでこのアプローチの成功が確認される。このプロトコルは黒い未亡人や中規模のスパイダーに適していますが、他の毒収集技術は24、ピペットなどガラス内にそのような牙から毒の直接吸引などのより大きなmygalomorph(タランチュラ様)クモのために使用されてきた。この後者のアプローチを、しかし、aggressiされていない小さなサイズのスパイダーのためにうまく機能しませんVEの。
それはより多くのルーチン、一貫してより速くなるように、ここで説明毒収集プロトコルの一つの特に重要な側面は、収集プロセスの準備と最適化の初期段階である。プロトコルは当初、マスターするために挑戦されていますが、繰り返される裁判で、それが簡単かつ迅速になります。注意はまた、危険なクモの取り扱い、電流、細かい点ガラスマイクロキャピラリー、及び注射針の使用を含むすべての重要な位相で付勢されている。これは、マイクロキャピラリを整形する際にアイウェアとしてだけでなく、そのようなニトリル手袋、白衣、長ズボンと閉じた靴のような適切な個人用保護具を着用することが重要です。
毒コレクションに別の困難な局面は、収集された量は、Liとすることができるから、いずれかのクモ、特にゴケグモ属によって産生さ毒の少量であるせいぜい個体あたり1~2マイクロリットルにmited。そのようなタンパク質ゲルまたは機能的アッセイなどの下流のアプリケーションのために十分な毒を得ることは1チューブに複数の個人からの毒の組み合わせを必要とするかもしれない。このような場合には、毒は、同じ性別、個体発生段階の個体から組み合わされるべきであり、人口は、いくつかの毒25、26、intersexual発達および地理的変動の認識を与えられた。クモも少ない量の腺の最近の枯渇を反映している可能性が個体間で生成さ毒の量でかなりの変動を示すことができる。したがって、それは彼らの最後の給餌後に毒数日を収集することをお勧めかもしれません。少し毒が解除されると、過大な電流が血リンパや死と毒の汚染につながる、キューティクルが破裂する恐れがありクモに適用しないでください。
クモSiと毒のサンプルの汚染LKまたはヒト源も無菌またはクリーン機器の使用により回避されるべきである。これらの課題にもかかわらず、純粋な毒のコレクション、生きているクモを残して、(他の細胞タンパク質から毒成分を分離しないでください)とクモを殺す腺ホモジネートから毒液を得る方法に好適である。これはサンプルを迅速にタンパク質の分解を防ぐために凍結されることを保証するためにも重要である。
毒の抽出、それによって毒腺に毒遺伝子の発現を刺激する、後続の毒産生を促進する。クモ毒枯渇を生き残るためには、このプロトコルができるのでしたがって、それらの腺は毒遺伝子の発現は、例えば10,11をクローニングする転写物の遺伝子研究のために十分であると予想される時点で(クモを殺す)、数日後に解剖してもよい。いくつかの重要な注意事項も毒腺郭清に注意する必要があります。重点はラボを使用して配置する必要があり設備を導入ENTとRNAを分解RNaseを含まない試薬。したがって、RNaseおよびDNAの混入を排除するソリューションを鉗子やその他の非使い捨て機器や表面を拭くことをお勧めします。解離は、組織のRNAの完全性を確保するために可能な限り迅速かつ直接凍結として行われるべきである。彼らの頭胸部と腹部がすぐに分離した後、最終的に、解剖は、麻酔をかけスパイダーで実行する必要があります。
結論として、この記事では、クモ毒と毒腺を取得するために検証されたプロトコルを提供します。毒及び毒液腺およびトランスクリプトーム、プロテオームアプローチを用いて、それらのタンパク質およびペプチド成分の単離および特徴づけを可能にする。また、毒のサンプルは、その構成分子の生物医学的および薬理学的潜在性を決定する機能的アッセイの開始点を表すことができる。ほぼすべてのスパイダーは毒を生産し、幅広いダイバー個々の種によって合成毒成分をsityは毒分子の広大な多様性を示唆している13をまだ発見されています。したがって、このプロトコルは、クモの毒に存在する生物学的に活性な分子の豊富な供給源を調査するためのツールを提供します。
The authors have nothing to disclose.
チャック·クリステンセン、グレタBinford、アレックス·K·ランカスター、コンラートZinsmaier、そしてメイズイマド:私は、このプロトコルの開発における彼らの支援のために以下の個人に感謝します。質量分析およびプロテオミクスデータは、NIH / NCI助成金CA023074はAZCCへとアリゾナ大学のBIO5研究所が、SWEHSCにNIEHSグラントES06694でサポートされているアリゾナ州プロテオミクス·コンソーシアムに買収された。この仕事のための資金は、ジェシカE.服装への助成金1F32GM83661-01と1R15GM097714-01から国立衛生研究所(ゼネラル·国立医学研究所)から提供された。
Nerve and muscle stimulator (electro-stimulator) | Grass Technologies | SD9 | http://www.grasstechnologies.com/products/stimulators/stimsd9.html |
Voltmeter | RadioShack | 22-223 | any generic voltmeter/multimeter can be substituted |
Pointed Featherweight Forceps | Bioquip | 4748 | |
Plasti Dip | Performix | Available at Ace Hardware | |
21 G X 1 1/2in Precision Glide hypodermic syringe needle | BD Medical | 305190 | |
Vacuum filter flask 1L | Nalgene | DS4101-1000 | smaller flask sizes may also work |
Buchner Two Piece funnel, 90 mm | Nalgene | 4280-0900 | |
5 microlitter Capillary Bores (Micro capillaries) | VWR | 53508-375 | |
Mounting putty strip | Loctite | Available at Ace Hardware | |
Fisherbrand* General-Purpose Extra-Long Forceps Length: 11-13/16 in. | Fisher | 10-316C | |
SSC Buffer, 20X (pH 7.0), Molecular Grade | Promega | V4261 | can be made from stock chemicals (150 mM NaCl, 15 mM sodium citrate) |
Eppendorf safe-lock tubes 0.5 mL tubes (cryogenic safe) | Eppendorf | 22363611 | |
Nalgene Dewar, 1L, HDPE, Liquid nitrogen benchtop flask | Thermo Scientific | 4150-1000 | |
Rnase Away | VWR | 53225-514 | |
Ultra Fine Tweezers (dissecting forceps) | EMS | 78310-0 | similar high-quality fine point forceps can be substituted |
Foot switch/pedal | Linemaster Switch Corp. | 491-S | |
Two-pronged extension clamp, with vinyl covered sleeves, 8.5 inches | VWR | 21570-007 | similar models could be substituted |
Clamp Holder | VWR | 89084-746 | similar models could be substituted, must accommodate diameter of extension clamp rod |
Magnetic base (holds extension clamp via clamp holder) | VWR | 300042-270 | similar apparatus able to securely hold extension clamp in fixed position may be substituted |
Plastic Collecting Vials (large/40 dram) | Bioquip | 8940 | |
Cotton sewing thread | Threadart.com | THRCOT9 | similar product could be substituted |