Ein-Kanal-Cell-Attached-Patch-Clamp-Aufnahme

Summary

Beschrieben wird hier ein Verfahren zur Erlangung weite Strecken der aktuellen Aufnahme von einem Ionenkanal mit der Cell-Attached-Patch-Clamp-Technik. Diese Methode erlaubt die Beobachtung in Echtzeit, das Muster der Öffnungs-Schließ-Kanal-Konformationen, die die biologische Signal zugrunde liegen. Diese Daten informieren über Kanaleigenschaften in ungestörten biologischen Membranen.

Abstract

Ionenkanal-Proteine ​​sind universelle Geräte für die schnelle Kommunikation durch biologische Membranen. Die zeitliche Signatur des Ionenflusses erzeugen sie hängt von intrinsischen Eigenschaften zu jedem Kanalprotein sowie den Mechanismus, mit dem sie erzeugt und gesteuert und stellt einen wichtigen Bereich der aktuellen Forschung. Informationen über die Betriebsdynamik der Ionenkanal-Proteine ​​können durch Beobachten langen Strecken von Strom, der von einem einzigen Molekül produziert, erhalten werden. Hier beschrieben ist ein Protokoll zum Erhalten eines Kanal Cell-Attached-Patch-Clamp-Aufnahmen Strom für einen Liganden abhängigen Ionenkanals des NMDA-Rezeptor heterolog in HEK293-Zellen oder nativ in kortikalen Neuronen exprimiert. Es werden auch Anweisungen, wie man die Methode auf andere Ionenkanäle von Interesse durch die Vorlage am Beispiel der mechanisch-sensitive Kanal PIEZO1 anzupassen. Dieses Verfahren kann Daten liefern hinsichtlich Leitfähigkeit Eigenschaften und der zeitlichen Abfolge der OPE des Kanalsn-Konformationen geschlossen, aus denen Aktivierungsmechanismus des Kanals, um dadurch ihre Funktionen in Gesundheit und Krankheit zu verstehen.

Introduction

Schnelle Kommunikation durch biologische Membranen erfolgt fast ausschließlich im oligomeren porenbildende Membranproteine, die allgemein als Kanäle bezeichnet. Diese Proteine ​​unterscheiden sich stark in Aktivierungssignale, Gating-Mechanismen und Leitfähigkeit Eigenschaften. Kanal-Proteine, deren Poren selektiv Ionen als Ionenkanäle klassifiziert; ihre Aktivierung produziert Ionenströme durch die Membran, und ihre Antworten können mit hoher Auflösung in Echtzeit mit Hilfe elektrophysiologischer Techniken aufgezeichnet werden. Die Aktivierungssignale umfassen eine breite Palette von chemischen und physikalischen Eingänge einschließlich Konzentrationsgradienten, mechanische und elektrische Kräfte und Temperatur; damit weiteren Klassifizieren Ionenkanäle in ligandenabhängigen, mechanosensitive, spannungsgesteuerten oder wärmeempfindliche Arten. In diesem Artikel werden Protokolle beschrieben, um Ein-Kanal-Aktivität aus einer ligandenabhängigen Kanal, den NMDA-Rezeptor und eine mechanosensitive Kanal, PIEZO1 aufzeichnen, mit der Patch-Clamp-Technik.0;

Patch-Clamp-Elektrophysiologie ist die erste und am meisten verwendete experimentelle Verfahren ausreichend empfindlich, um die Beobachtung von einzelnen Molekülen ^{1, 2} zu ermöglichen. Neben dieser ausgeprägte Empfindlichkeit hat es erheblich erweiterten die biologische Präparate zugänglich elektrophysiologischen Aufzeichnung und hat auch die Beobachtung von Ionenkanälen in intakten Membranen erlaubt. Erstens, weil beide Spannungsklemm und aktuelle Aufnahme mit der gleichen Elektrode erreicht, kann es verwendet werden, um Signale über kleine Zellen oder Membranen Flecken aufzuzeichnen. Die Technik ergab, dass Ionenkanäle sind nicht auf erregbare Membranen von Muskeln Frosch, Aal electroplaques, oder Tintenfisch Riesen Axone ^{3, 4,} sondern vielmehr, dass sie vertreten allgegenwärtigen Lampen der Transmembran-Signalmechanismen und sind untrennbar mit aller zellulären Membrantypen von uni-oder eingeschränkt mehrzelligen Organismen und auch intrazelluläre Membranen. Importantly, die Fähigkeit zur Transmembranströme durch einfaches Anbringen einer Glaspipette zu einer intakten Zelle aufnehmen, sofern die beispiellose Gelegenheit, um die Aktivität von Ionenkanälen in ihrer Mutter ungestörten Membranen aufnehmen. Somit ist die Zelle angeschlossen Patch-Clamp-Technik, die in diesem Protokoll beschrieben wird, ermöglicht die Kontrolle der Aktivität von Ionenkanälen kontinuierlich für zehn Minuten oder länger in ihrer natürlichen Umgebung.

Unter normalen Temperaturschwankungen, alle Proteine, einschließlich der Ionenkanal-Proteine ​​unterziehen strukturellen Veränderungen in einem breiten Zeitskala, mit den schnellsten und häufigsten Umlagerungen vertreten durch Seitenketten-Bewegungen und viel langsamer, weniger häufige Änderungen durch die Neupositionierung der gesamten dargestellten wahrscheinlich Domänen oder Untereinheiten oder in einigen Fällen durch posttranslationale Modifikationen oder Protein-Protein-Wechselwirkungen ^{5, 6.} Beobachten längere Tätigkeit, die ein Molekül erzeugt wird, kann helfen, die Funktion zu verstehenlen Dynamik der Ionenkanäle in intakten Membranen physiologischen und liefert wertvolle Informationen über den Betriebsmechanismus des betrachteten Molekül.

Im Gegensatz zu dem wachsenden Verständnis für die Vielfalt von Ionenkanälen in Zelltypen und Entwicklungsstadien, Wissen über die molekulare Zusammensetzung von Ionenkanälen in nativen Membranen noch immer begrenzt. Alle Ionenkanäle sind multimere Proteine ​​und die Mehrheit der nativen Ionenkanäle zusammen aus verschiedenen Arten von Untereinheiten Herstellung von Proteinen von breiten Molekular Vielfalt, die oft mit unterschiedlichen Leitfähigkeit und Gating Eigenschaften begleitet wird. Aus diesem Grund sind die Ionenkanäle von definierten molekularen Zusammensetzung nach Expression in heterologen Systemen untersucht. Insbesondere HEK293-Zellen, die eine klonale Linie von immortalisierten humanen embryonalen Nierenzellen ^7, gewonnen Akzeptanz als bevorzugte System zur heterologen Expression von rekombinanten Ionenkanäle. Unter den Manny Vorteile, die HEK293-Zellen als die Wahl System für Ionenkanal-Elektrophysiologie erhöht sind die einfache und kostengünstige Kultivierung und Pflege langlebige stabile Kulturen, ihre Fähigkeit zur Durchführung von post-translationale Faltung, Verarbeitung und Handel von Säugetierproteinen, und in vielen Fällen , ihrer geringen oder sogar Fehlen von endogenen Ausdruck für die interessierenden Kanal ^{7, 8.} Expression rekombinanter Ionenkanäle und das Studium ihrer funktionellen Eigenschaften in HEK293-Zellen nach wie vor ein wertvoller Ansatz, um Informationen über Struktur-Funktions-Eigenschaften von Ionenkanälen sowie die spezifischen Eigenschaften der Ionenkanal-Isoformen und ihre Rollen in nativem Gewebe zu erhalten. Die in diesem Artikel beschriebenen Protokolle können ebenso gut auf Ionenkanäle in rekombinanten HEK293 Zellen exprimiert und auf native Ionenkanäle verwendet werden.

Zusammenfassend ist die Patch-Clamp-Technik, durch seine beispiellose Fähigkeit zur Signal lösens von einem Molekül bleibt bis heute die direkteste Methode zur Beobachtung des Verhaltens von Einzelmolekülen. In seiner Cell-Attached-Modus ermöglicht Patch-Clamp-Aufzeichnung lange Beobachtungszeiträume, die, wenn für ein Molekül erfolgen kann außergewöhnliche Einsicht in den Betrieb der Ionenkanäle bereitzustellen. Unten ist ein Protokoll für den Erhalt hoher Auflösung aktuelle Aufnahmen aus der Zelle befestigt Patches ein Ionenkanal-Protein enthält, vorgestellt.

Protocol

1. Zellkultur und Proteinexpression

1. Aufrechterhaltung HEK293-Zellen (ATCC-Nummer CRL-1573) zwischen den Durchgängen 22 und 40, die Durchgänge durch die ATCC geführt, in Monolayer-Kultur in DMEM, ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) enthält und 1% Penicillin / Streptomycin-Gemisch bei 5% CO ₂ und 37 ° C. Zwischen Experimenten Passage-Zellen in T25-Kolben 5-20 fachen Verdünnungen in einem Endvolumen von 10 ml gelöst. Hinweis: Die Verwendung dieser Zellen während der Passagen garantiert günstigen Zellgesundheit, die für eine optimale Abdichtung Bildung und Patch-Stabilität ermöglicht.
2. Zur Transfektion Platte HEK293-Zellen in 35 mm-Schalen in einer Dichte von ~ 10 ⁵ Zellen / Schale, die ~ 0,5-0,6 ml Zellsuspension pro Schale entspricht und wachsen Zellen in 2 ml Medium für 18-24 Stunden.
3. In einem sterilen 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen, bereiten Sie die Transfektion Mischung für vier 35-mm-Schalen durch Zugabe von (in dieser Reihenfolge): (1) 1 ug jedes cDNA (GluN1, GluN2A und GFP); (2) 315 &mgr; ldoppelt destilliertem Wasser _(ddH2O); (3) 350 ul 42 mM 4 - (2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure (HEPES), und (4) 35 ul 2,5 M _CaCl &sub2; tropfenweise, die verwendet wird, um den Niederschlag zu bilden.
4. Wirbelrohr 5 Sekunden und füge 175 ul der Suspension der Transfektion in jeder der vier 35 mm-Schalen plattiert Tag vor, die Zellen enthalten nun bei 50-60% Konfluenz und Inkubation der Zellen bei 37 ° C für 2 Stunden.
5. Absaugen der Transfektion Medium, waschen mit PBS und ersetzen mit 2 ml Wachstumsmedium mit 2 mM MgCl ₂ ergänzt werden, um zu verhindern, NMDA-Rezeptor-vermittelten Exzitotoxizität ^9. Hinweis: Für die elektrophysiologischen Ableitungen von 24-48 Stunden nach der Transfektion können die Zellen verwendet werden.

2. Elektrodenvorbereitung

1. Erzeugen Sie zwei symmetrischen Aufnahme Pipetten durch Ziehen an Borosilikatglas Rohre mit einer vertikalen Magnet. Basierend auf der Größe und Geometrie des resultierenden Spitze, ferner Form Pipettenmit einer Poliermaschine. Hinweis: Die Spitze Größe optisch und elektrisch ausgewertet werden. Visuell sollte der Außendurchmesser im Bereich von 1,4 bis 5,6 &mgr; m sein. Elektrisch, eine optimale Größe Spitze, wenn sie mit extrazellulären Lösung gefüllt ist, sollte Widerstände im Bereich von 12 bis 24 MOhm erzeugen (siehe Abbildung 2B).
2. Verwenden Sie eine Pipette Lösung, die für die Zell angebracht Experimente stellt die extrazelluläre Milieu, die maximale Kanalaktivität und hohe Stromamplituden produzieren wird. Anmerkung: Für NMDA-Rezeptoren, dies entspricht einer Lösung, die Sättigungskonzentrationen von Agonisten (Glutamat und Glycin), 1 mM EDTA, das zweiwertige kationische, Inhibitoren und Blocker chelatisiert und hat physiologische Konzentrationen von Natrium (150 mM) als einzige dringenden Ionen ( in mM: 1. Glutamat, Glycin 0,1, 150 NaCl, 2,5 KCl, 1 EDTA und 10 HEPBS, bei pH 8,0 mit 1 N NaOH gepuffert).

3. Cell-Attached-Patch-Clamp-Aufnahme

1. Offene QuB Datenerfassung software (www.qub.buffalo.edu) und wählen Sie die Übernahme-Fenster unter "Layout". Öffnen Sie eine neue QuB Datendatei (QDF), indem Sie auf "Neue Daten" unter dem Dropdown-Menü mit dem Titel "Datei" und geben Sie die folgenden Eingangsparameter: Abtastrate 40 kHz; A / D-Skalierung, 3000; Ausgangskanal 1; und A / D-Datengröße, 2. Stellen Sie die Amplitude Skalierung auf 0,1 V / pA mit der rechten Maustaste auf die Datei, Eigenschaften auswählen, und klicken Sie auf die Registerkarte "Daten". Hinweis: Diese Parameter können für jedes Setup mit einem Modell-Zelle in der Cell-Attached-Modus verfeinert werden. Zusätzliche Hinweisschilder auf die Datenerfassung mit Software und QuB QDF Eigenschaften sind online unter www.qub.buffalo.edu.
2. Wählen Sie eine 35 mm Schale mit Ionenkanal-exprimierenden Zellen und ersetzen Wachstumsmedium mit 2 ml PBS Calcium und Magnesium enthält; montieren Sie die Schüssel auf den Mikroskoptisch und konzentrieren sich auf die Zellfeld mit Phasenkontrastmikroskopie zu bewerten, dass die Zellen gesund und gut in die Schale befestigtin Monolayer-Mode (Abbildung 1A). Schalter zur Fluoreszenzerfassung, um zu überprüfen, dass die erfolgreiche Transfektion (1B) war. Hinweis: Das Spektrum der Fluoreszenz-Intensitäten als grobes Maß für die Proteinexpression verwendet werden.
3. Für Einzelkanalaufnahme, stellen Sie den Verstärker-Ausgangsverstärkung auf x10-, Patch-Konfiguration, um β = 1, Analogfilter bis 10 kHz, Modus zu-Klemmspannung und der angelegten Spannung bis +100 mV. Mit dem Spannungshaltebefehl in die Position OFF, wählen Sie die "Dichtheitsprüfung"-Taste.
4. Basierend auf Fluoreszenz und Zellgesundheit, wählen Sie eine Zelle zu patchen. Verifizierung unter Phasenkontrast, dass die Zelle auch an der Schale befestigt ist, hat einen großen Teil der Zelloberfläche zum Patchen, belichtet und ansonsten gesund aussieht. Hinweis: Pflegen Phasenkontrastbeleuchtung zu vermeiden Bleichen der Zelle während des An-und Patch-Clamp.
5. Füllen Sie ein frisch poliert Pipette mit gerade genug Lösung so macht es Kontakt mit der electrode und leicht schütteln, um Luftblasen, die in der Spitze eingefangen werden können, zu entfernen. Sichern Sie die Aufnahme Pipette auf den Verstärker heads durch Anziehen der Verschlussschraube des Pipettenhalter und sicherzustellen, dass der Silberdraht in der Pipettenlösung eingetaucht.
6. Mit einem kleinen (5 cc) Kunststoffspritze, die dem Pipettenhalter mit Schlauch verbunden ist, sanft an Überdruck das Eindringen von Verunreinigungen und Verstopfungen der Spitze während der Annäherung (2A) zu verhindern.
7. Mit dem Mikromanipulator, leiten Sie die Pipette in die Badewanne und positionieren Sie es direkt über der für das Patchen (1C) ausgewählte Zelle, Schließen des Stromkreises. Beachten Sie die Oszilloskop, das eine rechteckige Wellenform entsprechend des Verstärkers Dichtung Testsignal (2B) geben sollte. Hinweis: Bei der Einreise in das Bad, ist die Pipette Widerstand im optimalen Bereich von 12 bis 24 MOhm. Für ein 5 mV Testsignal, der gemessene Strom range entspricht ~ 20-40 pA.
8. Während der Überwachung Pipette Position visuell durch das Mikroskop und Pipette Widerstand elektrisch auf dem Oszilloskop, weiterhin den Ansatz, in kleinen Schritten, bis die Pipette trifft sanft auf die Zelle und das Testsignal sinkt leicht auf erhöhten Widerstand (2B) anzuzeigen.
9. Um eine Abdichtung zu bilden, nehmen Sie die Spritze und mit leichtem Unterdruck durch den seitlichen Schlauch durch Ziehen Sie den Spritzenkolben, die die Zellmembran in die Spitze der Pipette zieht Aufnahme und initiiert die Bildung einer Widerstands GOhm Dichtung ^10. Beachten Sie die Testsignal-Wellenform auf dem Oszilloskop, in der Dichtung Bildung wird durch die vollständige Abflachung angegeben, nur mit kapazitiven Transienten sichtbar (Abbildung 2B). Hinweis: Wenn das Signal nicht vollständig glätten oder die Grundlinie wird laut, deutet dies auf eine schwache Dichtung mit erheblichen Leckstrom um die Dichtung. Dies wird verhindern, dass resolving ein Kanalströme. Wenn dies der Fall ist, ziehen Sie die Pipette aus der Zelle und aus dem Bad, entfernen Sie sie aus dem Kopf Bühne und entsorgen. Wiederholen Sie den Vorgang mit einem frisch poliert Pipette bis eine Dichtung im angemessenen Bereich (≥ 1 GOhm).
10. Auf der Verstärker, schalten Sie den externen Befehl Umschalten von 'Dichtheitsprüfung' auf 'off'; schalten Sie die Spannungshaltebefehl an positiv (die zuvor auf 'off' eingestellt wurde); und erhöhen Sie die Verstärkung auf x100. Beobachten Sie das Oszilloskop für die Kanalaktivität, die, falls vorhanden, wird als quadratische Ausschläge nach oben aus dem zuvor flachen Basislinie (Abbildung 2C) angezeigt werden.
11. Wenn die Kanalaktivität wird auf dem Oszilloskop angezeigt werden, Daten zu erfassen, in der zuvor geöffneten digitale Datei in QuB, indem Sie die Taste "Play"-Taste gefolgt von der Taste "Record". So stoppen Sie die Datenerfassung, drücken Sie die Stopp-Taste in QuB, und speichern Sie die Datei an eine QDF leicht RetrievLage Lage auf der Computer-Festplatte, indem Sie "Daten speichern unter ..." in der Drop-down-Menü mit dem Titel 'Datei'.

4. Datenvorverarbeitung und Idealisierung

Hinweis: Wichtige Informationen können zwischen Einzel-Kanal-Aufnahmen durch statistische Analysen, die jeden Datenpunkt auf eine geeignete Leitfähigkeit Klasse zuordnet (im einfachsten Fall geschlossen oder offen) extrahiert werden. Dieser Vorgang wird als Daten Idealisierung und eine kurze Beschreibung der Daten Idealisierung mit den Segment k Mittel (SKM) Verfahren ¹¹ in QuB wird nachstehend beschrieben bezeichnet.

1. Öffnen Sie die Datei in QuB, und zeigen Sie die aktuellen Spuren in der 'Pre' Schnittstelle unter "Layout". Zeigen Sie die aufgenommene Datei ungefiltert (Digitalfilter entfernen), indem Sie das Kontrollkästchen "Fc".
2. Optisch scannen den Rekord um Unregelmäßigkeiten und Artefakten (4A) zu erkennen. Richtig kurzen Stromspitzen, die Berufsr in der Spur (4A), indem Sie einen angrenzenden sauberen Region des gleichen Leitwert Klasse, Hervorhebung dieser Region mit der rechten Maustaste und wählen 'gesetzt Löschpuffer. " Vergrößern Sie die Spitze, bis einzelne Probenpunkte sichtbar sind, wählen Sie die Region ersetzt werden durch Hervorhebung und löschen nur die Region und dann mit der rechten Maustaste auf "Löschen".
3. Definieren Sie die aktuelle Baseline Null für den gesamten Datensatz, indem Sie einen frühen Teil des Datensatzes, wo die Grundlinie ist stabil, markieren, rechte Maustaste und wählen Sie "Grundlinie gesetzt. Stellen Sie sicher, dass die Richtlinie, die genau erscheint steht für die Basislinie (lila in 4B)
4. Identifizieren Sie in der Aufzeichnung, wo die Rohdaten Grundlinie aus der Menge Grundlinie abweicht sichtbar Punkten. Korrigieren Sie dies, indem Sie einen kleinen Ausschnitt aus Grundlinie in der Region abweichende rechten Maustaste und wählen Sie die "fügen Sie eine Baseline-Knoten"-Befehl.
5. Identifizieren Regionen ter Aufnahme mit überschüssigen Rauschen oder Artefakte, die nicht einfach korrigiert werden können (Abbildung 4C). Markieren Sie die Region verworfen werden, der rechten Maustaste und wählen Sie "löschen. ' Hinweis: In diesem Fall kinetische Informationen verloren: die verarbeiteten Aufzeichnungs werden kürzer und die nach dem Verbindungspunkt auftretende Punkte erscheint kontinuierlich mit der Pre-Rauschbereich zu sein.
6. Um Datensätze zu idealisieren mit dem SKM-Algorithmus ^11, markieren Sie einen Teil der Spur, die sowohl offene und geschlossene Veranstaltungen und geben Sie den "Mod"-Schnittstelle unter 'Layout ". In der "Modell"-Panel, markieren Sie einen sauberen Teil der Spur, die Vertreter der Grundlinie in der gesamten Datei mit der rechten Maustaste auf das schwarze Quadrat (geschlossenen Zustand) und wählen Sie "greifen". Machen Sie dasselbe für die Kanalöffnungen, indem Sie den offenen Leitfähigkeit der rechten Maustaste auf das rote Quadrat in der "Modell"-Panel und wählen Sie "greifen".
7. Führen Sie die Idealisierungtion für den gesamten Datensatz, indem Sie auf die Schaltfläche "Datei" unter "Data Source". Rechts-Klick auf die Registerkarte "Idealize" unter dem Abschnitt "Modellierung", um sicherzustellen, dass die gewünschten Parameter für die Analyse korrekt sind, und klicken Sie dann auf "Ausführen". Das Ergebnis der Idealisierung, zusammen mit Amplitudenhistogramm für das gesamte Bild wird mit den Daten überlagert, um eine visuelle Inspektion der Idealisierung (Fig. 5) zu ermöglichen. Hinweis: Unzureichende Idealisierung kann auf die Erzeugung von "falschen Ereignisse", in dem QuB erkennt Kanalöffnungen und Schließungen, die eigentlich nicht vorkommen führen. Innerhalb der Aufzeichnungsauflösung, die von der Endstufe Analogfilter und der Abtastrate eingestellt ist, kann die Auflösung, mit der SKM erkennt offene und geschlossene Veranstaltungen, die von einer Totzeit für die Analysen kontrolliert werden. Optimale Pausenzeiten muss durch Versuch und Irrtum ausgewählt werden und wird auf Sampling-Rate hängt jedoch ist eine gute Faustregelum eine tote Zeit, die Proben 2-3 ¹² auswählen.
8. Um sicherzustellen, dass die Idealisierung stellt genau die Rohdaten, manuell scannen die idealisierte Spur. Nach der Identifizierung von Fehlern in der Idealisierung, markieren Sie die Spur auf der falschen Veranstaltung der rechten Maustaste und wählen Sie "Join Idl. ' Hinweis: Weitere Optionen und eine ausführliche Erläuterung der verschiedenen Befehle und Funktionen in QuB finden Sie in der Bedienungsanleitung QuB online (www.qub.buffalo.edu).

Representative Results

Rekombinante NMDA-Rezeptoren

NMDA-Rezeptoren binden und auf die gleichzeitige Einwirkung von zwei mit-Agonisten: Glutamat und Glycin. Sie montieren wie Heterotetramere von zwei Glycin-Bindungs ​​GluN1 Untereinheiten und zwei Glutamat-Bindungs ​​GluN2 Untereinheiten. GluN2 Untereinheiten sind durch vier Gene (AD) und von diesen codiert die am häufigsten transkribiert Formen in Gehirn sind GluN2A bei Erwachsenen und GluN2B an Jungtieren. Aufgrund der Vielfalt von NMDA-Rezeptor-Subtypen in nativen Zubereitungen Rezeptoren exprimieren, in HEK293-Zellen (Fig. 1A) ermöglicht die Steuerung der Untereinheit-Zusammensetzung, sowie die Fähigkeit, mit einem fein polierten Glaspipette (1C) aufnehmen Strom von Kanälen.

Sobald die Pipetten der Zelle berührt, eine deutliche Reduzierung in der Amplitude des Testimpulswellenform auf (Fig. 2B), was die Fähigkeit zur Bildung einer Dichtung. Eine ausreichende Dichtung, die eineKanal liefert eine klare Kanalaktivität, wie Ausschläge nach unten von der Grundlinie angezeigt wird, mit einem guten Signal-Rausch-Verhältnis bei Anlegen einer positiven Spannung (Abbildung 2C). Maximale Kanalaktivität für Wildtyp rekombinanten NMDA-Rezeptoren erreicht werden kann, wenn beide Agonisten in hohen Konzentrationen vorhanden sind, und wenn Inhibitoren und Kanalblocker fehlen. Dies ist ideal, so dass, wenn ein Patch mit mehr als einem Kanal, gleichzeitig sind sofort ersichtlich Öffnungen ¹³ (Fig. 3B). Für Proteine ​​mit sehr geringer Aktivität kann die Wahrscheinlichkeit, dass eine Strecke von einer Ebene Öffnungen stammt aus nur einem Kanal berechnet werden, wenn der Kanal offen Wahrscheinlichkeit bekannt ist oder angenähert ¹⁴ werden. Dadurch können längere Beobachtungszeiten erforderlich sein.

Unter diesen Bedingungen und bei Anwendung einer Pipette Haltepotential von +100 mV (was zu einer ungefähren Membranpotential von -120 mV), Single rekombinanten GluN1/GluN2A und GluN1/GluN2B sind mit hoher Wahrscheinlichkeit (P _o, 0,3 bis 0,5) auf eine relativ hohe Leitfähigkeit Niveau (> 50 pS) (3A und 5B) ^15-17 geöffnet. Bei der Aufnahme kann aktuelle Geräuschspitzen, Baseline Verwehungen, oder Zeiten der übermäßigen Lärm (Abb. 4A-C) manifestieren, aber wie erwähnt, diese können, wenn kurz-und Neben korrigiert werden. Es ist jedoch wichtig, dass die Kanalaktivität ununterbrochen für eine ausreichende Zeitdauer (≥ 10 min, 10.000 Ereignissen) zu gewährleisten, daß die volle Breite des Kanalverhalten erfasst wird aufgezeichnet.

Die aus solchen Aufnahmen gewonnenen Daten können Informationen über beide Kanal Kinetik und Permeation Eigenschaften. Hier Idealisierung von QuB unter Verwendung der SKM-Algorithmus (5A), jedoch können die Daten Idealisierung, die andere Software-Programme wie pClamp durchgeführt werden oder SCAN ¹² zeigen wir, einnd kann unter Verwendung verschiedener Algorithmen oder Kriterien, wie etwa die halbe Schwellenverfahren durchgeführt werden, wobei jede dieser Optionen ihre eigenen Vorteile und Nachteile enthält. Beschlag dieser Daten an kinetischer Modelle können zur weiteren Einblick in das Verhalten des Ionenkanalverstärkung durchgeführt werden. Maximum-Likelihood-Armatur kann mit Software wie QuB HJCFIT oder ¹⁸ durchgeführt werden, in dem die von jedem Programm implementierten Algorithmen ihre eigenen Vorteile. Während die Idealisierung in Fig. 5 gezeigt, erfordert nur eine möglichst einfache Modell eines geschlossenen Zustand und einem offenen Zustand durchgeführt werden soll, passend eine vollständige kinetische Modell für einen Ionenkanal benötigt man nacheinander geschlossenen und offenen Zuständen, bis ein bestimmtes Kriterium erreicht ist. Dieser Prozess hat gezeigt, dass Wildtyp-Rezeptoren GluN1/GluN2A haben fünf verschiedene kinetisch geschlossenen Zuständen und zwei bis vier kinetisch unterschiedliche offenen Zuständen (Abbildung 5C) ^19, in der dieseGating Eigenschaften sind entscheidend für die Bestimmung der Form des NMDA-Rezeptor-vermittelte synaptische Signal ^{20, 21.} Diese Art der Analyse kann auf andere Ionenkanäle kleiner Leitfähigkeit, wie AMPA-Rezeptoren erweitert werden, um Einblick in ihre ganz eigenen Gating-Mechanismen ^22,23,24 zu gewinnen. Ein Nachteil ist jedoch, da AMPA-Rezeptoren haben mehrere Ebenen Leitfähigkeit, erfolgreiche Idealisierung mit QuB können verlangen, weitere Staaten werden in einem vorgefertigten Modell integriert.

Diese Verfahren können auch erweitert werden, um Informationen über die Ionenkanaldurchlässigkeit und Leitfähigkeit durch Änderung der permeierenden Ionenzusammensetzung und / oder Konzentration zu erhalten. Aufnahmetätigkeit durch einzelne GluN1/GluN2A Rezeptoren mit den hier beschriebenen Methoden, ersetzt jedoch 150 mM NaCl mit 75 mM CaCl ₂ in der Aufnahme Pipette liefert Ströme mit ~ 20% der Leitfähigkeit (~ 10 PS). Dies zeigt, dass, während Calcium durchdringt NMDA-Rezeptoren an halloGH-Spiegel in physiologischen Bedingungen, es tatsächlich durchquert den Kanal langsamer als Natriumionen, was anzeigt, dass es eine potentielle Calcium-Bindungsstelle innerhalb der Permeationsweg sein. Zusätzlich, obwohl diese mit niedriger Leitfähigkeit können die Aufnahmen ausreichend mit der SKM-Algorithmus in QuB, enthüllt das Vorhandensein einer Zwischenunterebene Leitfähigkeit, die etwa 50% der Stromamplitude des Hauptleitfähigkeit (Fig. 6A und B) idealisiert werden. Diese Unterebene Öffnungen, kann jedoch nur in QuB idealisiert werden, wenn eine zusätzliche Leitfähigkeit Klasse wird in der anfänglichen kinetischen Modell integriert. Weitere kinetische Analysen zeigten, dass unter diesen Bedingungen, Rezeptoren zeigen noch fünf kinetisch unterschiedliche geschlossenen Zuständen jedoch diese Zustände verglichen damit, wenn der Kanal nur Natriumionen (6C) verläuft extrem unterschiedlichen Zeitkonstanten und Belegungen. Darüber hinaus sind nur zwei offenen Zuständen u beobachtetnder diese Bedingungen zeigen, dass, zusätzlich zu beeinflussen Kanalleitfähigkeit, Calciumionen sind in der Lage, Gating-Rezeptor modulieren.

Es gibt keine bestimmte Art und Weise, um nur einen Kanal Patches erhalten. Stattdessen können mehrere experimentelle Manipulationen zur Erhöhung der Erfolgswahrscheinlichkeit bei. Erstens zielen niedrigen Kanalexpression durch Auswertung der Fluoreszenzintensität der transfizierten Zellen (1B). , Verringern die Gesamtmenge der cDNA für die Transfektion oder die Menge der cDNA, die für eine erforderliche Untereinheit zu verringern, wie GluN1 verwendet: Erfolgreiche Ansätze zu sein die Zeit der Inkubation mit dem DNA / Calciumphosphat-Niederschlag zu verringern; und zum Flicken nur schwach fluoreszierenden Zellen aus dem Sichtfeld zu wählen. Diese Ansätze sollten fortgesetzt werden, wenn die Patches erhalten enthalten häufig mehrere Kanäle. Zusätzlich Verringerung der Größe der Pipettenspitze kann auch dazu beitragen, nur einen Kanal im patc Trappingh. Letztlich aber wird ein bei der Beschaffung von Ein-Kanal-Patches durch systematisch von der Aufnahme über lange Zeiträume von Patches, die deutlich mehr als einen Kanal Verzicht erfolgreich.

Rekombinante PIEZO1 Kanäle

Die in diesem Protokoll beschriebenen Verfahren können leicht an jedem Ligand Ionenkanal verwendet werden, und zwar angepasst, um einen Kanalaktivität von jedem Ionenkanal aufzuzeichnen, ob die durch Chemikalien, Spannung, Kraft, Temperatur oder anderer Mittel aktiviert werden. Ein Beispiel, wie dieses Protokoll geeignet ist, eine Kanalströme von anderen Ionen Kanälen aufzuzeichnen, insbesondere Maus PIEZO1 ein mechanosensitive Ionenkanal wird unten (Fig. 7) ^{25, 26} dargestellt.

Wie bei den NMDA-Rezeptorkanäle sind PIEZO1 und GFP in HEK293-Zellen durch Calciumphosphat-vermittelte Transfektion exprimiert und die Zellen werden als 24 bis 48 Stunden nach der Transfektionin Abschnitt 1.2 beschrieben. Da PIEZO1 durch Membran Strecke aktiviert wird, sollte darauf geachtet werden, um die Membran bei der Patchbildung und geeigneten Geräten für die Umsetzung und Kontrolle der angelegten mechanischen Kraft sanft manipulieren sollte vorhanden sein. Diese Bedingungen können durch Herstellung größerer Aufnahmepipetten mit Widerstand im Bereich von 2-3 M &OHgr; und eine Hochgeschwindigkeitsdruckspannvorrichtung (HSPC) zu dem Aufzeichnungs Pipette durch den Pipettenhalter an den Verstärker angeschlossen heads erreicht werden. Die Verstärkereinstellungen sind ähnlich denen für die NMDA-Rezeptoren in Abschnitt 3.3 beschrieben, außer für das Einschalten des "äußeren" Befehlsknopf, so daß der Verstärker durch die Erfassungssoftware gesteuert werden.

Um die Aktivitäten von PIEZO1 erzielen, verwenden Sie eine Aufnahme mit Pipette (in mm) gefüllt: 130 NaCl, 5 KCl, 10 HEPES, 1 CaCl _2, 1 MgCl _2, 10 TEA-Cl, pH 7,3 mit NaOH. Unter diesen Bedingungen können Öffnungen i überwacht werdennward Natriumströme, die auf dem Oszilloskop als Ausschläge nach unten von einem Nullstromausgangswert angezeigt wird. Legen Sie die Aufnahme Pipette auf den Verstärker Kopfstufe und stellen Sie sicher, dass das Zifferblatt auf der HSPC steht auf Null. Vor Eintritt in die Badewanne, gelten 3-5 mmHg von Überdruck. Mit dem Mikromanipulator, senken Sie die Pipette in das Bad, überprüfen gewünschten Pipette Widerstand, und bringen Sie die Pipette in unmittelbarer Nähe zu der ausgewählten Zelle, wie in Abschnitt 3.6 beschrieben. Berühren Sie leicht die Zelle unter dem Mikroskop Führung und durch die Überwachung des Oszilloskop beobachten eine leichte Verringerung der Amplitude der Wellendichtheitsprüfung in einer ähnlichen Weise wie für NMDA-Rezeptoren (Abschnitt 3.7) durchgeführt. Kurz die positiven Druck durch Änderung des Drucks Holdingebene 3-5 auf 0 mmHg durch die Pipette aufgetragen. Warten Sie einen GOhm Dichtung durch die Überwachung der Dichtheitsprüfung Wellenform zu bilden. In diesem Fall wird kein negativer Druck angelegt, um eine Dichtung zu bilden. Sobald eine optimale Abdichtung erreicht ist die Taste &# 8216;. Rekord 'im QuB zu starten Erfassen von Daten, Bild 7 zeigt eine repräsentative Spur von mPIEZO1 indem -20 mmHg von Druck auf die Patch-Pipette aktiviert Einzelkanalströme. Diese Ströme waren Tiefpass bei 2 kHz filtriert und bei 20 kHz abgetastet.

Im Gegensatz zu den Liganden gesteuerten Kanäle mit extrazellulären Ligandenbindungsdomänen kann der Stimulus Aktivierung mechanosensitive Kanäle unter 2 Protokolle variiert werden. Die erste ist "spaltfrei", wo ein konstanter Unterdruck auf den Patch für die gesamte Aufzeichnungsdauer aufgetragen. Dieses Protokoll ist nützlich beim Erhalten Minuten lang Aufnahmen und ist am erfolgreichsten bei kleineren Druckreize (0 bis 20 mmHg), die Membranintegrität bewahren. Aktivität durch hohen Druck, die geeignet sind, die Membran reißen produziert wird, ist am besten mit "episodisch"-Aufnahmen, in denen Impulse unterschiedlicher Drücke auf den Patch für kürzere Zeiträume angewendet werden (<erhaltenstrong> Abbildung 7). Wie bei Liganden gesteuerten Kanäle, Aufnahmen von Zelle befestigt einen Kanal Patches liefern eine Fülle von Informationen über die sowohl in der Leitfähigkeit und der Gating-Eigenschaften des Kanals untersucht.

Neuronale NMDA-Rezeptoren

Die für eine Cell-Attached-Kanal-Aufzeichnungs hier beschriebene Verfahren kann verwendet werden, um Informationen über die Leitfähigkeit und Gating-Eigenschaften der Kanäle endogen einen bestimmten Zelltyp und / oder Entwicklungsstadium zu erhalten. Wie bei vielen anderen heteromere Kanäle, ist die genaue molekulare Zusammensetzung von nativen NMDA-Rezeptoren nicht bekannt. Durch den Vergleich der Ergebnisse aus rekombinanten Rezeptoren bekannter Zusammensetzung mit den aus Nativpräparate erhalten wird, Hypothesen über Zusammensetzung-Untereinheit und die Funktion der Kanäle in ihrer natürlichen Umgebung formuliert oder ¹⁷ getestet werden.

Neuronen wurden aus präfrontalen isoliertKortex von Ratten-Embryonen und in Kultur für bis zu 6 Wochen ¹⁷ gewachsen. Neben den für die rekombinante NMDA-Rezeptor-Aufnahmen in Abschnitt 2.2 beschriebenen Komponenten, die Pipettenlösung enthielt auch CNQX (20 uM) und Bicucullin (10 uM), native AMPA-und GABA-Rezeptoren hemmen, sind. Je nach dem Alter der Kultur, die von nativen NMDA-Rezeptoren erhaltenen Datensätze Kinetik ergab, die ganz anders waren. Aufnahmen von der frühen (8A, 5 Tage in vitro) Kultur stärker ähneln für GluN1/GluN2B Rezeptoren und Aufnahmen von Ende (8B, 27 Tagen in vitro-) Kulturen stärker ähneln für GluN1/GluN2A Rezeptoren beschrieben Kinetik (Fig. 3A beschrieben Kinetik und 5A). Diese Beobachtung steht im Einklang mit Mustern von NMDA-Rezeptor-Expression Isoformen und mit sorgfältiger Charakterisierungen von Strömen von Zelle angebracht Einkanal-Patches im Hip aufgezeichnetpocampal ¹⁶ Kulturen.

Abbildung 1. Auswählen einer HEK293-Zelle für Zelle angebracht Aufnahme. A) HEK293-Zellen in einer 35 mm-Schale kultiviert werden auf den Mikroskoptisch gelegt und mit Phasenkontrast bei 40-facher Vergrößerung. B) GFP-Fluoreszenz von der selben Sichtfeld wie in A angesehen transfizierten Zellen identifiziert. Der Pfeil zeigt auf eine Zelle, die GFP drückt, erscheint gesund und in der Lage ist zugänglich für Pipettenzugang. C) Die Aufnahme Pipette wird in unmittelbarer Nähe zu der ausgewählten Zelle mit einer feinen Bewegung Manipulator unter visuelle Führung gebracht. Bitte klicken Sie hier, um eine zu sehen Größere Version der Figur.

Abbildung 2. Zell angebracht Dichtung Bildung. A) Eine kleine Spritze an der Seite der Pipettenhalter verbunden ermöglicht eine manuelle Steuerung des Drucks innerhalb der Pipette. B) Der Strom, der durch die Pipette in Badlösung in Reaktion auf den Verstärker-Test, der bei 5 mV (0,5 kHz) getaucht 18 pA, und entspricht einer Pipette Größe von 28 M &OHgr;. Beim Berühren der Zelle (Pfeil links), die Höhe der beobachteten Strom abnimmt, was auf erhöhte Pipette Widerstand. Anlegen von Unterdruck durch die Pipette (Pfeil nach rechts) initiiert Dichtungsbildung und reduziert die von der Testimpuls nur kapazitiven Transienten erzeugt wird. C) in Abwesenheit eines Testimpulses, und wenn keine Spannung durch die Pipette (0 V), die Grundlinie angewendet stabil ist (links von Pfeil). Anwenden positive Spannung (Pfeil, 100 mV) pr oduces stochastischen einheitlichen Strömungen, die Kanalöffnungen geben. Rot gepunktete Linie zeigt die aktuelle Null-Grundlinie.

. Abbildung 3 Zelle angebracht Ströme von Rezeptoren aufgenommen GluN1/GluN2A A) Ein-Kanal-Patch:. Ein 50 sec Segment der kontinuierlichen Aufzeichnung zeigt Kanalöffnungen zu einer einzigen einheitlichen Amplitude B) Mehrkanal-Patch:. Ein 50 sec Segment der Daueraufzeichnung veranschaulicht Kanalöffnungen zu zwei Amplitudenwerte anzeigt, dass der Patch enthält mindestens 2 aktiven Kanälen. Rot gepunktete Linie zeigt Null aktuelle Baseline. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 4. Datenverarbeitung. A) Korrektur für Geräuschspitzen. Anzeigen von Daten ungefiltert und manuell ersetzen die Fremdsignal (rot) mit Basisliniensignal. Erweiterte Ansicht zeigt eine Spitze vor (Mitte) und nach (unten) der Dorn (rot) wurde mit Basisliniensignal. B) Korrektur für Basisliniendrift ersetzt. Früh in der Aufzeichnung wählen Sie einen kleinen Ausschnitt der Grundlinie und legen Sie es als Nullstrompegel für den gesamten Datensatz (lila Linie). Korrekte Basisliniendrift, indem Sie einen kleinen Teil der Grundlinie driftete (Pfeil) und das Hinzufügen einer Baseline-Knoten (lila Kreis). C) Längere Datensatz mit verrauschte Basislinie (rot), die nur schwer gelöscht werden können, um zu korrigieren sind. Bitte klicken Sie hier zur Ansicht eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 5. Daten Idealisierung. A) Stromspuren (schwarz) wurden von einem Rezeptor GluN1/GluN2A vorbei nur Natriumionen mit der Cell-Attached-Patch-Clamp-Technik aufgezeichnet. Idealisierte Datenpunkte (rot) für eine 30 Sekunden ein Kanalabschnitt veranschaulicht. Diese überschneiden sich auch, die anzeigt, dass die Idealisierung genau ist. B) Histogramm der Stromamplituden zeigen eine Distribution, die auch nur durch zwei Gauß-Funktionen mit Peaks bei Null (0,02 ± 0,8 pA), was auf geschlossenen Kanal Veranstaltungen und bei 10,3 ± 1,3 beschrieben wird, pA Hinweis auf nur eine Art von offenen Kanal Veranstaltungen für die gesamte Aufzeichnungsdauer (130 min). C) geschlossen (links) und offen (rechts) Verweilzeit Histogramme für in (A) gezeigt gesamte Aufnahme. Die Wahrscheinlichkeitkeit Dichtefunktion für den Histogrammen (dicke Linien) und individuelle kinetische Komponenten (dünne Linien) überlagert und wurden durch Anpassung der Daten an ein Modell mit fünf geschlossenen Zuständen und drei Freistaaten berechnet. Einsätzen stellen die Zeitkonstante (τ) und die relative Fläche (A) für jede der einzelnen Bewegungskomponenten.

Abbildung 6. Kalziumströme durch einzelne NMDA-Rezeptoren. A) Stromspuren (schwarz) wurden von einem Rezeptor GluN1/GluN2A aufgezeichnet vorbei nur Calciumionen mit dem Cell-Attached-Patch-Clamp-Technik. Idealisierte Datenpunkte (rot) werden für 30 sec Segment dargestellt. B) Histogramm der Stromamplituden zeigen eine Verteilung, die auch von drei Gauß-Funktionen mit Peaks bei Null beschrieben wird (0 ± 0,3 pA), was auf eine enged Kanal Events, 1,3 ± 0,4 pA Hinweis auf offenen Kanal Ereignisse in einer Unterebene Leitfähigkeit und 2,1 ± 0,3, was auf offener Kanal Ereignisse an den Hauptleitfähigkeit. C) geschlossen (links), Hauptleitfähigkeit offenen Zustand (Mitte) und Unterebene Leitfähigkeit offenen Zustand (rechts) Verweilzeit Histogramme für in (A) gezeigt gesamte Aufnahme. Die Wahrscheinlichkeitsdichtefunktion für die Histogramme (dicke Linien) und individuelle kinetische Komponenten (dünne Linien) überlagert und wurden durch Anpassung der Daten an ein Modell mit fünf geschlossenen Zustand, zwei Hauptleitfähigkeit offenen Staaten und ein Unterebene Leitfähigkeit offenen Zustand berechnet. Einsätzen stellen die Zeitkonstante (τ) und die relative Fläche (A) für jede der einzelnen Bewegungskomponenten.

Abbildung 7. Zell befestigt ein Kanal-Aufnahmevon mPIEZO1 in HEK293-Zellen exprimiert. Aktivität wird durch Anlegen -20 mmHg Druck mit einem HSPC Gerät durch die Patch-Pipette, bei konstanter Anwendung von Spannung (+80 mV) hervorgerufen wird. Rot gepunktete Linie zeigt die aktuelle Null-Niveau.

Figur 8. Zelle befestigt eine Kanalaufnahme von nativen Kanälen. Die Pipette wurde im Soma von einem Neuron, das aus dem präfrontalen Cortex eines Rattenembryos für 5 Tage (A) oder 27 Tage (B) gespalten wurde und in Kultur gehalten angebracht . Kontinuierliche NMDA-Rezeptor-Aktivität wurde mit Pipetten Lösungen mit Glutamat (1 mM) und Glycin (0,1 mM), und auch CNQX (20 uM) und Bicucullin (10 uM) zu nativen AMPA-und GABA-Rezeptoren hemmen, jeweils aufgezeichnet. Aktivität wurde durch Auftragen von +100 mV t hervorgerufenurch die Aufnahme Pipette. Rot gepunktete Linie zeigt die aktuelle Null-Niveau.

Discussion

In der Ionenkanal-Bereich wird ein wichtiger Bereich der Forschung zum Verständnis der Abfolge der Ereignisse, die zum Öffnen oder Gating-Mechanismus des Kanals Kanal führt gewidmet. Für die meisten Sender ist dieses Verfahren komplex und beinhaltet mehrere Bewegungsschritte, die nicht vom makroskopischen Mehrkanalsignal abgeleitet werden kann. Im Gegensatz dazu kann Experimenten beobachtet werden, wo die Reihenfolge der offene / geschlossene Veranstaltungen im Single Channel Datensatz kann detaillierte Informationen über Gating-Mechanismen zu produzieren. In den hier beschriebenen Verfahren kann die außen liegende Ligandenbindungsdomäne von NMDA-Rezeptoren besitzt für die minimal invasive Patch-Clamp-Aufnahmen unter konstanten Bedingungen durchgeführt werden. Dieses Protokoll kann müssen, um für die Untersuchung anderer ligandenabhängigen Ionenkanälen in Abhängigkeit von sowohl Ligand und Rezeptor Eigenschaften angepaßt werden.

Aufzeichnungen von Einzelkanalaktivität bieten zwei Arten von wertvollen Informationen. Zuerstda die Einheitsstromamplitude direkt gemessen werden kann, kann Experimente entworfen werden, um Informationen über Eigenschaften wie Porenkanalleitfähigkeit, Permeabilität und Selektivität zu erhalten. Zweitens, weil die Dauer der offenen und geschlossenen Veranstaltungen kann auch direkt aus dem Datensatz gemessen werden kann, können Experimente entworfen werden, um kinetische Informationen über Gating zu gewinnen und damit Rückschlüsse über den Betriebsmechanismus des Kanals. Für beide Arten von Experimenten, sinnvolle statistische Analyse erfordert Binning jeden einzelnen Punkt aus der aktuellen Kurve auf eine spezifische Leitfähigkeit Klasse. Präsentiert hier war eine solche Methode, dies zu tun, indem Sie die Segment k-Mittel (SKM) ^{11-Algorithmus,} kann dies jedoch durch mehrere mehr oder weniger ausgefeilten Algorithmen inklusive Halb Schwelle, SCAN ¹² erreicht werden, Baum-Welch, Viterbi, usw.

Aufnahmen mit der Cell-Attached-Konfiguration sind mächtig, dass Ionenkanäle in biologischen erhaltenMembranen mit ungestörten intrazellulären Milieus. Aus diesem Grund ist es entscheidend, dass die Membrandichtung ausreichend ausgebildet und für zwei Zwecke während der Aufzeichnung erhalten: 1) Versuchsdurchgang und 2) die Aufrechterhaltung einer günstigen Signal-Rausch-Verhältnis (peak to Grundrauschen <2 Pa Peak). Die Größe und Form der Pipettenspitze erzeugt bestimmt die Wahrscheinlichkeit eines erfolgreichen Membrandichtung mit genau einem Kanal. Eine flache Spitze sorgt dafür, dass, wenn die Pipette nähert sich dem Zell es wird auf einmal zu berühren und drücken Sie auf der Zellmembran mit der gesamten Spitzenoberfläche und hilft, gleichmäßig auf die Zelle zu verschließen. Eine Pipette mit einer Spitze, die zu breit ist, wird weniger wahrscheinlich, dass in Ein-Kanal-Patches führen sein; dagegen beim Ziehen einer Pipette mit einer Spitze, die zu eng ist, wird in einer omega-förmige Schleife, die Membran an der Basis zu versiegeln und verstopfen die Pipette ¹⁰ führen kann.

Ein günstiges Signal-Rausch-Verhältnis durch Minimieren Quellen elektrischer verwaltetLärm. Die headsKühlFunktion des Axopatch 200B hat für optimale Signalauflösung erlaubt; Lärm kann aber noch von keinem der Instrumente in der Elektrophysiologie beteiligt einzurichten, als auch externe Quellen wie Licht und unabhängigen Elektronik hergestellt werden. Glücklicherweise können mehrere Strategien umgesetzt, um Rauschen auf ein gewünschtes Niveau ^{2, 27} zu minimieren. Kurz gesagt, stellen Sie sicher, dass Teile der Ausrüstung, die in der Lage sind, werden Lärm auf einen einzigen Punkt in der Setup-geerdet. Wenn dies zu tun, ist es wichtig, die Bildung von Erdschleifen, die erhebliche Lärm verursachen verhindern. Außerdem, wenn 60 Zyklus Rauschen vorhanden ist, sollten Sie schalten Sie alle Lichter, die dem Aufzeichnungssignal stören können. Schließlich, indem ein Faraday-Käfig um das Aufzeichnungsgerät wird in der Nähe von Hindernissen verursachen elektrische Störungen zu vermeiden.

Beobachten eines Kanals für eine lange Zeitdauer demonstriert, dass die GatingKonformationsänderungen kann über einen breiten Bereich von Zeitskalen auftreten. Zeitlich sind Patch-Clamp-Daten an der "kurzen" Ende durch die Bandbreite des Verstärkers und der Rate, mit der das verstärkte Signal digitalisiert und auf der "langen" Ende durch das Beobachtungsfenster beschränkt. Für Konformationsänderungen, die schneller als die untere Grenze sind, können Patch-Clamp-Aufnahmen bieten nur Informationen, wenn sie mit komplementären experimentellen Ansätzen. Für Konformationsänderungen, die mit sehr langsamen Geschwindigkeiten auftreten, und somit werden nur selten abgetastet wird, kann man die Anzahl der Beobachtungen erhöhen oder die Dauer der Aufnahme, kann dies jedoch nicht immer möglich sein.

Trotz dieser Einschränkungen Patch-Clamp-Daten, insbesondere wenn sie aus einem einzelnen Kanal erhalten wird, enthalten oft mehr als direkt extrahierbar mit aktuellen Berechnungsmethoden. Somit ist die Erwartung, dass künftige Steigerungen der Rechenkapazität und in der sophistication der Analyse-Algorithmen ermöglichen zusätzliche Anwendungen. Nach dem Aufkommen der solche Fortschritte, ist es absehbar, dass die Patch-Clamp-Aufnahmen von einzelnen Kanäle können in der Lage, gleichzeitig mit FRET-Messungen, Kalzium-Imaging oder auch in vivo auftreten Vorbereitungen, um weitere Informationen über die Struktur, Funktion und Dynamik von Ionenkanälen in bereit sowohl native und kontrollierten Umgebungen.

Da die Vielfalt der Ionenkanäle untersucht zunimmt, detailliertes Verständnis ihrer Gating-Mechanismen und letztlich das Verständnis, wie ihr Betrieb trägt zu ihrer einzigartigen biologischen Funktionen von Einzelmolekül-Beobachtungen profitieren. Insbesondere Daten mit der Ein-Kanal-Patch-Clamp-Versprechen, über einheitliche Leitfähigkeit Eigenschaften und Gating-Sequenzen für die rekombinanten und nativen Kanäle informieren erhalten.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals	Sigma	Various
Borosillicate Glass	Sutter	BF-150-86-10
Bright field inverted microscope	Olympus	1x51	Nikon also has similar microscopes
Fluroescent box	X-cite	Series 120
Liquid Light Guide	X-cite	OEX-LG15
Micromanipulator	Sutter Instruments	MP-225
Oscilloscope	Tektronix	TDS1001
Amplifier	Molecular Devices	Axon Axopatch 200B
Table	TMC	63561
NIDAQ card	National Instruments	776844-01
Puller	Narishige	PC-10
Polisher	Narishige	Microforge MF-830
Faraday Cage	TMC	8133306
High Speed Pressure Clamp	ALA Scientific Instruments	ALA HSPC
Pressue/Vaccuum Pump	ALA Scientific Instruments	ALA PV-PUMP	For HSPC-1