En teknikk for å isolere cholangiocytes fra de ekstrahepatiske gallegangene av neonatal mus er beskrevet. Kanalene er omhyggelig dissekert, og cellene blir isolert ved utvekst i tykke kollagen geler. Denne metoden gir et nyttig verktøy for å studere ekstrahepatiske gallegang utvikling og patologi.
De intra-og ekstrahepatiske galleganger i leveren er utviklingsmessig forskjellige, og kan være forskjellig påvirket av visse sykdommer. Men forskjellene mellom intra-og ekstrahepatiske cholangiocytes, og mellom nyfødte og voksne celler, er ikke godt forstått.
Metoder for isolering av cholangiocytes fra intrahepatiske galleganger er godt etablert 1-4. Isolering av ekstrahepatiske duktale celler, spesielt fra den nyfødte, har ennå ikke blitt beskrevet, selv om dette ville være til stor nytte i å forstå forskjellene mellom forskjellige cholangiocyte populasjoner og i å studere sykdommer som galle atresi som synes å målrette de ekstrahepatiske kanaler. Beskrevet her er en optimalisert teknikk for å isolere både nyfødte og voksen mus ekstrahepatiske gallegang celler. Denne teknikken gir en ren cellepopulasjon med minimal forurensning fra mesenchymalceller som fibroblaster.
Dette method er basert på fjerning av ekstrahepatiske kanaler og galleblæren, etterfulgt av grundig disseksjon og skraping for å fjerne fett og fibroblast lag. Strukturer er forankret i tykke lag av kollagen og dyrket i omtrent 3 uker for å tillate utvekst av cholangiocytes i monolag, som deretter kan trypsinisert og på nytt belagt for eksperimentell bruk.
Opprinnelsen og utviklingen av intra-og ekstrahepatiske cholangiocytes er markant annerledes. Leveren utvikler seg fra en divertikkel i ventral forutgående endoderm fem. Hale regionen av divertikkel danner ekstrahepatiske galletreet, mens skallen genererer intrahepatisk galletreet fem. Intrahepatiske kanal cholangiocytes er avledet fra stamceller rundt ductal plate i peri portal regioner seks. Disse celler har evnen til å differensiere til enten hepatocytter eller cholangiocytes 6. Dette har betydelige kliniske implikasjoner gitt at cholangiopathies kan spesifikt mot en kategori av cholangiocytes. For eksempel, biliær atresi utgangspunktet påvirker ekstrahepatiske kanaler av den nyfødte, mens Alagille syndrom påvirker intrahepatiske kanaler.
Det finnes flere beskrivelser av isolering av intrahepatiske cholangiocytes og gallegang enheter fra mus og rotter. Isøkere har isolert enkeltceller ved kanal isolering og påfølgende utvekst, eller ved lever fordøyelse og antistoff trekk ned for cholangiocytes uttrykke markører spesifikke celleoverflate 1-4. Funksjonelle og polarisert gallegang enheter har blitt isolert av leveren fordøyelse og størrelse filtrering 7. Gallegang-enheter er i stand til å reagere på sekretorisk stimuli og demonstrere fluidsekresjon 7, mens isolerte cholangiocytes har vist seg å utvikle ductular strukturer in vitro 1,2. Begrensninger av disse metodene inkluderer behovet for spesialisert teknisk kompetanse og spesialutstyr for leverperfusjon med fordøyelsesenzymer. I tillegg er det en fare for forurensning med mesenchymale celler 3.
En fremgangsmåte for å isolere ekstrahepatiske gallekanal cholangiocytes, spesielt fra neonatale ekstrahepatiske galleganger, ikke tidligere er blitt beskrevet. Dette notatet skisserer en forenklet metode for å isolere neonatal ens vel som voksne ekstrahepatiske gallekanalceller ved høye nivåer av renhet. Denne teknikken vil gjøre det lettere å studere forskjeller mellom intra-og ekstrahepatiske cholangiocytes og forskning på mekanismer for sykdommer som galle atresi som involverer de ekstrahepatiske kanaler.
Beskrevet her er en teknikk for å isolere rene cholangiocytes fra de ekstrahepatiske gallegangene av mus til mus i alle aldre, inkludert nyfødte. Teknikken har den fordelen at ekstrahepatiske cholangiocytes kan studeres separat fra intrahepatic cholangiocytes, og kan legge til rette for studier for å identifisere viktige forskjeller mellom disse populasjonene av cellene. Vi har nylig publisert en studie som viser redusert flimmerhårene i ekstrahepatiske cholangiocytes isolert ved denne metoden, og smittet med rhesus…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne er takknemlige for Molecular Pathology og Imaging Core av UPenn NIDDK Center for Molecular Studies i fordøyelse og leversykdommer (P30 DK50306) for å få hjelp med bildebehandling. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra National Institutes of Health (R01 DK-092111) og fra Fred og Suzanne Biesecker Pediatric Liver Center (til RGW) og av et fellesskap fra barndommen Liver Disease Research and Education Network (til SK).
Name of Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
DMEM/F12 (1:1) | Gibco/ Life technologies | 11320-033 | 500ml, used in BEC media |
FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | 25 ml, used in BEC media |
MEM with non-essential amino acids | Gibco/ Life technologies | 11140-019 | 5 ml, used in BEC media |
Insulin-transferrin-selenium | Gibco/ Life technologies | 51300-044 | 5 ml, used in BEC media |
Na Pyruvate | Cellgro | 25-000-CL | 5ml, used in BEC media |
Chemically-defined lipid concentrate | Gibco/ Life technologies | 11905-031 | 5ml, used in BEC media |
Penicillin-Streptomycin | Cellgro | 30-002-CI | 5ml, used in BEC media and 500 ul in the isolation |
Gentamicin | Gibco/ Life technologies | 15750-060 | 0.2ml, used in BEC media and 500 ul in the isolation |
Ethanolamine | Sigma Aldrich | E9508-100ml | 0.13ml, used in BEC media |
MEM vitamin solution | Gibco/ Life technologies | 11120-052 | 5ml, used in BEC media |
Soybean trypsin inhibitor | Biowhittaker | 17-605E | 5ml, used in BEC media. Solvent is PBS, mix to 5mg/ml stock concentration |
L-glutamine | Cellgro | 25-005-CL | 5ml, used in BEC media |
Bovine pituitary extract | Gemini | 500-102 | 1.1ml, used in BEC media |
Dexamethasone | Sigma Aldrich | D4902 | 0.5ml, used in BEC media, Stock conc 393ug/ml dilute with ethanol |
3 3',5-triiodo-L-thyronine | Sigma Aldrich | T6397 | 0.5ml, used in BEC media, Stock conc 3.4 mg/ml dilute with ethanol |
Epidermal growth factor | millipore | 01-101 | 0.5ml, used in BEC media, 25ug/ml dilute with DMEM F12+1%BSA |
Forskolin | Sigma Aldrich | F6886 | 5ml, used in BEC media, use at stock concentration of 0.411mg/ml and dilute with DMSO |
Fungizone | Gibco/ Life technologies | 15290-018 | 1ml, used in BEC media and 500 ul in the isolation |
Rat-tail collagen | BD Biosciences | 354236 | variable depending on concentration of collagen |
PBS 10X | USB Corporation | 75889 | use at 10x, sterlie, used to make collagen, amount used depends on collagen concentration |
dH2O | N/A | N/A | sterile, used to make collagen, amount used depends on collagen concentration |
NaOH 10N | Fischer Scientific | ss255-1 | Dilute to 1N, sterile, used to make collagen, amount used depends on collagen concentration |
collagenase type XI from Clostridium histolyticum | Sigma Aldrich | C7657 | dilute in DMEM and sterile filter before use |
trypsin-EDTA (1x) 0.25% | Gibco/ Life technologies | 25200-056 | 3 ml, incubate max 10 minutes |
trypsin-EDTA (10x) 0.5% | Gibco/ Life technologies | 15400-054 | 3 ml, incubate max 10 minutes |
Dissecting microscope | Nikon | SMZ645 | Other models acceptable |
Light source (fiberoptic illuminator) | Schott-Fostec | Ace EKE LR 92240 | Other models acceptable |
12.5 cm straight iris scissors | Kent Scientific | Other models acceptable | |
6" non-serrated curved forceps with fine tips | Electron Microscopy Sciences | Other models acceptable | |
4" serrated stainless forceps with fine tips | Electron Microscopy Sciences | Other models acceptable |