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Engineering

द्वारा सहज प्रोटीन में प्रोटॉन हस्तांतरण और प्रोटीन रचना डायनेमिक्स समय हल इन्फ्रारेड स्पेक्ट्रोस्कोपी फूरियर बदलने कदम स्कैन

Published: June 27, 2014 doi: 10.3791/51622
Automatic Translation
1, 1
1Experimental Molecular Biophysics, Freie Universität Berlin

Abstract

एक प्रोटीन के समारोह के दौरान protonation और प्रोटीन रीढ़ रचना में परिवर्तन की गतिशीलता मॉनिटरिंग अपने तंत्र को समझने की दिशा में एक आवश्यक कदम है. Protonation और गठनात्मक परिवर्तन अवरक्त (आईआर) अंतर स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा जांच की जा सकती है, जो दोनों के क्रमशः अमीनो एसिड पक्ष श्रृंखला की और पेप्टाइड बांड की कंपन पैटर्न, प्रभावित करते हैं. जिसका समारोह प्रोटीन प्रकाश द्वारा repetitively और reproducibly चालू किया जा सकता है के लिए, यह फूरियर कदम स्कैन अवरक्त तकनीक का उपयोग करते हुए एक व्यापक वर्णक्रमीय सीमा पर (उप) microsecond संकल्प के साथ इन्फ्रारेड अंतर स्पेक्ट्रा प्राप्त करना संभव है. कैनेटीक्स का पालन करने के लिए पर्याप्त, 4 - photoreaction की ~ 10 2 -10 3 repetitions के साथ, न्यूनतम संख्या उचित वर्णक्रमीय संकल्प और बैंडविड्थ पर एक स्कैन पूरा करने के लिए, अवशोषण अंतर स्पेक्ट्रा में शोर स्तर ~ 10 जितनी कम किया जा सकता है एक एमिनो एसिड से protonation परिवर्तन. कमशोर का स्तर अधिक डेटा औसत और / या गणितीय प्रसंस्करण द्वारा पूरा किया जा सकता है. इष्टतम परिणामों के लिए आवश्यक प्रोटीन की मात्रा का इस्तेमाल किया नमूना तकनीक के आधार पर, 5-100 ग्राम के बीच है. अतिरिक्त आवश्यकताओं के बारे में, प्रोटीन पहले एक कम ईओण ताकत बफर में केंद्रित है और फिर एक फिल्म के लिए फार्म का सूख जाना चाहिए. प्रोटीन फिल्म पानी की छोटी बूंदों के साथ या नियंत्रित वायुमंडलीय नमी के तहत या तो प्रयोग करने से पहले हाइड्रेटेड है. प्राप्त कर ली जलयोजन स्तर (प्रोटीन का पानी / जी के छ) एक आईआर अवशोषण स्पेक्ट्रम से लगाया जाता है. तकनीक का प्रदर्शन करने के लिए, हम अपने देशी बैंगनी झिल्ली वातावरण में प्रकाश संचालित प्रोटॉन पंप bacteriorhodopsin का photocycle का अध्ययन किया, और प्रकाश gated आयन चैनल channelrhodopsin-2 के डिटर्जेंट में solubilized.

Introduction

पूरी तरह से प्रोटीन उनके कार्य प्रदर्शन कैसे स्पष्ट करने के लिए, यह वे यानी अक्सर मध्यवर्ती की एक श्रृंखला शामिल है और समय के कई आदेशों फैली कि एक प्रतिक्रिया मार्ग के किनारे, काम के रूप में उन्हें मापने के लिए आवश्यक है. प्रोटीन समारोह का महत्वपूर्ण कदम अक्सर समय सीमा 1 millisecond के लिए microsecond में जगह ले, रीढ़ गठनात्मक परिवर्तन और झिल्ली प्रोटीन में प्रोटॉन स्थानान्तरण प्रतिक्रियाओं विशेष रूप से. एक्स - रे क्रिस्टलोग्राफी, संरचनात्मक जीव विज्ञान की यकीनन स्तंभ, झिल्ली प्रोटीन 2 के साथ विकसित करने के लिए बेहद मुश्किल है, अच्छी तरह diffracting प्रोटीन क्रिस्टल से स्थिर (समय औसतन) इलेक्ट्रॉन घनत्व प्रदान करता है. शायद ही कभी हाइड्रोजन परमाणुओं के स्थान सहित हालांकि एक 3 डी परमाणु मॉडल, इलेक्ट्रॉन घनत्व के आधार पर बनाया जा सकता है. Laue विवर्तन 3 पर या femtosecond एक्स - रे दालों 4 पर या तो भरोसा समय हल एक्स - रे क्रिस्टलोग्राफी, में उल्लेखनीय प्रगति, उच्च संरचनात्मक जानकारी में करने के लिए समय आयाम कहते हैंएक्स - रे क्रिस्टलोग्राफी से 5 Herent. लेकिन तकनीकी और विश्लेषणात्मक चुनौतियों निवारक, क्रिस्टल जाली रीढ़ गठनात्मक परिवर्तन ख़राब और प्रोटीन गतिशीलता, प्रोटीन क्रिस्टल 5 पर आधारित विधियों में से एक अपरिहार्य कमी को बदल सकते हैं. नतीजतन, प्रोटीन के dynamical पहलुओं अभी भी सबसे अच्छा फ़्लैश photolysis 6,7 ने बीड़ा उठाया है, के रूप में ऑप्टिकल तरीके से कवर किया, सीमित संरचनात्मक अंतर्दृष्टि के सामान्य दोष के साथ यद्यपि. कर रहे हैं

फूरियर तब्दील अवरक्त स्पेक्ट्रोस्कोपी (फुट आईआर) प्रोटीन संरचना, झिल्ली प्रोटीन 8-11 पर असंख्य स्थिर संरचनात्मक और कार्यात्मक जांच में शोषण पिछले सुविधा के लिए एक मूल्यवान संवेदनशीलता के साथ ऑप्टिकल spectroscopies का अस्थायी समाधान को जोड़ती है. विशेष रूप से, फुट आईआर अंतर स्पेक्ट्रोस्कोपी एक और 12-19 के लिए एक metastable राज्य से एक प्रोटीन पारगमन के रूप में छोटे वर्णक्रमीय परिवर्तनों का अध्ययन करने के लिए एक आदर्श उपकरण साबित हो गया है.

पढ़ाईएक अणु स्तर 20,21 में अन्य की तुलना में प्रोटीन की गतिशीलता,, पर तुल्यकालन के लिए एक ट्रिगर प्रक्रिया की आवश्यकता होती है. चक्रीय photoreactions साथ प्रोटीन के अध्ययन में किया के रूप में एक प्रतिक्रिया सुविधापूर्वक ट्रिगर के रूप में प्रकाश के उपयोग invasively तेजी से और नहीं शुरू की है. अच्छा वर्णक्रमीय संकल्प और उचित संकेत करने वाली शोर अनुपात को बनाए रखते हुए समय हल पढ़ाई के साथ जुड़े एक बड़ी चुनौती के लिए पर्याप्त समय संकल्प की प्राप्ति है. इसके अलावा आवश्यक एक पर्याप्त व्यापक वर्णक्रमीय और अस्थायी रेंज को कवर करने के लिए है. समय हल कदम स्कैन फुट आईआर स्पेक्ट्रोस्कोपी प्रकाशित उदाहरण 3,900-850 मुख्यमंत्री के रूप में के रूप में व्यापक वर्णक्रमीय सीमाओं को कवर -1 और गतिशीलता अप करने के लिए 3.5 सेमी के साथ, ~ समय की 9 आदेशों का विस्तार -1 वर्णक्रम के साथ, इन पहलुओं 22 के सभी में excels और 30 nsec अस्थायी समाधान 23-28.

फूरियर बदलने आईआर स्पेक्ट्रोमीटर फैलानेवाला वाले 29 से अधिक कम शोर और बेहतर भामिति सटीकता दिखा. Howevएर, सामान्य तेजी से स्कैन रिकॉर्डिंग मोड में फुट आईआर स्पेक्ट्रोमीटर व्यकिकरणमीटर के मोबाइल दर्पण एक स्कैन पूरा करने की आवश्यकता है कम से कम समय का एक परिणाम के रूप में ≥ 5-10 मिसे तक सीमित एक समय संकल्प से ग्रस्त हैं. कदम स्कैन तकनीक के साथ, इसके विपरीत, गतिशील घटना के समय निर्भरता व्यकिकरणमीटर का स्कैन अवधि से decoupled है. संक्षेप में, असतत चरणों के बजाय में मोबाइल दर्पण चाल लगातार एक स्कैन पूरा करने के लिए स्कैनिंग. इनमें से प्रत्येक चरण में (मोबाइल) दर्पण तय आयोजित किया जाता है और एक क्षणिक दर्ज की गई है. इस प्रकार, समय संकल्प पारा, कैडमियम Telluride 10-100 nsec की रेंज में आम तौर पर है जो (एमसीटी) डिटेक्टर, के उदय के समय से सीमित है. अभ्यास में, (पंख में centerburst और छोटे संकेतों में एक तीव्र संकेत युक्त) interferogram की बड़ी गतिशील रेंज, नमूने के लिए अग्रणी के रूप में कई 16-24 के रूप में बिट्स के साथ उचित डिजिटिकरण एक एनालॉग / डिजिटल कनवर्टर (एडीसी) के लिए की आवश्यकता ~ 200 kHz से अधिक नहीं दरें(5 μsec) 30. Nanosecond समय संकल्प एक 8-12 बिट एडीसी पर्याप्त 23,31-33 है जिसके लिए interferogram में ही परिवर्तन को मापने के द्वारा पूरा किया जा सकता है. तकनीकी पहलुओं 30,34,35 और अनुप्रयोगों समय हल कदम स्कैन की 36-38 अन्यत्र विस्तार से चर्चा की गई है.

वर्तमान योगदान के उद्देश्य सहज झिल्ली प्रोटीन पर समय हल कदम स्कैन फुट आईआर स्पेक्ट्रोस्कोपी के चलन का वर्णन एक प्रोटोकॉल प्रदान करना है. पारेषण और तनु कुल प्रतिबिंब (एटीआर): यहाँ, तकनीक का प्रदर्शन दो नमूने तरीकों के लिए दिखाया गया है. एटीआर का उपयोग प्रोटीन के लिए पूर्ण जलयोजन स्थितियां सुनिश्चित करता है लेकिन यह भी नमूना पीएच और ईओण ताकत 49,50 की तीव्र नियंत्रण की अनुमति देता है, जो न केवल अतिरिक्त पानी की उपस्थिति में काम करने की अनुमति देता है. Bacteriorhodopsin और channelrhodopsin-2: कदम स्कैन प्रयोगों दो चयनित सिस्टम पर सचित्र हैं.

39,40 के लिए कई biophysical पढ़ाई का विषय रहा है. BR कार्यक्षमता फुट आईआर स्पेक्ट्रोस्कोपी का अध्ययन करने के लिए आवेदन कई तकनीकों के बीच यकीनन सबसे बड़ी प्रभावों में से एक exerted है. अर्थात्, फुट आईआर स्पेक्ट्रोस्कोपी कहीं 13,41,51 हिसाब रूप में झिल्ली भर प्रोटॉन हस्तांतरण में शामिल समूहों को हल करने के लिए महत्वपूर्ण हो गया है.

Channelrhodopsin (CHR) प्रकृति 42,43 में पाया पहला प्रकाश gated आयन चैनल है. Chr की हल्की उत्तेजना एक आयन चैनल का क्षणिक खोलने के लिए जाता है. इसकी खोज आणविक प्रक्रियाओं प्रकाश 44,45 द्वारा नियंत्रित कर रहे हैं, जहां optogenetics, के विकास के लिए जिस तरह से बसे. Chr माइक्रोबियल rhodopsins के परिवार के लिए, br के रूप में, के अंतर्गत आता है लेकिन BR के विपरीत, बहुत कम अपनी कार्य प्रणाली 52 के बारे में जाना जाता है. ChR2 एक आईओ के रूप में अपने कार्य को जोड़ती हैप्रोटॉन पंप गतिविधि 46,47 के साथ n चैनल. हाल ही में, हम इंट्रा प्रोटीन प्रोटॉन हस्तांतरण प्रतिक्रियाओं और ChR2 48 में प्रोटीन रीढ़ रचना में परिवर्तन की गतिशीलता को हल करने के लिए समय हल कदम स्कैन फुट आईआर स्पेक्ट्रोस्कोपी आवेदन किया.

Protocol

1. जनरल नमूना के पहलुओं और साधन तैयारी

  1. समय हल कदम स्कैन माप के लिए सुसज्जित एक वाणिज्यिक फुट आईआर स्पेक्ट्रोमीटर का प्रयोग करें. सबसे अच्छा परिणाम एक कंपन से decoupled तालिका के शीर्ष पर फुट आईआर स्पेक्ट्रोमीटर जगह के लिए.
  2. कुछ एम्बार प्रकाशिकी डिब्बे खाली. शुष्क हवा या नाइट्रोजन के साथ नमूना डिब्बे पर्ज.
  3. फुट आईआर स्पेक्ट्रोमीटर की एमसीटी डिटेक्टर के सामने दिखाई विकिरण अपारदर्शी एक आईआर पारदर्शी सामग्री रखें. यह एहतियात कदम स्कैन प्रयोगों के दौरान रोमांचक लेजर पल्स से कलाकृतियों को रोकने के लिए आवश्यक है. नोट: हम एक जर्मेनियम 25 मिमी व्यास की (जीई) विंडो का उपयोग करें. इसकी उच्च अपवर्तनांक अवांछनीय तीव्रता काफी हद तक antireflecting कोटिंग के साथ एक जीई फिल्टर का उपयोग करने से परहेज, खो देता है का कारण बनता है.
  4. तरल नाइट्रोजन के साथ एमसीटी डिटेक्टर देवर शांत हो जाओ. नोट: फोटोवोल्टिक एमसीटी डिटेक्टरों का उपयोग बेहतर photometr, इस प्रकार, क्योंकि उनके रेखीय प्रतिक्रिया की photoconductives अधिक पसंद किया जाता हैआईसी सटीकता और आधारभूत विश्वसनीयता 31,53.
  5. कम से एक बफर (<20 मिमी) एक समरूप प्रोटीन फिल्म के लिए फार्म प्रोटीन निलंबन सुखाने जबकि नमक क्रिस्टल के गठन को रोकने के लिए ईओण ताकत में कम से कम 2 मिलीग्राम प्रोटीन / मिलीलीटर प्रयोगों के लिए इस्तेमाल नमूना पूर्व ध्यान केंद्रित. तलछट कि नमूने के लिए, (एक liposomes में या कोशिका झिल्ली पैच में जैसे, झिल्ली प्रोटीन) ultracentrifugation लगाने से उन्हें ध्यान केंद्रित / धो लो. तलछट (जैसे, डिटर्जेंट solubilized झिल्ली प्रोटीन) नहीं है कि प्रोटीन के लिए उचित कटऑफ के centricons का प्रयोग करें.
  6. इष्टतम परिणामों के उपयोग के लिए: एक) संभव के रूप में प्रोटीन की तैयारी के रूप में शुद्ध और सक्रिय; कोशिका झिल्ली पैच में या liposomes में पुनर्गठन प्रोटीन के लिए वजन में 3 ≤ ख) लिपिड / प्रोटीन के अनुपात; ग) डिटर्जेंट / प्रोटीन डिटर्जेंट solubilized प्रोटीन के लिए वजन में 1 ≤ अनुपात. जिसका कंपन बैंड प्रोटीन (जैसे, लोग) के उन लोगों के साथ ओवरलैप डिटर्जेंट या लिपिड के प्रयोग से बचें.
    7. Bacteriorhodopsin पर तनु कुल प्रतिबिंब प्रयोगों के 2. तैयारी

    1. फुट आईआर स्पेक्ट्रोमीटर का नमूना डिब्बे में एटीआर गौण माउंट. नोट: हम 5 सक्रिय प्रतिबिंब के साथ एक ZnSe / हीरा एटीआर का उपयोग करें. उनके ऑप्टिकल गुण रोमांचक दिखाई लेजर से प्रभावित हैं, के रूप में इस तरह के एटीआर गौण के आंतरिक प्रतिबिंब तत्व (गुस्सा) के रूप जर्मेनियम या सिलिकॉन के रूप में अर्धचालक पदार्थों से बचें.
    2. 4 सेमी -1 पारंपरिक तेजी से स्कैन फुट आईआर स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा साफ गुस्सा सतह के प्रस्ताव पर एक व्यापक रेंज (लगभग 4,000-800 सेमी -1) ऊर्जा स्पेक्ट्रम उपाय. एक बाद में मंच पर अवशोषण स्पेक्ट्रा गणना करने के लिए एक संदर्भ स्पेक्ट्रम के रूप में इस स्पेक्ट्रम का प्रयोग करें.
    3. नमूना (जैसे, पीएच 7.4 में 4 एम NaCl और 100 मिमी NAPI) rehydrate करने के लिए बाद में इस्तेमाल किया बफर के 20 μl के साथ एटीआर का गुस्सा सतह को कवर किया. बफर के आईआर अवशोषण उपाय.
    4. बफर निकालें, और गुस्सा सतह वाई कुल्लावें पानी. सतह को छूने से बचें. एक तीव्र हवा के प्रवाह से गुस्सा सतह से अवशिष्ट तरल निकालें.
    5. गुस्सा सतह (~ 0.2 सेमी 2 क्षेत्र) के शीर्ष पर बैंगनी झिल्ली में bacteriorhodopsin का ~ 3 μl (बीआर) बिखरा (विआयनीकृत पानी में ~ 6 मिलीग्राम प्रोटीन / एमएल). एक फिल्म उपलब्ध हो जाता है जब तक शुष्क हवा की कोमल धारा के तहत प्रोटीन निलंबन सूखी.
    6. सूखी फिल्म का अवशोषण स्पेक्ट्रम उपाय (देखें चित्र 1).
    7. धीरे सूखी फिल्म (जैसे, पीएच 7.4 में 4 एम NaCl और 100 मिमी NAPI) rehydrate करने के लिए उच्च शक्ति ईओण का एक बफर के 20-40 μl जोड़ें. नोट: उच्च शक्ति ईओण जांच की सतह के लिए संभव करीब चित्रा (2) के रूप में ज्यादा प्रोटीन बनाए रखने के लिए अनुमति देता है, झिल्ली फिल्म की अत्यधिक सूजन को रोकता है.
    8. पानी के वाष्पीकरण को रोकने के लिए एक ढक्कन के साथ एटीआर धारक को कवर किया. वैकल्पिक रूप से, तापमान नियंत्रण के लिए 25 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट एक संचार स्नान से जुड़ा एक कवर जैकेट जगह है. लंबे photocycles (& # साथ प्रोटीन के लिए62, सेकंड), तापमान नियंत्रण आधारभूत स्थिरता में वृद्धि हो सकती है.
    9. एक absorbance स्पेक्ट्रम उपाय. बफर का अवशोषण स्पेक्ट्रम (चित्रा 3) घटा कर फिल्म के पुनर्जलीकरण के बाद सतह के पास शेष नमूना के प्रतिशत का अनुमान.
    10. पुनर्जलीकरण के बाद 5-20 मिनट के अंतराल (चित्रा 4) में अवशोषण स्पेक्ट्रा रिकॉर्डिंग से सूजन फिल्म के स्थिरीकरण की पुष्टि करें. यह कदम वैकल्पिक लेकिन अनुशंसित है.

    3. डिटर्जेंट solubilized channelrhodopsin-2 पर ट्रांसमिशन प्रयोगों प्रदर्शन

    1. 5 मिमी NaCl, 5 मिमी HEPES 20 मिमी व्यास की एक BAF 2 खिड़की के केंद्र में (7.4 पीएच) और decyl-maltoside (डीएम) में भंग ChR2 (~ 10 मिलीग्राम प्रोटीन / एमएल) की 10 μl जोड़ें. एक 6-8 मिमी व्यास को micropipette टिप की मदद से यह बिखरा हुआ है (~ 200 ग्राम / सेमी की प्रोटीन सतह घनत्व 2).
    2. एक फिल्म USI पर्चाशुष्क हवा के एक कोमल प्रवाह एनजी. सर्वोत्तम परिणामों के लिए फिल्म सजातीय है और मोटे तौर पर सबसे बड़ी एपर्चर में आईआर किरण का आकार मिलान व्यास है कि सुनिश्चित करते हैं.
    3. ≥ 1 मिमी मोटाई का एक फ्लैट सिलिकॉन O-अंगूठी का उपयोग 3-5 सूखी फिल्म के चारों ओर चला जाता है 3-5 में वितरित ग्लिसरॉल / पानी के मिश्रण से μl, और एक दूसरी खिड़की के साथ यह कसकर करीब जोड़कर फिल्म हाइड्रेट. नोट: ग्लिसरॉल / पानी के मिश्रण का अनुपात Windows 54 के बीच सापेक्ष आर्द्रता नियंत्रित करता है. Hydroscopic नमूने एक 3/7 या 2/8 ग्लिसरॉल / पानी के अनुपात (डब्ल्यू डब्ल्यू /) का उपयोग करें. ग्लिसरॉल / पानी की बूँदें प्रोटीन फिल्म के साथ सीधे संपर्क में नहीं हो जाना चाहिए.
    4. एक धारक में BAF 2 sandwiched Windows डालें. हाइड्रेटेड फिल्म के आकार से मेल खाते एक छेद के साथ इस तरह के पत्र के रूप में एक आईआर अपारदर्शी सामग्री, साथ नमूना खिड़की को कवर द्वारा डिटेक्टर तक पहुँचने से सीधे प्रकाश रोकें. नमूना डिब्बे में धारक रखें.
    5. 25 डिग्री धारक के तापमान को नियंत्रिततापमान नियंत्रित संचार स्नान से जुड़ा एक थर्मास्टाटिक जैकेट द्वारा सी.
    6. एक अवशोषण स्पेक्ट्रम उपाय. एमाइड मैं क्षेत्र में अधिकतम अवशोषण (~ 1,700-1,620 सेमी -1) 0.6-1.0 की रेंज में है कि सुनिश्चित करें.
    7. पानी, डीएम, और प्रतिनिधि झिल्ली प्रोटीन (चित्रा 6) के लिए संदर्भ विलुप्त होने गुणांक स्पेक्ट्रा का उपयोग हाइड्रेटेड फिल्म का अवशोषण स्पेक्ट्रम से बड़े पैमाने पर और प्रोटीन / डिटर्जेंट / पानी की दाढ़ अनुपात (चित्रा 5) का अनुमान है.
    8. जलयोजन स्तर कदम स्कैन प्रयोगों (≥ 1 घंटा) के प्रदर्शन से पहले स्थिर जब तक प्रतीक्षा करें.

    रोमांचक लेजर के 4. समायोजन और तुल्यकालन

    Photocycle ट्रिगर करने के लिए लेजर YAG (λ = 532 एनएम): बीआर प्रयोगों पर एक स्पंदित एन डी की दूसरी हार्मोनिक उत्सर्जन का उपयोग करें. एक सेशन द्वारा प्रदान की गई ChR2 शामिल प्रयोगों के लिए, λ = 450 एनएम के एक उत्तेजना का उपयोगYAG लेजर: राजनैतिक पैरामीट्रिक थरथरानवाला (OPO) एक एन डी के तीसरे हार्मोनिक (λ = 355 एनएम) द्वारा संचालित. लेजर पल्स माध्यमिक फोटो उत्तेजना कम करने के लिए (~ 10 NSEC) पर्याप्त कम है कि सुनिश्चित करें. नोट: लेजर दालों की ऊर्जा के रूप में संभव के रूप में लगातार जाना चाहिए. एक क्षणिक रिकॉर्डर से जुड़ा एक photodiode द्वारा लेजर की एक पलटा मापने और प्रतिक्रिया (चित्रा 8) को एकीकृत द्वारा की पुष्टि के रूप में हमारे सेटअप में, लेजर तीव्रता, मतलब मूल्य के आसपास ≤ 10% उतार चढ़ाव होता रहता.

    1. नमूने के युगल लेजर. एक बिजली मीटर का उपयोग कर नाड़ी प्रति 2-3 MJ / 2 सेमी के लिए नमूना पर लेजर के ऊर्जा घनत्व को समायोजित करें.
      1. एटीआर सेटअप के लिए एटीआर ढक्कन के ऊपर रखा एक ऑप्टिकल फाइबर का उपयोग करें.
      2. प्रसारण प्रयोगों के लिए, नमूना के लिए लेजर लाने के लिए दर्पण का उपयोग करें और, यदि आवश्यक हो, लेंस सीध में रखना या तो या थोड़ा नमूना फिल्म आकार ऊपर एक व्यास के लिए लेजर बीम हट जाना.
    2. लेस सिंक्रनाइज़आर स्पेक्ट्रोमीटर से डेटा रिकॉर्डिंग के साथ पल्स. स्पेक्ट्रोमीटर ट्रिगर करने के लिए लेजर YAG: एन डी के इलेक्ट्रॉनिक्स के क्यू स्विच सिंक बाहर टीटीएल नाड़ी का प्रयोग करें. क्रमश: YAG BR के लिए 10 हर्ट्ज के लिए लेजर और ChR2 के लिए 0.25 हर्ट्ज,: एन डी की उत्तेजना की दर निर्धारित.
    3. लेजर उत्तेजना की दर को नियंत्रित करने के लिए एक नाड़ी देरी जनरेटर (PDG) का उपयोग करते हैं एन डी की पुनरावृत्ति दर: YAG लेजर आसानी से समायोज्य नहीं है.
      1. PDG बाहरी ट्रिगर इनपुट करने के लिए लेजर YAG: एन डी के दीपक सिंक बाहर से कनेक्ट करें. PDG क्यू स्विच एन डी के इनपुट सिंक में करने के लिए एक ~ 190 μsec देरी टीटीएल पल्स उत्पादन प्रदान करता है: YAG लेजर lasing ट्रिगर करने के लिए. गेट PDG केवल पिछले स्वीकृत ट्रिगर (बीआर या ChR2 के लिए 4 सेकंड के लिए 100 मिसे) के बाद से समय की निश्चित अवधि के बाद एक बाहरी ट्रिगर स्वीकार करने के लिए.

    5. समय हल चरण स्कैन तैयारी और सेटिंग्स

    1. ऑप्टिकल पथ में एक कम पास फिल्टर ऑप्टिकल रखें. 1,800-85 में समय हल कदम स्कैन मापन प्रदर्शन0 सेमी -1 वर्णक्रमीय रेंज, 1,950 सेमी -1 ऊपर और 1800 सेमी -1 (चित्रा 7) नीचे अच्छा संचरण (> 50-80%) के साथ एक फिल्टर अपारदर्शी का उपयोग करें.
    2. एसी से डीसी से मिलकर मोड के लिए डिटेक्टर बदलें. नोट: इस समायोजन के बाद interferogram संकेत नहीं रह चारों ओर शून्य लेकिन डीसी स्तर के रूप में जाना एक मूल्य के आसपास हिलाना होगा.
    3. संकेत करने वाली शोर, लेकिन डिटेक्टर के linearity सीमा के भीतर इस तरह का सबसे बड़ा संभव किरण उच्च फोटॉन प्रवाह के लिए स्पेक्ट्रोमीटर के एपर्चर और, बेहतर उपयोग करें.
    4. शून्य करने के लिए interferogram के डीसी स्तर पर लाने और एनालॉग डिजिटल परिवर्तित (एडीसी) के गतिशील रेंज के बेहतर उपयोग करने के लिए इलेक्ट्रॉनिक लाभ रद्दोबदल. पूर्व एम्पलीफायर द्वारा प्रदान संकेत करने के लिए एक वोल्टेज पूर्वाग्रह लगाने से ऑफसेट डीसी स्तर को प्राप्त करने. नोट: इस विकल्प आधुनिक फुट आईआर स्पेक्ट्रोमीटर में शामिल है. अन्यथा, एक घर का बना बाहरी उपकरण preamplifier और एडीसी 38 के बीच रखा, बजाय प्रयोग किया जा सकता है. देखभाल तो हैऐसी डिवाइस के इलेक्ट्रॉनिक्स तेजी से और रैखिक रहे हैं कि यह सुनिश्चित करने की जरूरत है.
    5. फुट आईआर स्पेक्ट्रोमीटर के कदम स्कैन प्रारंभ मेनू. 1,975.3-0 सेमी कदम स्कैन माप के लिए लक्ष्य वर्णक्रमीय बैंडविड्थ सेट -1. थोड़ा ऑप्टिकल फिल्टर की कटऑफ से अधिक, वह-NE लेजर wavenumber (वर्तमान मामले में 1/8 वें) के एक अंश के लिए वर्णक्रमीय बैंडविड्थ को समायोजित करें.
    6. बाद में कई बार कैनेटीक्स की विकृतियों को रोकने के लिए किसी भी उच्च पास इलेक्ट्रॉनिक फ़िल्टर अक्षम. इसके cutoff आवृत्ति क्रम में या एडीसी (शोर अलियासिंग कम कर देता है) का नमूना दर से ऊपर है जब एक कम पास इलेक्ट्रॉनिक फिल्टर फायदेमंद हो सकता है.
    7. क्रमशः, 8 सेमी -1 और 64 सेमी -1 को वर्णक्रमीय और चरण संकल्प सेट. आगे एकल पक्ष को interferogram अधिग्रहण मोड सेट. इन विकल्पों के साथ एक interferogram के बारे में 500 अंक की आवश्यकता है.
    8. 160 के.एच., जैसे (स्पेक्ट्रोमीटर में उपलब्ध उच्चतम करने के लिए एडीसी का नमूना दर निर्धारितजेड, या 6.25 μsec). यानी "बाहरी", "करने के लिए प्रयोग के लिए ट्रिगर" सेट, लेजर मास्टर है. BR (अप करने के लिए 42 मिसे) के लिए 7,000 और 20,000 ChR2 (अप करने के लिए 125 मिसे) के लिए: दर्ज किया जा रैखिक दूरी डेटा बिंदुओं की संख्या निर्धारित करें. नोट: लंबा समय तराजू डाटा अधिग्रहण 38 को गति प्रदान करने के लिए एक लहर जनरेटर से एक अर्ध लघुगणकीय समय दूरी बाहरी टीटीएल दालों का उपयोग एडीसी स्मृति बह निकला बिना कवर किया जा सकता है, या आंतरिक एडीसी 31 के विकल्प के रूप में दो समानांतर क्षणिक रिकार्डर का उपयोग करके, 32.
    9. नमूना के अंधेरे राज्य के लिए एक संदर्भ के रूप में लगभग 100 पूर्व ट्रिगर अंक सहेजें. नोट: मिलीसेकंड समय पैमाने में डेटा गुणवत्ता अक्सर मोबाइल आईने में उतार चढ़ाव के द्वारा सीमित है. 100 से ऊपर पूर्व ट्रिगर अंक बढ़ाने से इसलिए भी महत्वपूर्ण है, डेटा की गुणवत्ता में सुधार की उम्मीद नहीं है.
    10. यानी, photoreaction का मूविंग की संख्या दर्पण मंज़ूर प्रति, सह परिवर्धन की संख्या सेट करेंआयन. BR के लिए, 20 सह परिवर्धन (10 हर्ट्ज उत्तेजना दर पर समय मापने के 20 मिनट) का उपयोग करें. ChR2 2 सह परिवर्धन (0.25 हर्ट्ज उत्तेजना दर पर समय मापने के 70 मिनट) का उपयोग करें
    11. BR के लिए प्रयोग 10x दोहराएँ, और ChR2 के लिए 35x तीन पर अलग नमूना फिल्मों, दर्पण स्थिति के अनुसार अंत में ~ 200 सह परिवर्धन के लिए है.

    6. डाटा प्रोसेसिंग

    1. पहली और आखिरी माप से प्राप्त प्रकाश प्रेरित आईआर अंतर स्पेक्ट्रम की तुलना द्वारा नमूना की स्थिति की पुष्टि. अंतर स्पेक्ट्रम की तीव्रता के नीचे की पहली माप की 60% बूँदें जहां किसी भी माप छोड़ना सम्मिलित करता है.
    2. दर्ज interferograms औसत.
      1. "स्पेक्ट्रम कैलकुलेटर" के लिए उन्हें औसत और जोड़ने के लिए समय हल interferograms चयन FTIR स्पेक्ट्रोमीटर से रचना सॉफ्टवेयर का उपयोग करना.
      2. "=" Interferograms का औसत प्राप्त करने के लिए क्लिक करें.
        नोट: जब interferogram के चरणयह औसत interferograms या एकल चैनल स्पेक्ट्रा के प्रति उदासीन है माप के दौरान स्थिर है. एक निरंतर चरण कंप्यूटिंग और पहले के लिए चरण स्पेक्ट्रम और पिछले रिकॉर्ड interferogram तुलना द्वारा की पुष्टि की जा सकती है.
    3. औसतन समय हल एक चैनल स्पेक्ट्रा प्राप्त करने के लिए फूरियर का औसत समय हल interferograms के बदलने प्रदर्शन करना.
      1. कदम 6.2.1 में के रूप में एक ही सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, औसतन समय हल interferogram का चयन करें और "स्पेक्ट्रा को interferogram" के लिए आइकन पर क्लिक करें. Mertz चरण सुधार विधि, 2 की एक शून्य को भरने कारक (वी संकल्प प्रति दो डिजिटल अंक), और एक apodization समारोह (जैसे, त्रिकोण, Blackmann हैरिस 3 शर्तों, आदि) का प्रयोग करें.
      2. समय हल स्पेक्ट्रा में समय हल interferogram परिणत करने के लिए नीचे "कन्वर्ट" पर क्लिक करें.
    4. एक "डेटा बिंदु तालिका" या एक "के रूप में समय हल एक चैनल डेटा निर्यात करें; Matlab "का उपयोग कर फ़ाइल" रचना सॉफ्टवेयर में आइकन 'के रूप में बचाने के लिए. एक बाहरी कार्यक्रम में डाटा प्रोसेसिंग जारी.
      1. लेजर से पहले एक चैनल स्पेक्ट्रा औसत, और समय हल अवशोषण अंतर स्पेक्ट्रा के लिए समय हल एक चैनल डेटा परिवर्तित.
      2. शोर मानक विचलन, ε का उपयोग, wavenumber के एक समारोह (चित्रा 12) के रूप में अंतर स्पेक्ट्रा में उम्मीद शोर मानक विचलन के लिए एक वेक्टर गणना, और मतलब है, एस 0 (ν), लेजर पूर्ववर्ती 100 एक चैनल स्पेक्ट्रा की: ε / एस 0 (ν). ε के मूल्य लगातार एक चैनल स्पेक्ट्रा घटाकर और √ 2 द्वारा सही मानक विचलन की गणना का अनुमान है.
      3. उपयोग के लिए भी शोर वर्णक्रमीय क्षेत्रों निकालें (1,825 सेमी -1 और 850 से नीचे सेमी ऊपर, जैसे -1).
      4. एक अर्ध logarithmically के औसत (जैसे, 20 स्पेक्ट्रा / समय दशक) करें. appearanडेटा के CE में सुधार होगा और स्पेक्ट्रा की संख्या खो किसी भी महत्वपूर्ण जानकारी (9 चित्रा) के बिना ~ 10 से 2 ~ 10 4 से कम हो जाएगा.
      5. फूरियर प्रक्षेप का उपयोग (1 बिंदु / सेमी -1) अंक की चार बार वर्णक्रमीय घनत्व में वृद्धि (शून्य भरने पोस्ट).
        नोट: हम MATLAB में चल रहे एक घर का बना कार्यक्रम में 6.4.4 के लिए कदम 6.4.1 प्रदर्शन करते हैं.
    5. एकवचन मान अपघटन, SVD, चित्रा (13) के साथ प्राप्त की समय हल स्पेक्ट्रा (चित्रा 10A) की प्रक्रिया. महत्वपूर्ण SVD घटकों (चित्रा 10 बी) की एक सीमित संख्या के साथ डेटा पुनर्गठन द्वारा डेटा denoising पूरा. नोट: हम निर्मित "SVD" समारोह का उपयोग कर matlab में SVD प्रदर्शन करते हैं.

Representative Results

चित्रा 1 एटीआर स्पेक्ट्रोस्कोपी के लिए इस्तेमाल किया हीरे की आंतरिक प्रतिबिंब तत्व की सतह पर जमा br की एक सूखी फिल्म का अवशोषण स्पेक्ट्रम को दर्शाता है. पेप्टाइड बांड (एमाइड ए, एमाइड मैं और एमाइड द्वितीय) के कंपन से विशेषता बैंड स्पष्ट रूप से अलग पहचाना जाता है. सूखी फिल्म के लगभग मोटाई (~ 0.2 सेमी 2) जोड़ा प्रोटीन (18 ग्राम) की राशि और एटीआर की सतह पर, और ~ 1.4 ग्राम / सेमी के रूप में प्रोटीन का घनत्व लेने, ~ 1 माइक्रोन के रूप में अनुमान लगाया जा सकता है 3, 58 और लिपिड के 1.0 के रूप में 3 जी / सेमी, 59 और 1/3 बैंगनी झिल्ली 60 में (डब्ल्यू / डब्ल्यू) के एक लिपिड / प्रोटीन अनुपात.

सूखी फिल्म पीएच 7.4 (चित्रा 3) के 4 एम NaCl, 100 मिमी Napi के अतिरिक्त के साथ rehydrated किया गया था. क्षणभंगुर लहर द्वारा जांच की मात्रा में जलयोजन स्तर और प्रभावी प्रोटीन एकाग्रता डिजिटली अवशोषण बैंड को दूर करने के लिए आवश्यक स्केलिंग कारक से deduced किया जा सकता हैपानी से. इष्टतम स्केलिंग कारक इस मामले में बफर 87% और सतह के पास की मात्रा का नमूना 13% पर है जिसका अर्थ है कि 0.87 था. खाता प्रोटीन और लिपिड घनत्व और बैंगनी झिल्ली में लिपिड / प्रोटीन अनुपात (ऊपर देखें) में ले रहा है, हम क्षणभंगुर लहर द्वारा जांच की मात्रा में 125 मिलीग्राम / एमएल के एक प्रभावी प्रोटीन एकाग्रता परिणाम निकालना कर सकते हैं. हम इस विशेष मामले में, नमूना फिल्म मोटाई ~ 1 से 6 ~ माइक्रोन, पुनर्जलीकरण पर ~ 6 बार विस्तार किया कि जलयोजन स्तर से परिणाम निकालना कर सकते हैं. हमारे लिए और सबसे एटीआर व्यवस्था के लिए ठेठ एक 45 डिग्री घटना कोण, के लिए, एक हाइड्रेटेड प्रोटीन फिल्म के लिए क्षणभंगुर क्षेत्र (डी पी) की प्रवेश गहराई 1,800-850 सेमी -1 61 अंतराल में माइक्रोन 0.3 के बीच और 0.6 बदलता रहता है. क्षणभंगुर क्षेत्र दो बार डी पी 61 के ऊपर स्थित नमूना के लिए लगभग असंवेदनशील है, क्योंकि हम एटीआर प्रयोग में इस्तेमाल किया प्रोटीन की मात्रा डब्ल्यू सिद्धांत कम 5x में हो सकता है अनुमानसंकेत के किसी भी महत्वपूर्ण नुकसान ithout.

कम ईओण ताकत का बफ़र्स का उपयोग करते समय फिल्म अधिक फैलता है, और क्षणभंगुर क्षेत्र द्वारा जांच की मात्रा में प्रोटीन की मात्रा (चित्रा 2) कम हो जाता है. फिल्म सूजन और बफर के ईओण ताकत के बीच सटीक निर्भरता लिपिड की प्रकृति पर, अन्य कारकों के बीच निर्भर करेगा. उदाहरण के लिए, 4 एम NaCl का उपयोग कर बैंगनी झिल्ली में BR के लिए यहाँ प्राप्त के रूप में सूजन एक ऐसी ही फिल्म ध्रुवीय ई. में पुनर्गठित एक झिल्ली प्रोटीन के लिए प्राप्त हुई थी सिर्फ 0.1 एम NaCl 62 का उपयोग कोलाई लिपिड. नमूना जांच मात्रा का कम से कम 5% पर है, तो उच्च ईओण ताकत की एक बफर का उपयोग जलयोजन कदम फिर से विचार कर रही. जलयोजन के बाद सूजन फिल्म स्थिरीकरण (चित्रा 4) तक पहुंचने के लिए कुछ समय की आवश्यकता है. बैंगनी झिल्ली में BR के लिए प्रक्रिया 12 मिनट की एक समय लगातार साथ, monoexponential है: यह एक स्थिर rehydrated फिल्म के लिए कोई अधिक 30-60 से मिनट लगते हैं

चित्रा 5 संचरण द्वारा प्राप्त ChR2 की एक हाइड्रेटेड फिल्म के एक आईआर अवशोषण स्पेक्ट्रम को दर्शाता है. इधर, जलयोजन ग्लिसरॉल / पानी का मिश्रण द्वारा प्रदान नियंत्रित नमी का वातावरण करने के लिए सूखी फिल्म उजागर करके हासिल की थी. स्पेक्ट्रम पानी, डिटर्जेंट और प्रोटीन से योगदान में विघटित किया जा सकता है. हम विलुप्त होने गुणांक स्पेक्ट्रा का उपयोग कर उनमें से प्रत्येक की राशि का अनुमान सकता है, प्रयोगात्मक स्पेक्ट्रम फिट करने के लिए बढ़ाया. पानी के लिए हम साहित्य 63 से विलुप्त होने गुणांक स्पेक्ट्रम ले लिया, और डीएम के लिए हम चित्रा (6) एक 100 मिलीग्राम / एमएल समाधान से यह मापा. Mitochondrial ADP / एटीपी वाहक 64 और BR (चित्रा 7): हम भी दो प्रतिनिधि झिल्ली प्रोटीन के लिए विलुप्त होने गुणांक इस्तेमाल किया. स्केलिंग कारक क्रमश: 260 माइक्रोग्राम / 2 सेमी और फिल्म में 200 माइक्रोग्राम / 2 सेमी की एक पानी और डीएम जन सतह घनत्व को इंगित करता है. शेष अवशोषण (Figurई 5, लाल रेखा) दो अलग झिल्ली प्रोटीन से एमाइड द्वितीय विलुप्त होने गुणांक का उपयोग कर 250 माइक्रोग्राम / 2 सेमी की एक सतह घनत्व में होने का अनुमान प्रोटीन, (6 चित्र देखें) से मुख्य रूप से आता है. प्रोटीन / डिटर्जेंट / पानी के लिए दाढ़ अनुपात क्रमश: 35 केडीए, 480 दा, और 18 दा, के एक आणविक द्रव्यमान का उपयोग 1/60/2000 होने की गणना की गई.

BR पर ठेठ समय हल कदम स्कैन फुट आईआर प्रयोग से एक 3 डी साजिश एटीआर द्वारा प्राप्त और डाटा अधिग्रहण के लिए 200 मिनट से जुड़े, चित्रा 10A में प्रस्तुत किया है. स्पेक्ट्रा एल, बी आर photocycle के एम एन मध्यवर्ती अपने उच्चतम आबादी (11 चित्रा) तक पहुंचने की उम्मीद कर रहे हैं जब उदाहरण के लिए, विशिष्ट समय पर निकाला जा सकता है. उनके वर्णक्रमीय सुविधाओं बड़े पैमाने पर 13,41,65 वर्णित किया गया है और आगे यहाँ पर चर्चा नहीं की जाएगी. 12 कुछ चयनित wavenumbers में समय निशान से पता चलता है. 1,762 सेल्सियस पर कैनेटीक्स अर्थात्, वृद्धिएम -1 (टी 1/2 ~ 60 μsec) रेटिना Schiff आधार 66 से Asp85 protonation की गतिशीलता पर रिपोर्ट, और शून्य करने के लिए अपने क्षय जमीन ऊबाना वसूली 67 पर अपने deprotonation इंगित करता है. 1,740 सेमी -1 (टी 1/2 ~ 1 मिसे) में कैनेटीक्स की नकारात्मक वृद्धि Asp96 पक्ष श्रृंखला, Schiff आधार 68 प्रोटॉन दाता की deprotonation पर रिपोर्ट. कोशिका द्रव्य 67 से इसकी reprotonation पर शून्य रिपोर्टों के तीव्रता का क्षय. प्रोटीन गठनात्मक परिवर्तन की गतिशीलता कमरे के तापमान 67,69 पर ~ 3 मिसे में एक अधिक से अधिक परिवर्तन पहुंचता है जो एमाइड मैं और एमाइड द्वितीय क्षेत्र में अवशोषण परिवर्तन द्वारा जांच की जा सकती.

समस्याओं स्पेक्ट्रोस्कोपी के लिए SVD का आवेदन 55,56 से पहले समीक्षा की गई है. एक = यू एस: संक्षेप में, SVD के रूप में, एक मैट्रिक्स एक में व्यवस्था की प्रयोगात्मक डेटा, factorizes टी. इस factorization wavenumber पर शोर निर्भरता के लिए खाते में और आधारभूत 57 में उतार चढ़ाव / drifts दंडित करने के लिए संशोधित किया जा सकता है. यू और वी के कॉलम क्रमशः, प्रत्येक SVD घटक के लिए orthonormal स्पेक्ट्रा और समय निशान वैक्टर होते हैं. एस तथाकथित विलक्षण मूल्यों से युक्त एक विकर्ण मैट्रिक्स है. यू और वी में (सार) Spectro-अस्थायी घटकों उनके संबद्ध विलक्षण मूल्य द्वारा मात्रा कम से कम वर्ग भावना, में प्रयोगात्मक डेटा का वर्णन करने के लिए प्रासंगिकता कम करने में दिखाई देते हैं. चित्रा 13A घटक संख्या के एक समारोह के रूप में विलक्षण मान दिखाता है, और यू (सार स्पेक्ट्रा, चित्रा 13B) और वी (सार समय निशान, चित्रा 13C) के पहले आठ कॉलम / घटकों reproduces. एक पीएच के लिए उम्मीद के रूप में संकेत (पहले पांच घटकों में केंद्रित हैotocycle पांच मध्यवर्ती राज्यों से युक्त), बड़े पैमाने पर यादृच्छिक शोर और त्रुटियों के अन्य स्रोतों का बोलबाला ऊपर घटकों के साथ. प्रयोगात्मक डेटा यू और वी के पहले पांच स्तंभों, और पहले पांच स्तंभों और एस की पंक्तियों केवल उपयोग कर खंगाला गया था. SVD से खंगाला डेटा रैंक पांच में से एक मैट्रिक्स के लिए प्रयोगात्मक डेटा का सबसे अच्छा कम से कम वर्ग सन्निकटन का प्रतिनिधित्व करता है. खंगाला डेटा गुणवत्ता में सुधार (चित्रा 10B) से पता चलता है. अर्थात्, शोर काफी हद तक (समय हल कदम स्कैन स्पेक्ट्रोस्कोपी 25 में आम) आधारभूत में कुछ मुश्किल से नजर उतार चढ़ाव और drifts, साथ ही कम है. SVD प्रसंस्करण millisecond रेंज में प्रयोगात्मक समय निशान (चित्रा 12 में लाल लाइनों) की गुणवत्ता में सुधार लाने के लिए विशेष रूप से लाभप्रद है.

ChR2 photocycle के लिए समय हल कदम स्कैन डेटा पारेषण के लिए ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग कर प्राप्त किया गया मोटे तौर पर संचित माप के 120 घंटे से जुड़े सायन प्रयोगों (चित्रा 14A),. कदम स्कैन द्वारा एकत्र समय हल डेटा 6.25 μsec से 125 मिसे तक फैली हुई है. ChR2 की photocycle पूरी वसूली के लिए लगभग 60 एस की आवश्यकता है. photocycle का नवीनतम हिस्सा तेजी से स्कैन फुट आईआर का उपयोग कर कवर किया जा सकता है, और कहीं 48 के रूप में प्रस्तुत कदम स्कैन और तेजी से स्कैन डेटा सेट दोनों का विलय कर दिया. ChR2 के वर्णक्रमीय परिवर्तन माप अधिक चुनौतीपूर्ण बनाने, बीआर से प्राप्त उन लोगों की तुलना ~ 10 गुना छोटे होते हैं. विशेष रूप से, millisecond रेंज में आधारभूत में दोलनों इन कम अवशोषण परिवर्तन पर स्पष्ट रूप से स्पष्ट हो गया है. ये मिलीसेकंड समय स्केल 25 में मोबाइल आईने में छोटे दोलनों के कारण होते हैं. दोलनों, एक साथ शोर के हिस्से के साथ, मोटे तौर पर उल्लेखनीय डेटा की उपस्थिति (चित्रा 14B) में सुधार, SVD द्वारा हटाया जा सकता है.

gure 1 "के लिए: सामग्री चौड़ाई =" 5in "src =" / files/ftp_upload/51622/51622fig1highres.jpg "चौड़ाई =" 500 "/>
बैंगनी झिल्ली में बीआर चित्रा 1. अवशोषण स्पेक्ट्रम एक एटीआर गौण के शीर्ष हीरे की सतह पर सूख गया. पेप्टाइड बंधन के कंपन से बैंड (एमाइड मैं, द्वितीय, और ए) संकेत कर रहे हैं.

चित्रा 2
विभिन्न ईओण ताकत का buffers का उपयोग पुनर्जलीकरण के बाद br की एक फिल्म की चित्रा 2. अवशोषण स्पेक्ट्रम (4 एम NaCl, 100 मिमी ना 2 HPO की dilutions 4 / नाह 2 7.4 पीएच में 4 पीओ). एमाइड द्वितीय बैंड की कमी देख, यानी, बफर के ईओण ताकत में कमी के साथ, फिल्म सूजन वृद्धि हुई है. Subtracti के बाद 1,541 सेमी -1 (एमाइड द्वितीय अधिकतम) पर absorbance की तीव्रता द्वारा मात्रा सतह के पास प्रोटीन की (सम्मिलित) रिश्तेदार राशि,बफर का अवशोषण योगदान के पर.

चित्रा 3
थोक बफर (4.3 एम ईओण ताकत) और बफर योगदान के घटाव के बाद साथ rehydrated br की एक फिल्म की चित्रा 3. अवशोषण स्पेक्ट्रम. घटाव कारक, 0.87, 3,700-3,000 सेमी के बीच मजबूत पानी अवशोषण हटाने -1 और करने के लिए चुना गया था 2,700-1,800 सेमी -1 के बीच एक फ्लैट आधारभूत प्राप्त करने के लिए.

चित्रा 4
4.3 एम ईओण ताकत का एक बफर के साथ पुनर्जलीकरण के बाद BR की चित्रा 4. अवशोषण स्पेक्ट्रम (बफर अवशोषण चित्रा 3 में के रूप में स्पष्टता के लिए घटाया गया है). डालने rehydrat बाद सूजन फिल्म के विकास से पता चलता हैआयन, 1541 सेमी -1 में प्रोटीन एमाइड द्वितीय absorbance के द्वारा पीछा किया. एक एकल घातीय एक फिट 12 मिनट की फिल्म सूजन स्थिरीकरण के लिए एक समय लगातार इंगित करता है.

चित्रा 5
संचरण (ब्लू लाइन) द्वारा मापा ChR2 की एक हाइड्रेटेड फिल्म की चित्रा 5. अवशोषण स्पेक्ट्रम. विलुप्त होने गुणांक पानी के स्पेक्ट्रम (धराशायी नारंगी लाइन) और डीएम (धराशायी सियान लाइन) पहुंचा और (लाल रेखा) घटाया गया था.

चित्रा 6
तरल पानी के लिए 25 डिग्री सेल्सियस (http://www.ualberta.ca/ ~ jbertie / JBDownload.HTM # स्पेक्ट्रा) पर और ADP / एटीपी वाहक (एएसी) के एक हाइड्रेटेड फिल्म के लिए 6 चित्रा. Reproduced जन विलुप्त होने गुणांक स्पेक्ट्रा 64 . टुनिशिया> जन विलुप्त होने गुणांक स्पेक्ट्रम डीएम (100 मिलीग्राम / एमएल) के लिए समाधान में मापा, और br लिए एक हाइड्रेटेड फिल्म में किया गया था.

चित्रा 7
समय हल स्कैन स्कैन फुट आईआर माप में इस्तेमाल ऑप्टिकल फिल्टर का आंकड़ा 7. संप्रेषण.

8 चित्रा
. 8 चित्रा एक एन डी के दूसरे हार्मोनिक (532 एनएम) द्वारा प्रदान की लेजर दालों का प्रदर्शन:. 1000 लेजर दालों के सापेक्ष ऊर्जा की भिन्नता के YAG लेजर हिस्टोग्राम, और 0.05 की एक मानक विचलन के साथ एक गाऊसी वितरण के लिए फिट बैठते हैं.

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चित्रा 9. अंतराल (हरे, काले और नीले रंग की लाइनों) रिक्ति वर्दी समय पर तीन प्रतिनिधि wavenumbers पर BR के absorbance परिवर्तन प्रकाश प्रेरित और अर्ध लघुगणक औसत के बाद ~ 20 अंक / दशक (लाल लाइनों). के बाद शोर में कमी को नोटिस लघुगणक औसतन, समय का दोलन खुलासा millisecond रेंज में बताते हैं.

चित्रा 10
पीएच 7.4 (4 एम NaCl, 100 मिमी NAPI) पर एटीआर द्वारा दर्ज BR के लिए प्रकाश प्रेरित absorbance के परिवर्तन का आंकड़ा 10. 3D प्रतिनिधित्व. पांच SVD घटकों के साथ खंगाला एक) कच्चे डेटा. बी) डेटा. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.


चित्रा 11. एल (12.5 μsec), एम (300 μsec), और एन (6 मिसे) मध्यवर्ती सबसे समृद्ध कर रहे हैं, जहां तीन चयनित समय पर BR photocycle की फुट आईआर अंतर अवशोषण स्पेक्ट्रा.

चित्रा 12
समय हल कदम स्कैन फुट आईआर अंतर स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा हल के रूप में बीआर photocycle में चित्रा 12. प्रोटॉन हस्तांतरण और प्रोटीन रीढ़ की गतिशीलता. 1,762 सेमी -1 Asp85 की protonation / deprotonation गतिशीलता पर रिपोर्ट, में और 1,741 सेमी पर absorbance परिवर्तन -1 (300 μsec पहले एच संबंध परिवर्तन सहित) Asp96 की deprotonation / reprotonation गतिशीलता पर. 1,670 में समय निशान और 1,555 सेमी -1पेप्टाइड रीढ़ की रचना करने के लिए संवेदनशील दोनों की रिपोर्ट एमाइड मैं में परिवर्तन और द्वितीय कंपन,. वापस निशान कच्चे डेटा के अनुरूप है, और SVD इलाज डेटा के लिए लाल वाले. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 13
चित्रा 13. BR photocycle की प्रयोगात्मक समय हल कदम स्कैन फुट आईआर डेटा के एकमात्र मूल्य अपघटन (SVD) (चित्रा 10A देखें). SVD खाते में wavenumber पर शोर मानक विचलन निर्भरता लेने प्रयोगात्मक डेटा तौल के बाद किया गया था (चित्रा 15); 57. एक से पहले के रूप में वर्णित, आधारभूत उतार चढ़ाव का सांख्यिकीय वजन कम करने के लिए 1 सेंट व्युत्पन्न के साथ संयुक्त) & #160, पहले 50 घटकों (काला हलकों) के सापेक्ष विलक्षण मूल्यों का प्लॉट. पहले पांच घटकों घटकों (लाल हलकों) संकेत को सौंपा है. शोर घटकों के लिए उम्मीद की तेजी के रूप में घटकों क्षय के बाकी (धराशायी ग्रे लाइन देखें). बी) पहले आठ सार स्पेक्ट्रा (यू से 8 यू 1). सी) पहले आठ सार समय निशान (वी 8 वी 1). संकेत को सौंपा सार स्पेक्ट्रा और समय निशान लाल लाइनों में दिखाया गया है, और नहीं तो काले लाइनों के साथ. रहे इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

14 चित्रा
कदम स्कैन द्वारा दर्ज ChR2 के लिए प्रकाश प्रेरित आईआर absorbance के परिवर्तन का आंकड़ा 14. 3D प्रतिनिधित्वप्रसारण विधा में. कदम स्कैन डेटा केवल photocycle का एक हिस्सा है. एक) कच्चे डेटा को कवर. बी) पाँच SVD घटकों के साथ खंगाला डाटा, 125 मिसे तक फैली हुई है. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 15
पर एक फुट आईआर. अंतर अवशोषण स्पेक्ट्रम में चित्रा 15. अनुमानित शोर स्तर 6.25 μsec लौकिक और 8 सेमी -1 1 co-addition/mirror स्थिति (500 photoreactions) या ~ 200 co-addition/mirror स्थिति से जुड़े एक प्रयोग के लिए वर्णक्रमीय संकल्प (10 5 photoreactions). मान तनु कुल प्रतिबिंब (एटीआर) और प्रसारण स्थापना के लिए दिखाए जाते हैं.

Discussion

एक प्रोटीन पर समय हल कदम स्कैन फुट आईआर प्रयोगों प्रदर्शन जब विचार की जरूरत है कि पहली पहलुओं में से एक आईआर स्पेक्ट्रोस्कोपी के लिए एक उपयुक्त प्रपत्र में एक नमूना की तैयारी है. ब्याज की प्रोटीन के अलावा अन्य पदार्थों से आईआर अवशोषण कम किया जाना चाहिए, विशेष रूप से पानी से है. सबसे आम तरीका एक फिल्म के लिए फार्म का नमूना के थोक पानी लुप्त हो जाना है. फिल्म एक जलीय घोल की कुछ बूंदों जोड़कर या नियंत्रित नमी का वातावरण करने के लिए इस फिल्म को उजागर करके या तो rehydrated किया जा सकता है. हम दोनों ही मामलों में यह आईआर अवशोषण स्पेक्ट्रोस्कोपी के माध्यम से प्राप्त जलयोजन स्तर (चित्रा 3 और 5 चित्र देखें) का अनुमान कैसे संभव है पता चला है. प्राप्त जलयोजन स्तर समाधान में उन लोगों की तुलना में कम दिखाई दे सकता है, वे कार्यात्मक प्रासंगिक प्रोटीन की हाइड्रेटेड फिल्मों का अध्ययन कर रही है, वास्तव में जीवित कोशिकाओं के 70 में पाए जाने वाले के करीब हैं. पानी के अलावा, यहपता करने के लिए और नमूने में लिपिड या डिटर्जेंट की मात्रा को नियंत्रित करने के लिए भी महत्वपूर्ण है. दोनों आईआर अवशोषण में एक कम स्पेक्ट्रोस्कोपी प्रभाव पड़ता है काफी कम रखा है, लेकिन ब्याज की प्रोटीन की अखंडता और कार्यक्षमता को बनाए रखने के लिए पर्याप्त उच्च किया जाना चाहिए.

समय हल कदम स्कैन स्पेक्ट्रोस्कोपी प्रकाश द्वारा reproducibly शुरू हो सकता है कि प्रतिवर्ती प्रतिक्रियाओं दिखा प्रोटीन के लिए केवल straightforwardly लागू है (लेकिन तेजी से बफर मुद्रा के साथ कदम स्कैन युग्मन में प्रगति देखें) 71. में प्रतिक्रिया में कम से कम ~ 500x के लिए प्रतिलिपि प्रस्तुत करने की आवश्यकता है कदम स्कैन, न्यूनतम संख्या 8 सेमी -1 संकल्प पर 1,800-850 सेमी -1 क्षेत्र को कवर एक interferogram पूरा करने के लिए. व्यवहार में, हालांकि, अतिरिक्त डेटा औसत आम तौर पर नीचे शोर स्तर पुश करने के लिए आवश्यक है. 200 co-additions/mirror स्थिति (प्रतिक्रिया की 10 5 repetitions) के लिए एक 6.25 μsec संकल्प absorbance के अंतर स्पेक्ट्रम एक शोर स्टेशन प्रदर्शित कर सकते हैंndard विचलन एक एटीआर के लिए और -5 10 एक्स -6 10 एक्स 5 और 3 के बीच एक संचरण प्रयोग (चित्रा 15) के लिए -4 10 एक्स -5 10 एक्स 2 के बीच और 2. इसकी उच्च फोटॉन throughput, संचरण के लिए धन्यवाद एटीआर, सफलतापूर्वक ऐसी ChR2 के रूप में कमजोर अवशोषण परिवर्तन देने के नमूनों के अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण पहलू से ~ 7 कम शोर के स्तर के लिए अनुमति देता है. दूसरी ओर, एटीआर एक प्रसारण प्रयोग से 5 बार से 25 कम नमूना की आवश्यकता है.

समय हल कदम स्कैन फुट आईआर स्पेक्ट्रोस्कोपी के आवेदन धीमी photocycles प्रदर्शित प्रोटीन के लिए समस्याग्रस्त है: चरण स्कैन करके एक interferogram रिकॉर्डिंग लंबे अव्यावहारिक बन सकता है. कुछ समाधान अक्सर वृद्धि की प्रोटीन की खपत और प्रयोगात्मक जटिलता 27,74 की कीमत पर माप तेजी लाने के लिए कई विनिमेय नमूनों के प्रयोग पर आधारित ऐसे मामलों 72,73, से निपटने के लिए प्रस्तुत किया गया है. कुछ उदाहरणों में यह पूर्व से इस समस्या को नाकाम करने के लिए संभव हैphotocycle सख्ती से पूर्ण होने से पहले नमूना हवाला देते हुए. ChR2 के लिए, 99% वसूली के लिए फोटो उत्तेजना 60 सेकंड के बाद की आवश्यकता होती है एक photocycle साथ, 4 सेकंड में वसूली पहले ही 80% 48 की है. लेजर पल्स दर 10% के एक उत्तेजना दक्षता के साथ, ChR2 अणुओं का 98% 0.25 हर्ट्ज के लिए एक लेजर पुनरावृत्ति दर पर प्रयोगों प्रदर्शन करने के लिए संभव बनाने, फोटो उत्तेजना के बाद अंधेरा राज्य 4 सेकंड में कर रहे हैं.

डाटा प्रोसेसिंग के लिए सर्वोत्तम संभव परिणाम प्राप्त करने के लिए आवश्यक एक अंतिम तकनीकी पहलू है. लघुगणक औसत शोर कम कर देता है और, यह भी महत्वपूर्ण है, विलक्षण मान अपघटन या वैश्विक फिटिंग का उपयोग, विकृतियों के बिना पीछे डेटा विश्लेषण के लिए एक सुविधा आवश्यक डेटा का आकार कम कर देता है. लघुगणक औसतन, तथापि, माप के दौरान मोबाइल दर्पण और अन्य 1 / च शोर स्रोतों (9 चित्रा) में दोलनों के कारण समय निशान में उतार चढ़ाव बाहर के औसत में बहुत सफल नहीं है. आधारभूत में ये उतार चढ़ावmillisecond रेंज और डेटा की भ्रष्ट गुणवत्ता में शोर अधिक हो सकती है. एकवचन मान अपघटन शोर को कम करने के लिए डेटा के अतिरेक का लाभ लेता है, और कुछ संशोधनों के 57 के साथ यह रूप में अच्छी तरह से आधारभूत में उतार चढ़ाव को कम कर सकते हैं.

अंत में, एक समय हल कदम स्कैन फुट आईआर प्रयोग के लिए कठिन है और सबसे अधिक समय लेने हिस्सा बैंड के काम करने के लिए और डेटा का वर्णक्रम और गतिज व्याख्या से मेल खाती है. Bacteriorhodopsin लिए आईआर अंतर स्पेक्ट्रा में प्रदर्शित होने के बैंड के कई दशकों में कई शोधकर्ता समूहों की संचित काम करने के लिए धन्यवाद सौंपा या व्याख्या की गई है. ऐसे channelrhodopsin-2 के रूप में एक बहुत कम अध्ययन प्रोटीन, के लिए, ऊपर प्रस्तुत समय हल आईआर प्रयोगों साइट निर्देशित म्यूटेंट पर समानांतर प्रयोगों के साथ और एक यंत्रवत व्याख्या 48 तक पहुँचने के लिए पूरक तकनीकों से जानकारी के साथ संयुक्त किया जाना चाहिए.

Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हित की घोषणा.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
FT-IR spectrometer Bruker Vertex 80v Equipped with photovoltaic-MCT detector, an external global, and an oil-free pump. Firmware 2.3.
BaF2 windows korth Kristalle
Diamond ATR accesory Smiths detection Nine-reflection DuraDisk
Thermostatic bath Julabo F25
Vibration decoupled table OPTA
Pulsed Nd:YAG laser with a second harmonic generator Continuum electro-Optics Minilite 
Optical parametric oscillator (OPO) OPTA BBO-355-VIS/IR S/N 1009
Digital delay/pulse generator  Stanford Research Systems DG535
Pulsed Nd:YAG laser with a third harmonic generator Spectra-Physics Quanta-Ray
Various optical mirrors and lenses ThorLabs
OPUS 7.0 Bruker Software to control Vertex 80v spectrometer
MATLAB run time Mathworks Used to run home-made executable programs to preprocess the data

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References

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