Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Engineering
Click here for the English version

Engineering

Proton Transfer og proteinkonformation Dynamics i Lysfølsomme Proteiner af Time-løst Step-scan Fourier-transform infrarød spektroskopi

Published: June 27, 2014 doi: 10.3791/51622
Automatic Translation
1, 1
1Experimental Molecular Biophysics, Freie Universität Berlin

Abstract

Overvågning dynamikken i protonisering og protein backbone kropsbygning ændringer i funktionen af ​​et protein er et vigtigt skridt i retning af at forstå dens mekanisme. Protonering og konformationelle ændringer påvirker vibration mønster af aminosyresidekæder og peptidbindingen, henholdsvis, som begge kan probes ved infrarød (IR) forskel spektroskopi. For proteiner, hvis funktion kan være gentagne og reproducerbart udløst af lys, er det muligt at opnå infrarøde differensspektrene med (sub) mikrosekund opløsning over et bredt spektralområde ved hjælp af trin-scanning Fouriertransformation infrarød teknik. Med ~ 10 2 -10 3 gentagelser af fotoreaktion, at det minimale antal fuldføre en scanning på fornuftig spektral opløsning og båndbredde, kan støjniveauet i absorptionen differensspektrene være så lav som ~ 10 - 4, med tilstrækkeligt at følge kinetik protonering skifter fra en enkelt aminosyre. Laverestøjniveauer kan opnås ved flere data udjævning og / eller matematisk behandling. Mængden af ​​protein, der kræves til optimale resultater er mellem 5-100 ug, afhængigt af den anvendte stikprøveteknik. Med hensyn til yderligere krav, der skal koncentreres først i en buffer med lav ionstyrke og derefter tørret til dannelse af en film proteinet. Proteinet Filmen hydratiseres inden forsøget, enten med små dråber af vand eller under kontrolleret luftfugtighed. Den opnåede hydreringsniveau (g vand / g protein) er målt fra en IR-absorptionsspektrum. At udstille den teknik, vi studerede photocycle af lys-drevne proton-pumpe bakterierhodopsin i sin oprindelige lilla membran miljø, og af lyset ionkanal channelrhodopsin-2 opløst i vaskemiddel.

Introduction

For fuldt ud at belyse, hvordan proteiner udfører deres funktion, er det nødvendigt at måle dem, mens de arbejder, dvs langs en ​​reaktion sti, der ofte involverer en række mellemprodukter og udvider flere ordrer tid. Vigtige skridt af protein funktion ofte finder sted i mikrosekund at millisekund område 1, navnlig backbone konformationsændringer og proton overfører reaktioner i membranproteiner. Røntgenkrystallografi, nok den søjle i strukturel biologi, giver statisk (tidsgennemsnitlig) elektron tætheder fra godt diffracting protein krystaller, notorisk vanskeligt at vokse med membranproteiner 2. En 3D atommodel kan bygges baseret på elektron tætheder, skønt sjældent, herunder placeringen af ​​brintatomer. Bemærkelsesværdige fremskridt i tidsopløst røntgenkrystallografi, bygger enten på Laue diffraktion 3 eller på femtosekund X-ray pulser 4, tilføjer tidsdimensionen til høj strukturel information iherent til røntgenkrystallografi 5.. Men at afsætte tekniske og analytiske udfordringer, kan krystalgitter forringe backbone konformationsændringer og ændre protein dynamik, en uundgåelig mangel af metoder baseret på protein krystaller 5. Derfor er dynamiske aspekter af proteiner stadig bedst dækket af optiske metoder, som pioner ved flash fotolyse 6,7, dog med den generelle ulempe begrænset strukturel indsigt.

Fourier transformeret infrarød spektroskopi (FT-IR) kombinerer den tidsmæssige opløsning af optiske spectroscopies med en værdifuld følsomhed til protein struktur, sidste funktion udnyttes i utallige statiske strukturelle og funktionelle undersøgelser af membranproteiner 8-11. Især har FT-IR forskel spektroskopi vist sig at være et ideelt redskab til at studere små spektrale ændringer som et protein transitter fra en metastabil tilstand til en anden 12-19.

Studies om protein dynamik, bortset fra enkelt molekyle niveau 20,21, kræver en udløsende proces til synkronisering. En reaktion hensigtsmæssigt indledes hurtigt og ikke invasivt ved hjælp af lys, som udløser, som det gøres i studiet af proteiner med cykliske photoreactions. En stor udfordring er forbundet med tidsopløste studier er opnåelsen af ​​tilstrækkelig tidsopløsning samtidig opretholde en god spektral opløsning og passende signal-til-støj-forhold. Også vigtigt er at dække en tilstrækkelig bred spektrale og temporale rækkevidde. Time-løst trin-scan FT-IR spektroskopi excellerer i alle disse aspekter 22, med offentliggjorte eksempler dækker spektralintervaller så bred som 3,900-850 cm -1 og dynamik udvide ~ 9 ordrer af tid, med op til 3,5 cm -1 spektral og 30 ns tidsopløsning 23-28.

Fourier-transform IR spektrometre udvise reduceret støj og forbedret fotometrisk nøjagtighed over dispersivt dem 29. Howevis, i den normale hurtige scan optagemetode FT-IR-spektrometre lider tid opløsning begrænset til ≥ 5-10 msek som følge af den minimale tid den mobile spejl interferometer kræver at fuldføre en scanning. Med trin-scan teknik, i modsætning, er tidsafhængighed den dynamiske begivenhed afkoblet fra scanningen varighed interferometer. Kort fortalt, de mobile spejl bevæger sig i diskrete trin snarere end kontinuerligt scanning for at fuldføre en scanning. På hvert af disse trin for (mobil) spejl holdes fast og en forbigående registreres. Således er den tid, opløsning begrænset af stigningen tidspunktet for kviksølv-cadmium-Telluride (MCT) detektor, der er typisk i intervallet 10-100 nsek. I praksis stort dynamikområde af interferogram (indeholdende et intenst signal i centerburst og små signaler i vingerne), kræver for korrekt digitalisering af en analog / digital konverter (ADC) med så mange som 16-24 bits, hvilket fører til prøveudtagning satser ikke højere end ~ 200 kHz(5 mikrosekunder) 30. Nanosekund tid opløsning kan opnås ved at måle kun de ændringer i interferogram, for hvilke en 8-12 bit ADC er tilstrækkelig 23,31-33. Tekniske aspekter 30,34,35 og applikationer 36-38 af tidsopløst trin-scan er blevet diskuteret i detaljer andetsteds.

Formålet med nuværende bidrag er at give en protokol, der beskriver de praktiske tidsopløst trin-scan FT-IR-spektroskopi på lysfølsomme membranproteiner. Her er resultaterne af teknikken vist for prøveudtagning to metoder: transmissions-og svækkede total refleksion (ATR). Brugen af ATR er muligt at arbejde i nærvær af overskydende vand, som ikke kun sikrer fuld hydrering betingelser for protein, men også giver mulighed for akut kontrol af prøven pH og ionstyrke 49,50. Trin-scan eksperimenter er illustreret på to udvalgte systemer: bakterierhodopsin og channelrhodopsin-2.

39,40, hvilket gør det til det bedste forstået membranproteinet hidtil. Blandt de mange teknikker, der anvendes til studiet af bR funktionalitet FT-IR-spektroskopi har velsagtens udøvet en af ​​de største påvirkninger. Nemlig, har FT-IR spektroskopi været nøglen til at løse de involverede i proton overførsel over membranen grupper tegnede andetsteds 13,41,51.

Channelrhodopsin (CHR) er det første lys ionkanal findes i naturen 42,43. Lys excitation af CHR fører til forbigående åbning af en ion-kanal. Dens opdagelse afgjort vejen for udviklingen af optogenetics, hvor molekylære processer styres af lys 44,45. Chr tilhører, som BR, til familien af mikrobielle rhodopsins men i modsætning til BR, er meget mindre kendt om dets funktionelle mekanisme 52.. ChR2 kombinerer sin funktion som et ion kanal med proton-pumpe aktivitet 46,47. For nylig ansøgte vi tidsopløst trin-scan FT-IR spektroskopi til at løse intra-protein reaktioner proton transferreglerne og dynamikken i protein backbone kropsbygning ændringer i ChR2 48.

Protocol

1.. Generelle aspekter af prøven og Instrument Forberedelse

  1. Brug en kommerciel FT-IR spektrometer udstyret til tidsopløste trin-scan målinger. For de bedste resultater placere FT-IR spektrometer på toppen af ​​en vibration-afkoblet bord.
  2. Evakuere optik rum til et par mbar. Purge prøven rum med tør luft eller nitrogen.
  3. Placer en IR transparent materiale uigennemsigtigt for synlig stråling foran MCT detektor af FT-IR spektrometer. Denne forholdsregel er afgørende for at forhindre artefakter fra spændende laserpuls under step-scan eksperimenter. Bemærk: Vi bruger en germanium (Ge) vindue med en diameter på 25 mm. Dens høje brydningsindeks forårsager uønsket intensitet taber stort set undgået at bruge en Ge-filter med antireflekterende belægning.
  4. Afkøl MCT detektor Dewar med flydende kvælstof. Bemærk: Brugen af ​​solceller MCT detektorer er foretrukket frem photoconductives grund af deres lineær respons og dermed overlegen photometric nøjagtighed og baseline pålidelighed 31,53.
  5. Pre-koncentrere prøven anvendes til forsøgene til mindst 2 mg protein / ml i en buffer med lav (<20 mM) ionstyrke for at forhindre dannelse af saltkrystaller samtidig tørring af proteinet suspensionen til dannelse af en homogen protein film. For prøver, der bundfald, vaske / koncentrere dem ved at anvende ultracentrifugering (f.eks membranproteiner i et liposomer eller i cellemembranen patches). Brug centricons for korrekt cutoff for proteiner, der ikke sediment (f.eks vaskemiddel opløste membranproteiner).
  6. For optimale resultater brug: a) præparater protein som ren og aktiv som muligt; b) lipid / protein-forhold ≤ 3 i vægt for proteiner i cellemembranen patches eller rekonstitueres i liposomer; c) vaske / protein-forhold ≤ 1 i vægt for detergent solubiliseret proteiner. Undgå brug af rengøringsmidler eller lipider, hvis vibrationelle bånd overlapper de af proteinet (fx CHAPS).
    7. 2.. Udarbejdelse af Svækket totalreflekterende Eksperimenter på bakterierhodopsin

    1. Monter ATR tilbehøret ind i prøven rum i FT-IR spektrometer. Bemærk: Vi bruger en ZnSe / diamant ATR med 5 aktive refleksioner. Undgå halvledermaterialer såsom germanium eller silicium som intern refleksion element (IRE) i ATR tilbehør, da deres optiske egenskaber er påvirket af den spændende synlig laser.
    2. Måle en bred vifte (ca. 4,000-800 cm -1) energi spektret ved 4 cm -1 opløsning af ren IRE overflade ved konventionel hurtig-scan FT-IR spektroskopi. Brug dette spektrum som en reference spektrum at beregne absorptionsspektre på et senere tidspunkt.
    3. Dæk IRE overfladen af ATR med 20 pi af buffer, der bruges senere til at rehydrere prøven (fx 4 M NaCl og 100 mM NaPi ved pH 7,4). Mål IR absorption af bufferen.
    4. Fjern puffer og skylles IRE overflade with vand. Undgå at berøre overfladen. Fjerne resterende væske fra IRE overfladen af ​​en intens luftstrøm.
    5. Spred ~ 3 pi bakterierhodopsin (BR) i lilla membraner (~ 6 mg protein / ml i deioniseret vand) oven på IRE overflade (~ 0,2 cm2 areal). Tør protein suspensionen under en svag strøm af tør luft, indtil en film er opnået.
    6. Måle absorptionsspektret for den tørre film (se figur 1).
    7. Forsigtigt tilføje 20-40 pi af en buffer med høj ionstyrke til at rehydrere tør film (fx 4 M NaCl og 100 mM NaPi ved pH 7,4). Bemærk: Den høje ionstyrke forhindrer overdreven kvældning af membranen film, gør det muligt at bevare så meget protein som muligt tæt på den tastede overflade (figur 2).
    8. Dæk ATR holder med et låg for at forhindre vandfordampning. Eventuelt placere en cover-kappe forbundet til et kredsløbs bad indstillet til 25 ° C til temperaturstyring. For proteiner med lange photocycles (& #62; sekunder), kan temperaturkontrol øge baseline stabilitet.
    9. Mål en absorbansspektrum. Vurdere procentdelen af prøven resterende nær overfladen efter rehydrering af filmen ved at trække absorptionsspektrum buffer (figur 3).
    10. Bekræft stabilisering af filmen hævelse ved at optage absorptionsspektre på 5-20 minutters intervaller efter rehydratisering (Figur 4). Dette trin er valgfrit, men anbefales.

    3.. Udførelse Transmission Forsøg på vaskemiddel-opløst Channelrhodopsin-2

    1. Der tilsættes 10 pi ChR2 (~ 10 mg protein / ml) opløst i 5 mM NaCl, 5 mM HEPES (pH 7,4) og decyl-maltosid (DM) i midten af en BaF 2 vindue med en diameter på 20 mm. Spred det med hjælp af mikropipettespidsen til en diameter på 6-8 mm (protein overfladetæthed på ~ 200 pg / cm 2).
    2. Danne en film USIng en svag strøm af tør luft. For de bedste resultater, at filmen er homogen og har en diameter omtrent svarende til størrelsen af ​​den infrarøde stråle mod den største åbning.
    3. Hydrere filmen ved tilsætning af 3-5 pi af en blanding af glycerol / vand, der fordeles i 3-5 dråber omkring den tørre film, og stramt tæt med et andet vindue med en flad silicone O-ring på ≥ 1 mm tykkelse. Bemærk: Forholdet mellem glycerol / vand-blanding styrer den relative fugtighed mellem vinduerne 54. For hydroskopiske prøver at bruge en 3/7 eller 2/8 glycerol / vand-forhold (vægt / vægt). Glycerol / vand-dråber bør aldrig være i direkte kontakt med proteinet film.
    4. Sæt BaF 2 klemt vinduer i en holder. Forhindre direkte lys i at nå detektoren ved at dække prøven vindue med en IR uigennemsigtigt materiale, såsom papir, med et hul som passer til formatet af det hydratiserede film. Anbring holderen i prøven rummet.
    5. Kontrollere temperaturen af ​​holderen til 25 °C ved en termostatisk kappe forbundet til et temperaturstyret kredsløbssygdomme bad.
    6. Mål en absorptionsspektrum. Sørg for, at den maksimale absorption i amid I region (~ 1,700-1,620 cm -1) er i intervallet 0,6-1,0.
    7. Skøn masse og molforhold af protein / detergent / vand fra absorptionsspektret for det hydratiserede film (figur 5) ved hjælp af reference ekstinktionskoefficient spektre for vand, DM og repræsentative membranproteiner (figur 6).
    8. Vent, indtil hydreringsniveau stabiliserer før du udfører trin-scan eksperimenter (≥ 1 time).

    4.. Justering og synkronisering af de spændende Laser

    Til forsøg BR bruge den anden harmoniske emission af en pulseret Nd: YAG laser (λ = 532 nm) for at udløse photocycle. For forsøg med ChR2 bruge en excitation af λ = 450 nm som leveres af en optisk parametrisk oscillator (OPO), drevet af den tredje harmoniske (λ = 355 nm) af en Nd: YAG laser. Sørg for, at laser puls er tilstrækkelig kort (~ 10 ns) for at minimere sekundær foto-excitation. Bemærk: Energien af ​​laserpulser bør være så konstant som muligt. I vores setup, laser intensitet svinger ≤ 10% omkring middelværdien, som bekræftet ved at måle en refleks laser ved en fotodiode forbundet til en forbigående optager og integrering af respons (figur 8).

    1. Par laseren til prøven. Juster energitæthed laser på prøven til 2-3 mJ / cm 2 impuls ved hjælp af en power-meter.
      1. For ATR setup, bruge en optisk fiber er placeret på toppen af ​​ATR låget.
      2. For transmission eksperimenter, bruger spejle til at bringe laseren til prøven og, hvis det kræves, linser til enten kollimering eller divergerer laserstrålen til en diameter lidt over prøvens film størrelse.
    2. Synkroniser laser puls med dataregistrering spektrometret. Anvende Q-switch sync ud TTL puls af elektronikken i Nd: YAG laser til at udløse spektrometer. Indstil excitation satsen for Nd: YAG laser til 10 Hz for BR og 0,25 Hz for ChR2, hhv.
    3. Brug en pulslængde generator (PDG) til styring af laserexcitation sats, hvis repetitionsfrekvensen af ​​Nd: YAG laser er ikke let indstillelige.
      1. Tilslut lampe sync-out af Nd: YAG laser til PDG triggerindgang eksterne. Den PDG giver en ~ 190 usek forsinket TTL puls output til Q-switch sync-in indgang Nd: YAG laser til at udløse strålende. Gate PDG at acceptere en ekstern trigger efter vis periode siden sidste accepterede aftrækkeren (100 msek for BR eller 4 sek ChR2).

    5. Tidsopløste Step-scan Præparater og indstillinger

    1. Placer et low pass optisk filter i den optiske bane. For at udføre tidsopløste step-scan-målinger i 1,800-850 cm -1 spektralområde bruge et filter uigennemsigtig over 1.950 cm -1 og med god transmission (> 50-80%) under 1.800 cm -1 (Figur 7).
    2. Skift detektoren fra AC til DC-koblet tilstand. Bemærk: Når denne justering interferogram signalet ikke længere vil svinge omkring nul, men omkring en værdi, kaldet DC-niveau.
    3. Brug den størst mulige stråle blænde spektrometer efter højere fotonflux og dermed bedre signal-til-støj, men inden linearitetsgrænser grænserne af detektoren.
    4. Bring DC-niveau interferogram til nul og justere den elektroniske gevinst at gøre bedre brug af dynamiske område af analoge digitale konverterede (ADC). Opnå DC-niveau opvejes ved at påføre en forspænding til signalet fra forforstærker. Bemærk: Denne indstilling er inkluderet i moderne FT-IR spektrometre. Ellers kan en hjemmelavet ekstern anordning anvendes i stedet er anbragt mellem forforstærkeren og ADC 38. Care er sånødvendige for at sikre, at elektronikken i en sådan anordning er hurtige og lineær.
    5. Start trin-scan menu af FT-IR spektrometer. Sæt mål spektrale båndbredde for trin-scan måling til 1,975.3-0 cm -1. Juster spektrale båndbredde til en brøkdel af He-Ne laser bølgetal (1/8 th i den foreliggende sag), lidt over cutoff af optisk filter.
    6. Deaktiver nogen high-pass elektronisk filter til at forhindre fordrejninger af kinetikken på senere tidspunkter. En lav-pass elektronisk filter kan være gavnligt, når dens cutoff frekvens er i orden eller over samplingfrekvens af ADC (reducerer støj aliasing).
    7. Indstil spektrale og faseopløsning til 8 cm -1 og 64 cm -1, hhv. Indstil interferogram erhvervelse mode til single-side fremad. Med disse muligheder man interferogram kræver omkring 500 point.
    8. Indstil samplingshastigheden af ADC til den højest tilgængelige i spektrometer (fx 160 kHz, eller 6,25 mikrosekunder). Indstil "trigger for eksperiment" til "Ekstern", dvs, laseren er mester. Indstil antallet af lineært fordelte datapunkter, der skal registreres: 7.000 til BR (op til 42 ms) og 20.000 for ChR2 (op til 125 ms). Bemærk: Længere tidshorisont kan dækkes uden at flyde ADC hukommelse ved hjælp af en kvasi-logaritmisk tid-fordelte eksterne TTL impulser fra en bølge generator til at udløse køb 38 data eller ved hjælp af to parallelle transientoptagere som substitutter for det indre ADC 31, 32..
    9. Gem cirka 100 pre-triggerpunkter som reference for den mørke tilstand af prøven. Bemærk: I millisekund tidshorisont datakvaliteten er ofte begrænset af udsving i den mobile spejl. Øget pre-triggerpunkter over 100 er derfor ikke forventes at have væsentlig forbedre datakvaliteten.
    10. Indstil antallet af co-tilføjelser, dvs antal gennemsnit af fotoreaktion pr spejlet postulereion. For BR, bruge 20 co-tilføjelser (20 min måle tid ved 10 Hz excitation sats). For ChR2 bruge 2 co-tilføjelser (70 min at måle tid på 0.25 Hz excitation rate)
    11. Gentag forsøget 10x for BR og 35x på tre forskellige prøve film for ChR2 at have endelig ~ 200 co-additioner pr spejl position.

    6.. Databehandling

    1. Bekræft status af prøven ved at sammenligne den lysinduceret IR differensspektrum opnået fra den første og den sidste måling. Overveje at slette alle målinger, når intensiteten differensspektret falder til under 60% af den første måling.
    2. Gennemsnittet af optagede interferogrammer.
      1. Brug af OPUS software fra FTIR spektrometer vælge tidsopløste interferogrammer til gennemsnitligt og tilføje dem til "Spectrum Calculator".
      2. Klik på "=" for at opnå gennemsnittet af interferogrammer.
        Bemærk: Når fase af interferogramer konstant under målingen er ligeglad med gennemsnitlige interferogrammer eller single-channel spektre. En konstant fase kan bekræftes ved at beregne og sammenligne fase frekvenser til den første og den sidste registrerede interferogram.
    3. Udfør Fouriertransformation af de midlede tidsopløste interferogrammer at opnå gennemsnit tidsopløst enkelt kanal spektre.
      1. Brug den samme software som i trin 6.2.1 vælge den gennemsnitlige tid-løst interferogram og klik på ikonet for "interferogram til spektre". Brug Mertz fase-korrektion metode, en nul-fyldning faktor 2 (to digitale point pr instrumental opløsning), og en apodiseringen funktion (f.eks, trekant, Blackmann-Harris 3-vilkår osv.).
      2. Klik på det nederste "Konverter" for at omdanne tidsopløst interferogram i tidsopløst spektre.
    4. Eksporter de tidsopløste enkelt kanal data som en "datapunkt bord" eller et "; Matlab "fil ved hjælp af" gem som "ikonet i OPUS-softwaren. Fortsæt databehandling i et eksternt program.
      1. Gennemsnittet enkelt kanal spektre før laser, og konvertere tidsopløste enkelt kanal data til tidsopløst absorption forskel spektre.
      2. Beregn en vektor for den forventede støj standardafvigelse i differensspektrene som en funktion af wavenumber (Figur 12), ved hjælp af støj standardafvigelse, ε, og mener, S 0 (ν) af de 100 enkelt kanal spektre forud laseren: ε / S 0 (ν). Værdien af ​​ε anslås trække træk enkelt kanal spektre og beregne standardafvigelsen korrigeret med √ 2.
      3. Fjern spektrale områder også støjende at være til nytte (fx over 1.825 cm -1 og under 850 cm -1).
      4. Udfør en kvasi-logaritmisk gennemsnit (fx 20 spektre / tid årti). Den appearance af data vil forbedre, og antallet af spektre vil blive reduceret fra ~ 10 4 til ~ 10 2 uden nogen væsentlige oplysninger tabt (Figur 9).
      5. Forøg fire gange spektral tæthed point (1 point / cm -1) ved hjælp af Fourier interpolation (skrive nul-fyldning).
        Bemærk: Vi udfør trin 6.4.1 til 6.4.4 i et hjemmelavet program, der kører i Matlab.
    5. Behandle den opnåede tidsopløst spektre (figur 10A) med singulære værdi, SVD, (figur 13). Udføre data denoising ved at rekonstruere data med et begrænset antal væsentlige SVD komponenter (Figur 10B). Bemærk: Vi udfører SVD i MATLAB, ved hjælp af den indbyggede "SVD"-funktion.

Representative Results

Figur 1 viser et absorptionsspektrum af en tør film af bR aflejret på overfladen af diamant indre refleksion, der er anvendt til ATR spektroskopi. Karakteristiske bands fra vibrationer af peptidbindingen (amid A, amid I og amid II) klart adskiller. Den omtrentlige tykkelse af den tørre film kan estimeres som ~ 1 um, i betragtning af mængden af tilsat protein (18 ug) og overfladen af ATR (~ 0,2 cm 2), idet tætheden af protein som ~ 1,4 g / cm 3, 58 og af lipider som 1,0 g / cm 3, 59 og et lipid / protein-forhold på 1/3 (w / w) i lilla membran 60.

Den tørre film blev rehydreret med overskud af 4 M NaCl, 100 mM NaPi ved pH 7,4 (figur 3). Koncentrationen af ​​hydrering niveau og effektiv protein i volumen probet ved kortvarige bølge kan udledes skaleringsfaktoren nødvendig for digitalt fjern absorptionsbåndfra vand. Den optimale skaleringsfaktor var 0,87, hvilket betyder, at bufferen i dette tilfælde indtager 87%, og prøven 13% af volumenet nær overfladen. Under hensyntagen til protein og lipid tæthed og lipid / protein-forholdet i lilla membraner (se ovenfor), kan vi udlede en effektiv proteinkoncentration på 125 mg / ml i volumen probet ved kortvarige bølge. Vi kan udlede af hydrering niveau, at der i dette særlige tilfælde, prøve tykkelse udvidet ~ 6 gange efter rehydrering, fra ~ 1 til ~ 6 um. For en 45 ° indfaldsvinkel, typisk for vores og for de fleste ATR arrangementer indtrængningsdybde flygtige felt (d p) for en hydreret protein film varierer mellem 0,3 og 0,6 um i 1,800-850 cm -1 intervallet 61. Fordi flygtige felt er næsten ufølsom over for prøven placeret to gange over d s. 61, slutter vi, at mængden af protein, der anvendes i ATR eksperimentet kunne i princippet være reduceret 5x wed en betydelig tab af signal.

Ved anvendelse af buffere med lavere ionstyrke filmen udvider mere, og mængden af protein i volumen probet af flygtige felt reduceres (figur 2). Den præcise sammenhæng mellem film hævelse og ionstyrken af ​​pufferen, afhænger blandt andre faktorer af arten af ​​lipiderne. For eksempel blev en lignende film hævelse som er opnået her for BR i lilla membran ved hjælp af 4 M NaCl opnået for en membran protein rekonstitueret i polar E. coli lipider ved brug af blot 0,1 M NaCl 62. Hvis prøven optager mindre end 5% af den tastede volumen overveje re-doing hydreringstrinnet anvendelse af en buffer med højere ionstyrke. Film hævelse efter hydrering kræver en vis tid til at nå en stabilisering (Figur 4). BR i lilla membran processen er monoeksponentiel med en tidskonstant på 12 min: det tager ikke mere end 30-60 min at have en stabil rehydreret film

Figur 5 viser et IR-absorptionsspektrum af en hydratiseret film af ChR2 opnået ved transmission. Her hydratisering blev opnået ved at udsætte den tørre film for en atmosfære med kontrolleret fugtighed fra en blanding af glycerol / vand. Spektret kan opdeles i bidrag fra vand, vaskemiddel og protein. Vi kunne anslå størrelsen af ​​den enkelte af dem ved hjælp af extinktionskoefficienten spektre, skaleret til at passe den eksperimentelle spektrum. Til vand tog vi ekstinktionskoefficienten spektret fra litteraturen 63, og DM målte vi det fra en opløsning 100 mg / ml (figur 6). Vi har også brugt ekstinktionskoefficienter til to repræsentative membranproteiner: mitokondrie ADP / ATP carrier 64 og BR (figur 7). Skaleringsfaktoren viser et vand-og DM masse overfladetæthed på 260 ug / cm 2 og 200 ug / cm 2 i filmen, hhv. Den resterende absorption (Figure 5, rød linje) kommer hovedsageligt fra det protein, der anslås til at være på en overflade tæthed på 250 ug / cm 2 ved hjælp af amid II ekstinktionskoefficient fra to forskellige membranproteiner (se figur 6). Molforholdet for protein / detergent / vand blev beregnet til at være 1/60/2000 hjælp af en molekylmasse på 35 kDa, 480 Da og 18 Da, hhv.

En 3D plot fra typiske tidsopløst trin-scan FT-IR eksperiment på bR er præsenteret i figur 10A, fremstillet ved ATR og involverer 200 min af dataopsamling. Spectra kan udvindes på bestemte tidspunkter, for eksempel når L er M og N mellemprodukter BR photocycle forventes at nå deres højeste befolkning (figur 11). Deres spektrale funktioner er blevet beskrevet udførligt 13,41,65 og vil blive ikke behandlet yderligere her. Figur 12 viser time-spor på nogle udvalgte bølgetal. Nemlig, stigningen af ​​kinetikken på 1.762 cm -1 (t 1/2 ~ 60 mikrosekunder) rapporter om dynamikken i Asp85 protonisering fra nethinden Schiff basen 66, og dens forfald til nul indikerer sin deprotonation på jord-sate opsving 67. Den negative stigning kinetikken på 1.740 cm -1 (t 1/2 ~ 1 msec) rapporter om deprotoneringen af Asp96 sidekæde, proton donor til Schiff basen 68.. Henfaldet af intensiteten til nul rapporter om reprotonation fra cytoplasmaet 67.. Dynamikken af protein konformationelle ændringer kan probes med absorptions-ændringer i amid I-og amid II-region, som når en maksimal ændring på ~ 3 ms ved stuetemperatur 67,69.

Anvendelsen af SVD til spektroskopiske problemer er blevet gennemgået før 55,56. Kort fortalt, SVD factorizes de eksperimentelle data, arrangeret i en matrix A, som: A = U S T. Denne faktorisering kan ændres for at tage højde for støj afhængighed wavenumber og at straffe udsving / driver i baseline 57.. De kolonner af U og V indeholder ortonormal spektre og time-spor vektorer for hver SVD komponent, hhv. S er en diagonal matrix, som indeholder de såkaldte singulære værdier. De (abstrakte) Spectro-temporale komponenter i U og V vises i faldende relevans at beskrive de eksperimentelle data i mindste kvadraters forstand, kvantificeret ved deres tilknyttede ental værdi. 13A viser ental værdier som en funktion af komponenten nummer, og gengiver de første otte kolonner / komponenter af U (abstrakt spektre, figur 13B) og V (abstrakt time-spor, figur 13C). Signalet er koncentreret i de første fem bestanddele (som forventet for en photocycle med fem mellemliggende stater), med komponenter over høj grad domineret af tilfældig støj og andre kilder til fejl. Den eksperimentelle data blev rekonstrueret ved hjælp af kun de første fem kolonner af U og V, og de ​​første fem kolonner og rækker af S. De data rekonstrueret af SVD repræsenterer den bedste mindste kvadraters tilnærmelse af de eksperimentelle data til en matrix af rang fem. Den rekonstruerede data viser, forbedret kvalitet (figur 10B). Nemlig støjen i høj grad reduceret, samt nogle næppe mærkbare udsving og driver i baseline (almindelige i tidsopløst trin-scanning spektroskopi 25). SVD behandlingen er især gavnligt for at forbedre kvaliteten af de eksperimentelle tids-spor i millisekunder (røde linjer i Figur 12).

Tidsopløste step-scan data for ChR2 photocycle blev opnået ved hjælp af den ovenfor beskrevne protokol for transmission Sion eksperimenter (figur 14A), groft involverer 120 hr af akkumulerede målinger. De tidsopløste data indsamlet af trin-scan strækker sig fra 6,25 mikrosekunder til 125 msek. Den photocycle af ChR2 kræver cirka 60 s for fuld helbredelse. Den seneste del af photocycle kan dækkes ved hjælp af hurtig-scan FT-IR og både step-scanning og hurtig-scan datasæt fusioneret som præsenteres andetsteds 48. De spektrale ændringer i ChR2 er ~ 10 gange mindre end dem indhente fra BR, hvilket gør målingerne mere udfordrende. Specielt, svingninger i baseline i millisekunder bliver tydeligt ved disse lave absorption ændringer. Det er på grund af små svingninger i den mobile spejl i millisekund tidsskala 25. De svingninger, sammen med en del af støjen, i vid udstrækning kan fjernes ved SVD bemærkelsesværdigt forbedre udseendet af data (figur 14B).

gur 1 "fo: content-width =" 5in "src =" / files/ftp_upload/51622/51622fig1highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 1. Absorptionsspektrum af bR i lilla membran tørret oven diamant overflade af en ATR tilbehør. Bands fra vibrationer af peptidbindingen (amid I, II og A) er angivet.

Figur 2
Figur 2. Absorptionsspektrum af en film af bR efter rehydrering hjælp buffere af forskellige ionstyrker Bemærk faldet af amidet II båndet (fortyndinger af 4 M NaCl, 100 mM Na 2 HPO 4 / NaH 2PO 4 ved pH 7,4)., dvs. øget film hævelse med faldende ionstyrke buffer. (Insert) Relativ mængde protein nær overfladen, kvantificeres ved intensiteten af absorbansen ved 1541 cm-1 (amid II maksimum) efter subtractipå for absorptionen bidrag bufferen.

Figur 3
Fig. 3. Absorption spektrum af en film af bR rehydreret med bulk-buffer (4,3 M ionstyrke), og efter subtraktion af bufferen bidrag. Subtraktionen faktor 0,87, blev valgt til at fjerne den stærke vandoptagelse mellem 3,700-3,000 cm -1 og for at opnå en flad basislinie mellem 2,700-1,800 cm -1.

Figur 4
Figur 4.. Absorptionsspektrum af bR efter rehydrering med en buffer på 4,3 M ionstyrke (buffer absorption er blevet fratrukket for klarhed som i figur 3). Indsatsen viser udviklingen af filmen hævelse efter rehydration, efterfulgt af protein-amid II absorbans ved 1541 cm-1. En egnet til en enkelt eksponentialfunktion angiver en tidskonstant for film hævelse stabilisering af 12 min.

Figur 5
Figur 5.. Absorptionsspektrum af en hydreret film af ChR2 målt ved transmission (blå linje). Ekstinktionskoefficienten spektrum af vand (stiplet orange linie) og DM (stiplet cyan linie) blev skaleret og trækkes (rød linje).

Figur 6
Figur 6. Gengivet masse ekstinktionskoefficienten spektre ved 25 ° C for flydende vand (http://www.ualberta.ca/ ~ jbertie / JBDownload.HTM # Spectra) og en hydratiseret film af ADP / ATP bærer (AAC) 64 . Trong> Massen ekstinktionskoefficient spektret blev målt i opløsning til DM (100 mg / ml), og i en hydratiseret film til Br.

Figur 7
Figur 7.. Transmittans af optisk filter, der anvendes i tidsopløste scan-scan FT-IR målinger.

Figur 8
. Figur 8. Udførelse af laserpulser, som den anden harmoniske (532 nm) af en Nd:. YAG laser Histogram af variationen af den relative energi af 1.000 laserpulser, og passer til en Gauss fordeling med en standardafvigelse på 0,05.

1622/51622fig9highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 9.. Lys-induceret absorbansændringer BR på tre repræsentative bølgetal på ensartet tid afstandseffekter intervaller (grøn, sort og blå linjer), og efter kvasi-logaritmisk midling til ~ Bemærk støjreduktionen efter 20 point / årti (røde linjer). logaritmisk midling, afslører svingning af tiden spor i millisekunder.

Figur 10
Figur 10. 3D repræsentation af lysinducerede absorbansændringer for BR optaget af ATR ved pH 7,4 (4 M NaCl, 100 mM NaPi). A) Rådata. B) oplysninger rekonstrueret med fem SVD komponenter. Klik her for at se en større version af dette tal.


Fig. 11. FT-IR forskel absorptionsspektre af bR photocycle på tre udvalgte tidspunkter, hvor L (12,5 mikrosekunder) er M (300 mikrosekunder) og N (6 msek) mellemprodukter mest berigede.

Figur 12
Figur 12. Proton transfer og protein backbone dynamik i BR photocycle som løses af tidsopløst trin-scan FT-IR forskel spektroskopi. Absorbansværdierne ændringer på 1.762 cm -1 rapporter om de protonation / deprotonation dynamik Asp85, og ved 1.741 cm -1 på deprotonation / reprotonation dynamik Asp96 (herunder H-bonding ændringer før 300 mikrosekunder). Den tid-spor på 1.670 og 1.555 cm -1rapportændringer i amid I og II vibrationer, både er følsomme for konformationen af ​​peptidrygraden. Bagsiden spor svarer til de rå data, og de ​​røde til SVD-behandlede data. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 13
Figur 13. Singular værdi dekomposition (SVD) af de eksperimentelle tidsopløst trin-scan FT-IR data Br photocycle (se figur 10A). SVD blev udført efter vejning de eksperimentelle data under hensyntagen til støj standardafvigelse afhængighed bølgetal (figur 15); kombineret med den 1. afledede for at reducere den statistiske vægt af baseline udsving, som beskrevet før 57.. A) & #160; Plot af de relative ental værdier af de første 50 komponenter (sorte cirkler). De første fem komponenter er tildelt til signal komponenter (røde cirkler). Resten af komponenterne forfald eksponentielt som forventet for støj-komponenter (se stiplede grå linie). B) Første otte abstrakt spektre (U 1 til U 8). C) Første otte abstrakte tids-spor (V 1 til V 8). Den abstrakte spektre og time-spor tildelt signal er afbildet i røde linjer, og med sorte linjer ellers. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 14
Figur 14. 3D repræsentation af lysinducerede IR absorbansændringer for ChR2 optaget med trin-scani transmission-mode. Trin-scan data forlænger indtil 125 ms, kun dækker en del af photocycle. A) Rå data. B) Oplysninger rekonstrueret med fem SVD komponenter. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 15
Figur 15. Skønnet støjniveau i en FT-IR. Forskel absorptionsspektrum på 6,25 mikrosekunder tidsmæssig og 8 cm -1 spektral opløsning for et eksperiment, der involverer 1 co-addition/mirror position (500 photoreactions) eller ~ 200 co-addition/mirror position (10 5 photoreactions). Værdierne er vist for den svækkede total refleksion (ATR) og opsætningen transmission.

Discussion

En af de første aspekter, der bør tages i betragtning, når der udføres tidsopløste trin-scan FT-IR eksperimenter på et protein er forberedelsen af ​​en prøve i en passende form for IR-spektroskopi. Brug IR absorption fra andre end det interessante protein stoffer, der skal reduceres, specielt det fra vand. Den mest almindelige fremgangsmåde er at fordampe størstedelen vand i prøven til dannelse af en film. Filmen kan rehydratiseres enten ved at tilføje nogle dråber af en vandig opløsning eller ved at udsætte filmen for en atmosfære med kontrolleret fugtighed. Vi har vist, hvordan i begge tilfælde er det muligt at estimere hydreringsniveau opnås ved hjælp af IR-spektroskopi (se figur 3 og 5). Selv om de opnåede hydrering niveauer kan synes lav i forhold til dem i opløsning, er de faktisk tæt på dem, der findes i levende celler 70, hvilket gør studiet af hydratiserede film af proteiner funktionelt relevante. Udover vand,er også vigtigt at vide og til at kontrollere mængden af ​​lipid-eller detergent i prøven. Begge bør holdes lavt nok til at have en reduceret spektroskopisk effekt i IR-absorption, men høj nok til at bevare integriteten og funktionaliteten af ​​proteinet af interesse.

Time-løst trin-scan spektroskopi er kun ligefremt gældende for proteiner viser reversible reaktioner, som kan udløses reproducerbart med lys (men se fremskridt i kobling trin-scanning med hurtig buffer udveksling) 71.. I trin-scan reaktionen skal være reproducerbar mindst ~ 500x, at det mindste antal fuldføre en interferogram dækker 1,800-850 cm -1 region 8 cm -1 opløsning. I praksis er der imidlertid yderligere data gennemsnitsberegning er generelt forpligtet til at skubbe støjniveauet nede. For 200 co-additions/mirror position (10 5 gentagelser af reaktionen) en 6,25 mikrosekunder opløsning absorbans differensspektrum kan vise en støj standard afvigelsen mellem 2 x 10 -5 og 2 x 10 -4 til en ATR og mellem 5 x 10 -6 og 3 x 10 -5 til en transmission eksperiment (figur 15). Takket være dens højere foton gennemløb, transmission giver mulighed for ~ 7 lavere støjniveau end ATR, et centralt aspekt for en vellykket undersøge prøver giver svage absorption ændringer såsom ChR2. På den anden side, ATR kræver 5 til 25 gange mindre prøve end en transmission eksperiment.

Anvendelsen af ​​tidsopløst trin-scan FT-IR spektroskopi er problematisk for proteiner, der udviser langsomme photocycles: optagelse af en interferogram trin-scanning kan blive upraktisk lang. Nogle løsninger er blevet præsenteret for at behandle sådanne sager 72,73 ofte baseret på at bruge flere udskiftelige prøver at fremskynde målinger på bekostning af øget protein forbrug og eksperimentel kompleksitet 27,74. I nogle tilfælde er det muligt at omgå dette problem ved excitere prøven før den photocycle er strengt afsluttet. For ChR2 med en photocycle kræver efter foto-excitation 60 sek for 99% genvinding, nyttiggørelse på 4 sek er allerede på 80% 48. Med en excitation virkningsgrad på 10% pr laserpuls, 98% af ChR2 molekyler er i den mørke tilstand 4 sek efter foto-excitation, hvilket gør det muligt at udføre eksperimenter på en laser gentagelse sats på 0,25 Hz.

Databehandling er en endelig teknisk aspekt kræves for at opnå de bedst mulige resultater. Logaritmisk gennemsnitsberegning reducerer støj og også vigtigt, reducerer størrelsen af ​​dataene uden forvridninger, en funktion afgørende for posteriore dataanalyse ved hjælp ental værdi dekomposition eller global montering. Logaritmisk gennemsnitsberegning er dog ikke meget vellykket i gennemsnit ud udsving i tids-spor forårsaget af svingninger i den mobile spejl og andre 1 / f støjkilder under målingerne (figur 9). Disse udsving i baselinekan overstige støjen i millisekunder og ødelægge kvaliteten af ​​data. Singular værdi dekomposition drager fordel af redundans af data for at reducere støjen, og med visse ændringer 57 det kan reducere såvel udsving i baseline.

Endelig er den hårdere og mest tidskrævende del af en tid-løst trin-scan FT-IR eksperiment svarer til tildelingen af ​​bands og spektrale og kinetiske fortolkning af data. For bakterierhodopsin mange af de bands optræder i IR differensspektrene har fået tildelt eller fortolket takket være det akkumulerede arbejde, som mange forskergrupper gennem årtier. For et langt mindre studeret protein, såsom channelrhodopsin-2, skal ledsages af parallelle eksperimenter på steddirigerede mutanter og kombineret med oplysninger fra komplementære teknikker til at nå en mekanistisk fortolkning 48 ovenstående præsenteret tidsopløste IR eksperimenter.

Disclosures

Forfatterne erklærer nogen konkurrerende finansielle interesser.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
FT-IR spectrometer Bruker Vertex 80v Equipped with photovoltaic-MCT detector, an external global, and an oil-free pump. Firmware 2.3.
BaF2 windows korth Kristalle
Diamond ATR accesory Smiths detection Nine-reflection DuraDisk
Thermostatic bath Julabo F25
Vibration decoupled table OPTA
Pulsed Nd:YAG laser with a second harmonic generator Continuum electro-Optics Minilite 
Optical parametric oscillator (OPO) OPTA BBO-355-VIS/IR S/N 1009
Digital delay/pulse generator  Stanford Research Systems DG535
Pulsed Nd:YAG laser with a third harmonic generator Spectra-Physics Quanta-Ray
Various optical mirrors and lenses ThorLabs
OPUS 7.0 Bruker Software to control Vertex 80v spectrometer
MATLAB run time Mathworks Used to run home-made executable programs to preprocess the data

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Henzler-Wildman, K., Kern, D. Dynamic personalities of proteins. Nature. 450, 964-972 (2007).
  2. Lacapère, J. J., Pebay-Peyroula, E., Neumann, J. M., Etchebest, C. Determining membrane protein structures: still a challenge. Trends Biochem. Sci. 32, 259-270 (2007).
  3. Wöhri, A. B., et al. Light-induced structural changes in a photosynthetic reaction center caught by Laue diffraction. Science. 328, 630-633 (2010).
  4. Aquila, A., et al. Time-resolved protein nanocrystallography using an X-ray free-electron laser. Opt. Express. 20, 2706-2716 (2012).
  5. Neutze, R., Moffat, K. Time-resolved structural studies at synchrotrons and X-ray free electron lasers: opportunities and challenges. Curr. Opin. Struc. Biol. 22, 651-659 (2012).
  6. Austin, R. H., et al. Dynamics of carbon monoxide binding by heme proteins. Science. 181, 541-543 (1973).
  7. Alberding, N., et al. Tunneling in ligand binding to heme proteins. Science. 192, 1002-1004 (1976).
  8. Goormaghtigh, E., Cabiaux, V., Ruysschaert, J. M. Determination of soluble and membrane protein structure by Fourier transform infrared spectroscopy. III. Secondary structures. Subcell. Biochem. 23, 405-450 (1994).
  9. Tamm, L. K., Tatulian, S. A. Infrared spectroscopy of proteins and peptides in lipid bilayers. Q. Rev. Biophys. 30, 365-429 (1997).
  10. Arrondo, J. L., Goñi, F. M. Structure and dynamics of membrane proteins as studied by infrared spectroscopy. Prog. Biophys. Mol. Biol. 72, 367-405 (1999).
  11. Barth, A., Zscherp, C. What vibrations tell us about proteins. Q. Rev. Biophys. 35, 369-430 (2002).
  12. Gerwert, K. Molecular reaction-mechanisms of proteins as monitored by time-resolved FTIR Spectroscopy. Curr. Opin. Struct. Biol. 3, 769-773 (1993).
  13. Maeda, A. Application of FTIR spectroscopy to the structural study on the function of bacteriorhodopsin. Isr. J. Chem. 35, 387-400 (1995).
  14. Kandori, H. Role of internal water molecules in bacteriorhodopsin. Biochim. Biophys. Acta. 1460, 177-191 (2000).
  15. Zscherp, C., Barth, A. Reaction-induced infrared difference spectroscopy for the study of protein reaction mechanisms. Biochemistry. 40, 1875-1883 (2001).
  16. Nyquist, R. M., Heitbrink, D., Bolwien, C., Gennis, R. B., Heberle, J. Direct observation of protonation reactions during the catalytic cycle of cytochrome c oxidase. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 8715-8720 (2003).
  17. Rich, P. R., Iwaki, M. Methods to probe protein transitions with ATR infrared spectroscopy. Mol. Biosyst. 3, 398-407 (2007).
  18. Noguchi, T. Light-induced FTIR difference spectroscopy as a powerful tool toward understanding the molecular mechanism of photosynthetic oxygen evolution. Photosynth. Res. 91, 59-69 (2007).
  19. Granell, M., Leon, X., Leblanc, G., Padros, E., Lorenz-Fonfria, V. A. Structural insights into the activation mechanism of melibiose permease by sodium binding. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 22078-22083 (2010).
  20. Schuler, B., Eaton, W. A. Protein folding studied by single-molecule FRET. Curr. Opin. Struct. Biol. 18, 16-26 (2008).
  21. Kapanidis, A. N., Strick, T. Biology, one molecule at a time. Trends Biochem. Sci. 34, 234-243 (2009).
  22. Uhmann, W., Becker, A., Taran, C., Siebert, F. Time-resolved FT-IR absorption spectroscopy using a step-scan interferometer. Appl. Spectrosc. 45, 390-397 (1991).
  23. Dioumaev, A. K., Braiman, M. S. Two bathointermediates of the bacteriorhodopsin photocycle, distringuished by nanosecond time-resolved FTIR spectroscopy at room temperature. J. Phys. Chem. B. 101, 1655-1662 (1997).
  24. Rammelsberg, R., Huhn, G., Lübben, M., Gerwert, K. Bacteriorhodopsin's intramolecular proton-release pathway consists of a hydrogen-bonded network. Biochemistry. 37, 5001-5009 (1998).
  25. Rödig, C., Siebert, F. Errors and artifacts in time-resolved step-scan FT-IR spectroscopy. Appl. Spectrosc. 53, 893-901 (1999).
  26. Brudler, R., Rammelsberg, R., Woo, T. T., Getzoff, E. D., Gerwert, K. Structure of the I1 early intermediate of photoactive yellow protein by FTIR spectroscopy. Nat. Struct. Biol. 8, 265-270 (2001).
  27. Remy, A., Gerwert, K. Coupling of light-induced electron transfer to proton uptake in photosynthesis. Nat. Struct. Biol. 10, 637-644 (2003).
  28. Lórenz-Fonfría, V. A., Furutani, Y., Kandori, H. Active internal waters in the bacteriorhodopsin photocycle. A comparative study of the L and M intermediates at room and cryogenic temperatures by infrared spectroscopy. Biochemistry. 47, 4071-4081 (2008).
  29. Griffiths, P. R., de Haseth, J. A. Fourier Transform Infrared Spectrometry. , John Wiley and Sons. (1986).
  30. Smith, G. D., Palmer, R. A. Handbook of vibrational spectroscopy. , John Wiley & Sons Ltd. (2002).
  31. Rammelsberg, R., Heßling, B., Chorongiewski, H., Gerwert, K. Molecular reaction mechanisms of protein monitored by nanosecond step-scan FT-IR difference spectroscopy. Appl. Spectrosc. 51, 558-562 (1997).
  32. Rödig, C., Chizhov, I., Weidlich, O., Siebert, F. Time-resolved step-scan Fourier transform infrared spectroscopy reveals differences between early and late M intermediates of bacteriorhodopsin. Biophys. J. 76, 2687-2701 (1999).
  33. Bromberg, S. E., et al. The mechanism of a C-H bond activation reaction in room-temperature alkane solution. Science. 278, 260-263 (1997).
  34. Rödig, C., Siebert, F. Handbook of vibrational spectroscopy. , John Wiley & Sons. (2002).
  35. Braiman, M. S., Xiao, Y. Vibrational Spectroscopy of Biological and Polymeric Materials. , CRC Press. 353-418 (2006).
  36. Gerwert, K. Handbook of vibrational spectroscopy. , John Wiley & Sons Ltd. (2002).
  37. Koutsoupakis, C., Pinakoulaki, E., Stavrakis, S., Daskalakis, V., Varotsis, C. Time-resolved step-scan Fourier transform infrared investigation of heme-copper oxidases: implications for O2 input and H2O/H+ output channels. Biochim. Biophys. Acta. 1655, 347-352 (2004).
  38. Radu, I., Schleeger, M., Bolwien, C., Heberle, J. Time-resolved methods in biophysics. 10. Time-resolved FT-IR difference spectroscopy and the application to membrane proteins. Photochem. Photobiol. Sci. 8, 1517-1528 (2009).
  39. Haupts, U., Tittor, J., Oesterhelt, D. Closing in on bacteriorhodopsin: progress in understanding the molecule. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 28, 367-399 (1999).
  40. Lanyi, J. K. Bacteriorhodopsin. Annu. Rev. Physiol. 66, 665-688 (2004).
  41. Heberle, J., Fitter, J., Sass, H. J., Büldt, G. Bacteriorhodopsin: the functional details of a molecular machine are being resolved. Biophys. Chem. 85, 229-248 (2000).
  42. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-1: a light-gated proton channel in green algae. Science. 296, 2395-2398 (2002).
  43. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proc. Natl. Acad. Sci U. S. A. 100, 13940-13945 (2003).
  44. Zhang, F., et al. The microbial opsin family of optogenetic tools. Cell. 147, 1446-1457 (2011).
  45. Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The development and application of optogenetics. Annu. Rev. Neurosci. 34, 389-412 (2011).
  46. Feldbauer, K., et al. Channelrhodopsin-2 is a leaky proton pump. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 12317-12322 (2009).
  47. Nack, M., et al. Kinetics of proton release and uptake by channelrhodopsin-2. FEBS Lett. 586, 1344-1348 (2012).
  48. Lórenz-Fonfría, V. A., et al. Transient protonation changes in channelrhodopsin-2 and their relevance to channel gating. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, (2013).
  49. Heberle, J., Zscherp, C. ATR/FT-IR difference spectroscopy of biological matter with microsecond time resolution. Appl. Spectrosc. 50, 588-596 (1996).
  50. Nyquist, R. M., Ataka, K., Heberle, J. The molecular mechanism of membrane proteins probed by evanescent infrared waves. Chembiochem. 5, 431-436 (2004).
  51. Gerwert, K., Freier, E., Wolf, S. The role of protein-bound water molecules in microbial rhodopsins. Biochim. Biophys. Acta. 1837, 606-613 (2014).
  52. Lórenz-Fonfría, V. A., Heberle, J. Channelrhodopsin unchained: Structure and mechanism of a light-gated cation channel. Biochim. Biophys. Acta. 1837, 626-642 (2014).
  53. Carter, R. O., Lindsay, N. E., Beduhn, D. A solution to base-line uncertainty due to MCT detector nonlinearity in FT-IR. Appl. Spectrosc. 44, 1147-1151 (1990).
  54. Noguchi, T., Sugiura, M. Flash-induced FTIR difference spectra of the water oxidizing complex in moderately hydrated photosystem II core films: effect of hydration extent on S-state transitions. Biochemistry. 41, 2322-2330 (2002).
  55. Henry, E. R., Hofrichter, J. Singular value decomposition: application to analysis of experimental data. Methods Enzymol. 210, 129-192 (1992).
  56. Hendler, R. W., Shrager, R. I. Deconvolutions based on singular value decomposition and the pseudoinverse: a guide for beginners. J. Biochem. Biophys. Methods. 28, 1-33 (1994).
  57. Lórenz-Fonfría, V. A., Kandori, H. Spectroscopic and kinetic evidence on how bacteriorhodopsin accomplishes vectorial proton transport under functional conditions. J. Am. Chem. Soc. 131, 5891-5901 (2009).
  58. Fischer, H., Polikarpov, I., Craievich, A. F. Average protein density is a molecular-weight-dependent function. Protein Sci. 13, 2825-2828 (2004).
  59. Nagle, J. F., Tristram-Nagle, S. Structure of lipid bilayers. Biochim. Biophys. Acta. 1469, 159-195 (2000).
  60. Lee, A. G. Lipid-protein interactions in biological membranes: a structural perspective. Biochim. Biophys. Acta. 1612, 1-40 (2003).
  61. Goormaghtigh, E., Raussens, V., Ruysschaert, J. M. Attenuated total reflection infrared spectroscopy of proteins and lipids in biological membranes. Biochim. Biophys. Acta. 1422, 105-185 (1999).
  62. Lórenz-Fonfría, V. A., León, X., Padrós, E. Studying substrate binding to reconstituted secondary transporters by attenuated total reflection infrared difference spectroscopy. Methods Mol. Biol. 914, 107-126 (2012).
  63. Bertie, J. E., Lan, Z. D. Infrared intensities of liquids XX: the intensity of the OH stretching band of liquid water revisited, and the best current values of the optical constants of H2O(l) at 25 oC between 15,000 and 1 cm-1. Appl. Spectrosc. 50, 1047-1057 (1996).
  64. Lórenz, V. A., et al. The secondary structure of the inhibited mitochondrial ADP/ATP transporter from yeast analyzed by FTIR spectroscopy. Biochemistry. 40, 8821-8833 (2001).
  65. Heßling, B., Souvignier, G., Gerwert, K. A model-independent approach to assigning bacteriorhodopsin's intramolecular reactions to photocycle intermediates. Biophys. J. 65, 1929-1941 (1993).
  66. Braiman, M. S., et al. Vibrational spectroscopy of bacteriorhodopsin mutants: light-driven proton transport involves protonation changes of aspartic acid residues 85, 96, and 212. 27, 8516-8520 (1988).
  67. Gerwert, K., Souvignier, G., Hess, B. Simultaneous monitoring of light-induced changes in protein side-group protonation, chromophore isomerization, and backbone motion of bacteriorhodopsin by time-resolved Fourier-transform infrared spectroscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 87, 9774-9778 (1990).
  68. Gerwert, K., Hess, B., Soppa, J., Oesterhelt, D. Role of aspartate-96 in proton translocation by bacteriorhodopsin. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86, 4943-4947 (1989).
  69. Lórenz-Fonfría, V. A., Kandori, H., Padrós, E. Probing specific molecular processes and intermediates by time-resolved Fourier transform infrared spectroscopy: application to the bacteriorhodopsin photocycle. J. Phys. Chem. B. 115, 7972-7985 (2011).
  70. Ellis, R. J., Minton, A. P. Cell biology: join the crowd. Nature. 425, 27-28 (2003).
  71. Furutani, Y., Kimura, T., Okamoto, K. Development of a rapid Buffer-exchange system for time-resolved ATR-FTIR spectroscopy with the step-scan mode. Biophysics. 9, 123-129 (2013).
  72. Rammelsberg, R., Boulas, S., Chorongiewski, H., Gerwert, K. Set-up for time-resolved step-scan FTIR spectroscopy of noncyclic reactions. Vib. Spectrosc. 19, 143-149 (1999).
  73. Rödig, C., Siebert, F. Monitoring fast reactions of slow cycling systems with time-resolved FTIR spectroscopy. Vib. Spectrosc. 19, 271-276 (1999).
  74. Rödig, C., Siebert, F. Distortion of the L→M transition in the photocycle of the bacteriorhodopsin mutant D96N: a time-resolved step-scan FTIR investigation. FEBS Lett. 445, 14-18 (1999).

Tags

Biofysik bakterierhodopsin channelrhodopsin svækket total refleksion proton overførsel protein dynamik infrarød spektroskopi tidsopløst spektroskopi trin-scan membranproteiner singular værdi dekomposition
Proton Transfer og proteinkonformation Dynamics i Lysfølsomme Proteiner af Time-løst Step-scan Fourier-transform infrarød spektroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lórenz-Fonfría, V. A.,… More

Lórenz-Fonfría, V. A., Heberle, J. Proton Transfer and Protein Conformation Dynamics in Photosensitive Proteins by Time-resolved Step-scan Fourier-transform Infrared Spectroscopy. J. Vis. Exp. (88), e51622, doi:10.3791/51622 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter