Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Engineering
Click here for the English version

Engineering

Proton Transfer och proteinkonforma Dynamics i Känsliga Proteiner från Time-löst Step-scan Fourier-transform infraröd spektroskopi

Published: June 27, 2014 doi: 10.3791/51622
Automatic Translation
1, 1
1Experimental Molecular Biophysics, Freie Universität Berlin

Abstract

Övervakning dynamiken i proto och protein ryggrad konforma förändringar under funktionen hos ett protein är ett viktigt led i att förstå dess mekanism. Protonering och konformationsförändringar påverka vibrationsmönstret för aminosyrasidokedjor och av peptidbindningen, respektive, som båda kan sonderas genom infraröd (IR) skillnad spektroskopi. För proteiner vars funktion kan vara upprepat och reproducerbart utlösas av ljus, är det möjligt att erhålla infraröddifferensspektra med (under) mikrosekund upplösning över ett brett spektralområde med hjälp av steg-scan Fouriertransform infraröd teknik. Med ~ 10 2 -10 3 repetitioner av fotoreaktion, det minsta antal slutföra en skanning till rimliga spektral upplösning och bandbredd, kan ljudnivån i absorptionen skillnaden spektra vara så låg som ~ 10 - 4, tillräckligt för att följa kinetiken av proto förändringar från en enda aminosyra. Lägrebullernivåer kan åstadkommas genom flera datamedelvärdesbildning och / eller matematisk bearbetning. Mängden protein som krävs för optimala resultat är mellan 5-100 mikrogram, beroende på provtagningsteknik som används. Beträffande ytterligare krav måste det protein som skall koncentreras först i en buffert med låg jonstyrka och torkades sedan för att bilda en film. Proteinet filmen hydratiseras före experimentet, antingen med små droppar av vatten eller under kontrollerad luftfuktighet. Den uppnås hydratisering nivå (g vatten / g protein) mäts från en IR-absorptionsspektrum. För att visa upp den teknik, studerade vi photocycle av ljusdriven protonpumps bacteriorhodopsin i dess nativa purpur membranmiljö och av ljuset jonkanal channelrhodopsin-2 solubiliserad i detergent.

Introduction

För att till fullo belysa hur proteiner utför sin funktion, är den skyldig att mäta dem som de arbetar, det vill säga längs en ​​reaktion väg som ofta innebär en rad mellanprodukter och sträcker flera storleks tid. Viktiga steg av proteiners funktion sker ofta i mikrosekund att millisekund tidsområde 1, särskilt ryggraden konformationsförändringar och proton överföringar reaktioner hos membranproteiner. Röntgenkristallografi, utan tvekan den pelaren i strukturbiologi, ger statisk (tidsmedel) elektrontäthet från väl-brytande proteinkristaller, notoriskt svårt att växa med membranproteiner 2. En 3D atommodell kan byggas baserat på elektrontäthet, men sällan inklusive platsen för väteatomer. Stora framsteg i tidsupplöst röntgenkristallografi, förlitar sig antingen på Laue diffraktion 3 eller på femtosecond röntgenpulser 4, tillägger tidsdimensionen till den höga strukturella informationen iHerent till röntgenkristallografi 5. Men bortsett tekniska och analytiska utmaningar, kan kristallgitter försämra ryggraden konformationsförändringar och förändra proteindynamik, en oundviklig brist på metoder baserade på proteinkristaller 5. Följaktligen är dynamiska aspekter av proteiner fortfarande bäst täcks av optiska metoder, som banade väg för flash fotolys 6,7, även om den allmänna nackdelen med begränsad strukturell insikt.

Fourier-transformerad infraröd spektroskopi (FT-IR) kombinerar den temporala upplösningen av optiska spektroskopier med ett värdefullt känslighet för proteinstruktur, den sista funktionen utnyttjas i otaliga statiska strukturella och funktionella undersökningar på membranproteiner 8-11. Framför allt har FT-IR skillnad spektroskopi visat sig vara ett idealiskt verktyg för att studera små spektrala förändringar som ett protein transite från en metastabila tillstånd till ett annat 12-19.

Studies på proteindynamik, annat än vid enda molekyl nivå 20,21, kräver en utlösande process för synkronisering. En reaktion lämpligen initieras snabbt och inte invasivt med hjälp av ljus som trigger, som görs i studien av proteiner med cykliska fotoreaktioner. En stor utmaning i samband med tidsupplösta studier är att uppnå tillräcklig tidsupplösning med bibehållen god spektral upplösning och lämplig signal-till-brusförhållande. Också viktigt är att täcka en tillräckligt bred spektral och tidsmässiga intervall. Tidsupplöst steg-scan FT-IR-spektroskopi utmärker sig i alla dessa aspekter 22, med publicerade exempel täcker spektralområden så bred som 3,900-850 cm -1 och dynamik förlängning ~ 9 order av tid, med upp till 3,5 cm -1 spektral och 30 ns tidsupplösning 23-28.

Fourier-transform IR-spektrometrar uppvisa minskad buller och förbättrad fotometriska noggrannhet över dispersiva kära 29. However, i det normala snabb-scan inspelningsläge FT-IR-spektrometrar lider av en tidsupplösning begränsad till ≥ 5-10 msek som en följd av den minsta tid som den mobila spegeln av interferometern krävs för att slutföra en skanning. Med steg-scan-teknik, däremot är tidsberoendet hos den dynamiska händelse frikopplas från scan-durationen av interferometern. I korthet, den mobila spegeln rör sig i diskreta steg snarare än kontinuerligt skanna för att slutföra en genomsökning. Vid vart och ett av dessa steg i (mobilt) spegel hålls fast och en transient registreras. Således är den tids upplösningen begränsas av stigtid kvicksilver-kadmium-Telluride (MCT) detektor, som är typiskt i intervallet 10-100 ns. I praktiken är det stora dynamiska området för interferogrammet (innehållande en intensiv signal i centerburst och små signaler i vingarna), krävs för korrekt digitalisering av en analog / digitalomvandlare (ADC) med så många som 16 till 24 bitar, vilket leder till provtagning priser som inte överstiger ~ 200 kHz(5 ^ sek) 30. Nanosekund tidsupplösning kan åstadkommas genom att mäta endast de förändringar i interferogrammet, för vilka ett 8-12 bitars ADC är tillräcklig 23,31-33. Tekniska aspekter 30,34,35 och program 36-38 av tidsupplöst steg-scan har diskuterats i detalj på annan plats.

Syftet med den aktuella bidrag är att tillhandahålla ett protokoll som beskriver de praktiska tidsupplöst steg-scan FT-IR-spektroskopi på fotokänsliga membranproteiner. Här är resultatet av tekniken visas i två provtagningsmetoder: sändning och dämpad total reflektion (ATR). Användningen av ATR gör att arbeta i närvaro av överskott av vatten, som inte bara säkerställer fullständig hydrering villkor för proteinet men tillåter också akut kontroll av provets pH och jonstyrka 49,50. Steg-skanna experiment illustreras på två utvalda system: bacteriorhodopsin och channelrhodopsin-2.

39,40, vilket gör det till den bästa-förstådd membranprotein hittills. Bland de många tekniker som tillämpas på studiet av bR funktionalitet FT-IR-spektroskopi har utan tvekan utövat en av de största effekterna. Nämligen, har FT-IR-spektroskopi varit nyckeln till att lösa de grupper som deltar i protonöverföring över membranet som redovisas på annan plats 13,41,51.

Channelrhodopsin (FHS) är den första ljus jonkanal som finns i naturen 42,43. Ljus excitation av ChR leder till övergående öppningen av en jonkanal. Dess upptäckt bosatte vägen för utvecklingen av optogenetics, där molekylära processer styrs av ljus 44,45. ChR tillhör, såsom Br, till familjen av mikrobiella rhodopsins men i motsats till Br, mycket mindre är känt om dess funktionella mekanism 52. ChR2 kombinerar sin funktion som en ion-kanal med protonpumpverksamhet 46,47. Nyligen tillämpade vi tidsupplöst steg-scan FT-IR-spektroskopi för att lösa inom proteinprotonöverföringsreaktioner och dynamiken i proteinskelettet konformationsförändringar ChR2 48.

Protocol

1. Allmänna aspekter på Sample och instrument Förberedelse

  1. Använd en kommersiell FT-IR-spektrometer utrustad för tidsupplöst steg-scan mätningar. För bästa resultat placera FT-IR-spektrometer på toppen av en vibrations frikopplat tabell.
  2. Evakuera optik utrymmet till ett fåtal mbar. Purge provutrymmet med torr luft eller kväve.
  3. Placera ett IR-transparent material ogenomskinligt för synlig strålning framför MCT detektor i FT-IR-spektrometer. Denna försiktighetsåtgärd är nödvändig för att förhindra artefakter från den spännande laserpulsen under steg-scan experiment. OBS: Vi använder en germanium (Ge) fönster på 25 mm diameter. Dess höga brytningsindex orsakar oönskad intensitet förlorar, undvikas till stor del med hjälp av en Ge filter med antireflexbeläggning.
  4. Kyl ner MCT detektor Dewar med flytande kväve. Obs: Användningen av solceller MCT detektorer är att föredra framför photoconductives grund av deras linjär respons och därmed överlägsen photometric noggrannhet och baslinjen tillförlitlighet 31,53.
  5. Pre-koncentrera provet användes för experimenten till åtminstone 2 mg protein / ml i en buffert av låg (<20 mM) jonstyrka för att förhindra bildning av saltkristaller medan torkning av protein suspensionen för att bilda en homogen proteinfilm. För prover som sediment, tvätt / koncentrera dem genom att tillämpa ultracentrifugering (t.ex. membranproteiner i ett liposomer eller i cellmembran patchar). Använd centricons av lämplig cutoff för proteiner som inte sediment (t.ex. tvättmedel solubiliserade membranproteiner).
  6. För bästa resultat används: a) proteinpreparat som ren och aktiv som möjligt; b) lipid / proteinförhållande ≤ 3 i vikt för proteiner i cellmembran patchar eller utspädda i liposomer; c) tvättmedel / proteinförhållande ≤ 1 i vikt för rengöringsmedel upplöst proteiner. Undvik att använda rengöringsmedel eller lipider vars vibrations band överlappar de av proteinet (t.ex. CHAPS).
    7. 2. Framställning av dämpad totalreflexion Experiment på bacteriorhodopsin

    1. Montera ATR-tillbehör in i provutrymmet i FT-IR-spektrometer. OBS: Vi använder en ZnSe / diamant ATR med fem aktiva reflektioner. Undvik halvledarmaterial såsom germanium eller kisel som inre reflektionselement (IRE) av ATR-tillbehör, som deras optiska egenskaper påverkas av den spännande synlig laser.
    2. Mät ett brett intervall (ca. 4,000-800 cm -1) energispektrum vid 4 cm -1 upplösning av den rena IRE ytan genom konventionell snabb-scan FT-IR-spektroskopi. Använd detta spektrum såsom ett referensspektrum för att beräkna absorptionsspektrum i ett senare skede.
    3. Täck IRE ytan av ATR med 20 ul av den buffert som används senare för att rehydratisera provet (t.ex., 4 M NaCl och 100 mM NaPi vid pH 7,4). Mät den IR-absorption av bufferten.
    4. Ta bufferten, och skölj IRE ytan with vatten. Undvik att röra vid ytan. Avlägsna kvarvarande vätska från IRE yta genom ett intensivt luftflöde.
    5. Sprid ~ 3 ^ il av bacteriorhodopsin (Br) i lila membran (~ 6 mg protein / ml i avjoniserat vatten) på toppen av IRE yta (~ 0,2 cm 2-området). Torka det proteinsuspension under en svag ström av torr luft till dess att en film erhålles.
    6. Mät-absorptionsspektrum för den torra filmen (se figur 1).
    7. Försiktigt lägga 20-40 pl av en buffert med hög jonstyrka att rehydrera den torra filmen (t.ex. 4 M NaCl och 100 mM NaPi vid pH 7,4). Obs: hög jonstyrka förhindrar alltför svullnad av membranfilmen, vilket gör att behålla så mycket protein som möjligt nära den avkända ytan (figur 2).
    8. Täck ATR-hållare med ett lock för att förhindra vattenavdunstning. Eventuellt placera en cover-jacka som är ansluten till en cirkulations bad inställd på 25 ° C för temperaturreglering. För proteiner med långa photocycles (& #62, sekunder), kan temperatur öka baslinjen stabilitet.
    9. Mät ett absorptionsspektrum. Beräkna den procentuella andelen av provet kvar nära ytan efter rehydratisering av filmen genom att subtrahera absorptionsspektrum av buffert (Figur 3).
    10. Bekräfta stabilisering av filmen svullnad genom registrering absorptionsspektra vid 5-20 minuters intervall efter rehydratisering (figur 4). Detta steg är valfritt men rekommenderas.

    3. Utföra Transmission Experiment på Tvättmedels lösliggjort channelrhodopsin-2

    1. Tillsätt 10 pl av ChR2 (~ 10 mg protein / ml) löst i 5 mM NaCl, 5 mM HEPES (pH 7,4) och decyl-maltosid (DM) vid centrum av en BaF2 fönster av 20 mm i diameter. Sprid den med hjälp av mikropipett tips till en 6-8 mm diameter (protein ytors ~ 200 mikrogram / ​​cm 2).
    2. Bilda en film USIng ett försiktigt flöde av torr luft. För bästa resultat se till att filmen är homogen och har en diameter på ungefär matchar storleken på den infraröda strålen på den största bländaren.
    3. Fukta filmen genom att lägga 3-5 pl av en blandning av glycerol / vatten distribueras i 3-5 droppar runt den torra filmen, och tätt nära den med ett andra fönster med hjälp av en platt silikon O-ring av ≥ 1 mm tjocklek. Anmärkning: Förhållandet av blandningen glycerol / vatten kontrollerar den relativa luftfuktigheten mellan fönstren 54. För hygroskopiska prover använda ett förhållande 3/7 eller 2/8 glycerol / vatten (vikt / vikt). De glycerol / vattendroppar bör aldrig vara i direkt kontakt med proteinfilm.
    4. Sätt i BaF2 inklämt fönster i en hållare. Förhindra rakt ljus från att nå detektorn genom att täcka provet fönstret med en IR-opakt material, såsom papper, med ett hål som motsvarar storleken på den hydratiserade filmen. Placera hållaren i provrummet.
    5. Styr temperaturen igar till 25 °C av en termojacka som är ansluten till en temperaturkontrollerad cirkulations bad.
    6. Mät ett absorptionsspektrum. Se till att maximal absorption i amid I regionen (~ 1,700-1,620 cm -1) ligger i intervallet 0,6-1,0.
    7. Uppskatta massa och molförhållandet mellan protein / detergent / vatten från absorptionsspektrumet för den hydratiserade filmen (figur 5) med användning av referens extinktionskoefficient spektra för vatten, mark, och representativa membranproteiner (Figur 6).
    8. Vänta tills hydra stabiliserats innan du utför steg-scan experiment (≥ 1 timme).

    4. Justering och synkronisering av spännande laser

    För experiment på bR använda den andra övertonen emission av en pulsad Nd: YAG-laser (λ = 532 nm) för att trigga photocycle. För experiment med ChR2, använd en excitation av λ = 450 nm som tillhandahålls av en optiska parametrisk oscillator (OPO) som drivs av den tredje övertonen (λ = 355 nm) av en Nd: YAG-laser. Se till att laserpulsen är tillräckligt kort (~ 10 ns) för att minimera sekundär foto-excitation. Anmärkning: Den energi av laserpulserna bör vara så konstant som möjligt. I vår setup, fluktuerar laserintensiteten ≤ 10% runt medelvärdet, vilket bekräftas genom mätning av en reflex av lasern genom en fotodiod som är ansluten till en transient recorder och integrera responsen (figur 8).

    1. Par lasern till provet. Justera energitäthet hos lasern vid provet till 2-3 mJ / cm 2 per puls med användning av en effektmätare.
      1. För ATR installationen, använd en optisk fiber placerad på toppen av ATR locket.
      2. För överföringsexperiment, använder speglar för att få lasern till provet och, om så krävs, linser till antingen Rikta eller divergerar laserstrålen till en diameter något över provfilmstorleken.
    2. Synkronisera laser puls med datainsamling spektrometern. Använd Q-switch synk-ut TTL-puls av elektroniken i Nd: YAG-laser för att trigga spektrometern. Ställ excitation hastigheten av Nd: YAG-laser till 10 Hz för Br och 0,25 Hz för ChR2, respektive.
    3. Använd en pulsfördröjningsgenerator (PDG) för att styra laserexciteringshastighet, om repetitionshastighet av Nd: YAG-laser är inte lätt att justera.
      1. Anslut lampa synk-ut från Nd: YAG-laser till PDG extern triggeringång. PDG ger en ~ 190 ^ sek fördröjd TTL-puls matas ut till Q-switch synk-in-ingången hos Nd: YAG-laser för att utlösa lasring. Gate i PDG att acceptera en extern trigger först efter viss tid sedan den senaste accepterade trigger (100 msek för bR eller 4 sek för ChR2).

    5. Tidsupplöst Step-scan Förberedelser och inställningar

    1. Placera en låg optiskt filter pass i den optiska vägen. För att utföra tidsupplösta steg-scan mätningar i 1,800-850 cm -1 spektral räckvidd, använda ett filter ogenomskinlig över 1950 cm-1 och med god transmission (> 50-80%) under 1800 cm-1 (Figur 7).
    2. Ändra detektorn från AC till DC-kopplade läget. Obs: Efter denna justering interferogrammet signalen inte längre svänga runt noll, men runt ett värde som kallas DC-nivå.
    3. Använd den största möjliga balken vidd av spektrometern för högre fotonflöde och sålunda bättre signal-till-brus, men inom de linjära gränserna för detektorn.
    4. Ta med DC-nivån på interferogrammet till noll och justera den elektroniska förstärkningen för att bättre utnyttja dynamiska området för den analoga digitala konverterade (ADC). Uppnå DC-nivå kompenseras genom applicering av en förspänning till den signal som tillhandahålls av förförstärkaren. Anm: Det här alternativet ingår i moderna FT-IR-spektrometrar. I annat fall kan en hemmagjord externa enheten användas i stället, placerat mellan förförstärkaren och ADC 38. Omsorg är sedansom behövs för att se till att elektroniken hos en sådan anordning är snabb och linjär.
    5. Starta steg-scan meny av FT-IR-spektrometer. Ställ målet spektral bandbredd för steg-scan mätning till 1,975.3-0 cm -1. Justera spektral bandbredd till en bråkdel av He-Ne laser vågtal (1/8: e i detta fall), något som överstiger brytpunkten på det optiska filtret.
    6. Inaktivera alla högpass elektroniskt filter för att förhindra en snedvridning av kinetiken vid senare tillfällen. En låg-pass elektroniskt filter kan vara till nytta när dess gränsfrekvens är i ordning eller över samplingsfrekvens för ADC (minskar buller aliasing).
    7. Ställ den spektrala och fas resolution till 8 cm -1 och 64 cm -1, respektive. Ställ interferogrammet förvärvsläge till enkelsidan framåt. Med dessa alternativ en interferogram kräver cirka 500 punkter.
    8. Ställ in samplingsfrekvensen för ADC till den högsta tillgängliga i spektrometern (t.ex. 160 kHz, eller 6,25 ^ sek). Ställ in "trigger för experiment" till "External", det vill säga, är lasern master. Ange antalet linjärt fördelade datapunkter som ska registreras: 7.000 för bR (upp till 42 msek) och 20.000 för ChR2 (upp till 125 msek). OBS: Längre tidsskalor kan täckas utan att rinna över ADC minnet med en kvasi-logaritmiskt tidsplacerade externa TTL pulser från en våg generator för att utlösa datainsamling 38, eller genom att använda två parallella övergående brännare som substitut för den interna ADC 31, 32.
    9. Spara ca 100 pre-triggerpunkter som en referens för det mörka läget i provet. Obs: I millisekund tidsskalan datakvaliteten begränsas ofta av fluktuationer i den mobila spegeln. Att öka pre-triggerpunkter över 100 är därför inte förväntas avsevärt förbättra datakvaliteten.
    10. Ange antalet co-tillägg, det vill säga antalet medelvärden för fotoreaktion per spegeln positjon. För Br, använder 20 co-tillägg (20 min för att mäta tid på 10 Hz excitation ränta). För ChR2 använda 2 co-tillägg (70 min för att mäta tid på 0,25 Hz excitation hastighet)
    11. Upprepa experimentet 10x för Br och 35x på tre olika provfilmer för ChR2, att äntligen ~ 200 co-tillägg per spegelläge.

    6. Databehandling

    1. Bekräfta statusen av provet genom att jämföra den Ijusinducerad IR-differensspektrum som erhålls från den första och den sista mätningen. Överväg kasserar några mätningar där intensiteten hos differensspektrum sjunker under 60% av den första mätningen.
    2. Medelvärdet inspelade interferogram.
      1. Med hjälp av OPUS mjukvara från FTIR spektrometer välja de tidsupplösta interferogram i genomsnitt och lägga till dem i "Spectrum Calculator".
      2. Klicka på "=" för att få den genomsnittliga av interferogram.
        Obs: När fasen för interferogrammetär konstant under mätningen är likgiltig för genomsnitts interferogram eller enkanalig spektra. En konstant fas kan bekräftas genom att beräkna och jämföra fas spektrum för den första och den sista inspelade interferogrammet.
    3. Utför Fouriertransformen av de medelvärdestidsupplösta interferogram ingen medelvärdestidsupplöst enda kanal spektra.
      1. Med samma programvara som i steg 6.2.1, väljer genomsnitt tidsupplöst interferogram och klicka på ikonen för "interferro till spektra". Använd Mertz fas-korrigeringsmetod, en nollfyllfaktor på 2 (två digitala poäng per instrument-upplösning), och en apodization funktion (t.ex., triangel, Blackmann-Harris 3-termer, etc.).
      2. Klicka på den nedersta "konvertera" för att omvandla den tidsupplöst interferogram i tidsupplöst spektra.
    4. Exportera tidsupplösta enkelkanaldata som en "datapunkttabell" eller en "; Matlab "fil med" spara som "-ikonen i OPUS mjukvaran. Fortsätta databehandling i ett externt program.
      1. Genomsnitt enda kanal spektra innan lasern, och omvandla den tidsupplösta enstaka kanaldata för tidsupplöst absorption skillnaden spektra.
      2. Beräkna en vektor för den förväntade brusstandardavvikelsen i differensspektra som en funktion av vågtal (Figur 12) med användning av brus standardavvikelse, ε, och medelvärdet, S 0 (ν) å 100 enda kanal spektra föregående lasern: ε / S 0 (ν). Värdet på ε beräknas subtrahera rad kanal spektra och beräkna standardavvikelsen korrigeras med √ 2.
      3. Ta spektralområden alltför bullriga för att vara till nytta (t.ex. över 1825 cm-1 och under 850 cm -1).
      4. Utför en kvasi-logaritmiskt genomsnitt (t.ex. 20 spektra / tid decennium). Den appearance av uppgifterna kommer att förbättras och antalet spektra kommer att minskas från ~ 10 4 till ~ 10 2 utan någon väsentlig information förlorad (Figur 9).
      5. Öka fyra gånger spektraltätheten poäng (1 poäng / cm-1) med hjälp av Fourier-interpolation (posta noll-fyllning).
        OBS: Vi utför steg 6.4.1 till 6.4.4 i en hemmagjord program som körs i MATLAB.
    5. Bearbeta den erhållna tidsupplöst spektra (figur 10A) med singulärvärdesuppdelning, SVD, (figur 13). Åstadkomma uppgifter denoising genom att rekonstruera data med ett begränsat antal stora SVD komponenter (figur 10b). OBS: Vi utför SVD i MATLAB med hjälp av den inbyggda "svd"-funktion.

Representative Results

Figur 1 visar ett absorptionsspektrum för en torr film av bR avsatt på ytan av diamanten inre reflektionselement som används för ATR-spektroskopi. Karaktäristiska band från vibrationer av peptidbindningen (amid A-, amid-I-och amid II) är klart urskiljbara. Den ungefärliga tjockleken på den torra filmen kan uppskattas som ~ 1 | im, med tanke på mängden tillsatt protein (18 ug) och ytan av ATR (~ 0,2 cm 2), och med densiteten hos proteinet som ~ 1,4 g / cm ^ 3, 58 och av lipider som 1,0 g / cm 3, 59 och en lipid / protein-förhållande av 1/3 (vikt / vikt) i lila membran 60.

Den torra filmen med vätska i överskott av 4 M NaCl, 100 mM NaPi vid pH 7,4 (Figur 3). Hydratisering nivå och effektiv proteinkoncentration i volymen sonderades genom den evanescenta vågen kan härledas från den skalfaktor som krävs för att digitalt bort absorptionsbandfrån vatten. Den optimala skalningsfaktorn var 0,87, vilket innebär att i detta fall den buffert upptar 87% och provet 13% av den volym nära ytan. Med hänsyn till protein och lipid densitet och lipid / proteinhalt i lila membran (se ovan), kan vi härleda en effektiv proteinkoncentration av 125 mg / ml i volym sonderades genom den evanescenta vågen. Vi kan härleda från hydranivå som, i det här fallet, expanderade provfilmtjocklek ~ 6 gånger efter rehydrering, från ~ 1 till ~ 6 um. För en 45 ° infallsvinkel, som är typisk för vår och för de flesta ATR arrangemang varierar inträngningsdjupet för den evanescenta fältet (dp) för ett hydratiserat proteinfilm mellan 0,3 och 0,6 | im i 1,800-850 cm -1 intervall 61. Eftersom den evanescenta fältet är nästan okänslig för provet ligger två gånger ovan dp 61, vi dra slutsatsen att den mängd protein som används i ATR experimentet skulle kunna vara i princip minskas 5x wtan att någon signifikant förlust av signal.

Vid användning av buffertar med lägre jonstyrka filmen expanderar mer, och mängden protein i den volym sonderades genom det evanescenta fältet reduceras (Figur 2). Det exakta beroendet mellan film svullnad och jonstyrkan hos bufferten kommer att bero, bland andra faktorer, på naturen av de lipider. Till exempel var en liknande film svullnad som erhållits här för bR i lila membranet med användning av 4 M NaCl som erhölls för ett membranprotein rekonstitueras i polärt E. coli-lipider med bara 0,1 M NaCl 62. Om provet upptar mindre än 5% av den avkända volymen överväga re-doing hydratiseringssteget användning av en buffert med högre jonstyrka. Film svullnad efter hydrering kräver lite tid att nå stabilisering (Figur 4). För bR i lila membran processen är monoexponentiellt, med en tidskonstant på 12 min: det tar inte mer än 30-60 minuter för att få en stabil uppblött film

Figur 5 visar ett IR-absorptionsspektrum för en hydratiserad film av ChR2 erhållas genom överföring. Här, var hydratisering uppnås genom exponering av den torra filmen för en atmosfär med reglerad fuktighet som tillhandahålls av en blandning av glycerol / vatten. Spektrumet kan delas upp i bidrag från vatten, tvättmedel och protein. Vi kan uppskatta beloppet för varje av dem med hjälp av extinktionskoefficienten spektra, skalas för att passa den experimentella spektrumet. För vatten tog vi extinktionskoefficient spektrum från litteraturen 63 och för DM mätte vi den från en 100 mg / ml lösning (Figur 6). Vi använde också extinktionskoefficienterna för två representativa membranproteiner: den mitokondriella ADP / ATP carrier 64 och BR (figur 7). Skalningsfaktorn anger en vatten-och DM mass ytdensitet av 260 | ig / cm 2 och 200 | ig / cm 2 i filmen, respektive. Resterande absorptionen (Figure 5, kommer röd linje) främst från protein, beräknas ligga på en yta täthet på 250 mikrogram / ​​cm 2 med hjälp av amid II extinktionskoefficienten från två olika membranproteiner (se Figur 6). Molförhållandet för protein / detergent / vatten beräknades vara 1/60/2000 med användning av en molekylmassa på 35 kDa, 480 Da och 18 Da.

En 3D-plot från typisk tidsupplöst steg-scan FT-IR-experiment på bR återges i fig 10A, som erhållits genom ATR och involverar 200 min av datainsamling. Spektra kan extraheras vid specifika tidpunkter, exempelvis när L är M och N mellanprodukter med bR photocycle förväntas nå sin högsta populationen (Figur 11). Deras spektrala egenskaper har beskrivits utförligt 13,41,65 och kommer inte diskuteras vidare här. Figur 12 visar tids spår på några utvalda vågtalen. Nämligen ökningen av kinetiken vid 1762 Cm -1 (t 1/2 ~ 60 ^ sek) rapporterar på dynamiken i Asp85 protonisering från retinal Schiff basen 66, och dess förfall till noll indikerar dess avprotonering på mark-sate återhämtning 67. Den negativa ökningen av kinetiken vid 1740 cm-1 (t 1/2 ~ 1 ms) rapporter om avprotonering av Asp96 sidokedja, protondonator till Schiffs bas 68. Sönderfallet av intensiteten till noll rapporterar sitt reprotonation från cytoplasman 67. Dynamiken i proteinkonformationsändringar kan sonderas genom absorption förändringar i amid I-och amid-II-regionen, som når en maximal förändring vid ~ 3 ms vid rumstemperatur 67,69.

Tillämpningen av SVD att spektroskopiska problemen har granskats före 55,56. Kortfattat, SVD factorizes experimentella data, ordnade i en matris A, som: A = U S T. Denna faktorisering kan modifieras för att ta hänsyn till buller beroendet vågtal och att bestraffa fluktuationer / drivor i baslinjen 57. Kolumnerna i U och V innehåller ortonormal spektra och tids traces vektorer för varje SVD komponenten, respektive. S är en diagonal matris som innehåller de så kallade singulära värdena. De (abstract) Spectro-temporala komponenter i U och V visas i minskande betydelse för att beskriva de experimentella data i minsta kvadrat bemärkelse, kvantifieras genom deras tillhörande singulära värdet. Figur 13A visar de singulära värdena som en funktion av komponentens nummer och reproducerar de första åtta kolumner / komponenterna i U (abstrakt spektra, Figur 13B) och V (abstrakt tidsspår, fig 13C). Signalen koncentrerades i de första fem komponenterna (som förväntat för ett pHotocycle innehåller fem mellantillstånd), med komponenter ovan till stor del domineras av slumpmässigt brus och andra felkällor. Den experimentella data rekonstruerades med enbart de fem första kolumnerna i U och V, och de första fem kolumner och rader av S. Uppgifterna rekonstruerade av SVD representerar det bästa minsta kvadrat tillnärmning av experimentella data till en matris av rang fem. Den rekonstruerade data visar förbättrad kvalitet (Figur 10B). Nämligen, är bruset i stort sett minskat, samt några knappt märkbara fluktuationer och drivor i baslinjen (vanliga i tidsupplöst steg-scan spektroskopi 25). SVD behandlingen är särskilt gynnsam för att förbättra kvaliteten på de experimentella tids spår i millisekund område (röda linjer i figur 12).

Time-resolved steg-avsökningsdata för ChR2 photocycle erhölls med användning av det ovan beskrivna protokollet för överföring sionsförsök (Figur 14A), ungefär som omfattar 120 timmar av ackumulerade mätningar. De tidsupplösta data som samlas för steg-scan sträcker sig från 6,25 ^ sek till 125 ms. Den photocycle av ChR2 kräver ungefär 60 s för fullständig återhämtning. Den senaste delen av photocycle kan täckas med hjälp av snabb-scan FT-IR, och båda steg-skanning och snabb-scan dataset fusione som presenteras på annan plats 48. De spektrala förändringar ChR2 är ~ 10-faldigt mindre än de som erhålla från Br, vilket gör mätningarna mer utmanande. Speciellt, svängningar i baslinjen i millisekund område blir tydligt vid dessa låga förändringar absorption. Dessa är på grund av att små oscillationer i den mobila spegeln i millisekundtidsskalan 25. De svängningar tillsammans med en del av det buller, kan till stor del avlägsnas genom SVD, anmärkningsvärt att förbättra utseendet av data (Figur 14B).

gur 1 "fo: innehåll-width =" 5in "src =" / files/ftp_upload/51622/51622fig1highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 1. Absorptionsspektrum för bR i lila membran torkades ovanpå diamantytan av ett ATR-tillbehör. Band från vibrationer av peptidbindningen (amid I, II, och A) anges.

Figur 2
Figur 2. Absorptionsspektrum av en film av bR efter rehydratisering med användning av buffertar med olika jonstyrkor (utspädningar av 4 M NaCl, 100 mM Na 2 HPO 4 / NaH 2 PO 4 vid pH 7,4). Observera minskningen av amiden II-bandet, dvs ökad film svullnad, med minskande jonstyrka hos bufferten. (Insert) Relativ mängd protein nära ytan, kvantifieras genom intensiteten i absorbansen vid 1541 cm-1 (amid II maximalt) efter subtractipå på absorptionen bidrag av bufferten.

Figur 3
Figur 3. Absorptionsspektrum av en film av bR uppblött med bulk buffert (4,3 M jonstyrka) och efter subtraktion av buffert bidrag. Subtraktionen faktor, 0,87, valdes för att ta bort den starka vattenabsorption mellan 3,700-3,000 cm -1 och för att få en plan baslinje mellan 2,700-1,800 cm -1.

Figur 4
Figur 4. Absorptionsspektrum för bR efter rehydratisering med en buffert av 4,3 M jonstyrka (buffert absorption har subtraherats för klarhet såsom i fig. 3). Insatsen visar utvecklingen av filmen svullnad efter rehydratjon, följt av protein amid II absorbans vid 1541 cm -1. En passning till en enda exponentiell indikerar en tidskonstant för film svullnad stabilisering av 12 min.

Figur 5
Figur 5. Absorptionsspektrum av en hydrerad film av ChR2 mätt med transmission (blå linje). Extinktionskoefficienten spektrum av vatten (streckad orange linje) och DM (streckad cyan linje) skalades och subtraheras (röd linje).

Figur 6
Figur 6. Återgivet massan extinktionskoefficienten spektra vid 25 ° C i vatten i vätskeform (http://www.ualberta.ca/ ~ jbertie / JBDownload.HTM # Spectra) och för en hydratiserad film av ADP / ATP-bärare (AAC) 64 . Trong> Mass utsläckningskoefficient spektrum mättes i lösning för DM (100 mg / ml), och i en hydrerad film för Br.

Figur 7
Figur 7. Transmittans av det optiska filtret som används i tidsupplösta scan-scan FT-IR-mätningarna.

Figur 8
. Figur 8 Utförande av laserpulserna som tillhandahålls av den andra övertonen (532 nm) av en Nd:. YAG-laser Histogram av variationen av den relativa energin i 1000 laserpulser, och montera dem på en normalfördelning med en standardavvikelse av 0,05.

1622/51622fig9highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 9. Ljusinducerad absorbansförändringar BR vid tre representativa vågtalen till enhetlig tid distansintervaller (grönt, svart, och blå linjer) och efter nästan logaritmisk medelvärdes till ~ 20 poäng / decennium (röda linjer). Lägg märke till att minska buller efter logaritmisk medelvärdes, avslöjar svängning av tiden spår i millisekund område.

Figur 10
Figur 10. 3D-representation av ljus-inducerad absorbansförändringar för bR inspelade av ATR vid pH 7,4 (4 M NaCl, 100 mM NaPi). A) Rådata. B) Uppgifter rekonstruerade med fem SVD-komponenter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.


Figur 11. FT-IR skillnad absorptionsgrad av BR photocycle vid tre utvalda tider där L (12,5 ^ sek), är M (300 ^ sek), och N (6 ms) intermediärer mest berikade.

Figur 12
Figur 12 överföring och protein. Proton ryggraden dynamik i BR photocycle som lösas genom tidsupplöst steg-scan FT-IR skillnaden spektroskopi. Absorbansvärdena förändringar vid 1762 cm -1 rapporter på protonisering / deprotonisering dynamik Asp85, och vid 1741 cm -1 på avprotonering / reprotonation dynamik Asp96 (inklusive H bond ändringar innan 300 ^ sek). Tidsfrist spåren vid 1670 och 1555 cm-1rapport förändringar i amid I och II vibrationer, både känsliga för konformationen hos peptidryggraden. De bakre spår motsvarar de rådata, och de röda till SVD-behandlade uppgifter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 13
Figur 13. Singulärvärdesfaktorisering (SVD) av de experimentella tidsupplösta steg-scan FT-IR-data av den b photocycle (se figur 10A). SVD utfördes efter vägning av experimentella data med hänsyn till buller standardavvikelse beroendet vågtal (Figur 15); i kombination med den 1: a derivatan för att minska den statistiska vikten av grundlinjeförändringar, som beskrivits tidigare 57. A) & #160; Rita av de relativa singulära värdena för de första 50 komponenterna (svarta cirklar). De första fem komponenterna är tilldelade signalkomponenter (röda cirklar). Resten av komponenterna förfall exponentiellt som förväntat för buller-komponenter (se streckad grå linje). B) Första åtta abstrakt spektra (U 1 till U 8). C) Första åtta abstrakta tids spår (V 1 till V 8). Den abstrakta spektra och tids spår tilldelats signalen visas i röda linjer, och med svarta linjer på annat sätt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 14
Figur 14. 3D-representation av Ijusinducerade IR absorbansförändringar för ChR2 inspelade av steg-scani sändningsläge. Steget-scan uppgifter sträcker sig till 125 msek, endast täcker en del av photocycle. A) Rådata. B) Uppgifter rekonstruerade med fem SVD-komponenter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 15
Figur 15. Beräknad ljudnivå i en FT-IR. Skillnad absorptionsspektrum vid 6,25 ^ sek tids och 8 cm -1 spektral upplösning för ett experiment som involverar 1 co-addition/mirror läge (500 fotoreaktioner) eller ~ 200 co-addition/mirror läge (10 5 fotoreaktioner). Värden visas för den dämpade totalreflektion (ATR) och sändningsinställningen.

Discussion

En av de första frågor som behöver beaktas när man utför tidsupplösta steg-scan FT-IR-experiment på ett protein är beredningen av ett prov i en lämplig form för IR-spektroskopi. IR-absorption från andra än proteinet av intresse ämnen måste minskas, särskilt det från vatten. Det vanligaste tillvägagångssättet är att avdunsta bulkvattnet av provet för att bilda en film. Filmen kan rehydratiseras antingen genom att tillsätta några droppar av en vattenlösning eller genom att exponera filmen för en atmosfär med reglerad fuktighet. Vi har visat hur man i båda fallen är det möjligt att uppskatta den hydratisering nivå erhålls med hjälp av IR-absorptions-spektroskopi (se figur 3 och figur 5). Även om de erhållna hydrering nivåer kan tyckas låg jämfört med dem i lösning, är de faktiskt nära de som återfinns i levande celler 70, vilket gör studiet av hydratiserade filmer av proteiner funktionellt relevanta. Förutom vatten är detär också viktigt att känna till och för att styra mängden av lipid eller detergent i provet. Båda bör hållas tillräckligt låg för att ha en reducerad spektroskopisk effekt i IR-absorption, men tillräckligt hög för att bevara integriteten och funktionaliteten hos proteinet av intresse.

Tidsupplöst steg-scan spektroskopi är bara rakt tillämplig på proteiner som visar reversibla reaktioner som kan utlösas reproducerbart med ljus (men se framsteg i koppling steg-scan med snabb buffert utbyte) 71. I steg-scan reaktionen måste vara reproducerbar minst ~ 500x, det minsta antal slutföra en interferogram täcker 1,800-850 cm -1 region 8 cm -1 upplösning. Men i praktiken, ytterligare uppgifter medelvärdes krävs normalt att skjuta ljudnivån nere. För 200 co-additions/mirror läge (10 5 repetitioner av reaktionen) en 6.25 isek upplösning absorbans skillnad spektrum kan visa en brus standard avvikelse mellan 2 x 10 -5 och 2 x 10 -4 för en ATR och mellan 5 x 10 -6 och 3 x 10 -5 för en överföringsexperiment (Figur 15). Tack vare dess högre foton genomströmning, transmission möjliggör ~ 7 lägre ljudnivå än ATR, en viktig aspekt för att framgångsrikt studera prover som har gett svaga absorption förändringar såsom ChR2. Å andra sidan, kräver ATR 5 till 25 gånger mindre prov än en transmissionsexperiment.

Tillämpningen av tidsupplöst steg-scan FT-IR-spektroskopi är problematiskt för proteiner som visar långsamma photocycles: spela in ett interferogram för steg-scan kan bli opraktiskt lång. Vissa lösningar har presenterats för att hantera sådana fall 72,73, ofta baserade på användning av flera utbytbara prover för att snabba upp mätningarna på bekostnad av ökad proteinkonsumtion och experimentell komplexitet 27,74. I vissa fall är det möjligt att kringgå detta problem genom att exciterar provet innan photocycle är strängt klar. För ChR2, med en photocycle kräver efter foto-excitation 60 sek för 99% återvinning, är redan på 80% 48 återhämtningen på 4 sek. Med en exciteringseffektivitet på 10% per laserpuls, 98% av ChR2 molekyler är i mörkt tillstånd 4 sek efter foto-excitation, vilket gör det möjligt att utföra experiment på en laserrepetitionsfrekvens på 0,25 Hz.

Databehandling är en slutlig teknisk aspekt som krävs för att uppnå bästa möjliga resultat. Logaritmisk medelvärdes minskar buller och, viktigt, minskar storleken på de data utan förvrängningar, en funktion avgörande för bakre dataanalys med hjälp singulärvärdesuppdelning eller global montering. Logaritmisk medelvärdes är dock inte särskilt framgångsrika i genomsnitt ut svängningar i de tids spår orsakade av svängningar i den mobila spegeln och andra 1 / f bullerkällor under mätningarna (Figur 9). Dessa svängningar i baslinjenkan överstiga bruset i millisekund område och korrupta kvaliteten på uppgifterna. Singulärvärdesuppdelning drar fördel av redundans av data för att minska buller, och med vissa ändringar 57 det kan minska samt fluktuationer i baslinjen.

Slutligen, den hårdare och mest tidskrävande delen av en tidsupplöst steg-scan FT-IR-experiment motsvarar tilldelningen av banden och den spektrala och kinetisk tolkning av data. För bacteriorhodopsin många av banden som visas i IR skillnaden spektra har tilldelats eller tolkats tack vare den ackumulerade arbetet av många forskargrupper under årtionden. För en betydligt mindre studerade protein, såsom channelrhodopsin-2, de ovan presenterade tidsupplösta IR-experiment måste åtföljas av parallella experiment på plats riktade mutanter och kombineras med information från kompletterande tekniker för att nå en mekanistisk tolkning 48.

Disclosures

Författarna förklarar ingen konkurrerande ekonomiska intressen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
FT-IR spectrometer Bruker Vertex 80v Equipped with photovoltaic-MCT detector, an external global, and an oil-free pump. Firmware 2.3.
BaF2 windows korth Kristalle
Diamond ATR accesory Smiths detection Nine-reflection DuraDisk
Thermostatic bath Julabo F25
Vibration decoupled table OPTA
Pulsed Nd:YAG laser with a second harmonic generator Continuum electro-Optics Minilite 
Optical parametric oscillator (OPO) OPTA BBO-355-VIS/IR S/N 1009
Digital delay/pulse generator  Stanford Research Systems DG535
Pulsed Nd:YAG laser with a third harmonic generator Spectra-Physics Quanta-Ray
Various optical mirrors and lenses ThorLabs
OPUS 7.0 Bruker Software to control Vertex 80v spectrometer
MATLAB run time Mathworks Used to run home-made executable programs to preprocess the data

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Henzler-Wildman, K., Kern, D. Dynamic personalities of proteins. Nature. 450, 964-972 (2007).
  2. Lacapère, J. J., Pebay-Peyroula, E., Neumann, J. M., Etchebest, C. Determining membrane protein structures: still a challenge. Trends Biochem. Sci. 32, 259-270 (2007).
  3. Wöhri, A. B., et al. Light-induced structural changes in a photosynthetic reaction center caught by Laue diffraction. Science. 328, 630-633 (2010).
  4. Aquila, A., et al. Time-resolved protein nanocrystallography using an X-ray free-electron laser. Opt. Express. 20, 2706-2716 (2012).
  5. Neutze, R., Moffat, K. Time-resolved structural studies at synchrotrons and X-ray free electron lasers: opportunities and challenges. Curr. Opin. Struc. Biol. 22, 651-659 (2012).
  6. Austin, R. H., et al. Dynamics of carbon monoxide binding by heme proteins. Science. 181, 541-543 (1973).
  7. Alberding, N., et al. Tunneling in ligand binding to heme proteins. Science. 192, 1002-1004 (1976).
  8. Goormaghtigh, E., Cabiaux, V., Ruysschaert, J. M. Determination of soluble and membrane protein structure by Fourier transform infrared spectroscopy. III. Secondary structures. Subcell. Biochem. 23, 405-450 (1994).
  9. Tamm, L. K., Tatulian, S. A. Infrared spectroscopy of proteins and peptides in lipid bilayers. Q. Rev. Biophys. 30, 365-429 (1997).
  10. Arrondo, J. L., Goñi, F. M. Structure and dynamics of membrane proteins as studied by infrared spectroscopy. Prog. Biophys. Mol. Biol. 72, 367-405 (1999).
  11. Barth, A., Zscherp, C. What vibrations tell us about proteins. Q. Rev. Biophys. 35, 369-430 (2002).
  12. Gerwert, K. Molecular reaction-mechanisms of proteins as monitored by time-resolved FTIR Spectroscopy. Curr. Opin. Struct. Biol. 3, 769-773 (1993).
  13. Maeda, A. Application of FTIR spectroscopy to the structural study on the function of bacteriorhodopsin. Isr. J. Chem. 35, 387-400 (1995).
  14. Kandori, H. Role of internal water molecules in bacteriorhodopsin. Biochim. Biophys. Acta. 1460, 177-191 (2000).
  15. Zscherp, C., Barth, A. Reaction-induced infrared difference spectroscopy for the study of protein reaction mechanisms. Biochemistry. 40, 1875-1883 (2001).
  16. Nyquist, R. M., Heitbrink, D., Bolwien, C., Gennis, R. B., Heberle, J. Direct observation of protonation reactions during the catalytic cycle of cytochrome c oxidase. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 8715-8720 (2003).
  17. Rich, P. R., Iwaki, M. Methods to probe protein transitions with ATR infrared spectroscopy. Mol. Biosyst. 3, 398-407 (2007).
  18. Noguchi, T. Light-induced FTIR difference spectroscopy as a powerful tool toward understanding the molecular mechanism of photosynthetic oxygen evolution. Photosynth. Res. 91, 59-69 (2007).
  19. Granell, M., Leon, X., Leblanc, G., Padros, E., Lorenz-Fonfria, V. A. Structural insights into the activation mechanism of melibiose permease by sodium binding. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 22078-22083 (2010).
  20. Schuler, B., Eaton, W. A. Protein folding studied by single-molecule FRET. Curr. Opin. Struct. Biol. 18, 16-26 (2008).
  21. Kapanidis, A. N., Strick, T. Biology, one molecule at a time. Trends Biochem. Sci. 34, 234-243 (2009).
  22. Uhmann, W., Becker, A., Taran, C., Siebert, F. Time-resolved FT-IR absorption spectroscopy using a step-scan interferometer. Appl. Spectrosc. 45, 390-397 (1991).
  23. Dioumaev, A. K., Braiman, M. S. Two bathointermediates of the bacteriorhodopsin photocycle, distringuished by nanosecond time-resolved FTIR spectroscopy at room temperature. J. Phys. Chem. B. 101, 1655-1662 (1997).
  24. Rammelsberg, R., Huhn, G., Lübben, M., Gerwert, K. Bacteriorhodopsin's intramolecular proton-release pathway consists of a hydrogen-bonded network. Biochemistry. 37, 5001-5009 (1998).
  25. Rödig, C., Siebert, F. Errors and artifacts in time-resolved step-scan FT-IR spectroscopy. Appl. Spectrosc. 53, 893-901 (1999).
  26. Brudler, R., Rammelsberg, R., Woo, T. T., Getzoff, E. D., Gerwert, K. Structure of the I1 early intermediate of photoactive yellow protein by FTIR spectroscopy. Nat. Struct. Biol. 8, 265-270 (2001).
  27. Remy, A., Gerwert, K. Coupling of light-induced electron transfer to proton uptake in photosynthesis. Nat. Struct. Biol. 10, 637-644 (2003).
  28. Lórenz-Fonfría, V. A., Furutani, Y., Kandori, H. Active internal waters in the bacteriorhodopsin photocycle. A comparative study of the L and M intermediates at room and cryogenic temperatures by infrared spectroscopy. Biochemistry. 47, 4071-4081 (2008).
  29. Griffiths, P. R., de Haseth, J. A. Fourier Transform Infrared Spectrometry. , John Wiley and Sons. (1986).
  30. Smith, G. D., Palmer, R. A. Handbook of vibrational spectroscopy. , John Wiley & Sons Ltd. (2002).
  31. Rammelsberg, R., Heßling, B., Chorongiewski, H., Gerwert, K. Molecular reaction mechanisms of protein monitored by nanosecond step-scan FT-IR difference spectroscopy. Appl. Spectrosc. 51, 558-562 (1997).
  32. Rödig, C., Chizhov, I., Weidlich, O., Siebert, F. Time-resolved step-scan Fourier transform infrared spectroscopy reveals differences between early and late M intermediates of bacteriorhodopsin. Biophys. J. 76, 2687-2701 (1999).
  33. Bromberg, S. E., et al. The mechanism of a C-H bond activation reaction in room-temperature alkane solution. Science. 278, 260-263 (1997).
  34. Rödig, C., Siebert, F. Handbook of vibrational spectroscopy. , John Wiley & Sons. (2002).
  35. Braiman, M. S., Xiao, Y. Vibrational Spectroscopy of Biological and Polymeric Materials. , CRC Press. 353-418 (2006).
  36. Gerwert, K. Handbook of vibrational spectroscopy. , John Wiley & Sons Ltd. (2002).
  37. Koutsoupakis, C., Pinakoulaki, E., Stavrakis, S., Daskalakis, V., Varotsis, C. Time-resolved step-scan Fourier transform infrared investigation of heme-copper oxidases: implications for O2 input and H2O/H+ output channels. Biochim. Biophys. Acta. 1655, 347-352 (2004).
  38. Radu, I., Schleeger, M., Bolwien, C., Heberle, J. Time-resolved methods in biophysics. 10. Time-resolved FT-IR difference spectroscopy and the application to membrane proteins. Photochem. Photobiol. Sci. 8, 1517-1528 (2009).
  39. Haupts, U., Tittor, J., Oesterhelt, D. Closing in on bacteriorhodopsin: progress in understanding the molecule. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 28, 367-399 (1999).
  40. Lanyi, J. K. Bacteriorhodopsin. Annu. Rev. Physiol. 66, 665-688 (2004).
  41. Heberle, J., Fitter, J., Sass, H. J., Büldt, G. Bacteriorhodopsin: the functional details of a molecular machine are being resolved. Biophys. Chem. 85, 229-248 (2000).
  42. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-1: a light-gated proton channel in green algae. Science. 296, 2395-2398 (2002).
  43. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proc. Natl. Acad. Sci U. S. A. 100, 13940-13945 (2003).
  44. Zhang, F., et al. The microbial opsin family of optogenetic tools. Cell. 147, 1446-1457 (2011).
  45. Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The development and application of optogenetics. Annu. Rev. Neurosci. 34, 389-412 (2011).
  46. Feldbauer, K., et al. Channelrhodopsin-2 is a leaky proton pump. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 12317-12322 (2009).
  47. Nack, M., et al. Kinetics of proton release and uptake by channelrhodopsin-2. FEBS Lett. 586, 1344-1348 (2012).
  48. Lórenz-Fonfría, V. A., et al. Transient protonation changes in channelrhodopsin-2 and their relevance to channel gating. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, (2013).
  49. Heberle, J., Zscherp, C. ATR/FT-IR difference spectroscopy of biological matter with microsecond time resolution. Appl. Spectrosc. 50, 588-596 (1996).
  50. Nyquist, R. M., Ataka, K., Heberle, J. The molecular mechanism of membrane proteins probed by evanescent infrared waves. Chembiochem. 5, 431-436 (2004).
  51. Gerwert, K., Freier, E., Wolf, S. The role of protein-bound water molecules in microbial rhodopsins. Biochim. Biophys. Acta. 1837, 606-613 (2014).
  52. Lórenz-Fonfría, V. A., Heberle, J. Channelrhodopsin unchained: Structure and mechanism of a light-gated cation channel. Biochim. Biophys. Acta. 1837, 626-642 (2014).
  53. Carter, R. O., Lindsay, N. E., Beduhn, D. A solution to base-line uncertainty due to MCT detector nonlinearity in FT-IR. Appl. Spectrosc. 44, 1147-1151 (1990).
  54. Noguchi, T., Sugiura, M. Flash-induced FTIR difference spectra of the water oxidizing complex in moderately hydrated photosystem II core films: effect of hydration extent on S-state transitions. Biochemistry. 41, 2322-2330 (2002).
  55. Henry, E. R., Hofrichter, J. Singular value decomposition: application to analysis of experimental data. Methods Enzymol. 210, 129-192 (1992).
  56. Hendler, R. W., Shrager, R. I. Deconvolutions based on singular value decomposition and the pseudoinverse: a guide for beginners. J. Biochem. Biophys. Methods. 28, 1-33 (1994).
  57. Lórenz-Fonfría, V. A., Kandori, H. Spectroscopic and kinetic evidence on how bacteriorhodopsin accomplishes vectorial proton transport under functional conditions. J. Am. Chem. Soc. 131, 5891-5901 (2009).
  58. Fischer, H., Polikarpov, I., Craievich, A. F. Average protein density is a molecular-weight-dependent function. Protein Sci. 13, 2825-2828 (2004).
  59. Nagle, J. F., Tristram-Nagle, S. Structure of lipid bilayers. Biochim. Biophys. Acta. 1469, 159-195 (2000).
  60. Lee, A. G. Lipid-protein interactions in biological membranes: a structural perspective. Biochim. Biophys. Acta. 1612, 1-40 (2003).
  61. Goormaghtigh, E., Raussens, V., Ruysschaert, J. M. Attenuated total reflection infrared spectroscopy of proteins and lipids in biological membranes. Biochim. Biophys. Acta. 1422, 105-185 (1999).
  62. Lórenz-Fonfría, V. A., León, X., Padrós, E. Studying substrate binding to reconstituted secondary transporters by attenuated total reflection infrared difference spectroscopy. Methods Mol. Biol. 914, 107-126 (2012).
  63. Bertie, J. E., Lan, Z. D. Infrared intensities of liquids XX: the intensity of the OH stretching band of liquid water revisited, and the best current values of the optical constants of H2O(l) at 25 oC between 15,000 and 1 cm-1. Appl. Spectrosc. 50, 1047-1057 (1996).
  64. Lórenz, V. A., et al. The secondary structure of the inhibited mitochondrial ADP/ATP transporter from yeast analyzed by FTIR spectroscopy. Biochemistry. 40, 8821-8833 (2001).
  65. Heßling, B., Souvignier, G., Gerwert, K. A model-independent approach to assigning bacteriorhodopsin's intramolecular reactions to photocycle intermediates. Biophys. J. 65, 1929-1941 (1993).
  66. Braiman, M. S., et al. Vibrational spectroscopy of bacteriorhodopsin mutants: light-driven proton transport involves protonation changes of aspartic acid residues 85, 96, and 212. 27, 8516-8520 (1988).
  67. Gerwert, K., Souvignier, G., Hess, B. Simultaneous monitoring of light-induced changes in protein side-group protonation, chromophore isomerization, and backbone motion of bacteriorhodopsin by time-resolved Fourier-transform infrared spectroscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 87, 9774-9778 (1990).
  68. Gerwert, K., Hess, B., Soppa, J., Oesterhelt, D. Role of aspartate-96 in proton translocation by bacteriorhodopsin. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86, 4943-4947 (1989).
  69. Lórenz-Fonfría, V. A., Kandori, H., Padrós, E. Probing specific molecular processes and intermediates by time-resolved Fourier transform infrared spectroscopy: application to the bacteriorhodopsin photocycle. J. Phys. Chem. B. 115, 7972-7985 (2011).
  70. Ellis, R. J., Minton, A. P. Cell biology: join the crowd. Nature. 425, 27-28 (2003).
  71. Furutani, Y., Kimura, T., Okamoto, K. Development of a rapid Buffer-exchange system for time-resolved ATR-FTIR spectroscopy with the step-scan mode. Biophysics. 9, 123-129 (2013).
  72. Rammelsberg, R., Boulas, S., Chorongiewski, H., Gerwert, K. Set-up for time-resolved step-scan FTIR spectroscopy of noncyclic reactions. Vib. Spectrosc. 19, 143-149 (1999).
  73. Rödig, C., Siebert, F. Monitoring fast reactions of slow cycling systems with time-resolved FTIR spectroscopy. Vib. Spectrosc. 19, 271-276 (1999).
  74. Rödig, C., Siebert, F. Distortion of the L→M transition in the photocycle of the bacteriorhodopsin mutant D96N: a time-resolved step-scan FTIR investigation. FEBS Lett. 445, 14-18 (1999).

Tags

Biofysik bacteriorhodopsin channelrhodopsin dämpad total reflektion protonöverföring proteindynamik infraröd spektroskopi tidsupplöst spektroskopi steg-scan membranproteiner singulärvärdesuppdelning
Proton Transfer och proteinkonforma Dynamics i Känsliga Proteiner från Time-löst Step-scan Fourier-transform infraröd spektroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lórenz-Fonfría, V. A.,… More

Lórenz-Fonfría, V. A., Heberle, J. Proton Transfer and Protein Conformation Dynamics in Photosensitive Proteins by Time-resolved Step-scan Fourier-transform Infrared Spectroscopy. J. Vis. Exp. (88), e51622, doi:10.3791/51622 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter