Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Engineering
Click here for the English version

Engineering

העברת פרוטון והחלבון Dynamics קונפורמציה בחלבונים רגישים לאור בזמן נפתר-Step-לסרוק פורייה-להפוך ספקטרוסקופית אינפרא אדום

Published: June 27, 2014 doi: 10.3791/51622
Automatic Translation
1, 1
1Experimental Molecular Biophysics, Freie Universität Berlin

Abstract

ניטור הדינמיקה של protonation וחלבון שינויי קונפורמציה עמוד השדרה במהלך הפונקציה של חלבון הוא צעד חיוני לקראת הבנת המנגנון שלה. שינויי protonation וקונפורמציה משפיעים על דפוס הרטט של רשתות בצד של חומצות אמיניות ושל אג"ח פפטיד, בהתאמה, אשר שניהם יכולים להיות נחקר על ידי ספקטרוסקופיה הבדל אינפרא אדום (IR). לחלבונים שתפקידם יכולים להיות שוב ושוב וreproducibly מופעל על ידי אור, ניתן לקבל ספקטרום הבדל אינפרא אדום עם רזולוציה המיקרו (משנה) על פני טווח ספקטרום רחב באמצעות טכניקת אינפרא אדום צעד לסרוק ההתמרה פורייה. עם ~ 10 2 -10 3 חזרות של photoreaction, המספר המינימאלי כדי להשלים את סריקה ברזולוציה ספקטרלית סבירה ורוחב פס, את רמת הרעש בספקטרום הבדל קליטה יכולה להיות נמוכה כמו ~ 10-4, מספיק כדי ללכת בקינטיקה של שינויי protonation מחומצת אמינו אחת. נמוך יותרניתן להשיג רמות רעש על ידי מיצוע יותר נתונים ו / או עיבוד מתמטי. כמות החלבון הדרושה לתוצאות אופטימליות היא בין 5-100 מיקרוגרם, תלוי בטכניקת הדגימה בשימוש. בנוגע לדרישות נוספות, החלבון צריך להיות מרוכז ראשונה בחיץ כוח היוני נמוך ולאחר מכן מיובש כדי ליצור סרט. סרט חלבון התייבשות לפני הניסוי, או עם טיפות קטנות של מים או בלחות באטמוספרה מבוקרת. רמת הלחות המושגת (גרם של מים / גרם של חלבון) נמדדה מספקטרום ספיגת IR. כדי להפגין את הטכניקה, למדנו photocycle של bacteriorhodopsin פרוטון משאבה מונע האור בסביבה הסגולה המקורית שלו בממברנה, ושל ערוץ יון channelrhodopsin-2-מגודרת אור solubilized בחומרי ניקוי.

Introduction

על מנת להבהיר באופן מלא כיצד חלבונים לבצע את תפקידם, הוא נדרש למדוד אותם כפי שהם פועלים, כלומר לאורך נתיב תגובה כי לעתים קרובות כרוך בסדרה של שלבי ביניים ומרחיב צווים שונים של זמן. שלבים עיקריים של תפקוד חלבון מתקיימים לעתים קרובות במייקרו לאלפית שני טווח זמן 1, בפרט שינויי קונפורמציה עמוד השדרה ותגובות העברות פרוטון בחלבונים בממברנה. קריסטלוגרפיה באמצעות קרן רנטגן, ניתן לטעון את עמוד התווך של ביולוגיה מבנית, מספקת צפיפות אלקטרונים (זמן ממוצע) סטטי מגבישי חלבון diffracting היטב, קשה לשמצה לגדול עם חלבוני קרום 2. מודל אטומי 3D יכול להיות בנוי על בסיס צפיפות אלקטרונים, אם כי רק לעתים נדירות, כולל מיקום של אטומי מימן. התקדמות מרשימה בקריסטלוגרפיה באמצעות קרן רנטגן בזמן נפתר, בהסתמך גם על אואה עקיפה 3 או בפולסים רנטגן femtosecond 4, מוסיפה את ממד הזמן למידע המבני הגבוה בHerent לקריסטלוגרפיה באמצעות קרן רנטגן 5. אבל נתעלם אתגרים טכניים ואנליטי, הסריג הגבישי יכול לפגוע שינויי קונפורמציה עמוד השדרה ולשנות דינמיקת חלבון, חסרון בלתי נמנע של שיטות המבוסס על גבישי חלבון 5. כתוצאה מכך, היבטים דינמיים של חלבונים עדיין מכוסים על ידי מיטב שיטות אופטיות, כחלוץ ידי הבזק photolysis 6,7, אם כי עם החסרון הכללי של תובנה מבנית מוגבלת.

ספקטרוסקופיה פורייה הפכה אינפרא אדום (FT-IR) משלבת את ההחלטה הזמנית של spectroscopies האופטי עם רגישות רבת ערך למבנה חלבון, התכונה שעברה ניצלה בחקירות מבניות ותפקודיות סטטי אין ספור על חלבוני קרום 8-11. בפרט, ספקטרוסקופיה הבדל FT-IR הוכיחה להיות כלי אידיאלי ללמוד שינויי רפאים זעירים כמעברי חלבון ממצב אחד metastable ל12-19 אחר.

Studies על דינמיקת חלבון, מלבד ברמת המולקולה בודדת 20,21, דורש תהליך מפעילה לסנכרון. תגובה היא יזם נוח מהיר ולא פולשני באמצעות אור כהדק, כפי שנעשתה במחקר של חלבונים עם photoreactions המחזורי. אתגר עיקרי הקשורים ללימודים בזמן נפתר הוא השגת הרזולוציה מספיק זמן, תוך שמירה על רזולוציה ספקטרלית טובה ויחס אות לרעש מתאים. חיוני גם הוא כדי לכסות את טווח ספקטרום וזמן רחב דיו. ספקטרוסקופיה FT-IR צעד סריקת זמן נפתר מצטיינת בכל ההיבטים הללו 22, עם דוגמאות שפורסמו מכסות טווחים רחבים של רוח רפאים כמו 3,900-850 -1 סנטימטר ודינמיקת הארכה ~ 9 הזמנות של זמן, עם עד 3.5 -1 סנטימטר רפאים ו30 החלטה זמנית NSEC 23-28.

ספקטרומטרים פורייה-להפוך IR להראות רעש מופחת ודיוק פוטומטריה משופר מעל נפיצה אלה 29. Howevאה, במצב ההקלטה מהיר הסריקה הרגילה ספקטרומטרים FT-IR סובלים מרזולוצית זמן מוגבלת ל≥ 5-10 אלפיות שני כתוצאה מהזמן המינימאלי המראה הניידת של אינטרפרומטר דורשת להשלים את סריקה. עם טכניקת צעד הסריקה, בניגוד לכך, התלות של האירוע הדינמי הזמן מנותק ממשך הסריקה של אינטרפרומטר. בקצרה, את מהלכי המראה הניידים בשלבים בדידים ולא סריקה ברציפות כדי להשלים את סריקה. בכל אחד מהשלבים הבאים במראה (הנייד) מוחזק קבוע וחולף נרשם. לפיכך, ברזולוציה הזמן מוגבלת על ידי זמן העלייה של הכספית קדמיום טלוריד-גלאי (MCT), שהוא בדרך כלל בטווח של 10-100 NSEC. בפועל, הטווח הדינמי הגדול של interferogram (המכיל אות אינטנסיבית באותות centerburst וקטנים בכנפיים), דורש לדיגיטציה נאותה ממיר אנלוגי / דיגיטלי (ADC) עם רבים כמו 16-24 חתיכות, מה שמוביל לדגימה שיעור גבוה יותר מאשר לא ~ 200 kHz (Μsec 5) 30. רזולוציה זמן שבריר שנייה יכולה להתבצע על ידי מדידה רק השינויים בinterferogram, שעבורו ADC קצת 8-12 הוא 23,31-33 מספיק. היבטים טכניים 30,34,35 ויישומים 36-38 של שלב סריקת זמן נפתר כבר דנו בפירוט במקום אחר.

מטרת התרומה הנוכחית היא לספק פרוטוקול מתאר המעשי של צעד סריקת ספקטרוסקופיה FT-IR זמן נפתר על חלבוני קרום רגישים לאור. הנה, את הביצועים של הטכניקה מוצגים עבור שתי שיטות דגימה: שידור והשתקפות מוחלשת כוללת (ATR). השימוש בATR מאפשר עבודה בנוכחות של מים עודפים, אשר לא רק מבטיחה תנאי לחות מלאים לחלבון, אלא גם מאפשרת שליטה חריפה של ה-pH המדגם והכוח היוני 49,50. ניסויי שלב לסרוק מומחשים בשתי מערכות שנבחרו: bacteriorhodopsin וchannelrhodopsin-2.

> Bacteriorhodopsin מונע אור משאבת פרוטון (BR) כבר הנושא למחקרי biophysical רבים במשך יותר מארבעים שנים 39,40, מה שהופך את חלבון הקרום ביותר הבין עד כה. בין הטכניקות הרבות פנו למחקר של ספקטרוסקופיה FT-IR פונקציונלי BR יש מופעל ללא ספק אחת ההשפעות הגדולות ביותר. כלומר, ספקטרוסקופיה FT-IR הייתה מפתח לפתרון הקבוצות מעורבות בהעברת פרוטון על פני הקרום כהיווה מקום אחר 13,41,51.

Channelrhodopsin (CHR) הוא יון הערוץ הראשון מגודרת אור המצויים בטבע 42,43. אור עירור של Chr מוביל לפתיחה הזמנית של תעלות יונים. גילויו התיישב את הדרך לפיתוח של optogenetics, שבו תהליכים מולקולריים נשלטים על ידי 44,45 אור. Chr שייך, כמו BR, למשפחתו של rhodopsins חיידקים אבל בניגוד לBR, הרבה פחות ידוע על מנגנון הפעילות שלה 52. ChR2 משלב את תפקידה כioערוץ n עם פעילות פרוטון שאיבת 46,47. לאחרונה, אנחנו מוחלים ספקטרוסקופיה FT-IR צעד סריקת זמן לפתור לפתור תגובות העברת פרוטון תוך חלבון ואת הדינמיקה של חלבוני עמוד השדרה שינויי קונפורמציה בChR2 48.

Protocol

1. היבטים כלליים של מדגם וכלי הכנה

  1. השתמש ספקטרומטר FT-IR מסחרי מצויד למדידות צעד סריקת זמן נפתר. לקבלת התוצאות הטובות ביותר למקם את ספקטרומטר FT-IR על גבי שולחן decoupled רטט.
  2. לפנות את תא אופטיקה לכמה mbar. טהר את תא המדגם עם אוויר או חנקן יבש.
  3. הנח חומר שקוף IR אטום לקרינה גלויה מול גלאי MCT של ספקטרומטר FT-IR. אמצעי זהירות זה הוא חיוני כדי למנוע מחפצי דופק הלייזר המרגש במהלך ניסויי שלב סריקה. הערה: אנו משתמשים גרמניום חלון (גה) של 25 קוטר מ"מ. מקדמת השבירה הגבוהה שלה גורמת לעצמה רצויה מאבדת, במידה רבה, נמנעה מלהשתמש במסנן גה עם ציפוי antireflecting.
  4. לצנן את דיואר גלאי MCT עם חנקן נוזלי. שים לב: השימוש בגלאי MCT פוטו עדיף על פני photoconductives בגלל התגובה ליניארי שלהם, ולכן, photometr מעולהדיוק ic ואמינות בסיסית 31,53.
  5. טרום להתרכז המדגם המשמש לניסויים ללפחות 2 חלבון / מיליליטר מ"ג במאגר של נמוך (<20 מ"מ) כוח היוני כדי למנוע היווצרות של גבישי מלח תוך ייבוש ההשעיה החלבון ויוצר את סרט חלבון הומוגנית. לקבלת דוגמיות שמשקעים, לשטוף / לרכז אותם על ידי יישום ultracentrifugation (למשל, חלבונים בממברנה ביפוזומים או בכתמי קרום תא). השתמש centricons של הפסקת ראויה לחלבונים שאינם משקעים (למשל, חלבונים בממברנה solubilized חומר ניקוי).
  6. לשימוש תוצאות אופטימליות: א) הכנות חלבון טהור וכפעיל ככל האפשר; ב) יחסי שומנים / חלבון ≤ 3 במשקל לחלבונים בטלאים קרום תא או מחדש ביפוזומים; ג) יחסי חומרי ניקוי / חלבון ≤ 1 במשקל לחלבוני אבקת solubilized. הימנע משימוש בחומרי ניקוי או שומני להקות שרטט חפיפה עם אלו של החלבון (לדוגמא, בחורים).
    7. 2. הכנת ניסויי השתקפות נחלש סה"כ בBacteriorhodopsin

    1. הר אבזר ATR לתוך תא המדגם של ספקטרומטר FT-IR. הערה: אנו משתמשים ATR ZnSe / יהלומים עם 5 השתקפויות פעילים. הימנע מחומרים מוליכים למחצה כגון גרמניום או סיליקון כאלמנט השתקפות פנימי (IRE) של אבזר ATR, כפי שהתכונות אופטיות שלהם מושפעות מהליזר הגלוי המרגש.
    2. מדוד רחב טווח (כ 4,000-800 -1 סנטימטר) ספקטרום אנרגיה ב 4 -1 סנטימטר ברזולוציה של פני השטח IRE הנקי על ידי ספקטרוסקופיה FT-IR מהירה סריקה הקונבנציונלית. השתמש בספקטרום הזה כספקטרום התייחסות לחישוב ספקטרום ספיגה בשלב מאוחר יותר.
    3. לכסות את פני השטח IRE של ATR עם 20 μl של המאגר המשמש מאוחר יותר לרעננות המדגם (למשל, 4 M NaCl ו100 מ"מ NaPi ב-pH 7.4). מדוד את קליטת IR של המאגר.
    4. הסר את החיץ, ולשטוף את משטח wi IREמים ה. הימנע ממגע עם פני השטח. הסר את הנוזל שנותר בשטח IRE על ידי זרימת אוויר אינטנסיבית.
    5. מורחים ~ 3 μl של bacteriorhodopsin (BR) בקרום סגול (~ חלבון 6 מ"ג / מיליליטר במים deionized) על גבי משטח IRE (~ 0.2 2 סנטימטר באזור). ייבש את ההשעיה החלבון תחת זרם עדין של אוויר היבש עד סרט מושגת.
    6. מדוד את ספקטרום הספיגה של הסרט היבש (ראה איור 1).
    7. בעדינות להוסיף 20-40 μl של חיץ של כוח היוני גבוה רעננות הסרט היבש (לדוגמא, 4 M NaCl ו100 מ"מ NaPi ב-pH 7.4). הערה: הכוח היוני הגבוה מונע נפיחות מוגזמת של סרט הקרום, המאפשר לשמור על כמה שיותר חלבון קרוב אפשרי אל פני השטח גשש (איור 2).
    8. מכסה את בעל ATR עם מכסה כדי למנוע אידוי מים. לחלופין, למקם את כיסוי מעיל מחובר לאמבטית דם מוגדרת 25 מעלות צלזיוס בקרת טמפרטורה. לחלבונים עם photocycles הארוך (& #62; שניות), בקרת טמפרטורה עשויה להגביר יציבות בסיסית.
    9. למדוד ספקטרום הספיגה. להעריך את אחוז המדגם שנותר בקרבת פני השטח לאחר התייבשותו של הסרט על ידי הפחתת ספקטרום הספיגה של החיץ (איור 3).
    10. לאשר התייצבות של סרט נפיחות על ידי הקלטת ספקטרום קליטה ב5-20 מרווחי דקות לאחר החזרת נוזלים (איור 4). שלב זה הוא אופציונלי, אך מומלץ.

    3. ביצוע ניסויי הילוכים בChannelrhodopsin-2 דטרגנט-solubilized

    1. הוסף 10 μl של ChR2 (~ 10 חלבון מ"ג / מיליליטר) מומס 5 מ"מ NaCl, 5 מ"מ HEPES (pH 7.4) וdecyl-maltoside (DM) במרכזה של BAF 2 חלון 20 קוטר מ"מ. מורחים אותו בעזרת קצה micropipette לקוטר 6-8 מ"מ (צפיפות פני חלבון של ~ 200 מיקרוגרם / 2 סנטימטר).
    2. יוצר סרט USIng זרימה עדינה של אוויר יבש. לקבלת התוצאות הטובות ביותר להבטיח כי הסרט הוא הומוגנית ויש לו קוטר בערך התאמת הגודל של קרן האינפרא אדום בצמצם הגדול ביותר.
    3. מימה הסרט על ידי הוספת 3-5 μl מתערובת של גליצרול / מים תחולק ב3-5 טיפות סביב הסרט היבש, ולסגור אותו בחוזקה עם חלון שני באמצעות O-טבעת סיליקון שטוחה של ≥ עובי 1 מ"מ. הערה: היחס של תערובת גליצרול / מים שולט בלחות היחסית בין החלונות 54. לקבלת דוגמיות hydroscopic להשתמש יחס 3/7 או 2/8 גליצרול / מים (w / w). אף פעם לא צריכים טיפות גליצרול / המים להיות בקשר ישיר עם סרט החלבון.
    4. הכנס את BAF 2 חלונות דחוקה בבעל. למנוע אור ישר מלהגיע הגלאי על ידי כיסוי החלון לדוגמא עם חומרי IR אטומים, כגון נייר, עם חור בגודל של סרט התייבשות תואם. הנח את המחזיק בתא המדגם.
    5. לשלוט על הטמפרטורה של בעל ל25 °C על ידי מעיל תרמוסטטי מחובר לאמבטית דם בטמפרטורה מבוקרת.
    6. למדוד ספקטרום ספיגה. להבטיח כי הספיגה מקסימלית באזור אני אמיד (~ 1,700-1,620 -1 סנטימטר) היא בטווח של .6-1.0.
    7. להעריך את המסה ויחס טוחנת של חלבון / אבקת / מים מספקטרום הספיגה של סרט התייבשות (איור 5) באמצעות ספקטרום מקדם הכחדת התייחסות למים, DM, וחלבונים קרום נציג (איור 6).
    8. חכה עד שרמת הלחות תתייצב לפני ביצוע ניסויי שלב סריקה (≥ 1 שעות).

    4. התאמה וסנכרון של הלייזר מרגש

    לניסויים בBR להשתמש בפליטה השנייה ההרמונית של Nd פעם: YAG הלייזר (λ = 532 ננומטר) כדי לעורר את photocycle. לניסויים מעורבים ChR2, השתמש עירור של λ = 450 ננומטר, כפי שנקבע על ידי אופמתנד tical פרמטרית (OPO) מונע על ידי הרמוני השלישי (λ = 355 ננומטר) של Nd: YAG לייזר. ודא שדופק הלייזר הוא קצר מספיק (~ 10 NSEC) כדי למזער צילום עירור המשני. הערה: האנרגיה של פעימות הלייזר צריכה להיות קבועה ככל האפשר. בהתקנה שלנו, עוצמת הלייזר משתנה ≤ 10% סביב הערך הממוצע, כפי שאושר על ידי מדידת רפלקס של הלייזר על ידי דיודת אור מחובר למקליט חולף ושילוב התגובה (איור 8).

    1. זוג הלייזר למדגם. התאם את צפיפות האנרגיה של הלייזר במדגם ל2-3 mJ / 2 סנטימטר לכל דופק באמצעות כוח מטר.
      1. להתקנת ATR, להשתמש בסיבים אופטיים הונחו על גבי המכסה ATR.
      2. עבור ניסויי שידור, להשתמש במראות כדי להביא את הלייזר לדוגמא, ואם נדרש, עדשות או לcollimate או לסטות קרן הלייזר לקוטר מעט מעל המדגם בגודל הסרט.
    2. לסנכרן את laser דופק עם הקלטת נתונים בספקטרומטר. השתמש בדופק Q-מתג סנכרון החוצה TTL של האלקטרוניקה של Nd: YAG לייזר כדי לעורר את ספקטרומטר. הגדר את קצב העירור של Nd: YAG לייזר ל10 הרץ לBR ו0.25 הרץ לChR2, בהתאמה.
    3. השתמש בגנרטור עיכוב דופק (PDG) כדי לשלוט בקצב עירור לייזר אם שיעור החזרה של Nd: YAG הלייזר הוא לא מתכוונן בקלות.
      1. חבר את הסנכרון מתוך מנורה של Nd: YAG לייזר לכניסת טריגר החיצוני PDG. PDG מספק פלט ~ 190 דופק μsec TTL עיכב לQ-מתג סנכרון בקלט של Nd: YAG לייזר כדי לעורר את lasing. שער PDG לקבל טריגר חיצוני רק לאחר תקופה מסוימת של זמן מאז ההדק האחרון מקובלים (לBR או 4 שניות לChR2 100 אלפיות השניים).

    5. הכנות שלב סריקה נפתרו בזמן והגדרות

    1. הנח מסנן אופטי נמוך לעבור בנתיב האופטי. כדי לבצע מדידות צעד סריקת זמן נפתר ב1,800-850 -1 סנטימטר טווח ספקטרום, השתמש אטום מסנן מעל 1,950 -1 סנטימטר ועם תיבת הילוכים טובים (> 50-80%) מתחת 1,800 -1 סנטימטר (איור 7).
    2. לשנות את הגלאי מAC למצב בשילוב-DC. הערה: לאחר התאמה זו אות interferogram כבר לא להתנדנד סביב אפס, אלא סביב ערך המכונה ברמת DC.
    3. השתמש במפתח הצמצם הגדול ביותר האפשרי קרן ספקטרומטר לשטף פוטון גבוה יותר, ולכן טוב יותר אות לרעש, אבל במסגרת מגבלות הליניאריות של הגלאי.
    4. להביא את רמת הבירה של interferogram לאפס ולהתקין מחדש את הרווח האלקטרוני כדי לנצל טוב יותר את הטווח הדינמי של האנלוגי הדיגיטלי המומר (ADC). להשיג ברמת DC לקזז על ידי יישום הטיה מתח לאות הניתנת על ידי מראש המגבר. הערה: אפשרות זו כלולה בספקטרומטרים FT-IR המודרניים. אחרת, התקן חיצוני תוצרת בית יכול לשמש במקום, ממוקם בין המגבר וה-ADC 38. טיפול הוא אזדרוש כדי להבטיח כי האלקטרוניקה של מכשיר כזה הן מהירה וליניארי.
    5. הפעל את תפריט שלב הסריקה של ספקטרומטר FT-IR. הגדר את רוחב פס ספקטרלי היעד למדידת שלב סריקה ל1,975.3-0 -1 סנטימטר. התאם את רוחב פס ספקטרלי לשבריר של wavenumber הוא Ne-הלייזר (1/8 th במקרה הנוכחי), מעט עולה על החיתוך של המסנן האופטי.
    6. השבת כל מסנן אלקטרוני גבוה לעבור כדי למנוע עיוותים של קינטיקה בתקופות מאוחרות יותר. מסנן אלקטרוני נמוך לעבור יכול להיות מועיל כאשר תדר החיתוך שלה הוא בסדר גודל ומעלה את קצב הדגימה של ה-ADC (מפחית הרעש aliasing).
    7. הגדר את הרפאים ורזולוציה שלב 8 סנטימטר ו -1 64 -1 סנטימטר, בהתאמה. הגדר את מצב רכישת interferogram לחד צדדי קדימה. עם אפשרויות אלה interferogram אחד דורש כ -500 נקודות.
    8. הגדר את קצב הדגימה של הממיר ADC לגבוה ביותר הקיים בספקטרומטר (למשל, 160 KHz, או 6.25 μsec). הגדר את "הטריגר לניסוי" ל" חיצוני ", כלומר, הלייזר הוא האדון. הגדר את מספר נקודות הנתונים באופן ליניארי ברווח שיירשם: 7,000 לBR (עד 42 אלפיות שני) ו20,000 לChR2 (עד 125 אלפיות שני). הערה: קשקשי זמן ארוכים יותר יכולים להיות מכוסים ללא גדות זיכרון ADC באמצעות מעין וגריתמיות פולסים TTL חיצוניים ברווח זמן ממחולל גל כדי לעורר רכישת נתונים 38, או על ידי שימוש בשני מכשירי הקלטה ארעיות במקביל כתחליף של ADC הפנימי ביום 31, 32.
    9. לחסוך כ 100 נקודות הדק טרום כנקודת התייחסות למדינה החשוכה של המדגם. הערה: בזמן בקנה המידה אלפית השנייה את איכות הנתונים היא מוגבלת לעתים קרובות על ידי תנודות במראה הנייד. הגדלת נקודות הדק טרום מעל 100 היא, אם כן, אינו צפויה לשפר את איכות הנתונים באופן משמעותי.
    10. הגדר את מספר עמיתים לתוספות, כלומר, מספר ממוצע של photoreaction ללהניח מראהיון. לBR, השתמש 20 שיתוף תוספות (20 דקות למדידת זמן בקצב עירור הרץ 10). לChR2 להשתמש 2 שיתוף תוספות (70 דקות למדידת זמן בקצב עירור הרץ 0.25)
    11. חזור על הניסוי 10x עבור BR, ו35x בשלושה סרטים שונים עבור מדגם ChR2, יש סוף סוף ~ 200 שיתוף שנוספו למשרת מראה.

    6. עיבוד נתונים

    1. לאשר את מעמדו של המדגם על ידי השוואת ספקטרום ההבדל מושרה אור IR המתקבל מהראשון והמדידה האחרונה. ישקול לבטל כל מדידות שבו העצמה של ספקטרום ההבדל יורדת מתחת 60% מהמדידה הראשונה.
    2. ממוצע interferograms המוקלט.
      1. שימוש בתוכנת OPUS מספקטרומטר FTIR בחר interferograms הזמן נפתר לממוצע ולהוסיף אותם ל" ספקטרום המחשבון ".
      2. לחץ על "=" כדי להשיג הממוצע של interferograms.
        הערה: כאשר השלב של interferogramהוא קבוע במהלך המדידה היא אדיש לinterferograms הממוצע או ספקטרום ערוץ יחיד. שלב קבוע יכול להיות מאושר על ידי מחשוב והשוואת ספקטרום השלב לראשון וinterferogram ההקלטה האחרונה.
    3. בצע את ההתמרה פורייה של interferograms הזמן נפתר בממוצע לקבל ספקטרום ערוץ בממוצע זמן לפתור אחת.
      1. באמצעות אותה התוכנה כמו בשלב 6.2.1, בחר interferogram הזמן נפתר בממוצע ולחץ על הסמל "interferogram לספקטרום". השתמש בשיטה שטיף שלב התיקון, גורם אפס מילוי של 2 (שתי נקודות דיגיטליות לרזולוצית אינסטרומנטלי), ופונקצית האפודיציה (למשל, משולש, Blackmann-האריס 3 תנאים, וכו ').
      2. לחץ על "מר" התחתון כדי להפוך את interferogram הזמן נפתר בספקטרום הזמן נפתר.
    4. לייצא את נתוני ערוץ אחד בזמן נפתר כמו "שולחן נקודת נתונים" או ""קובץ באמצעות" matlab שמירה בשם "סמל בתוכנת OPUS;. המשך עיבוד נתונים בתוכנה חיצונית.
      1. ממוצע ספקטרום הערוץ היחיד לפני הלייזר, ולהמיר את נתוני שערוץ אחד בזמן נפתר לספקטרום הבדל קליטת זמן נפתר.
      2. לחשב וקטור לסטייה הצפויה הרעש הסטנדרטי בספקטרום ההבדל כפונקציה של wavenumber (איור 12), תוך שימוש בסטיית תקן הרעש, ε, ומתכוון, S 0 (ν), של ספקטרום ערוץ אחד 100 שקדמו לליזר: ε / S 0 (ν). הערך של ε מוערך חיסור ספקטרום ערוץ אחד ברציפות וחישוב סטיית התקן המתוקנת על ידי √ 2.
      3. הסר אזורי רפאים רועשים מכדי להיות שימוש (למשל, מעל 1,825 -1 סנטימטר ומתחת 850 -1 סנטימטר).
      4. ביצוע (למשל, 20 עשור ספקטרום / שעה) מעין טור לוגריתמים בממוצע. Appearanהספירה של נתונים תשפר ומספר הספקטרום יופחת מ ~ 10 4 ל ~ 10 2 ללא כל מידע משמעותי לאיבוד (איור 9).
      5. להגדיל פי ארבעה את הצפיפות הספקטרלית של נקודות (ל-1 נקודת 1 / סנטימטר) באמצעות אינטרפולציה פורייה (לפרסם אפס מילוי).
        הערה: אנו מבצעים צעדים 6.4.1 ל6.4.4 בתכנית תוצרת בית פועלת בMATLAB.
    5. לעבד את ספקטרום הזמן נפתר הושג (איור 10A) עם פירוק יחיד ערך, SVD, (איור 13). להשיג denoising נתונים על ידי שחזור נתונים עם מספר מוגבל של מרכיבים משמעותיים SVD (איור 10B). הערה: אנו מבצעים SVD בMATLAB, באמצעות הפונקציה "SVD" המובנה.

Representative Results

איור 1 מציג ספקטרום ספיגה של סרט יבש של BR שהופקד על פני השטח של אלמנט ההשתקפות הפנימי יהלומים המשמש לספקטרוסקופיה ATR. להקות אופייניות מתנודות של אג"ח פפטיד (אמיד, אני אמיד ואמיד השני) הם בבירור להבחין. העובי המשוער של הסרט היבש יכול להיות מוערך כ~ 1 מיקרומטר, בהתחשב בכמות החלבון מוסף (18 מיקרוגרם) והפנים השטח של ATR (~ 0.2 2 סנטימטר), ולוקח את הצפיפות של חלבון כמו ~ 1.4 גרם / סנטימטר 3, 58 ושל שומנים כ1.0 גר '/ סנטימטר 3, 59 ויחס שומנים בדם / חלבון של 1/3 (w / w) בקרום סגול 60.

הסרט היבש היה rehydrated עם עודף של 4 M NaCl, 100 מ"מ NaPi ב-pH 7.4 (איור 3). ריכוז רמת הלחות וחלבון יעיל בנפח נחקר על ידי הגל החולף ניתן להסיק מגורם קנה המידה הדרוש כדי להסיר באופן דיגיטלי להקות קליטהממים. גורם קנה המידה האופטימלי היה 0.87, כלומר, במקרה זה החיץ תופס 87% ומדגם 13% מההיקף קרוב לפני השטח. אם ניקח בחשבון חלבון וצפיפות שומנים בדם ויחס שומנים בדם / חלבון בקרום סגול (ראה לעיל), אנו יכולים להסיק ריכוז חלבון יעיל של 125 מ"ג / מיליליטר בנפח נחקר על ידי הגל החולף. אנו יכולים להסיק מרמת הלחות שבמקרה המסוים הזה, מדגם עובי הסרט מורחב ~ 6 פעמים על התייבשות, מ ~ 1 עד ~ 6 מיקרומטר. לזווית אירוע 45 °, אופיינית לנו ועבור רוב הסדרי ATR, את עומק החדירה של שדה חלוף (עמ 'ד) לסרט חלבון התייבשות משתנה בין 0.3 ו0.6 מיקרומטר בסנטימטר 1,800-850 -1 מרווח 61. בגלל שדה חלוף כמעט חסר רגישות לדוגמה ממוקם שתי פעמים הנ"ל בעמ 'ד 61, אנו מסיקים שכמות החלבון המשמש בניסוי ATR יכולה להיות ב5x עיקרון מופחת without כל אובדן משמעותי של אות.

בעת שימוש במאגרים של כוח היוני נמוך הסרט מרחיב יותר, וכמות החלבון בנפח נחקר על ידי שדה חלוף מופחת (איור 2). התלות המדויקת בין נפיחות סרט והחוזק היוני של המאגר תהיה תלויה, בין שאר, באופי של השומנים. לדוגמא, סרט דומה נפיחות כפי שמתקבל כאן לBR בקרום סגול באמצעות 4 M NaCl הושג לחלבון קרום מחדש בא הקוטב שומני coli רק באמצעות 0.1 M NaCl 62. אם המדגם תופס פחות מ -5% מגששו הנפח לשקול מחדש עושה את צעד הידרציה באמצעות מאגר של כוח היוני גבוה יותר. סרט נפיחות לאחר הידרציה דורש קצת זמן כדי להגיע לייצוב (איור 4). לBR בקרום סגול התהליך הוא monoexponential, עם קבוע של דקות 12 זמן: זה לוקח לא יותר מ 30-60 דקות יש סרט rehydrated יציב

איור 5 מראה ספקטרום ספיגת IR של סרט התייבשות של ChR2 מתקבל על ידי שידור. הנה, לחות הושגה על ידי חשיפת הסרט היבש לאווירה של לחות מבוקרת הניתנת על ידי תערובת של גליצרול / מים. הספקטרום יכול להיות מפורקת לתרומות ממים, חומרי ניקוי וחלבון. אנחנו יכולים להעריך את הכמות של כל אחד מהם באמצעות ספקטרום מקדם הכחדה, ישתנה בהתאם לספקטרום הניסיוני. למים שלקחנו את הספקטרום מקדם הכחדה מהספרות 63, ולDM מדדנו אותו מפתרון 100 מ"ג / מיליליטר (איור 6). כמו כן נעשה שימוש במקדמי הכחדה לשני חלבוני קרום נציג: מוביל המיטוכונדריה ADP / ATP 64 וBR (איור 7). גורם קנה המידה מצביע על צפיפות שטח מסת מים וDM של 260 מיקרוגרם / 2 סנטימטר ו200 מיקרוגרם / 2 סנטימטר בסרט, בהתאמה. הקליטה הנותרת (figurדואר 5, קו אדום) מגיע בעיקר מהחלבון, מוערך בצפיפות שטח של 250 מיקרוגרם / 2 סנטימטר בעזרת מקדם הכחדה אמיד השנייה משני חלבוני קרום שונים (ראה איור 6). היחס טוחנת לחלבון / אבקת / מים היה מחושב להיות 1/60/2000 באמצעות מסה מולקולרית של 35 kDa, 480 דא, ו18 דא, בהתאמה.

עלילת 3D מצעד סריקת ניסוי זמן נפתר טיפוסי FT-IR בBR מוצגת באיור 10A, שהושג על ידי ATR ומעורב 200 דקות של רכישת נתונים. ניתן לחלץ ספקטרה בזמנים מסוימים, למשל, כאשר L, ביניים M ו-N של photocycle BR צפויים להגיע האוכלוסייה הגבוהה ביותר שלהם (איור 11). התכונות ספקטרליות שלהם כבר תוארו בהרחבה 13,41,65 ולא יידונו עוד כאן. איור 12 מציג בזמן עקבות על כמה wavenumbers שנבחר. כלומר, העלייה של קינטיקה ב1,762 גמ -1 (t 1/2 ~ 60 μsec) מדווח על הדינמיקה של protonation Asp85 מהבסיס שיף רשתית 66, וההתפרקות שלו לאפס מציינת deprotonation על התאוששות קרקע להשביע 67. העלייה השלילית של קינטיקה ב1,740 -1 סנטימטר (t 1/2 ~ msec 1) מדווחת על deprotonation של שרשרת צד Asp96, תורם הפרוטון לבסיס שיף 68. הדעיכה של עוצמת לאפס דיווחים על reprotonation מן הציטופלסמה 67. הדינמיקה של שינויי קונפורמציה חלבון יכולה להיות נחקר על ידי שינויים בקליטה אני אמיד ואמיד השני באזור, אשר מגיע שינוי מקסימאלי ב ~ 3 אלפיות שני בטמפרטורת חדר 67,69.

היישום של SVD לספקטרוסקופיות בעיות נבדק לפני 55,56. בקצרה, SVD factorizes נתונים הניסיוניים, מסודרים לתוך מטריצה, כמו: = U S T. פירוק לגורמים זה יכול להיות שונה כדי להסביר את תלות הרעש על wavenumber ולהעניש תנודות / מרחף ב57 תחילת המחקר. העמודות של U ו-V מכילות ספקטרום orthonormal ווקטורים בזמן עקבות לכל רכיב SVD, בהתאמה. S היא מטריצה ​​אלכסונית המכילה את הערכים ייחודיים שנקרא. רכיבי ספקטרו ובזמן (המופשטים) בU ו-V מופיעים בהפחתת רלוונטית כדי לתאר את נתוני הניסוי במובן לפחות מרובע, לכמת ידי הערך הייחודי הקשורים בם. איור 13A מציג את הערכים ייחודיים כפונקציה של מספר המרכיבים, ו משחזר את שמונה עמודים / הרכיבים הראשונים של U (ספקטרום מופשט, איור 13B) ו-V (מופשט בזמן עקבות, 13C איור). האות מרוכזת בחמשת המרכיבים הראשונים (כצפוי לphotocycle המכיל חמש מדינות ביניים), עם רכיבים הנ"ל נשלטו ברובו על ידי רעש אקראי ומקורות של שגיאות אחרות. נתוני הניסוי שוחזר רק באמצעות חמישה העמודים הראשונים של U ו-V, וחמישה העמודים הראשונים ושורות של S. הנתונים שוחזרו על ידי SVD מייצגים הקירוב לפחות מרובע הטוב ביותר של נתוני הניסוי למטריצה ​​של דרגה חמש. הנתונים המשוחזרים מציג שיפור איכות (איור 10B). כלומר, הרעש מופחת במידה רבה, כמו גם כמה תנודות בקושי מורגשת ונסחף בתחילת המחקר (נפוצות בספקטרוסקופיה צעד סריקה הזמן נפתר 25). עיבוד SVD מועיל במיוחד לשיפור האיכות של זמן העקבות הניסיוניות בטווח אלפית השנייה (קווים אדומים באיור 12).

נתונים צעד סריקת זמן נפתר לphotocycle ChR2 התקבלו באמצעות הפרוטוקול שתואר לעיל עבור transmis ניסויי שיאון (איור 14A), בערך מעורבים 120 שעות של מדידות שנצברו. נתוני הזמן נפתר שנאספו על ידי צעד סריקה משתרע מ6.25 μsec 125 אלפיות שניים. Photocycle של ChR2 דורש כ 60 ים להחלמה מלאה. החלק האחרון של photocycle יכול להיות מכוסה באמצעות סריקה מהירה-FT-IR, והן צעד סריקה וערכות נתונים מהיר סריקה התמזגו כפי שהוצגו במקומות אחרים 48. שינויי הרפאים של ChR2 הם ~ קטנים פי 10 מאלה להשיג מBR, מה שהופך את המדידות יותר מאתגר. במיוחד, תנודות בתחילת המחקר בטווח אלפית השנייה הפכו בבירור בשינויי הספיגה נמוכים אלה. אלה הם עקב תנודות קטנות במראה הנייד בזמן בקנה מידה אלפית השנייה 25. התנודות, יחד עם חלק מהרעש, ניתן להסיר במידה רבה על ידי SVD, להפליא לשפר את המראה של הנתונים (איור 14B).

gure 1 "עבור: תוכן width =" 5in "src =" / files/ftp_upload/51622/51622fig1highres.jpg "width =" 500 "/>
איור 1. ספקטרום קליטה של BR בקרום סגול יבש על גבי משטח היהלום של אבזר ATR. להקות מתנודות של אג"ח פפטיד (אמיד I, II, ו) מצוינות.

איור 2
איור 2. ספקטרום קליטה של סרט של BR לאחר החזרת נוזלים באמצעות מאגרים של חוזק היוני שונים (דילולים של 4 M NaCl, 100 מ"מ Na 2 HPO 4 / אא 2 PO 4 ב-pH 7.4). שים לב לירידה של הלהקה אמיד השנייה, כלומר, הגדיל את נפיחות סרט, עם ירידה בחוזק היוני של המאגר. סכום (הוספה) יחסית של חלבון סמוך לפני השטח, לכמת מעוצמת הספיגה ב 1,541 -1 סנטימטר (מקסימום אמיד השני) לאחר subtractiעל תרומת הקליטה של ​​המאגר.

איור 3
איור 3. ספקטרום קליטה של סרט של BR rehydrated עם חיץ בתפזורת (כוח 4.3 M היוני) ולאחר הפחתת תרומת המאגר. גורם החיסור, 0.87, נבחר כדי להסיר את ספיגת מים החזקה בין 3,700-3,000 סנטימטר ו -1 כדי להשיג בסיס שטוח בין 2,700-1,800 -1 סנטימטר.

איור 4
איור 4. ספקטרום קליטה של BR לאחר החזרת נוזלים עם חיץ של 4.3 כוח היוני M (קליטת חיץ כבר הופחתה לבהירות כמו באיור 3). להוסיף מציג את האבולוציה של סרט נפיחות לאחר rehydratיון, ואחריו את ספיגת החלבון אמיד השני ב1,541 -1 סנטימטר. לנכון מעריכי בודדים מציין זמן קבוע לייצוב נפיחות סרט של 12 דקות.

איור 5
איור 5. ספקטרום קליטה של סרט התייבשות של ChR2 נמדד על ידי שידור (קו כחול). ספקטרום הכחדת המקדם של מים (קו כתום מקווקו) וDM (קו מקווקו ציאן) צומצמו ומופחתים (קו אדום).

איור 6
ספקטרום איור 6. לשכפל הכחדה המונית מקדם ב ° C25 למים נוזליים (http://www.ualberta.ca/ ~ jbertie / JBDownload.HTM # ספקטרה) ועבור סרט התייבשות של מוביל ADP / ATP (AAC) 64 . טרונג> הספקטרום מקדם הכחדה ההמונית נמדד בפתרון לDM (100 מ"ג / מיליליטר), וכן בסרט התייבשות לBR.

איור 7
איור 7. העברה של המסנן האופטי המשמש במדידות FT-IR סריקת סריקה בזמן נפתר.

איור 8
. איור 8 ביצועים של פעימות לייזר הניתנות על ידי הרמוני השני (532 ננומטר) של Nd:. YAG לייזר היסטוגרמה של הווריאציה של האנרגיה היחסית של 1,000 פעימות לייזר, ושתתאים להפצת גאוס עם סטיית תקן של 0.05.

"Width =" 1622/51622fig9highres.jpg 500 "/>
איור 9. אור הנגרם שינויי הספיגה של BR בשלושה wavenumbers נציג בזמן אחיד מרווח מרווחים (ירוק, שחור, וקווים כחולים) ולאחר מיצוע למחצה לוגריתמים ל~ 20 נקודות / עשור (קווים אדומים). שים לב להפחתת הרעש לאחר מיצוע לוגריתמים, חושף תנודה של זמן עקבות בטווח אלפית השנייה.

איור 10
איור 10. ייצוג 3D של שינויי הספיגה מושרה אור לBR נרשמו על ידי ATR ב-pH 7.4 (4 M NaCl, 100 מ"מ NaPi). נתונים) נתונים גולמיים. ב ') שחזרו עם חמישה מרכיבי SVD. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

o: לשמור-together.within-page = "תמיד"> איור 11
איור 11. ספקטרום ספיגת הבדל FT-IR של photocycle BR בשלוש פעמים שנבחרו בו L (12.5 μsec), ביניים M (300 μsec), ו-N (6 אלפיות שני) מועשרים ביותר.

איור 12
דינמיקת עמוד השדרה איור 12. העברת פרוטון וחלבון בphotocycle BR כפי שיוחלט על ידי ספקטרוסקופיה הבדל זמן נפתר צעד סריקת FT-IR. שינויי הספיגה ב 1,762 -1 סנטימטר דיווחים על דינמיקת protonation / deprotonation של Asp85, ועל 1,741 סנטימטר -1 על דינמיקת deprotonation / reprotonation של Asp96 (כולל שינויי H-מליטה לפני 300 μsec). זמן העקבות ב1,670 ו1,555 -1 סנטימטרשינויים בדו"ח שאני אמיד ושני תנודות, שניהם רגישים לקונפורמציה של עמוד השדרה פפטיד. העקבות האחוריות מתאימות לנתונים הגולמיים, ואלה האדומים לנתונים שטופלו SVD. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 13
איור 13. פירוק יחיד ערך (SVD) של צעד סריקת נתונים FT-IR הניסיוניים הזמן נפתר של photocycle BR (ראה איור 10A). SVD בוצע לאחר שקילת נתוני הניסוי לוקח בחשבון את תלות סטיית תקן הרעש בwavenumber (איור 15); בשילוב עם נגזר -1 להפחית את המשקל הסטטיסטי של תנודות תחילת המחקר, כפי שתואר קודם 57.) & #160; מגרש של הערכים ייחודיים היחסי של 50 המרכיבים הראשונים (עיגולים שחורים). חמשת המרכיבים הראשונים מוקצים לאותת רכיבים (עיגולים אדומים). שאר ריקבון רכיבים באופן אקספוננציאלי כצפוי לרעש ורכיבים (ראה קו אפור מקווקו). B) ספקטרום מופשט ראשון שמונה (1 U ל U 8). C) ראשון שמונה בזמן עקבות מופשטות (V 1 עד V 8). הספקטרום המופשט וזמן העקבות שהוקצה לאות מתוארים בקווים אדומים, ועם קווים שחורים אחר. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 14
ייצוג הדמות 14. 3D של IR שינויי הספיגה מושרה אור לChR2 נרשמו על ידי צעד סריקהבמצב שידור. נתונים צעד סריקה משתרע עד 125 אלפיות שני, רק מכסים חלק מphotocycle.) נתונים גולמיים. ב ') נתונים שחזרו עם חמישה מרכיבי SVD. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 15
איור 15 רמת רעש משוערת. בספקטרום ספיגת הבדל FT-IR. ב6.25 μsec זמני ו8 -1 סנטימטר רזולוציה ספקטרלית לניסוי הכרוך בעמדת 1 co-addition/mirror (500 photoreactions) או ~ 200 עמדת co-addition/mirror (10 5 photoreactions). ערכים מוצגים עבור ההשתקפות המוחלשת הכוללת (ATR) והתקנת השידור.

Discussion

אחד ההיבטים הראשונים שצריך לשקול בעת ביצוע ניסויי FT-IR צעד סריקת זמן נפתר בחלבון הוא ההכנה של מדגם בצורה מתאימה לספקטרוסקופיית IR. קליטת IR מחומרים אחרים מאשר החלבון של עניין צריכה להיות מופחתת, במיוחד כי ממים. הגישה הנפוצה ביותר היא להתאדות המים בכמות גדולה של המדגם כדי ליצור סרט. הסרט יכול להיות rehydrated או על ידי הוספה כמה טיפות של תמיסה מימית או על ידי חשיפת הסרט לאווירה של לחות מבוקרת. הראנו כיצד בשני המקרים זה ניתן להעריך את רמת הלחות שהושגה באמצעות ספקטרוסקופיה קליטת IR (ראה איור 3 ואיור 5). למרות שרמות הלחות שהושגו עשויות להיראות נמוכות בהשוואה לאלו בפתרון, הם למעשה קרובים לאלה שנמצאו בתאים חיים 70, מה שהופך את המחקר של סרטי התייבשות של חלבונים רלוונטיים מבחינה תפקודית. חוץ ממים, זהכמו כן, חשוב לדעת ולשלוט בכמות השומנים בדם או חומר ניקוי במדגם. שניהם צריכים להישמר נמוכים מספיק כדי להיות השפעה ספקטרוסקופיות מופחתת בקליטת IR, אבל גבוהים מספיק כדי לשמור על שלמותה ואת הפונקציונליות של החלבון של עניין.

ספקטרוסקופיה צעד סריקה זמן נפתר היא רק בצורה ישירה החלים על חלבונים מראים תגובות הפיכים שיכול להיות מופעלות על ידי אור reproducibly (אך ראה התקדמות בצימוד צעד סריקה עם חילופי חיץ מהירים) 71. בשלב לסרוק את התגובה צריכה להיות לשעתק לפחות ~ 500x, המספר המינימאלי כדי להשלים interferogram מכסה את 1,800-850 -1 סנטימטר באזור 8 -1 סנטימטר ברזולוציה. בפועל, עם זאת, מיצוע נתונים נוסף נדרש בדרך כלל לדחוף את רמת הרעש למטה. לעמדת co-additions/mirror 200 (10 5 חזרות של התגובה) ספקטרום 6.25 הבדל ספיגת μsec רזולוציה יכול להציג STA רעשסטיית ndard בין 2 x 10 -5 ו -2 x 10 -4 לATR ובין 5 x 10 -6 ו3 x 10 -5 לניסוי הילוכים (איור 15). הודות לתפוקת פוטון, ההולכה גבוהה יותר שלה מאפשר ל~ 7 רמות רעש נמוכות יותר מאשר ATR, היבט מרכזי ללימוד בהצלחה דגימות נותנים חלשים קליטת שינויים כגון ChR2. מצד השני, ATR דורש פעמים 5-25 פחות מדגם מאשר ניסוי שידור.

היישום של ספקטרוסקופיה FT-IR צעד סריקת הזמן נפתר הוא בעייתי לחלבונים בו מוצגות photocycles איטי: הקלטת interferogram אחרת צעד-סריקה יכולה להיות חסרת מעשיות רבות. פתרונות חלקם כבר הציגו להתמודדות עם מקרים כאלה 72,73, מבוססים לעתים קרובות על שימוש בדגימות להחלפה מרובות כדי לזרז את המדידות במחיר של צריכת חלבון מוגברת ומורכבות ניסיונית 27,74. במקרים מסוימים ניתן לעקוף את הבעיה על ידי לשעברבצטטו את הדוגמא לפני photocycle הושלם לחלוטין. לChR2, עם photocycle דורש לאחר צילום עירור 60 שניות להתאוששות 99%, ההתאוששות ב 4 שניות היא כבר של 80% 48. עם יעילות עירור של 10% לדופק לייזר, 98% ממולקולות ChR2 נמצאים במצב 4 שניות הכהות לאחר צילום עירור, מה שהופך אפשרי לבצע ניסויים בשיעור החזרה לייזר ל0.25 הרץ.

עיבוד נתונים הוא היבט טכני סופי הנדרש כדי להשיג את התוצאות הטובות ביותר אפשריות. מיצוע לוגריתמי מפחית רעש ו, גם חשוב, מקטין את הגודל של נתונים ללא עיוותים, חיוני תכונה לניתוח נתונים האחוריים באמצעות פירוק ערך ייחודי או התאמה הגלובלית. מיצוע לוגריתמי הוא, לעומת זאת, לא מאוד מוצלח במיצוע של תנודות בזמן העקבות הנגרמות על ידי תנודות במראה הניידת ומקורות רעש 1 / f אחרים במהלך המדידות (איור 9). תנודות אלו בתחילת המחקריכול לחרוג הרעש בטווח אלפית השנייה ולהשחית את איכות הנתונים. פירוק ערך ייחודי מנצל את היתירות של נתונים כדי להפחית את הרעש, ועם כמה שינויים 57 זה יכול להפחית כמו גם תנודות בתחילת המחקר.

לבסוף, חלק הזמן רב יותר ורוב שלב סריקת ניסוי FT-IR זמן נפתר מתאים למשימה של להקות ולפרשנות רפאים והקינטית של נתונים. לbacteriorhodopsin רבים של הלהקות המופיעות בספקטרום הבדל IR הוקצו או לפרש הודות לעבודה המצטברת של קבוצות חוקרת רבות על פני עשרות שנים. לחלבון הרבה פחות למד, כגון channelrhodopsin-2, ניסויי IR הזמן נפתר הוצגו לעיל צריכים להיות מלווה בניסויים מקבילים במוטציות מכוונות אתר ושילוב עם מידע מטכניקות משלימות כדי להגיע לפרשנות מכניסטית 48.

Disclosures

המחברים מצהירים שום אינטרס כלכלי מתחרה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
FT-IR spectrometer Bruker Vertex 80v Equipped with photovoltaic-MCT detector, an external global, and an oil-free pump. Firmware 2.3.
BaF2 windows korth Kristalle
Diamond ATR accesory Smiths detection Nine-reflection DuraDisk
Thermostatic bath Julabo F25
Vibration decoupled table OPTA
Pulsed Nd:YAG laser with a second harmonic generator Continuum electro-Optics Minilite 
Optical parametric oscillator (OPO) OPTA BBO-355-VIS/IR S/N 1009
Digital delay/pulse generator  Stanford Research Systems DG535
Pulsed Nd:YAG laser with a third harmonic generator Spectra-Physics Quanta-Ray
Various optical mirrors and lenses ThorLabs
OPUS 7.0 Bruker Software to control Vertex 80v spectrometer
MATLAB run time Mathworks Used to run home-made executable programs to preprocess the data

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Henzler-Wildman, K., Kern, D. Dynamic personalities of proteins. Nature. 450, 964-972 (2007).
  2. Lacapère, J. J., Pebay-Peyroula, E., Neumann, J. M., Etchebest, C. Determining membrane protein structures: still a challenge. Trends Biochem. Sci. 32, 259-270 (2007).
  3. Wöhri, A. B., et al. Light-induced structural changes in a photosynthetic reaction center caught by Laue diffraction. Science. 328, 630-633 (2010).
  4. Aquila, A., et al. Time-resolved protein nanocrystallography using an X-ray free-electron laser. Opt. Express. 20, 2706-2716 (2012).
  5. Neutze, R., Moffat, K. Time-resolved structural studies at synchrotrons and X-ray free electron lasers: opportunities and challenges. Curr. Opin. Struc. Biol. 22, 651-659 (2012).
  6. Austin, R. H., et al. Dynamics of carbon monoxide binding by heme proteins. Science. 181, 541-543 (1973).
  7. Alberding, N., et al. Tunneling in ligand binding to heme proteins. Science. 192, 1002-1004 (1976).
  8. Goormaghtigh, E., Cabiaux, V., Ruysschaert, J. M. Determination of soluble and membrane protein structure by Fourier transform infrared spectroscopy. III. Secondary structures. Subcell. Biochem. 23, 405-450 (1994).
  9. Tamm, L. K., Tatulian, S. A. Infrared spectroscopy of proteins and peptides in lipid bilayers. Q. Rev. Biophys. 30, 365-429 (1997).
  10. Arrondo, J. L., Goñi, F. M. Structure and dynamics of membrane proteins as studied by infrared spectroscopy. Prog. Biophys. Mol. Biol. 72, 367-405 (1999).
  11. Barth, A., Zscherp, C. What vibrations tell us about proteins. Q. Rev. Biophys. 35, 369-430 (2002).
  12. Gerwert, K. Molecular reaction-mechanisms of proteins as monitored by time-resolved FTIR Spectroscopy. Curr. Opin. Struct. Biol. 3, 769-773 (1993).
  13. Maeda, A. Application of FTIR spectroscopy to the structural study on the function of bacteriorhodopsin. Isr. J. Chem. 35, 387-400 (1995).
  14. Kandori, H. Role of internal water molecules in bacteriorhodopsin. Biochim. Biophys. Acta. 1460, 177-191 (2000).
  15. Zscherp, C., Barth, A. Reaction-induced infrared difference spectroscopy for the study of protein reaction mechanisms. Biochemistry. 40, 1875-1883 (2001).
  16. Nyquist, R. M., Heitbrink, D., Bolwien, C., Gennis, R. B., Heberle, J. Direct observation of protonation reactions during the catalytic cycle of cytochrome c oxidase. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 8715-8720 (2003).
  17. Rich, P. R., Iwaki, M. Methods to probe protein transitions with ATR infrared spectroscopy. Mol. Biosyst. 3, 398-407 (2007).
  18. Noguchi, T. Light-induced FTIR difference spectroscopy as a powerful tool toward understanding the molecular mechanism of photosynthetic oxygen evolution. Photosynth. Res. 91, 59-69 (2007).
  19. Granell, M., Leon, X., Leblanc, G., Padros, E., Lorenz-Fonfria, V. A. Structural insights into the activation mechanism of melibiose permease by sodium binding. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 22078-22083 (2010).
  20. Schuler, B., Eaton, W. A. Protein folding studied by single-molecule FRET. Curr. Opin. Struct. Biol. 18, 16-26 (2008).
  21. Kapanidis, A. N., Strick, T. Biology, one molecule at a time. Trends Biochem. Sci. 34, 234-243 (2009).
  22. Uhmann, W., Becker, A., Taran, C., Siebert, F. Time-resolved FT-IR absorption spectroscopy using a step-scan interferometer. Appl. Spectrosc. 45, 390-397 (1991).
  23. Dioumaev, A. K., Braiman, M. S. Two bathointermediates of the bacteriorhodopsin photocycle, distringuished by nanosecond time-resolved FTIR spectroscopy at room temperature. J. Phys. Chem. B. 101, 1655-1662 (1997).
  24. Rammelsberg, R., Huhn, G., Lübben, M., Gerwert, K. Bacteriorhodopsin's intramolecular proton-release pathway consists of a hydrogen-bonded network. Biochemistry. 37, 5001-5009 (1998).
  25. Rödig, C., Siebert, F. Errors and artifacts in time-resolved step-scan FT-IR spectroscopy. Appl. Spectrosc. 53, 893-901 (1999).
  26. Brudler, R., Rammelsberg, R., Woo, T. T., Getzoff, E. D., Gerwert, K. Structure of the I1 early intermediate of photoactive yellow protein by FTIR spectroscopy. Nat. Struct. Biol. 8, 265-270 (2001).
  27. Remy, A., Gerwert, K. Coupling of light-induced electron transfer to proton uptake in photosynthesis. Nat. Struct. Biol. 10, 637-644 (2003).
  28. Lórenz-Fonfría, V. A., Furutani, Y., Kandori, H. Active internal waters in the bacteriorhodopsin photocycle. A comparative study of the L and M intermediates at room and cryogenic temperatures by infrared spectroscopy. Biochemistry. 47, 4071-4081 (2008).
  29. Griffiths, P. R., de Haseth, J. A. Fourier Transform Infrared Spectrometry. , John Wiley and Sons. (1986).
  30. Smith, G. D., Palmer, R. A. Handbook of vibrational spectroscopy. , John Wiley & Sons Ltd. (2002).
  31. Rammelsberg, R., Heßling, B., Chorongiewski, H., Gerwert, K. Molecular reaction mechanisms of protein monitored by nanosecond step-scan FT-IR difference spectroscopy. Appl. Spectrosc. 51, 558-562 (1997).
  32. Rödig, C., Chizhov, I., Weidlich, O., Siebert, F. Time-resolved step-scan Fourier transform infrared spectroscopy reveals differences between early and late M intermediates of bacteriorhodopsin. Biophys. J. 76, 2687-2701 (1999).
  33. Bromberg, S. E., et al. The mechanism of a C-H bond activation reaction in room-temperature alkane solution. Science. 278, 260-263 (1997).
  34. Rödig, C., Siebert, F. Handbook of vibrational spectroscopy. , John Wiley & Sons. (2002).
  35. Braiman, M. S., Xiao, Y. Vibrational Spectroscopy of Biological and Polymeric Materials. , CRC Press. 353-418 (2006).
  36. Gerwert, K. Handbook of vibrational spectroscopy. , John Wiley & Sons Ltd. (2002).
  37. Koutsoupakis, C., Pinakoulaki, E., Stavrakis, S., Daskalakis, V., Varotsis, C. Time-resolved step-scan Fourier transform infrared investigation of heme-copper oxidases: implications for O2 input and H2O/H+ output channels. Biochim. Biophys. Acta. 1655, 347-352 (2004).
  38. Radu, I., Schleeger, M., Bolwien, C., Heberle, J. Time-resolved methods in biophysics. 10. Time-resolved FT-IR difference spectroscopy and the application to membrane proteins. Photochem. Photobiol. Sci. 8, 1517-1528 (2009).
  39. Haupts, U., Tittor, J., Oesterhelt, D. Closing in on bacteriorhodopsin: progress in understanding the molecule. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 28, 367-399 (1999).
  40. Lanyi, J. K. Bacteriorhodopsin. Annu. Rev. Physiol. 66, 665-688 (2004).
  41. Heberle, J., Fitter, J., Sass, H. J., Büldt, G. Bacteriorhodopsin: the functional details of a molecular machine are being resolved. Biophys. Chem. 85, 229-248 (2000).
  42. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-1: a light-gated proton channel in green algae. Science. 296, 2395-2398 (2002).
  43. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proc. Natl. Acad. Sci U. S. A. 100, 13940-13945 (2003).
  44. Zhang, F., et al. The microbial opsin family of optogenetic tools. Cell. 147, 1446-1457 (2011).
  45. Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The development and application of optogenetics. Annu. Rev. Neurosci. 34, 389-412 (2011).
  46. Feldbauer, K., et al. Channelrhodopsin-2 is a leaky proton pump. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 12317-12322 (2009).
  47. Nack, M., et al. Kinetics of proton release and uptake by channelrhodopsin-2. FEBS Lett. 586, 1344-1348 (2012).
  48. Lórenz-Fonfría, V. A., et al. Transient protonation changes in channelrhodopsin-2 and their relevance to channel gating. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, (2013).
  49. Heberle, J., Zscherp, C. ATR/FT-IR difference spectroscopy of biological matter with microsecond time resolution. Appl. Spectrosc. 50, 588-596 (1996).
  50. Nyquist, R. M., Ataka, K., Heberle, J. The molecular mechanism of membrane proteins probed by evanescent infrared waves. Chembiochem. 5, 431-436 (2004).
  51. Gerwert, K., Freier, E., Wolf, S. The role of protein-bound water molecules in microbial rhodopsins. Biochim. Biophys. Acta. 1837, 606-613 (2014).
  52. Lórenz-Fonfría, V. A., Heberle, J. Channelrhodopsin unchained: Structure and mechanism of a light-gated cation channel. Biochim. Biophys. Acta. 1837, 626-642 (2014).
  53. Carter, R. O., Lindsay, N. E., Beduhn, D. A solution to base-line uncertainty due to MCT detector nonlinearity in FT-IR. Appl. Spectrosc. 44, 1147-1151 (1990).
  54. Noguchi, T., Sugiura, M. Flash-induced FTIR difference spectra of the water oxidizing complex in moderately hydrated photosystem II core films: effect of hydration extent on S-state transitions. Biochemistry. 41, 2322-2330 (2002).
  55. Henry, E. R., Hofrichter, J. Singular value decomposition: application to analysis of experimental data. Methods Enzymol. 210, 129-192 (1992).
  56. Hendler, R. W., Shrager, R. I. Deconvolutions based on singular value decomposition and the pseudoinverse: a guide for beginners. J. Biochem. Biophys. Methods. 28, 1-33 (1994).
  57. Lórenz-Fonfría, V. A., Kandori, H. Spectroscopic and kinetic evidence on how bacteriorhodopsin accomplishes vectorial proton transport under functional conditions. J. Am. Chem. Soc. 131, 5891-5901 (2009).
  58. Fischer, H., Polikarpov, I., Craievich, A. F. Average protein density is a molecular-weight-dependent function. Protein Sci. 13, 2825-2828 (2004).
  59. Nagle, J. F., Tristram-Nagle, S. Structure of lipid bilayers. Biochim. Biophys. Acta. 1469, 159-195 (2000).
  60. Lee, A. G. Lipid-protein interactions in biological membranes: a structural perspective. Biochim. Biophys. Acta. 1612, 1-40 (2003).
  61. Goormaghtigh, E., Raussens, V., Ruysschaert, J. M. Attenuated total reflection infrared spectroscopy of proteins and lipids in biological membranes. Biochim. Biophys. Acta. 1422, 105-185 (1999).
  62. Lórenz-Fonfría, V. A., León, X., Padrós, E. Studying substrate binding to reconstituted secondary transporters by attenuated total reflection infrared difference spectroscopy. Methods Mol. Biol. 914, 107-126 (2012).
  63. Bertie, J. E., Lan, Z. D. Infrared intensities of liquids XX: the intensity of the OH stretching band of liquid water revisited, and the best current values of the optical constants of H2O(l) at 25 oC between 15,000 and 1 cm-1. Appl. Spectrosc. 50, 1047-1057 (1996).
  64. Lórenz, V. A., et al. The secondary structure of the inhibited mitochondrial ADP/ATP transporter from yeast analyzed by FTIR spectroscopy. Biochemistry. 40, 8821-8833 (2001).
  65. Heßling, B., Souvignier, G., Gerwert, K. A model-independent approach to assigning bacteriorhodopsin's intramolecular reactions to photocycle intermediates. Biophys. J. 65, 1929-1941 (1993).
  66. Braiman, M. S., et al. Vibrational spectroscopy of bacteriorhodopsin mutants: light-driven proton transport involves protonation changes of aspartic acid residues 85, 96, and 212. 27, 8516-8520 (1988).
  67. Gerwert, K., Souvignier, G., Hess, B. Simultaneous monitoring of light-induced changes in protein side-group protonation, chromophore isomerization, and backbone motion of bacteriorhodopsin by time-resolved Fourier-transform infrared spectroscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 87, 9774-9778 (1990).
  68. Gerwert, K., Hess, B., Soppa, J., Oesterhelt, D. Role of aspartate-96 in proton translocation by bacteriorhodopsin. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86, 4943-4947 (1989).
  69. Lórenz-Fonfría, V. A., Kandori, H., Padrós, E. Probing specific molecular processes and intermediates by time-resolved Fourier transform infrared spectroscopy: application to the bacteriorhodopsin photocycle. J. Phys. Chem. B. 115, 7972-7985 (2011).
  70. Ellis, R. J., Minton, A. P. Cell biology: join the crowd. Nature. 425, 27-28 (2003).
  71. Furutani, Y., Kimura, T., Okamoto, K. Development of a rapid Buffer-exchange system for time-resolved ATR-FTIR spectroscopy with the step-scan mode. Biophysics. 9, 123-129 (2013).
  72. Rammelsberg, R., Boulas, S., Chorongiewski, H., Gerwert, K. Set-up for time-resolved step-scan FTIR spectroscopy of noncyclic reactions. Vib. Spectrosc. 19, 143-149 (1999).
  73. Rödig, C., Siebert, F. Monitoring fast reactions of slow cycling systems with time-resolved FTIR spectroscopy. Vib. Spectrosc. 19, 271-276 (1999).
  74. Rödig, C., Siebert, F. Distortion of the L→M transition in the photocycle of the bacteriorhodopsin mutant D96N: a time-resolved step-scan FTIR investigation. FEBS Lett. 445, 14-18 (1999).

Tags

ביופיסיקה, bacteriorhodopsin channelrhodopsin השתקפות נחלש סך הכל העברת פרוטון דינמיקת חלבון ספקטרוסקופית אינפרא אדום ספקטרוסקופיה זמן נפתר שלב סריקה חלבונים בממברנה פירוק ערך יחיד גיליון 88
העברת פרוטון והחלבון Dynamics קונפורמציה בחלבונים רגישים לאור בזמן נפתר-Step-לסרוק פורייה-להפוך ספקטרוסקופית אינפרא אדום
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lórenz-Fonfría, V. A.,… More

Lórenz-Fonfría, V. A., Heberle, J. Proton Transfer and Protein Conformation Dynamics in Photosensitive Proteins by Time-resolved Step-scan Fourier-transform Infrared Spectroscopy. J. Vis. Exp. (88), e51622, doi:10.3791/51622 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter