Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

הקלטת תיקון מהדק מצורף תא אחד ערוצים

Published: June 9, 2014 doi: 10.3791/51629
Automatic Translation
1, 2, 1, 3, 4
1Graduate Program in Neuroscience, SMBS, University at Buffalo, SUNY, 2Department of Biochemistry, SMBS, University at Buffalo, SUNY, 3Molecular and Cellular Neuroscience Department, The Scripps Research Institute, 4Department of Biochemistry and Graduate Program in Neuroscience, SMBS, University at Buffalo, SUNY

Summary

שתואר כאן הוא הליך לקבלת משתרע הקלטה הנוכחית ארוך מערוץ יון אחד עם טכניקת התיקון-clamp מצורף תא. שיטה זו מאפשרת להתבוננות, בזמן אמת, את הדפוס של תצורות ערוץ פתוחות קרובים העומדות בבסיס האות הביולוגית. נתונים אלה להודיע ​​על נכסי ערוץ בממברנות ביולוגיות באין מפריע.

Abstract

חלבוני ערוץ יון הם מכשירים אוניברסליים לתקשורת מהירה על פני ממברנות ביולוגיות. החתימה הזמנית של השטף היוני הם מייצרים תלויה במאפיינים פנימיים לכל חלבון ערוץ, כמו גם את המנגנון שבאמצעותו הוא נוצר ונשלט ומייצגת תחום חשוב של מחקר הנוכחי. ניתן להשיג מידע על הדינמיקה התפעולית של חלבוני תעלת יונים על ידי התבוננות פרקי זמן ארוכים של זרם המיוצרים על ידי מולקולה בודדת. שתואר כאן הוא פרוטוקול להשגת הקלטות אחד ערוצים מצורפים תא התיקון-clamp הנוכחיות לערוץ יגנד מגודרת יון, הקולטן NMDA, הביע heterologously בHEK293 תאים או באופן מקורי בתאי עצב בקליפת המוח. גם סיפקו הוראות כיצד להתאים את השיטה לתעלות יונים אחרות של עניין על ידי הצגת הדוגמא של PIEZO1 ערוץ מיכני רגיש. שיטה זו יכולה לספק נתונים לגבי מאפייני המוליכות של הערוץ ואת הרצף הזמני של אופתצורות n-סגורים המרכיבות את מנגנון ההפעלה של הערוץ, ובכך לסייע להבנת תפקודם בבריאות ובחוליים.

Introduction

תקשורת מהירה על פני ממברנות ביולוגיות מסתמכת כמעט אך ורק על חלבוני oligomeric נקבוביות ויוצר קרום, המכונות גם ערוצים. חלבונים אלה שונים באופן נרחב באותות הפעלה, מנגנוני gating, ומאפייני מוליכות. חלבוני ערוץ נקבוביות שהם סלקטיבית ליוני מסווגים כתעלות יונים; ההפעלה שלהם מייצרת זרמים יוניים על פני הקרום, והתגובות שלהם יכולות להיות מוקלטות עם רזולוציה גבוהה בזמן אמת תוך שימוש בטכניקות אלקטרו. אותות ההפעלה span מגוון רחב של תשומות כימיות ופיזיות הכוללים מילויים ריכוז, כוחות מכאניים וחשמליים, וטמפרטורה; וכך, סיווג נוסף תעלות יונים ליגנד מגודרת, mechanosensitive, מתח מגודרת, או סוגים רגישים לחום. במאמר זה, פרוטוקולים מתוארים להקליט פעילות אחד ערוצים מערוץ יגנד מגודרת, הקולטן NMDA, וערוץ mechanosensitive, PIEZO1, תוך שימוש בטכניקת תיקון מהדק.0;

אלקטרופיזיולוגיה תיקון מהדק היא השיטה הניסיונית הראשונה והנפוצה ביותר רגישה מספיק כדי לאפשר התצפית של מולקולות בודדות 1, 2. בנוסף לרגישות המעודנת זה, היא הרחיבה במידה רבה את ההכנות ביולוגיות ניתנות להקלטת אלקטרו וגם אפשרה התצפית של תעלות יונים בקרומים שלמים. ראשית, משום ששניהם הידוק המתח והקלטה נוכחית הם השיגו עם אותו אלקטרודה, ניתן להשתמש בו כדי להקליט את האותות פני תאים קטנים או תיקוני ממברנות. הטכניקה גילתה כי תעלות יונים אינן מוגבלות לממברנות להתרגש של שרירי צפרדע, electroplaques צלופח, או אקסונים ענק דיונון 3, 4, אלא שהם מייצגים גופי בכל מקום של מנגנוני איתות הטרנסממברני ומהותיים לכל סוגי קרום התא של חד או אורגניזמים רב תאיים, וגם לקרומים תאיים. יבואantly, היכולת להקליט זרמים הטרנסממברני פשוט על ידי חיבור פיפטה זכוכית לתא שלם סיפקה את ההזדמנות חסרת תקדים להקליט פעילות מתעלות יונים בקרום בלא ההפרעה האם שלהם. לכן, טכניקת התא המצורפת תיקון מהדק, אשר מתוארת בפרוטוקול זה, מאפשרת ניטור הפעילות של תעלות יונים ברציפות במשך עשרות דקות או יותר בסביבה הטבעית שלהם.

על פי תנודות תרמיות נורמליות, כל החלבונים, כוללים חלבוני ערוץ יון, לעבור שינויים מבניים על פני זמן בקנה מידה רחבה, עם השחלופים המהירים ביותר והשכיח ביותר ייצגו ככל הנראה על ידי תנועות בצד שרשרת ושינויים הרבה יותר איטיים, פחות תכופים מיוצגים על ידי מיקום מחדש של כל תחומים או יחידות משנה, או במקרים מסוימים על ידי שינויים שלאחר translational או אינטראקציות בין חלבונים 5, 6. התבוננות תקופות ארוכות של פעילות שנוצרו על ידי מולקולה אחת יכולה לעזור להבין את התפקודדינמיקה תזונתית של תעלות יונים בקרום פיסיולוגי שלם ומספקת מידע רב ערך על המנגנון המבצעי של המולקולה שנצפתה.

בניגוד להבנה הגדלה והולכת של הגיוון של תעלות יונים על פני סוגי תאים ושלבי התפתחות, ידע על ההרכב המולקולרי של תעלות יונים בקרום ילידים עדיין מוגבל. כל תעלות היונים הן חלבוני Multimeric ורוב תעלות יונים האם להרכיב ממספר סוגים של תת יחידות ייצור חלבונים של גיוון מולקולרי רחב, אשר לעתים קרובות מלווה עם תכונות מוליכות וgating מגוונות. מסיבה זו, תעלות יונים של הרכב מולקולרי מוגדר נלמדות על ביטוי במערכות Heterologous. בפרט, HEK293 תאים, שהם קו משובט של תאים עובריים אנושיים הונצחו בכליות 7, זכו בהכרה נרחבת כמערכת המועדפת לביטוי Heterologous של תעלות יונים רקומביננטי. בין האדםיתרונות y שהעלו HEK293 תאים כמערכת הבחירה לאלקטרופיזיולוגיה ערוץ יון הם את הקלות ואת affordability של culturing ושמירה על תרבויות יציבים חיים ארוכות, את היכולת שלהם לבצע קיפול לאחר translational, עיבוד וסחר של חלבוני יונקים, ובמקרים רבים , רמתם הנמוכה או אפילו העדר ביטוי אנדוגני לערוץ של עניין 7, 8. להביע תעלות יונים רקומביננטי ולומדים את מאפייני הפעילות שלהן בתאי HEK293 ממשיך להיות גישה רבת ערך לקבלת מידע על נכסי מבנה לתפקוד של תעלות יונים, כמו גם את המאפיינים הספציפיים של isoforms ערוץ יון ואת תפקידם ברקמות מקומיות. הפרוטוקולים מתוארים במאמר זה יכול להיות מיושמים באופן שווה גם לתעלות יונים רקומביננטי המתבטאות בתאי HEK293 ולתעלות יונים ילידים.

לסיכום, טכניקת תיקון מהדק, באמצעות היכולת חסרת תקדים שלה כדי לפתור אותים ממולקולה אחת נותר, עד כה, השיטה הישירה ביותר להתבוננות בהתנהגות של מולקולות בודדות. במצב מחובר התא שלה, הקלטת התיקון-clamp מאפשרת תצפית תקופות ארוכות אשר, כאשר נעשה למולקולה אחת, יכול לספק תובנה יוצאת דופן לפעילות של תעלות יונים. להלן מוצג פרוטוקול להשגת הקלטות הנוכחיות ברזולוציה גבוהה מתיקונים מצורפים תא המכילים חלבון ערוץ יון אחד.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. ביטוי תרבית תאים וחלבונים

  1. שמור על תאי HEK293 (מספר ATCC CRL-1573) בין הקטעים 22 ו40, הכולל קטעים שבוצעו על ידי ATCC, בתרבות monolayer DMEM בתוספת 10% שור סרום עוברי (FBS) ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין בתערובת 5% CO 2 ו37 ° C. בין ניסויים, תאי מעבר לתוך צלוחיות T25 ב5-20 דילולים לקפל בנפח סופי של 10 מיליליטר. הערה: שימוש בתאים במהלך מעברים אלה מבטיח בריאות תא חיובית אשר תאפשר להיווצרות חותם אופטימלית ויציבות תיקון.
  2. עבור transfection, תאי צלחת HEK293 ב35 מנות מ"מ בצפיפות של ~ 10 5 תאים / צלחת, אשר תואמת ~ 0.5-0.6 מיליליטר של השעיה תא לכל צלחת ולגדל תאים ב2 בינוני מיליליטר לשעה 18-24.
  3. בצינור צנטריפוגות סטרילי 1.5 מיליליטר, להכין את תערובת transfection לארבע מנות 35 מ"מ על ידי הוספה (לפי סדר זה): (1) 1 מיקרוגרם של כל cDNA (GluN1, GluN2A, וGFP); (2) 315 μl שלמים מזוקקים פעמיים (DDH 2 O); (3) 350 μl של 42 4 מ"מ - (2-Hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic חומצה (HEPES), ו (4) 35 μl של 2.5 M CaCl ירידה של 2 חכמה, המשמשת כדי ליצור את המשקע.
  4. צינור המערבולת במשך 5 שניות ולהוסיף 175 μl של ההשעיה transfection בכל אחת מארבע המנות 35 מ"מ מצופה היום לפני, אשר כעת מכיל תאים במפגש 50-60%, דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות.
  5. לשאוב את מדיום transfection, לשטוף עם PBS ולהחליף עם 2 מיליליטר של מדיום גידול בתוספת 2 מ"מ MgCl 2 כדי למנוע הקולטן NMDA בתיווך הפעלת יתר רעילה 9. הערה: התאים יכולים לשמש עבור קלטות אלקטרו הודעה 24-48 שעה transfection.

2. אלקטרודה הכנה

  1. ליצור 2 טפטפות הקלטה סימטרית על ידי משיכת צינורות זכוכית בורוסיליקט עם חולץ אנכי. בהתבסס על הגודל והגיאומטריה של הקצה וכתוצאה מכך, טפטפות צורה נוספתבאמצעות ליטוש. הערה: גודל הטיפ ניתן להעריך מבחינה ויזואלית וחשמלי. מבחינה ויזואלית, הקוטר החיצוני צריך להיות בטווח מיקרומטר 1.4-5.6. חשמלי, קצה גודל אופטימלי, כאשר התמלא פתרון תאי, צריך לייצר התנגדויות בטווח MΩ 12-24 (ראה איור 2).
  2. להשתמש בפתרון פיפטה, אשר לניסויי תא מצורפים מייצג את הסביבה תאית שתפיק פעילות ערוץ מקסימלי ואמפליטודות נוכחית גבוהה. הערה: לקולטני NMDA, זה מתאים לתמיסה המכילה ריכוזים להרוות של אגוניסטים (גלוטמט וגליצין), 1 mM EDTA, אשר chelates מעכבי קטיוני דו הערכי וחוסמים, ויש ריכוזים פיסיולוגיים של נתרן (150 מ"מ) כיון permeant הבלעדי ( במ"מ: גלוטמט 1, 0.1 גליצין, 150 NaCl, KCl 2.5, EDTA 1, ו10 HEPBS, שנאגרו ב-pH 8.0 עם 1 N NaOH).

3. הקלטת תיקון מהדק מצורף נייד

  1. softwa רכישת נתונים QuB הפתוחמחדש (www.qub.buffalo.edu), ובחר את חלון הרכישה תחת "פריסה". פתח קובץ נתונים QuB חדש (QDF) על ידי לחיצה על "נתונים חדשים" תחת תפריט הנפתח שכותרתו "קובץ" ולהזין את הפרמטרים הראשוניים הבאים: קצב דגימה, 40 kHz; דרוג / D, 3,000; ערוץ פלט, 1; וגודל / D נתונים, 2. התאימו את קנה המידה משרעת ל0.1 V / הרשות הפלסטינית על ידי לחיצה ימנית על קובץ הנתונים, בחירת מאפיינים, ולחיצה על הכרטיסייה 'נתונים'. הערה: פרמטרים אלו יכולים להיות מעודנים לכל התקנה תוך שימוש במודל תאים במצב מחובר התא. הוראה נוספות על רכישת נתונים עם תוכנת QuB ומאפייני QDF הן באופן מקוון ב www.qub.buffalo.edu.
  2. בחר צלחת 35 מ"מ המכילה ערוץ יון לבטא בתאים ולהחליף את מצע גידול עם 2 מיליליטר PBS המכיל סידן ומגנזיום; הר הצלחת לבמה מיקרוסקופ ולהתמקד בתחום הסלולר באמצעות מיקרוסקופ לעומת השלב להעריך כי תאים בריאים ומחוברים היטב לצלחתב( איור 1 א) אופנה שכבה. לעבור לגילוי הקרינה כדי לוודא שtransfection היה מוצלח (איור 1). הערה: הטווח של עוצמות הקרינה יכול לשמש כמדד גס של ביטוי חלבון.
  3. להקלטת ערוץ אחד, להגדיר את רווח מגבר פלט x10, תצורת תיקון לβ = 1, מסנן אנלוגי ל10 קילוהרץ, במצב למתח-clamp ולהחיל מתח ל+100 mV. עם פקודת החזקת המתח במצב OFF, בחר בלחצן "מבחן חותם".
  4. המבוסס על הקרינה ובריאות תא, בחר תא לתיקון. ודא תחת לעומת שלב שהתא מחובר היטב לצלחת, יש חלק גדול של תא השטח החשוף לתיקון, ואחרת נראה בריא. הערה: שמור על תאורה בניגוד שלב, כדי למנוע הלבנת התא במהלך הגישה ותיקון-ההידוק.
  5. מלא פיפטה טריות מלוטשת עם רק פתרון מספיק, כך שהוא יוצר קשר עם electrodדואר וללחוץ בעדינות כדי לסלק בועות אוויר שעלול להיות לכודים בקצה. אבטח את פיפטה ההקלטה על גבי headstage המגבר על ידי הידוק בורג האיטום של בעל פיפטה ולוודא כי חוט הכסף הוא שקוע בפתרון פיפטה.
  6. באמצעות מזרק קטן (5 סמ"ק) פלסטיק, אשר מחובר למחזיק פיפטה על ידי צינורות, בעדינות להפעיל לחץ חיובי על מנת למנוע זיהומים מלהיכנס וסותם את הקצה במהלך הגישה (איור 2 א).
  7. שימוש micromanipulator, לכוון את פיפטה לתוך האמבטיה ולמקם אותו ישירות מעל לתא שנבחר לתיקון (איור 1 ג), סוגר את המעגל החשמלי. שימו לב לאוסצילוסקופ, אשר אמור להצביע על צורת גל מלבני המקביל לאות בדיקת החותם של המגבר (איור 2). הערה: עם כניסתו לאמבטיה, התנגדות פיפטה בטווח האופטימלי היא 12-24 MΩ. לאות בדיקת 5 mV, r הנוכחי נמדדAnge מתאים ל~ 20-40 רשות.
  8. תוך מעקב אחר מצב פיפטה ויזואלית דרך התנגדות מיקרוסקופ ופיפטה חשמלית על אוסצילוסקופ, תמשיך בגישה במרווחים קטנים עד פיפטה פוגעת בעדינות על התא, ואות הבדיקה מקטינה מעט כדי לציין התנגדות מוגברת (איור 2).
  9. כדי ליצור חותם, להרים את המזרק ולהפעיל לחץ שלילי קל דרך צינורות לרוחב על ידי משיכת בוכנת המזרק, מה שמושך את קרום התא אל קצה פיפטה ההקלטה ויוזמת את הקמתה של חותם התנגדות GΩ 10. שימו לב לצורת גל בדיקת האות על אוסצילוסקופ, שבו היווצרות חותם מצויינים על ידי השטחה המלאה שלה, ורק ארעיים קיבולי גלויים (איור 2). הערה: אם אות לא לשטח לחלוטין או הבסיס הופך להיות רועש, זה מצביע על חותם חלש עם דליפה נוכחית משמעותית סביב החותם. זה ימנע resolving זרמי ערוץ אחד. אם זה המקרה, למשוך את פיפטה מהתא ומהם לאמבטיה, להסיר אותו מהבמה בראש וזורקים אותו. חזור על התהליך עם טפטפת טרי מלוטש עד לקבלת חותם בטווח המתאים (≥ 1 GΩ).
  10. על המגבר, להחליף את מתג הפיקוד החיצוני מ" מבחן חותם 'ל' כבוי '; לעבור את פקודת המתח מחזיק לחיובי (שהוקם בעבר ל'כבוי '); ולהגדיל את הרווח לx100. שים לב אוסצילוסקופ לפעילות ערוץ, אשר, אם קיימים, יוצג כסטיות כלפי מעלה מרובעות מהבסיס השטוח בעבר (איור 2 ג).
  11. אם פעילות הערוץ מוצגת על אוסצילוסקופ, לרכוש נתונים לתוך הקובץ הדיגיטלי פתח בעבר בQuB, על ידי לחיצה על הכפתור "המשחק" ואחריו על הכפתור 'השיא'. להפסיק לרכוש נתונים, לחץ על כפתור העצירה בQuB, ולשמור את הקובץ בקלות לQDF retrievמיקום הצליח על הכונן הקשיח של המחשב על ידי בחירה "שמור נתונים בשם ... 'בתפריט הנפתח שכותרתו" קובץ ".

4. נתונים עיבוד מקדימים ואידיאליזציה

הערה: מידע חשוב ניתן להפיק מהקלטות ערוץ אחד על ידי ניתוחים סטטיסטיים שמקצה כל נקודת נתונים לכיתת מוליכות מתאימה (במקרה הפשוט ביותר, סגור או פתוח). תהליך זה מכונה אידיאליזציה נתונים ותיאור קצר של אידיאליזציה נתונים עם האמצעי המגזרי k (SKM) שיטה 11 בQuB מתוארת להלן.

  1. פתח את קובץ הנתונים בQuB, ולהציג את העקבות הנוכחיות בממשק 'קדם' תחת 'פריסה'. להציג את הקובץ המוקלט לא מסונן (להסיר מסנן דיגיטלי) על ידי ביטול הסימון התיבה שכותרתה "מועדון כדורגל".
  2. מבחינה ויזואלית לסרוק את השיא לזהות חריגות וממצאים (איור 4 א). קוצים הנוכחיים קצרים נכון שoccur בתוך העקבות (איור 4 א) על ידי בחירת אזור נקי סמוך מאותו סוג המוליכות, המדגיש אזור זה, לחיצה ימנית ובחירה באפשרות "חיץ למחוק מוגדר. ' קרב על העלייה החדה עד נקודות מדגם בודדות נראות, בחר את האזור כדי להיות מוחלפים ולמחוק ידי הדגשה רק אזור זה ולאחר מכן לחץ לחיצה ימנית על "למחוק".
  3. הגדר את הבסיס הנוכחי אפס עבור כל הרשומה על ידי בחירת חלק מוקדם של התקליט שבו הבסיס יציב, גולת כותרת, לחץ לחיצה ימנית ובחר 'קו בסיס שנקבע ". ודא כי הקו המנחה המופיע מייצגת במדויק את הרמה הבסיסית (סגול באיור 4 ב)
  4. לזהות נקודות בשיא שבו בסיס הנתונים הגולמי חורג בעליל מנקודת ההתחלה שנקבעה. לתקן זאת על ידי בחירת קטע קטן של קו בסיס באזור הסטייה, לחץ לחיצה ימנית ובחר בפקודה 'להוסיף צומת בסיס ".
  5. לזהות אזורים של tהוא הקלטה המכיל רעש עודף או חפצים שלא ניתן לתקן (איור 4C) בקלות. הדגש את האזור כדי להיות מושלכים, לחץ לחיצה ימנית, ובחר 'מחק'. הערה: במקרה זה מידע הקינטית ייאבד: שיא מעובד יהיה קצר יותר והנקודות שהתרחשו לאחר נקודת אחוי יופיעו להיות רציף עם האזור לפני הרעש.
  6. לעשות אידיאליזציה רשומות באמצעות אלגוריתם SKM 11, להדגיש חלק מהעקבות המכילות את שני אירועים פתוח וסגור ולהיכנס לממשק 'מוד' תחת 'פריסה'. בפנל "המודל", להדגיש חלק נקי של הקורט כי הוא נציג של קו הבסיס לאורך כל הקובץ, לחץ לחיצה ימנית על הריבוע השחור (מצב סגור) ובחר באפשרות "לתפוס". לעשות את אותו הדבר לפתחי ערוץ על ידי הדגשת המוליכות פתוחות, לחץ לחיצה ימנית על הריבוע האדום בפנל "המודל" ובחר באפשרות "לתפוס".
  7. בצע idealization לכל השיא על ידי בחירה על הכפתור "הקובץ" תחת "מקור נתונים". לחץ לחיצה ימנית על הכרטיסייה 'אידיאליזציה' מתחת לחלק 'דוגמנות' כדי לוודא שהפרמטרים הרצויים לניתוח נכונים, ולאחר מכן לחץ על 'הפעלה'. התוצאה של האידיאליזציה, יחד עם היסטוגרמה משרעת לקובץ כולו, היא ועליהן את הנתונים, כדי לאפשר בדיקה ויזואלית של האידיאליזציה (איור 5). הערה: אידיאליזציה לקויה עלולה להוביל לדור של 'אירועי שווא, "שבי QuB מזהה פתחי ערוץ וסגרים שלא באמת מתרחשים. במסגרת החלטת ההקלטה, אשר מוגדרת על ידי המסנן האנלוגי של המגבר ואת קצב הדגימה, ברזולוציה שבה SKM מזהה אירועים פתוחים וסגורים יכולה להיות נשלטה על ידי הגדרת זמן מת לניתוחים. שעות מתות אופטימליות חייבים להיות נבחרו על ידי ניסוי וטעייה ותהיה תלויות בקצב דגימה, לעומת זאת, כלל אצבע טובה הואכדי לבחור זמן מת שהוא 2-3 דגימות 12.
  8. כדי לוודא שהאידיאליזציה מייצגת במדויק את הנתונים הגולמיים, סריקה ידנית עקבות אידיאליזציה. עם זיהוי של שגיאות באידיאליזציה, להדגיש את העקבות על אירוע השווא, קליק ימני ובחר 'הצטרף IDL.' הערה: לאפשרויות נוספות והסבר מפורט של פקודות שונות ופונקציות בQuB, להתייעץ QuB מקוון ידני (www.qub.buffalo.edu).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

רקומביננטי NMDA רצפטורים

קולטני NMDA להיקשר ולהגיב לפעולה במקביל של שני עמיתים לאגוניסטים: גלוטמט וגליצין. הם להרכיב כheterotetramers של שני גליצין המחייב יחידות משנה GluN1 ושני גלוטמט מחייב יחידות משנה GluN2. יחידות משנה GluN2 מקודדות על ידי ארבעה גנים (לספירה) ושל אלה הצורות ביותר עיבד נרחב במוח הן GluN2A במבוגרים וGluN2B בבעלי חיים לנוער. בגלל המגוון של תת NMDA קולטן בהכנות ילידים, לבטא קולטנים בתאי HEK293 (איור 1 א) מאפשר שליטה על הרכב למקטע, כמו גם את היכולת להקליט שוטף מערוצים באמצעות פיפטה זכוכית דק מלוטשת (תרשים 1C).

ברגע שפיפטה נוגעת התא, ירידה ברורה בהמשרעת של הגל הדופק המבחן מתרחשת (איור 2), המציינת את היכולת ליצור חותם. חותם נאות המכיל אחדערוץ מייצר פעילות ערוץ ברורה, מוצגת כסטיות כלפי מטה מנקודת ההתחלה, עם אות טובה יחס רעש על פי בקשה של מתח חיובי (איור 2 ג). פעילות ערוץ מקסימלי לקולטניים NMDA רקומביננטי מסוג בר יכולה להיות מושגת כאשר שני אגוניסטים נמצאים בריכוזים גבוהים, וכאשר מעכבים וחוסמי תעלות נעדרות. זה אידיאלי, כך שכאשר תיקון מכיל יותר מערוץ אחד, פתחים בו זמנית ניכרים מייד 13 (איור 3 ב). לחלבונים עם רמות פעילות נמוכות מאוד, ההסתברות שמתיחה של פתחי רמה אחת מקורו בערוץ אחד בלבד ניתן לחשב אם ההסתברות הפתוחה הערוץ ידועה או יכולה להיות מקורב 14. בגלל זה, תקופות תצפית ארוכות יותר עשויות להיות נחוצות.

בתנאים אלה, וכאשר פונים לפוטנציאל פיפטה החזקת +100 mV (שמוביל לפוטנציאל הממברנה משוער של -120 mV), siGluN1/GluN2A רקומביננטי ngle וGluN1/GluN2B פתוחים בהסתברות גבוהה (o P, 0.3-0.5) לרמה אחת גבוהה יחסית מוליכות (> 50 PS) (3 א ו 5 ב איורים) 15-17. בעת ההקלטה, דוקרנים הנוכחיים רעש, מרחף תחילת המחקר, או תקופות של רעש מוגזם יכולים להתבטא (איורים 4 א-C), עם זאת כאמור, אלה עשויים להיות מתוקנים אם קצרים וקלים. חשוב, עם זאת, כי פעילות ערוץ נרשמת ללא הפסקה לכמות מספקת של זמן (≥ 10 דקות, 10,000 אירועים) כדי להבטיח שרוחבה המלא של התנהגויות ערוץ הוא נתפס.

הנתונים המתקבלים מהקלטות אלה יכולים לספק מידע על שני קינטיקה הערוץ ומאפייני חלחול. הנה, אנחנו מדגימים אידיאליזציה שבוצעה על ידי QuB באמצעות אלגוריתם SKM (איור 5 א), לעומת זאת אידיאליזציה הנתונים יכולה להתבצע באמצעות תוכנות אחרות כגון pClamp או לסרוק 12,nd עשוי להתבצע באמצעות אלגוריתמים או קריטריונים, כגון שיטת סף המחצית שונים, עם כל אחת מאפשרויות אלה המכילים יתרונות משלהם וחסרונות. התאמה של נתונים אלה לדגמים הקינטית ניתן לבצע על מנת לקבל תובנה נוספת לתוך ההתנהגויות של ערוץ יון. התאמת סיכוי המרבית ניתן לבצע עם תוכנה כגון QuB או HJCFIT 18, שבהן לאלגוריתמים המיושמים על ידי כל תכנית יתרונות משלהם. בעוד האידיאליזציה הפגינה באיור 5 דורשת המודל הפשוט ביותר האפשרי של מדינה אחת סגורה ומדינה אחת פתוחה שיש לבצע, התאמת מודל הקינטית מלא עבור ערוץ יון רק דורש ברצף הוספה סגורה ומדינות פתוחות עד שיגיע לקריטריון מסוים. תהליך זה הוכיח שיש להם קולטנים GluN1/GluN2A הסוג בר חמש מדינות סגורות kinetically מובחנות ושניים לארבע מדינות פתוחות kinetically ברורות (איור 5 ג) 19, שבו אלהמאפייני gating הם קריטיים לקביעת צורתו של הקולטן NMDA בתיווך אות הסינפטי 20, 21. סגנון זה של ניתוח יכול להתארך לערוצים אחרים יון של מוליכות קטנות יותר, כגון קולטנים AMPA, לקבל תובנות על המנגנונים שלהם מובחנים gating 22,23,24. אזהרה אחת היא, עם זאת, שכן יש לי קולטני AMPA רמות מוליכות מרובות, אידיאליזציה מוצלחת באמצעות QuB עשויה לדרוש מדינות נוספות ישולבו מודל מוכנים מראש.

יכולות להיות גם מורחבות בשיטות אלה כדי להשיג מידע על חלחול ערוץ יון ומוליכות על ידי שינוי הרכב יון מחלחל ו / או ריכוז. הקלטת פעילות באמצעות קולטנים GluN1/GluN2A יחיד באמצעות השיטות שתוארו כאן, אבל החלפת 150 מ"מ NaCl עם 75 מ"מ CaCl 2 בפיפטה ההקלטה, מניבה זרמים עם ~ 20% מהמוליכות (~ 10 PS). זה מוכיח כי בעוד סידן מחלחל קולטני ה-NMDA בהיירמות הורמון הגדילה בתנאים פיסיולוגיים, היא למעשה חוצה את הערוץ לאט יותר יוני נתרן, מה שמעיד כי ייתכן שיש אתר קישור סידן פוטנציאל בתוך מסלול החלחול. בנוסף, למרות המוליכות קטנות הזה, את ההקלטות ניתן אידיאליזציה כראוי באמצעות אלגוריתם SKM בQuB, חשיפת קיומה של מוליכות sublevel ביניים, שהוא כ -50% משרעת הנוכחית של רמת המוליכות העיקרית (6A דמויות ו-B). פתחי sublevel אלה, עם זאת, יכולים להיות אידיאליים רק בQuB כאשר מוליכות כיתה נוספת שולבה במודל הקינטית הראשוני. ניתוחים הקינטית נוספים גילו כי, בתנאים אלה, הקולטנים עדיין תערוכת חמש מדינות סגורות kinetically ברורות, עם זאת יש מצבים אלה בקבועי זמן שונים מאוד ותפוסות לעומת כאשר הערוץ עובר רק יוני נתרן (איור 6 ג). בנוסף, רק שתי מדינות פתוחות הם נצפו under תנאים אלה הוכחת כי, בנוסף להשפעה על מוליכות ערוץ, יוני סידן מסוגלים לווסת gating הקולטן.

אין דרך מסוימת לקבל רק אחד תיקוני ערוץ. במקום זאת, כמה מניפולציות ניסיוני יכולות לתרום להגדלת סיכויי הצלחה. ראשית, לשאוף לרמה נמוכה של ביטוי ערוץ על ידי הערכת עוצמת הקרינה של תאי transfected (איור 1). מוצלחות גישות עשויות להיות ל: להקטין את הכמות הכוללת של cDNA משמש לtransfection או כדי להקטין את הכמות של cDNA למקטע נדרש, כפי שהוא GluN1; כדי להקטין את הזמן של דגירה עם משקע פוספט DNA / סידן; וכדי לבחור עבור תיקון רק תאי במעומעם ניאון משדה הראייה. צריכה להיות רדופות גישות אלה אם התיקונים שהתקבלו לעתים קרובות מכילים מספר רב של ערוצים. בנוסף, להקטין את הגודל של קצה פיפטה יכול גם לתרום להשמנה רק ערוץ אחד בpatcשעות. סופו של דבר עם זאת, אחד הופך להיות מוצלח בהשגת טלאים אחד ערוצים באופן שיטתי נמנע מרישום לתקופות ארוכות מתיקונים שיכילו באופן ברור יותר מערוץ אחד.

ערוצי PIEZO1 רקומביננטי

השיטות שתוארו בפרוטוקול זה יכולה להיות מיושמות בקלות לכל ערוץ יון מגודרת ליגנד, ואכן ניתן להתאים להקליט פעילות ערוץ אחד מכל ערוץ יון, בין אם מופעלות על ידי כימיקלים, מתח, כוח, טמפרטורה, או באמצעים אחרים. דוגמא אחת לאופן פרוטוקול זה יכול להיות מותאם לזרמים להקליט ערוץ אחד מערוצי יונים אחרים, במיוחד העכבר PIEZO1, ערוץ יון mechanosensitive, מוצגת להלן (איור 7) 25, 26.

כמו עם ערוצי הקולטן NMDA, PIEZO1 וGFP מבוטאים בתאי HEK293 ידי transfection פוספט בתיווך סידן ותאים משמשים 24-48 ההודעה hr transfection כשתואר בסעיף 1.2. בגלל PIEZO1 מופעל על ידי מתיחת קרום, יש להיזהר כדי לתפעל את הקרום בעדינות במהלך היווצרות תיקון והתקנים מתאימים למסירה ושליטה של ​​הכוח המכני להחיל צריכה להיות זמין. ניתן להשיג תנאים אלה על ידי ביצוע טפטפות הקלטה גדולה יותר, עם התנגדות בטווח MΩ 2-3 ומשתמש במכשיר במהירות גבוהה מהדק לחץ (HSPC) המחובר לפיפטה ההקלטה דרך בעל פיפטה על headstage המגבר. הגדרות המגבר דומות לאלה שתוארו לקולטני ה-NMDA בסעיף 3.3, פרט להחלפה על ידית הפקודה "החיצונית", כך שניתן לשלוט במגבר באמצעות תוכנת הרכישה.

להקליט פעילות מPIEZO1, השתמש פיפטה הקלטה מלאה (במ"מ): 130 NaCl, 5 KCl, 10 HEPES, 1 CaCl 2, 1 MgCl 2, 10 תה Cl, pH 7.3 עם NaOH. בתנאים אלה, ניתן לנטר פתחים כiזרמי nward נתרן, אשר יופיעו על אוסצילוסקופ כסטיות כלפי מטה מנקודת התחלה נוכחית אפס. הנח את פיפטה ההקלטה על הבמה ראש המגבר ולוודא החיוג בHSPC הוא באפס. לפני הכניסה לאמבטיה, להחיל 3-5 מ"מ כספית בלחץ חיובי. שימוש micromanipulator, מנמיך את פיפטה לתוך האמבטיה, לבדוק התנגדות פיפטה רצויה, ולהביא את פיפטה בסמיכות לתא שנבחר כאמור בסעיף 3.6. לגעת בעדינות את התאים תחת מיקרוסקופ והדרכה על ידי ניטור אוסצילוסקופ, להתבונן ירידה קלה בהמשרעת של גל מבחן החותם באופן דומה כפי שנעשה לקולטני NMDA (סעיף 3.7). מהר לשחרר את הלחץ החיובי מיושם באמצעות פיפטה על ידי שינוי ברמת האחזקה בלחץ בין 3-5 ל0 מ"מ כספית. חכה חותם GΩ כדי ליצור על ידי ניטור צורת גל מבחן חותם. במקרה זה, אין לחץ שלילי מיושם כדי ליצור חותם. ברגע שחותם אופטימלי מתקבל עיתונות &# 8216;. כפתור 'שיא בQuB להתחיל לרכוש נתונים איור 7 מראה עקבות נציג של זרמי ערוץ יחיד mPIEZO1 הופעלו על ידי יישום -20 מ"מ כספית של לחץ לפיפטה את התיקון. זרמים אלה היו נמוכים לעבור סינון ב 2 קילוהרץ וידגם ב20 קילוהרץ.

בניגוד לערוצים מגודרות ליגנד עם תחומים המחייבים יגנד תאיים, גירוי הפעלת ערוצי mechanosensitive יכול להיות מגוון תחת 2 פרוטוקולים. הראשון הוא "ללא פער," שבו לחץ שלילי מתמיד מוחל על התיקון למשך כל ההקלטה. פרוטוקול זה שימושי בקבלת דקות הקלטות ארוכות, והוא מוצלח ביותר עם גירויים קטנים יותר לחץ (0-20 מ"מ כספית), אשר לשמור על שלמות קרום. פעילות המיוצרת על ידי לחץ גבוה, אשר עשויה להיקרע הקרום, מתקבלת הטובה ביותר עם הקלטות 'אפיזודי', שבו פולסים של לחצים שונים ניתן ליישם את התיקון לתקופות זמן קצר יותר (<strong> איור 7). כמו עם ערוצי יגנד מגודרות, הקלטות מתא מצורפים תיקוני ערוץ אחד מספקים שפע של מידע על שתי המוליכות ומאפייני gating של הערוץ תחת חקירה.

העצבי NMDA רצפטורים

השיטה המתוארת כאן להקלטה אחד ערוצים מצורפים תא יכול לשמש כדי להשיג מידע על המוליכות ומאפייני gating של אנדוגני ערוצים לסוג תא מסוים ו / או שלב התפתחותי. כמו במקרה עם הרבה ערוצי heteromeric אחרים, ההרכב המולקולרי המדויק של קולטני NMDA האם שלהם אינו ידוע. על ידי השוואת תוצאות המתקבלות מקולטנים רקומביננטי של הרכב ידוע עם אלו המתקבלות מהכנות ילידים, השערות לגבי הרכב למקטע ואת הפונקציה של ערוצים בסביבה המקומית שלהם יכול להיות מנוסח או נבדק 17.

נוירונים בודדו ממוח הקדם חזיתיתקליפת מוח של עוברי עכברים וגדלו בתרבות לתקופה של עד 6 שבועות 17. בנוסף לרכיבים שתוארו עבור הקלטות הקולטן NMDA רקומביננטי בסעיף 2.2, פתרון פיפטה הכיל גם CNQX (20 מיקרומטר) וbicuculline (10 מיקרומטר) לעכב קולטני AMPA וGABA ילידים, בהתאמה. בהתאם לגיל של התרבות, את הרשומות המתקבלות מקולטניים NMDA ילידים חשפו קינטיקה שהיו שונים לגמרי. הקלטות ממוקדמים (איור 8 א, 5 ימים במבחנה) תרבות דומה יותר לקינטיקה תיארה לקולטנים GluN1/GluN2B והקלטות מהסוף (איור 8 ב, 27 ימים במבחנה) תרבויות דומות יותר לקינטיקה תיארה לקולטנים GluN1/GluN2A (3A דמויות ו5A). תצפית זו עולה בקנה אחד עם דפוסים של isoforms ביטוי הקולטן NMDA ועם אפיונים זהירים של זרמים שנרשמו מתיקונים אחד ערוצי תא מצורף בירך תרבויות pocampal 16.

איור 1
איור 1. בחירת תא HEK293 להקלטה המצורפת תא.) HEK293 תאים בתרבית בצלחת 35 מ"מ מונחים על הבמה מיקרוסקופ וצופים עם ניגוד שלב ב40X הגדלת הקרינה ה-GFP. ב ') מאותו שדה הראייה כמו בפנל מזהה תאי transfected. החץ מצביע על תא שמבטא את ה-GFP, נראה בריא, ונמצא בעמדה נוחה לפיפטה גישה. C) פיפטה ההקלטה מובאת באזור הקרוב לתא שנבחר באמצעות מניפולטור תנועה עדין תחת הדרכה חזותית. אנא לחץ כאן לצפייה גרסה גדולה יותר של דמות זו.

ether.within-page = "תמיד"> איור 2
איור 2. נייד מצורף היווצרות חותם. א) מזרק קטן מחובר לצדו של בעל פיפטה מאפשר שליטה ידנית של לחץ בתוך פיפטה. ב ') עובר הזרם דרך פיפטה שקועה בפתרון אמבטיה בתגובה לבדיקת המגבר, אשר ב5 mV (0.5 קילוהרץ) היא 18 הרשות הפלסטינית, ומתאים לגודל פיפטה של ​​MΩ 28. עם הנגיעה התא (חץ שמאלה), ברמה של הירידות הנוכחיות ציינו, מעידות על התנגדות פיפטה מוגברת. הפעלת לחץ שלילי באמצעות פיפטה (החץ ימינה) יוזמת היווצרות חותמת ומפחיתה את האות המיוצרת על ידי את דופק הבדיקה רק ארעיים קיבולי. ג) בהיעדר דופק בדיקה, ואם אין מתח חשמלי באמצעות פיפטה (0 V), הבסיס הוא יציב (שמאל של חץ). החלת מתח חיובי (חץ, +100 mV) יחסי ציבור oduces זרמים אחידים סטוכסטיים המצביעים על פתחי ערוץ. קו מקווקו אדום מציין את נקודת ההתחלה הנוכחית אפס.

איור 3
. איור 3 זרמים סלולריים מצורפים נרשמו מקולטני GluN1/GluN2A) תיקון חד ערוץ:. קטע 50 שניות של הקלטה רציפה ממחיש פתחי ערוץ משרעת אחיד B יחיד) תיקון מרובה ערוצים:. קטע 50 שניות של הקלטה רציפה ממחיש פתחי ערוץ לשתי רמות משרעת מצביעים על כך שהתיקון מכיל לפחות 2 ערוצים פעילים. קו מקווקו אדום מציין אפס תחילת המחקר נוכחית. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

"> איור 4
תיקון עיבוד נתונים איור 4..) לקוצי רעש. הצגת נתונים לא מסוננים וידני להחליף את האות זר (אדום) עם אות בסיס. תצוגה מורחבת ממחישה ספייק לפני (באמצע) ואחרי (נמוך יותר) ספייק (אדום) הוחלף בתיקון אות בסיס. ב ') לסחיפת בסיס. מוקדם בשיא, בחר קטע קטן של קו בסיס ולהגדיר אותו כרמה הנוכחית אפס עבור כל הרשומה (קו סגול). סחיפת בסיס נכונה על ידי בחירת חלק קטן של נסחפה בסיס (חץ) והוספת צומת בסיס (עיגול סגול). C) תקופות ארוכות יותר של שיא עם תחילת המחקר רועש (אדום) שקשה לתקן ניתן למחוק. אנא לחץ כאן לצפייה גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור 5. אידיאליזציה נתונים.) עקבות נוכחיים (שחור) נרשמו מקולט GluN1/GluN2A אחד עובר רק יוני נתרן עם טכניקת התיקון-clamp מצורף תא. נקודות אידיאליזציה נתונים (אדום) מומחשות עבור פלח ערוץ 30 שניות אחת. אלה חופפים היטב, המציין כי האידיאליזציה היא מדויקת. B) היסטוגרמה של אמפליטודות הנוכחית ממחישה הפצה שמתוארת היטב על ידי פונקציות רק שני גאוס עם פסגות באפס (0.02 ± 0.8 PA), מעיד על אירועי ערוץ סגורים וב10.3 ± 1.3 הרשות הפלסטינית מעידה על סוג אחד בלבד של אירועי ערוץ פתוחים למשך כל ההקלטה (130 דקות). C) סגור (משמאל) ופתוח (מימין) ושכנתי היסטוגרמות זמן להקלטה כולו מוצגת ב( א '). Probabilפונקצית צפיפות ity להיסטוגרמות (קווים עבים) ורכיבים הקינטית בודדים (קווים דקים) הם כיסו וחושבו על ידי התאמת הנתונים למודל המכיל חמש מדינות סגורות ושלוש מדינות פתוחות. ריבועי לספק את קבוע הזמן (τ) ושטח יחסי (א) לכל אחד מהמרכיבים הקינטית הבודדים.

איור 6
איור 6. זרמי סידן דרך קולטני NMDA אחת.) עקבות נוכחיים (שחור) נרשמו מקולט GluN1/GluN2A אחד עוברים רק יוני סידן עם טכניקת התיקון-clamp מצורף תא. היסטוגרמה נקודות נתונים אידיאליות (אדום) מומחשות ל30 פלח שניות. ב) לאמפליטודות הנוכחית ממחישה הפצה שמתוארת היטב על ידי שלוש פונקציות גאוס עם פסגות על אפס (0 ± 0.3 PA), מעידים על קרבהאירועי ערוץ ד, 1.3 ± 0.4 הרשות הפלסטינית מעיד על אירועי ערוץ פתוחים למוליכות sublevel, ו2.1 ± 0.3, מעיד על אירועי ערוץ פתוחים לרמת המוליכות הראשית. C) סגור (משמאל), מצב פתוח ברמת מוליכות העיקרית (באמצע) ו מדינת מוליכות sublevel פתוחה (מימין) ושכנתי היסטוגרמות זמן להקלטה כולו מוצגת ב( א '). פונקצית צפיפות הסתברות להיסטוגרמות (קווים עבים) ורכיבים הקינטית בודדים (קווים דקים) הם כיסו וחושבו על ידי התאמת הנתונים למודל המכיל חמש מדינות סגורות, שתי מדינות פתוחות ברמת המוליכות עיקריות ומדינת מוליכות sublevel אחד פתוחה. ריבועי לספק את קבוע הזמן (τ) ושטח יחסי (א) לכל אחד מהמרכיבים הקינטית הבודדים.

איור 7
איור 7. סלולרי מצורף הקלטת ערוץ אחדמmPIEZO1 מתבטא בתאי HEK293. הפעילות מופקת על ידי הפעלת לחץ mmHg -20 עם מכשיר HSPC באמצעות פיפטה את התיקון, במהלך יישום המתמיד של מתח (+80 mV). קו מקווקו אדום מציין את הרמה הנוכחית אפס.

איור 8
איור 8. סלולריים מצורף הקלטת ערוץ אחד מערוצים מקומיים. פיפטה צורפה בסומה של נוירון שניתק מקליפת מוח הקדם חזיתית של עובר חולדה ונשמר בתרבות במשך 5 ימים (א) או 27 ימים (ב ') . פעילות הקולטן NMDA רציפה נרשמה עם פתרונות פיפטה המכילים גלוטמט (1 מ"מ) וגליצין (0.1 מ"מ), וגם CNQX (20 מיקרומטר) וbicuculline (10 מיקרומטר) לעכב קולטני AMPA וGABA ילידים, בהתאמה. פעילות שהושרו על ידי החלת +100 mV through פיפטה ההקלטה. קו מקווקו אדום מציין את הרמה הנוכחית אפס.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בתחום ערוץ יון, אזור חשוב של מחקר מוקדש להבנת רצף אירועים שמוביל לערוץ פתיחה או מנגנון gating של הערוץ. עבור רוב הערוצים, תהליך זה הוא מורכב וכולל מספר שלבים הקינטית שלא ניתן להסיק מאות רב ערוצים מקרוסקופית. לעומת זאת, יכולים להיות מתוכננים ניסויים שבם התבוננות רצף אירועים פתוחים / סגורים ברשומת ערוץ אחד יכולה לייצר מידע מפורט יותר על מנגנוני gating. בשיטות שתוארו כאן, תחום יגנד מחייב ממוקם החיצוני ברשותו על ידי קולטנים NMDA מאפשר להקלטות תיקון מהדק פולשנית ללהתבצע בתנאים קבועים. פרוטוקול זה ייתכן שיצטרך להיות מותאם כדי להיות מתאים לחוקר ערוצי יגנד אחרים מגודרות יון בהתאם לשניהם ליגנד ומאפייני הקולטן.

שיאים של פעילות ערוץ אחד לספק שני סוגים של מידע בעל ערך. ראשית,כי משרעת הנוכחית יחידתי ניתן למדוד באופן ישיר, יכול להיות מתוכננים ניסויים כדי לקבל מידע על נכסים נקבוביות כגון מוליכות ערוץ, חדירות והסלקטיביות. שנית, משום שמשך הזמן של אירועים פתוחים וסגורים ניתן גם למדוד ישירות מהתקליט, יכול להיות מתוכננים ניסויים כדי לקבל מידע על הקינטית gating וכך, להסיק על המנגנון המבצעי של הערוץ. עבור שני הסוגים של ניסויים, ניתוח סטטיסטי משמעותי דורש binning כל נקודה בודדת מהעקבות הנוכחיות לכיתת מוליכות ספציפית. מוצג כאן הייתה שיטה אחת כזאת של לעשות את זה, על ידי שימוש במגזרי k-האמצעי (SKM) 11 אלגוריתם, לעומת זאת, זה יכול להיות מושלם על ידי מספר אלגוריתמים מתוחכמים פחות או יותר כוללים חצאי סף, לסרוק 12, באום-וולש, Viterbi, וכו '

הקלטות באמצעות התצורה המצורפת התא הן חזקות שבתעלות היונים נשמרים בביולוגיממברנות עם חוגים תאיים מוטרדים. מסיבה זו, חשוב כי חותמות קרום כראוי נוצרו ונשתמרו לאורך כל ההקלטה לשתי מטרות: 1) המשכיות ניסיונית ו2) שמירה על יחס חיובי אות לרעש (שיא לשיא רעש בסיס <2 Pa). הגודל והצורה של קצה פיפטה נוצר קובעים את ההסתברות של חותם קרום מוצלח המכיל בדיוק ערוץ אחד. קצה שטוח מבטיח שכאשר פיפטה מתקרבת לתא זה יהיה לגעת וללחוץ על גבי קרום התא בכל פני השטח הקצה בבת אחת, עוזר לאטום באופן אחיד על גבי התא. פיפטה עם טיפ שהוא רחב מדי תהיה פחות עשוי להביא לתיקונים אחד ערוצים; בניגוד לכך, בעת משיכת פיפטה עם טיפ שהוא צר מדי יגרום קרום לולאה בצורת אומגה שעשויה לחתום בבסיס ולסתום את פיפטה 10.

אות חיובית יחס רעש יכולה להיות מנוהלת על ידי צמצום מקורות החשמלרעש. תכונת קירור headstage על 200B Axopatch אפשרה לרזולוצית אות אופטימלית; עם זאת רעש עדיין יכול להיות מיוצר על ידי כל אחד מהמכשור המעורב באלקטרופיזיולוגיה להגדיר, כמו גם מקורות חיצוניים כגון אור ומוצרי אלקטרוניקה שאינן קשורות. למרבה המזל, ניתן ליישם כמה אסטרטגיות כדי למזער את הרעש לרמה רצויה 2, 27. בקצרה, ודא שפריטי ציוד שהם מסוגלים לייצר רעש מקורקעים לנקודה אחת בתוך ההתקנה. כאשר עושים זאת, חשוב כדי למנוע היווצרות של לולאות קרקע אשר תגרום רעש משמעותי. בנוסף, אם 60 רעש מחזור הוא הווה, הקפד לכבות את כל אורות שעלולים להיות הפרעה לאות ההקלטה. לבסוף, הצבת כלוב פאראדיי סביב מכשירי ההקלטה תמנע מכשולים סמוכים מגרימת רעש חשמלי.

התבוננות ערוץ אחד לתקופה ארוכה של הזמן הוכיחה שgatingשינויי קונפורמציה יכולים להתרחש על פני טווח רחב של סולמות זמן. באופן זמני, נתונים התיקון-clamp מוגבלים בסופו של הדבר 'הקצר' ברוחב הפס של המגבר וקצב שבו האות המוגבר הוא דיגיטציה ובסוף 'הזמן' ליד חלון התצפית. לשינויים קונפורמציה כי הם מהירים יותר מהגבול הנמוך, הקלטות תיקון מהדק יכולות רק להציע מידע כאשר בשילוב עם גישות ניסיוניות משלימות. לשינויי קונפורמציה המתרחשים עם שיעורים איטיים מאוד, ובכך נדגמים לעתים רחוקות, ניתן להגדיל את מספר התצפיות או להגדיל את משך הזמן של השיא, לעומת זאת, זה לא יכול להיות אפשרי תמיד.

למרות מגבלות אלה, נתונים תיקון מהדק, במיוחד כאשר המתקבלים מערוץ בודד, לעתים קרובות מכילים יותר מידע מאשר באופן מיידי לחילוץ עם מתודולוגיות חישובית הנוכחיות. לפיכך, הציפייה היא כי עלייה בעתיד ביכולת חישוב ובסופistication אלגוריתמים ניתוח יגרום יישומים אפשריים נוספים. עם כניסתו של התקדמות כזו, זה הנראה לעין, שהקלטות תיקון מהדק מערוצים בודדים עשויות להיות מסוגלים להתרחש במקביל למדידות סריג, הדמיה סידן או אפילו בהכנות vivo לספק מידע נוסף על המבנה, התפקוד והדינמיקה של תעלות יונים ב שני סביבות ילידים מבוקרות ו.

כגיוון של תעלות יונים חקר עליות, הבנה מפורטת של מנגנוני gating וסופו של דבר להבין כיצד פעולתם תורמת לתפקודים הביולוגיים הייחודיים שלהם ייהנה מתצפיות מולקולה בודדות. בפרט, הנתונים שהתקבלו בהבטחת התיקון-clamp אחד הערוצים להודיע ​​על מאפייני מוליכות אחידים ורצפי gating לערוצי רקומביננטי וילידים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

הסופרים של כתב היד הזה מצהירים שאין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי F31NS086765 (KAC), F31NS076235 (MAP), וR01 NS052669 (GKP) וEIA9100012. המחברים מודים איילין Kasperek למומחיות וסיוע בביולוגיה מולקולרית ותרביות רקמה; וג'ייסון מאיירס לשיתוף נתונים המתקבלים מנוירונים בקליפת המוח הקדם חזיתית מוקדם.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals Sigma Various
Borosillicate Glass Sutter BF-150-86-10
Bright field inverted microscope Olympus 1x51 Nikon also has similar microscopes
Fluroescent box X-cite Series 120
Liquid Light Guide X-cite OEX-LG15
Micromanipulator Sutter Instruments MP-225
Oscilloscope Tektronix TDS1001
Amplifier Molecular Devices Axon Axopatch 200B
Table TMC 63561
NIDAQ card National Instruments 776844-01
Puller Narishige PC-10
Polisher Narishige Microforge MF-830
Faraday Cage TMC 8133306
High Speed Pressure Clamp ALA Scientific Instruments ALA HSPC
Pressue/Vaccuum Pump ALA Scientific Instruments ALA PV-PUMP For HSPC-1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260, 799-802 (1976).
  2. Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch. 391, 85-100 (1981).
  3. Piccolino, M. Animal electricity and the birth of electrophysiology: the legacy of Luigi Galvani. Brain Research Bulletin. 46, 381-407 (1998).
  4. Albright, T. D., Jessell, T. M., Kandel, E. R., Posner, M. I. Neural Science: A Century of Progress and the Mysteries that Remain. Neuron. 25, (2000).
  5. Popescu, G. K. Modes of glutamate receptor gating. The Journal of Physiology. 590, 73-91 (2012).
  6. Morimoto-Tomita, M., et al. Autoinactivation of Neuronal AMPA Receptors via Glutamate-Regulated TARP Interaction. Neuron. 61, 101-112 (2009).
  7. Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 51, 187-200 (2005).
  8. Huang, Z., Li, G., Pei, W., Sosa, L. A., Niu, L. Enhancing protein expression in single HEK 293 cells. Journal of Neuroscience Methods. 142, 159-166 (2005).
  9. Raymond, L. A., Moshaver, A., Tingley, W. G., Huganir, R. L. Glutamate receptor ion channel properties predict vulnerability to cytotoxicity in a transfected nonneuronal cell line. Mol Cell Neurosci. 7, 102-115 (1996).
  10. Suchyna, T. M., Markin, V. S., Sachs, F. Biophysics and Structure of the Patch and the Gigaseal. Biophysical Journal. 97, 738-747 (2009).
  11. Qin, F. Restoration of single-channel currents using the segmental k-means method based on hidden Markov modeling. Biophys J. 86, 1488-1501 (2004).
  12. Colquhoun, D., Sigworth, F. J. chapter in Single-channel recording. 2nd edn eds B. Sakmann and E Neher. , Plenum Press. (1995).
  13. Popescu, G., Auerbach, A. Modal gating of NMDA receptors and the shape of their synaptic response. Nat Neurosci. 6, 476-483 (2003).
  14. Colquhoun, D., Hawkes, A. G. Stochastic properties of ion channel openings and bursts in a membrane patch that contains two channels: evidence concerning the number of channels present when a record containing only single openings is observed. Proc R Soc Lond B Biol Sci. 240, 453-477 (1990).
  15. Kussius, C. L., Kaur, N., Popescu, G. K. Pregnanolone Sulfate Promotes Desensitization of Activated NMDA Receptors. J. Neurosci. 29, 6819-6827 (2009).
  16. Amico-Ruvio, S., Popescu, G. Stationary gating of GluN1/GluN2B receptors in intact membrane patches. Biophysical Journal. 98, 1160-1169 (2010).
  17. Borschel, W. F., et al. Gating reaction mechanism of neuronal NMDA receptors. J Neurophysiol. 108, 3105-3115 (2012).
  18. Colquhoun, D., Hatton, C. J., Hawkes, A. G. The quality of maximum likelihood estimates of ion channel rate constants. The Journal of Physiology. 547, 699-728 (2003).
  19. Kussius, C. L., Kaur, N., Popescu, G. K. Pregnanolone Sulfate Promotes Desensitization of Activated NMDA Receptors. The Journal of Neuroscience. 29, 6819-6827 (2009).
  20. Popescu, G., Auerbach, A. Modal gating of NMDA receptors and the shape of their synaptic response. Nat Neurosci. 6, 476-483 (2003).
  21. Popescu, G., Robert, A., Howe, J. R., Auerbach, A. Reaction mechanism determines NMDA receptor response to repetitive stimulation. Nature. 430, 790-793 (2004).
  22. Prieto, M. L., Wollmuth, L. P. Gating Modes in AMPA Receptors. The Journal of Neuroscience. 30, 4449-4459 (2010).
  23. Poon, K., Nowak, L. M., Oswald, R. E. Characterizing Single-Channel Behavior of GluA3 Receptors. Biophysical Journal. 99, 1437-1446 (2010).
  24. Smith, T. C., Wang, L. -Y., Howe, J. R. Heterogeneous Conductance Levels of Native AMPA Receptors. The Journal of Neuroscience. 20, 2073-2085 (2000).
  25. Coste, B., et al. Piezo1 and Piezo2 Are Essential Components of Distinct Mechanically Activated Cation Channels. Science. 330, 55-60 (2010).
  26. Coste, B., et al. Piezo proteins are pore-forming subunits of mechanically activated channels. Nature. 483, 176-181 (2012).
  27. Benndorf, K. chapter in Single-channel recording. 2nd edn eds B. Sakmann and E Neher. , Plenum Press. (1995).

Tags

Neuroscience, ביופיסיקה תעלות יונים הקלטת ערוץ אחד קולטני NMDA gating אלקטרופיזיולוגיה תיקון מהדק ניתוח הקינטית גיליון 88
הקלטת תיקון מהדק מצורף תא אחד ערוצים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Maki, B. A., Cummings, K. A.,… More

Maki, B. A., Cummings, K. A., Paganelli, M. A., Murthy, S. E., Popescu, G. K. One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording. J. Vis. Exp. (88), e51629, doi:10.3791/51629 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter