قناة واحدة الخلية المرفقة تسجيل التصحيح، المشبك

Summary

الموصوفة هنا هي إجراءات الحصول على فترات طويلة من التسجيل الحالي من قناة واحدة أيون مع تقنية التصحيح، المشبك الخلية المرفقة. يسمح هذا الأسلوب للمراقبة، في الوقت الحقيقي، ونمط التشكل قناة مفتوحة قريبة من التي تكمن وراء إشارة البيولوجية. هذه البيانات إعلام حول خصائص القناة في الأغشية البيولوجية دون عائق.

Abstract

أيون البروتينات القناة هي أجهزة عالمية للاتصال سريعة عبر الأغشية البيولوجية. التوقيع الزمني للتدفق الأيونية أنها تولد يعتمد على الخصائص الذاتية لكل قناة البروتين وكذلك الآلية التي يتم إنشاؤها والتحكم فيه، ويمثل مجالا هاما للأبحاث الحالية. يمكن الحصول على معلومات حول الديناميات التشغيلية من البروتينات القناة الايونية من خلال مراقبة فترات طويلة من الحالية التي تنتجها جزيء واحد. الموصوفة هنا هو بروتوكول للحصول على قناة واحدة الخلية المرفقة التصحيح، المشبك التسجيلات الحالية ليجند بوابات القناة الايونية، ومستقبلات NMDA، أعرب heterologously في الخلايا HEK293 أو أصلا في الخلايا العصبية القشرية. كما أنه تقدم إرشادات حول كيفية التكيف مع أسلوب لقنوات ايون الأخرى ذات الاهتمام من خلال تقديم المثال للقناة PIEZO1 الحساسة للميكانو. هذه الطريقة يمكن توفير البيانات المتعلقة بالخصائص تصرف القناة والتسلسل الزمني لمكتب مستشار رئيس الوزراءالتشكل مغلق ن التي تشكل آلية تفعيل القناة، مما يساعد على فهم وظائفها في الصحة والمرض.

Introduction

الاتصالات السريعة عبر الأغشية البيولوجية تعتمد بشكل شبه حصري على من oligomeric المسام تشكيل بروتينات الغشاء، يشار إلى القنوات. هذه البروتينات تختلف على نطاق واسع في إشارات التنشيط، آليات النابضة، وخصائص تصرف. تصنف البروتينات القناة التي المسام انتقائية لأيونات كقنوات أيون؛ تفعيلها تنتج التيارات الأيونية عبر الغشاء، ويمكن تسجيل إجاباتهم مع ارتفاع القرار في الوقت الحقيقي باستخدام تقنيات الكهربية. إشارات التنشيط تمتد مجموعة واسعة من المدخلات الكيميائية والفيزيائية بما في ذلك تدرجات التركيز، القوات الميكانيكية والكهربائية، ودرجة الحرارة؛ وبالتالي، المزيد من تصنيف القنوات الأيونية في يجند بوابات، mechanosensitive، والجهد مسور، أو أنواع حساسة للحرارة. في هذه المقالة، وصفت البروتوكولات لتسجيل نشاط قناة واحدة من قناة يجند بوابات، ومستقبلات NMDA، وقناة mechanosensitive، PIEZO1، وذلك باستخدام تقنية التصحيح، المشبك.0؛

التصحيح، المشبك الكهربية هو المنهج التجريبي الأول والأكثر استخداما على نطاق واسع حساسة بما فيه الكفاية للسماح مراقبة الجزيئات واحدة ^{1، 2.} بالإضافة إلى هذه الحساسية رائعة، وتوسعت بشكل كبير الاستعدادات البيولوجية قابلة للتسجيل الكهربية وأيضا قد سمح مراقبة القنوات الأيونية في الأغشية سليمة. أولا، لأن كلا لقط الجهد والتسجيل الحالي يتم إنجاز مع نفس القطب، ويمكن استخدامه لتسجيل إشارات عبر أغشية خلايا صغيرة أو بقع. وكشفت هذه التقنية أن القنوات الأيونية لا تقتصر على الأغشية منفعل للعضلات الضفدع، electroplaques ثعبان البحر، أو المحاور العملاقة الحبار ^{3، 4،} بل أنها تمثل المباريات في كل مكان من آليات يشير الغشاء والمتأصلة لجميع أنواع غشاء الخلوي للأحادي أو الكائنات الحية متعددة الخلايا، وأيضا لأغشية الخلايا. استيرادantly، شريطة القدرة على تسجيل التيارات عبر الغشاء ببساطة عن طريق ربط ماصة الزجاج لخلية سليمة فرصة غير مسبوقة لتسجيل النشاط من القنوات الأيونية في الأغشية undisrupted الأصلية الخاصة بهم. وبالتالي، الخلية المرفقة تقنية التصحيح، المشبك، والتي تم وصفها في هذا البروتوكول، ويسمح برصد نشاط القنوات الأيونية بشكل مستمر لعشرات دقيقة أو أكثر في بيئتها الأصلية.

تحت التقلبات الحرارية العادية، جميع البروتينات، بما في ذلك البروتينات القناة الايونية، تغيرات هيكلية على نطاق واسع الوقت، مع الأسرع والأكثر تواترا إعادة ترتيب تمثل على الأرجح من قبل الحركات الجانبية وسلسلة التغييرات أبطأ بكثير، أقل تواترا ممثلة ضعيتها كامل المجالات أو الوحدات الفرعية، أو في بعض الحالات بواسطة التعديلات بعد متعدية أو تفاعلات البروتين البروتين ^{5، 6.} يمكن مراقبة فترات طويلة من النشاط الناتجة عن جزيء واحد يساعد على فهم وظائفهاالديناميات التقليدية للقنوات ايون في الأغشية الفسيولوجية سليمة ويوفر معلومات قيمة حول آلية تنفيذية للجزيء لوحظ.

وعلى النقيض من فهم متزايد للتنوع القنوات الأيونية عبر أنواع الخلايا ومراحل النمو والمعرفة حول التركيب الجزيئي من القنوات الأيونية في الأغشية الأم لا تزال محدودة. جميع القنوات الأيونية هي بروتينات multimeric وغالبية القنوات الأيونية الأصلي تجميع من عدة أنواع من مفارز إنتاج البروتينات الجزيئية واسعة التنوع، والتي غالبا ما ترافق مع تصرف والنابضة خصائص متنوعة. لهذا السبب، يتم دراسة قنوات الأيونات من التركيب الجزيئي محددة على التعبير في أنظمة مغايرة. على وجه الخصوص، اكتسبت خلايا HEK293، والتي هي خط نسيلي من الخلايا الجنينية البشرية خلد الكلى ⁷ والقبول على نطاق واسع كنظام المفضل للتعبير مغايرة من القنوات الأيونية المؤتلف. بين الرجلمزايا ذ أن ارتقى الخلايا HEK293 كنظام خيار لقناة أيون الكهربية هي السهولة والقدرة على تحمل تكاليف زراعة والحفاظ على ثقافتها مستقرة طويلة الأمد، وقدرتهم على تنفيذ ما بعد متعدية للطي، وتجهيز والاتجار من البروتينات الثدييات، وفي كثير من الحالات ، ومستوى منخفض أو حتى غياب التعبير الذاتية للقناة من الفائدة ^{7، 8.} معربا عن القنوات الأيونية المؤتلف ودراسة الخصائص الوظيفية في الخلايا HEK293 يزال نهجا قيما للحصول على معلومات حول خصائص هيكل وظيفة من القنوات الأيونية فضلا عن خصائص محددة من الأشكال الإسوية القناة الايونية ودورها في أنسجة الأم. البروتوكولات الموضحة في هذه المقالة يمكن تطبيقها بشكل جيد على قدم المساواة لقنوات أيون المؤتلف وأعرب في الخلايا HEK293 والقنوات الأيونية الأصلية.

وباختصار، فإن تقنية التصحيح، المشبك، من خلال قدرته غير مسبوقة لحل إشارةق من جزيء واحد لا يزال، حتى الآن، الأسلوب الأكثر مباشرة لمراقبة سلوك الجزيئات واحدة. في وضع الخلية المرفقة به، وتسجيل التصحيح، المشبك يسمح فترات المراقبة الطويلة التي، عند القيام به لجزيء واحد، يمكن أن توفر نظرة استثنائية في تشغيل القنوات الأيونية. ويرد أدناه بروتوكول للحصول على تسجيلات عالية الدقة الحالية من خلية بقع المرفقة تحتوي على واحد من البروتين القناة الايونية.

Protocol

1. الثقافة الخليوي والبروتين التعبير

1. الحفاظ على خلايا HEK293 (آي تي سي سي عدد CRL-1573) بين المقاطع 22 و 40، والذي يتضمن فقرات يؤديها آي تي سي سي، في الثقافة أحادي الطبقة في DMEM تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) و 1٪ البنسلين / الستربتوميسين الخليط في 5٪ CO ₂ و 37 درجة مئوية. بين التجارب، وخلايا العبور إلى قوارير T25 في 5-20 أضعاف التخفيفات في الحجم النهائي من 10 مل. ملاحظة: استخدام الخلايا خلال هذه المقاطع يضمن صحة الخلية مواتية والتي سوف تسمح لتشكيل ختم الأمثل والاستقرار التصحيح.
2. لترنسفكأيشن، لوحة خلايا HEK293 في 35 ملم الأطباق في كثافة ~ 10 ⁵ خلية / طبق، والتي تتطابق إلى ~ 0.5-0.6 مل من تعليق خلية في طبق وتنمو الخلايا في 2 مل متوسطة لمدة 18-24 ساعة.
3. في العقيمة 1.5 مل أنبوب الطرد المركزي، وإعداد خليط ترنسفكأيشن لمدة أربعة أطباق 35 ملم وذلك بإضافة (في هذا النظام): (1) 1 ميكروغرام لكل [كدنا] (GluN1، GluN2A، وGFP)؛ (2) 315 ميكرولتر منالماء المقطر مزدوجة ([ده ₂ O)؛ (3) 350 ميكرولتر من 42 ملي 4 - (2-هيدروكسي)-1-piperazineethanesulfonic حمض (HEPES)، و (4) 35 ميكرولتر من 2.5 M و CaCl ₂ قطرة من الحكمة، والذي يستخدم لتشكيل راسب.
4. أنبوب دوامة لمدة 5 ثوانى وإضافة 175 ميكرولتر من تعليق ترنسفكأيشن في كل من أربعة أطباق مطلي 35 مم في اليوم السابق، والتي تحتوي على الخلايا الآن في 50-60٪ التقاء، واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
5. نضح قبالة المتوسطة ترنسفكأيشن، ويغسل مع برنامج تلفزيوني واستبدالها مع 2 مل من النمو المتوسط ​​تستكمل مع 2 مم MgCl ₂ لمنع NMDA مستقبلات بوساطة التحفيز الزائدة ^9. ملاحظة: الخلايا يمكن استخدامها للحصول على تسجيلات الكهربية 24-48 ساعة بعد ترنسفكأيشن.

2. إعداد الكهربائي

1. 2 توليد ماصات تسجيل متناظرة عن طريق سحب على أنابيب زجاجية البورسليكات مع ساحبة العمودي. استنادا إلى حجم والهندسة من طرف الناتجة عن ذلك، مزيد من الماصات الشكلباستخدام الملمع. ملاحظة: يمكن تقييم حجم غيض بصريا وكهربائيا. بصريا، يجب أن يكون قطرها الخارجي في نطاق 1،4-5،6 ميكرون. كهربائيا، وحجم غيض الأمثل، عندما تمتلئ حل خارج الخلية، يجب أن تنتج المقاومة في نطاق MΩ 12-24 (انظر الشكل 2B).
2. استخدام حل ماصة، والتي لخلية المرفقة تجارب يمثل الوسط خارج الخلية التي سوف تنتج النشاط قناة الأقصى وسعة الحالية المرتفعة. ملاحظة: للحصول على مستقبلات NMDA، وهذا يتوافق مع محلول يحتوي على تركيزات تشبع من منبهات (الغلوتامات والجلايسين)، 1 ملم EDTA، الذي يخلب مثبطات ثنائي التكافؤ الموجبة وحاصرات، ولديها تركيزات الفسيولوجية من الصوديوم (150 ملم) على هيئة أيون نفيذ الوحيد ( في ملي: 1 الغلوتامات، 0.1 الجلايسين، 150 كلوريد الصوديوم، و 2.5 بوكل، 1 EDTA، و 10 HEPBS، مخزنة في درجة الحموضة 8.0 مع هيدروكسيد الصوديوم N 1).

3. المرفقة خلية تسجيل التصحيح، المشبك

1. مفتوحة softwa الحصول على البيانات يعقوبإعادة (www.qub.buffalo.edu)، وحدد الإطار اقتناء تحت عنوان "تخطيط". فتح ملف البيانات يعقوب الجديدة (مؤسسة القذافي للتنمية) من خلال النقر على 'بيانات جديد "تحت القائمة المنسدلة بعنوان' ملف 'وأدخل المعلمات الأولية التالية: معدل أخذ العينات، 40 كيلو هرتز؛ A D التحجيم /، 3000؛ قناة الإخراج، 1؛ وA / D حجم البيانات، 2. ضبط التحجيم السعة إلى 0.1 V / السلطة الفلسطينية بالنقر بزر الماوس الأيمن فوق ملف البيانات، واختيار خصائص، ثم النقر فوق علامة التبويب "البيانات". ملاحظة: يمكن أن يتم تكريره هذه المعلمات لكل الإعداد باستخدام خلايا نموذج في وضع الخلية المرفقة. تعليمات إضافية على الحصول على البيانات مع برنامج يعقوب وخصائص QDF على الانترنت في www.qub.buffalo.edu.
2. حدد طبق 35 ملم تحتوي على قناة أيون معربا عن الخلايا والنمو استبدال المتوسطة مع 2 مل PBS تحتوي على الكالسيوم والمغنيسيوم؛ تركيب طبق على خشبة المسرح المجهر والتركيز على مجال الخلوية باستخدام النقيض من المرحلة المجهري لتقييم أن الخلايا يتمتعون بصحة جيدة وتعلق كذلك إلى الطبقفي أحادي الطبقة الأزياء (الشكل 1A). التبديل إلى الكشف عن مضان للتحقق من أن ترنسفكأيشن كانت ناجحة (الشكل 1B). ملاحظة: مجموعة من كثافة مضان يمكن استخدامها كإجراء الخام من البروتين التعبير.
3. لتسجيل قناة واحدة، تعيين مكبر للصوت مكاسب الإخراج إلى X10، التكوين التصحيح لβ = 1، مرشح التناظرية إلى 10 كيلو هرتز، ووضع لالجهد المشبك والجهد لتطبيقها +100 بالسيارات. مع الأمر عقد الجهد في وضع OFF، حدد زر 'اختبار ختم'.
4. استنادا إلى مضان والصحة الخلية، واختيار خلية لرأب الصدع. تحقق في إطار المرحلة المقابل أن الخلية يتم إرفاق كذلك إلى الطبق، لديه جزء كبير من سطح الخلية تتعرض للترميم، ويبدو على خلاف ذلك في صحة جيدة. ملاحظة: الحفاظ على النقيض من المرحلة الإضاءة لتجنب تبيض الخلية خلال نهج والتصحيح لقط.
5. ملء ماصة مصقول طازجة مع حل عادل بما فيه الكفاية بحيث أنه يجعل الاتصال مع electrodه ويهز بلطف لإخراج فقاعات الهواء التي قد يكون محاصرا في الطرف. تأمين تسجيل ماصة على headstage مكبر للصوت من خلال تشديد المسمار ختم حامل ماصة والتأكد من أن الأسلاك الفضية ومنغمسين في حل ماصة.
6. باستخدام صغيرة (5 سم) حقنة بلاستيكية، وهذا مرتبط إلى حامل ماصة عن طريق الأنابيب، وتطبيق الضغط الايجابي بلطف لمنع الشوائب من الدخول وانسداد غيض خلال النهج (الشكل 2A).
7. باستخدام مياداة مجهرية، توجيه ماصة في حمام وضعه مباشرة فوق الخلية المحددة لترميم (الشكل 1C)، وإغلاق الدائرة الكهربائية. يحيط علما الذبذبات، والتي ينبغي أن تشير إلى وجود الموجي مستطيلة المقابلة لمكبر للصوت في إشارة ختم اختبار (الشكل 2B). ملاحظة: عند دخول الحمام، والمقاومة ماصة ضمن النطاق الأمثل هو 12-24 MΩ. لاختبار إشارة بالسيارات 5، ص الحالي تقاسآنج يتوافق مع ~ 20-40 السلطة الفلسطينية.
8. في حين رصد موقف ماصة بصريا من خلال المجهر وماصة المقاومة كهربائيا على الذبذبات، ومواصلة النهج بزيادات صغيرة حتى يصطدم ماصة بلطف على الخلية، وإشارة الاختبار يقلل قليلا للإشارة إلى زيادة المقاومة (الشكل 2B).
9. على شكل خاتم، والتقاط حقنة وتطبيق ضغط سلبي طفيف خلال أنابيب الجانبي عن طريق سحب المكبس المحاقن، والتي تسحب الغشاء الخلوي إلى غيض من ماصة تسجيل ويبدأ تشكيل ختم GΩ المقاومة ^10. يحيط علما إشارة الموجي الاختبار على الذبذبات، والتي يشار تشكيل الختم بواسطة تسطيح التام، مع العابرين فقط بالسعة مرئية (الشكل 2B). ملاحظة: في حالة عدم إشارة تتسطح تماما أو يصبح الأساس صاخبة، وهذا يشير إلى وجود ختم ضعيفة مع تسرب الحالية كبيرة حول الختم. هذا سيمنع صesolving احد التيارات القناة. إذا كان هذا هو الحال، سحب ماصة من الخلية وبعيدا عن الحمام، وإزالته من مرحلة الرأس وتجاهل ذلك. كرر العملية مع ماصة مصقول طازجة حتى الحصول على ختم في مجموعة كافية (≥ 1 GΩ).
10. على مكبر للصوت، والتبديل تبديل الأوامر الخارجية من 'اختبار ختم' إلى 'قبالة'؛ التبديل الأمر الجهد لعقد الإيجابية (التي كانت مقررة سابقا ل'قبالة')؛ وزيادة الربح لX100. مراقبة الذبذبات للنشاط القناة، والذي، إذا كان موجودا، كما سيتم عرض الانحرافات التصاعدي مربع من خط الأساس شقة في السابق (الشكل 2C).
11. إذا تم عرض النشاط قناة على الذبذبات، والحصول على البيانات في الملفات الرقمية التي تم فتحها سابقا في يعقوب، عن طريق الضغط على زر 'اللعب' متبوعا على زر 'سجل'. لوقف الحصول على البيانات، اضغط على زر التوقف في يعقوب، وحفظ الملف QDF إلى retriev بسهولةموقع قادرا على القرص الصلب لجهاز الكمبيوتر عن طريق تحديد "حفظ بيانات باسم ..." في القائمة المنسدلة بعنوان 'ملف'.

4. البيانات وتجهيزها بالتمجيد

ملاحظة: يمكن استخراج معلومات هامة من تسجيلات قناة واحدة عن طريق التحليلات الإحصائية التي يعين كل نقطة البيانات إلى الطبقة تصرف المناسب (في أبسط الحالات، مغلقة أو مفتوحة). ويشار إلى هذه العملية كما بالتمجيد البيانات وصفا موجزا للبالتمجيد البيانات بالوسائل ك قطعي (SKM) يوصف أسلوب ¹¹ في يعقوب أدناه.

1. فتح ملف البيانات في يعقوب، وعرض آثار الحالية في 'ما قبل' واجهة تحت عنوان "تخطيط". عرض الملف المسجل غير المرشحة (إزالة فلتر رقمي) عن طريق إلغاء تحديد المربع المسمى "التيسير".
2. بصريا مسح السجل على الفور المخالفات والتحف (الشكل 4A). المسامير الحالية وجيزة الصحيح أن occuص ضمن التتبع (الشكل 4A) عن طريق اختيار منطقة نظيفة المجاورة من نفس الفئة تصرف، تسليط الضوء على هذه المنطقة، النقر بزر الماوس الأيمن واختيار 'مجموعة عازلة محو ". التكبير في الارتفاع حتى نقطة عينة الفردية مرئية، تحديد المنطقة لتحل محلها ومحو خلال تسليط الضوء على هذه المنطقة فقط ثم انقر بزر الماوس الأيمن فوق 'محو'.
3. تحديد خط الأساس الحالية الصفر للسجل كامل عن طريق اختيار الجزء المبكر من السجل حيث الأساس مستقرة، وتسليط الضوء انقر بزر الماوس الأيمن فوق وحدد "تعيين خط الأساس '. تحقق من أن المبدأ التوجيهي الذي يظهر بدقة يمثل مستوى خط الأساس (البنفسجية في الشكل 4B)
4. تحديد نقاط في السجل حيث ينحرف خط الأساس البيانات الخام بشكل واضح من خط الأساس مجموعة. تصحيح هذا عن طريق اختيار جزء صغير من خط الأساس في المنطقة الانحراف، انقر بزر الماوس الأيمن واختر الأمر "إضافة عقدة خط الأساس '.
5. تحديد مناطق رانه يحتوي على تسجيل الضوضاء الزائدة أو القطع الأثرية التي لا يمكن تصحيحها بسهولة (الشكل 4C). تسليط الضوء على المنطقة المراد التخلص منها، انقر بزر الماوس الأيمن، ثم اختر "حذف". ملاحظة: في هذه الحالة سوف يتم فقدان المعلومات الحركية: سوف السجل معالجتها تكون أقصر وسوف تحدث نقطة بعد نقطة لصق يبدو أن تكون مستمرة مع المنطقة قبل الضوضاء.
6. ليمجد السجلات باستخدام خوارزمية SKM ^11، تسليط الضوء على جزء من التتبع التي تحتوي المفتوحة والمغلقة على حد سواء الأحداث ودخول إلى واجهة 'وزارة الدفاع' أسفل 'تخطيط'. في لوحة "نموذج"، تسليط الضوء على جزء نظيف من التتبع التي هو ممثل من خط الأساس في جميع أنحاء الملف، بزر الماوس الأيمن فوق مربع أسود (دولة مغلقة) وحدد "انتزاع". نفعل نفس الشيء بالنسبة فتحات القناة من خلال تسليط الضوء على تصرف مفتوحة، انقر بزر الماوس الأيمن على المربع الأحمر في لوحة "النموذج" وحدد "انتزاع".
7. أداء idealizaنشوئها عن السجل بأكمله عن طريق اختيار زر 'ملف' تحت عنوان 'مصدر البيانات ". انقر بزر الماوس الأيمن على علامة التبويب "يمجد" تحت قسم "النمذجة" للتحقق من أن المعلمات المطلوبة للتحليل صحيحة، ثم انقر فوق "تشغيل". نتيجة بالتمجيد، جنبا إلى جنب مع الرسم البياني لسعة الملف بأكمله، ومضافين مع البيانات للسماح للتفتيش البصري للبالتمجيد (الشكل 5). ملاحظة: قد يؤدي عدم كفاية بالتمجيد لتوليد 'أحداث كاذبة،' التي يعقوب بالكشف عن فتحات قناة والإغلاق التي لا تحدث في الواقع. ضمن قرار تسجيل، وهو يحدد من قبل مرشح التناظرية مكبر للصوت ومعدل أخذ العينات، والقرار الذي SKM بالكشف عن الأحداث المفتوحة والمغلقة يمكن التحكم عن طريق تحديد وقت ميت لالتحليلات. يجب تحديد الأوقات القتلى الأمثل عن طريق التجربة والخطأ، وسوف تعتمد على معدل أخذ العينات، ومع ذلك، هناك قاعدة جيدة من التجربة هولتحديد وقت الميتة التي هي 2-3 عينات ^12.
8. للتحقق من أن بالتمجيد يمثل بدقة البيانات الخام، ومسح أثر المثالية يدويا. على تحديد الأخطاء في بالتمجيد، وتسليط الضوء على تتبع الحدث كاذبة، انقر بزر الماوس الأيمن واختر "المختبر الدولي للألماس تاريخ". ملاحظة: للحصول على خيارات إضافية وشرحا مفصلا لمختلف الأوامر والوظائف في يعقوب، والتشاور مع يعقوب دليل على الانترنت (www.qub.buffalo.edu).

Representative Results

المؤتلف NMDA المستقبلات

مستقبلات NMDA ربط والاستجابة لعمل ما يصاحب ذلك من رئيسان منبهات: الغلوتامات والجلايسين. كما أنها تجميع heterotetramers اثنين من الجلايسين ملزمة مفارز GluN1 واثنين من الغلوتامات ملزمة مفارز GluN2. يتم ترميز مفارز GluN2 أربعة جينات (م) وهذه الأشكال الأكثر كتب على نطاق واسع في الدماغ هي GluN2A في الكبار وGluN2B في الحيوانات الأحداث. بسبب تنوع الأنواع الفرعية NMDA مستقبلات في الأعمال التحضيرية الأم، معربا عن المستقبلات في الخلايا HEK293 (الشكل 1A) يسمح للسيطرة على تكوين الوحيدات، وكذلك القدرة على تسجيل الحالي من القنوات باستخدام الزجاج ماصة مصقول بدقة (الشكل 1C).

مرة واحدة ماصة يمس الخلية، انخفاض واضح في السعة للاختبار نبض الموجي يحدث (الشكل 2B)، مما يدل على القدرة على شكل خاتم. ختم كافية تحتوي على واحدقناة ينتج النشاط قناة واضحة، كما عرض الانحرافات الهبوط من خط الأساس، مع إشارة جيدة إلى نسبة الضوضاء عند تطبيق الجهد الإيجابي (الشكل 2C). النشاط قناة القصوى لنوع البرية مستقبلات NMDA المؤتلف يمكن تحقيقه عندما تكون موجودة في تركيزات عالية سواء منبهات، وعندما مثبطات وحاصرات قناة غائبة. هذا هو المثل الأعلى، بحيث عندما يحتوي على التصحيح أكثر من قناة، وفتحات في وقت واحد على الفور واضحة ¹³ (الشكل 3B). لبروتينات مع مستويات النشاط منخفضة جدا، واحتمال أن تمتد من فتحات مستوى واحد تنبع من قناة واحدة فقط يمكن أن تحسب إذا كان من المعروف على قناة مفتوحة أو احتمال يمكن أن يقترب ^14. لهذا السبب، قد يكون من الضروري فترات المراقبة لفترة أطول.

في ظل هذه الظروف، وعند تطبيق إمكانية عقد ماصة لل+100 بالسيارات (مما يؤدي إلى غشاء المحتملة تقريبي من -120 بالسيارات)، الاشتراكيةGluN1/GluN2A المؤتلف ngle وGluN1/GluN2B مفتوحة مع احتمال كبير (P _س، 0.3-0.5) إلى مستوى واحد تصرف عالية نسبيا (> 50 PS) (أرقام 3A و5B) ^15-17. عند التسجيل، والمسامير الحالية الضوضاء، والانجرافات خط الأساس، أو فترات من الضوضاء المفرطة قد تظهر (أرقام 4A-C)، ولكن كما ذكرت، وهذه يمكن تصحيحها إذا موجزة وبسيطة. من المهم، مع ذلك، أن النشاط القناة يتم تسجيلها دون انقطاع لفترة كافية من الزمن (≥ 10 دقيقة، 10،000 الأحداث) لضمان أن اتساع كاملة من السلوكيات قناة يتم التقاطها.

يمكن أن البيانات التي تم الحصول عليها من هذه التسجيلات تقديم معلومات عن كل من حركية القناة وخصائص تخلل. هنا، علينا أن نظهر بالتمجيد يؤديها يعقوب باستخدام خوارزمية SKM (الشكل 5A)، ومع ذلك بالتمجيد البيانات يمكن أداؤها باستخدام برامج أخرى مثل pClamp أو SCAN ^12، والثانية قد نفذت باستخدام خوارزميات أو معايير، مثل أسلوب عتبة النصف مختلفة، مع كل من هذه الخيارات تحتوي على مزاياها وعيوبها. تركيب هذه البيانات إلى نماذج الحركية يمكن أداؤها من أجل كسب مزيد من التبصر في سلوكيات قناة أيون. الحد الأقصى لاحتمال المناسب لا يمكن أن يؤديها مع برامج مثل يعقوب أو HJCFIT ¹⁸ الذي الخوارزميات التي تنفذها كل برنامج لها فوائد خاصة بهم. في حين أن بالتمجيد موضح في الشكل 5 لا يتطلب سوى أبسط نموذج ممكن للدولة مغلقة واحدة ودولة واحدة مفتوحة لأن يؤديها، وتركيب نموذج الحركية كاملة لقناة أيون يتطلب بالتتابع مضيفا مغلقة ومفتوحة الدول حتى يتم التوصل إلى معيار معين. وقد أثبتت هذه العملية أن مستقبلات النوع البري GluN1/GluN2A ديك خمس ولايات مغلقة متميزة kinetically و2-4 الدول مفتوحة متميزة kinetically (الشكل 5C) ^19، والتي هذهخصائص النابضة حاسمة لتحديد شكل مستقبلات NMDA بوساطة إشارة متشابك ^{20، 21.} هذا النمط من التحليل يمكن أن تمتد إلى غيرها من القنوات الأيونية أصغر تصرف، مثل مستقبلات أمبا، لاكتساب المعرفة لآلياتها الخاصة النابضة متميزة ^22،23،24. واحد هو التحذير، ولكن، منذ مستقبلات أمبا لديهم مستويات تصرف متعددة، بالتمجيد ناجحة باستخدام يعقوب قد تتطلب تدرج دول إضافية إلى نموذج تم إنشاؤها مسبقا.

ويمكن أيضا أن هذه الأساليب أن تمتد إلى الحصول على معلومات حول القناة الايونية وتخلل تصرف عن طريق تغيير تتخلل تكوين أيون و / أو تركيز. تسجيل النشاط من خلال مستقبلات GluN1/GluN2A واحدة باستخدام الأساليب المذكورة هنا، ولكن استبدال 150 ملي مول كلوريد الصوديوم مع 75 مم CaCl ₂ في تسجيل ماصة، ينتج تيارات مع ~ 20٪ من تصرف (~ 10 PS). هذا يوضح أنه في حين أن الكالسيوم يتخلل مستقبلات NMDA في مرحبامستويات غ في ظروف الفسيولوجية، فإنه يخترق فعلا قناة ببطء أكثر من أيونات الصوديوم، مشيرا إلى أنه قد يكون هناك موقع الكالسيوم المحتملة ملزمة ضمن مسار تخلل. بالإضافة إلى ذلك، على الرغم من هذا تصرف الصغيرة، وتسجيلات يمكن المثالية على نحو كاف باستخدام خوارزمية SKM في يعقوب، يكشف فيه النقاب عن وجود تصرف sublevel وسيطة، وهي عبارة عن 50٪ من السعة الحالية من مستوى تصرف الرئيسي (أرقام 6A و B). هذه الفتحات sublevel، ومع ذلك، لا يمكن إلا أن المثالية في يعقوب عندما يتم دمج فئة تصرف إضافية في النموذج الأولي الحركية. وكشفت التحليلات الحركية أيضا أنه في ظل هذه الظروف، لا يزال يحمل مستقبلات خمس ولايات مغلقة متميزة kinetically، ولكن هذه الدول لديها ثوابت زمنية مختلفة للغاية والإشغال مقارنة عندما يمر القناة الوحيدة أيونات الصوديوم (الشكل 6C). بالإضافة إلى ذلك، لوحظ اثنين فقط من الدول مفتوحة يوالتانجو هذه الظروف مما يدل على أن، بالإضافة إلى التأثير على قناة الموصلية، أيونات الكالسيوم قادرون على مستقبلات تعدل النابضة.

لا توجد وسيلة معينة للحصول على واحد فقط بقع القناة. بدلا من ذلك، يمكن أن العديد من التلاعب التجريبية تسهم في زيادة احتمالات النجاح. الأولى، تهدف لمستوى منخفض من قناة التعبير من خلال تقييم كثافة مضان من الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل (الشكل 1B). قد يكون النهج الناجحة ل: خفض المبلغ الإجمالي للكدنا] تستخدم لترنسفكأيشن أو لتقلل من كمية [كدنا] لالوحيدات المطلوبة، كما هو GluN1؛ لتقليل الوقت من الحضانة مع راسب الفوسفات الحمض النووي / الكالسيوم؛ واختيار لترميم الخلايا فقط الفلورسنت بشكل خافت من مجال الرؤية. وينبغي متابعة هذه المناهج إذا كان الحصول على بقع كثيرا ما تحتوي على قنوات متعددة. بالإضافة إلى ذلك، خفض حجم غيض ماصة يمكن أيضا أن تسهم في محاصرة قناة واحدة فقط في patcح. ولكن في نهاية المطاف، واحد يصبح ناجحا في الحصول على بقع قناة احدا تلو الامتناع منهجي من تسجيل لفترات طويلة من البقع التي تحتوي بوضوح أكثر من قناة.

قنوات PIEZO1 المؤتلف

الأساليب الموصوفة في هذا البروتوكول يمكن تطبيقها بسهولة على أي يجند بوابات القناة الايونية، بل ويمكن تكييفها لتسجيل نشاط قناة واحدة من أي قناة أيون، سواء تفعيلها من المواد الكيميائية، والجهد، والقوة، ودرجة الحرارة، أو وسائل أخرى. أحد الأمثلة على الكيفية التي يمكن أن تتكيف هذا البروتوكول لتسجيل التيارات قناة واحدة من قنوات أخرى الأيونات، وتحديدا الماوس PIEZO1، قناة أيون mechanosensitive، ويرد أدناه (الشكل 7) ^{25 و 26.}

كما هو الحال مع قنوات مستقبلات NMDA، يتم التعبير عن PIEZO1 وGFP في الخلايا HEK293 بواسطة الفوسفات بوساطة ترنسفكأيشن الكالسيوم وتستخدم الخلايا 24-48 ساعة ترنسفكأيشن آخر كماهو موضح في القسم 1.2. لتنشيط PIEZO1 عن طريق تمتد الغشاء، ينبغي الحرص على التعامل مع الغشاء بلطف خلال تشكيل التصحيح والأجهزة المناسبة للتسليم والسيطرة على القوة الميكانيكية المطبقة ينبغي أن تكون متاحة. ويمكن تحقيق هذه الشروط بجعل ماصات تسجيل أكبر، مع المقاومة في نطاق MΩ 2-3 واستخدام سرعة عالية جهاز المشبك الضغط (HSPC) متصلا من خلال تسجيل ماصة حامل ماصة على headstage مكبر للصوت. إعدادات مكبر للصوت هي مماثلة لتلك التي وصفها لمستقبلات NMDA في القسم 3.3، باستثناء تبديل على 'الخارجية' مفتاح الأوامر بحيث يمكن التحكم في مكبر للصوت من خلال برنامج استحواذ.

لتسجيل النشاط من PIEZO1، استخدم ماصة تسجيل مليئة (مم): 130 كلوريد الصوديوم، 5 بوكل، 10 HEPES، 1 و CaCl _2، 1 MgCl _2، 10 TEA-CL، ودرجة الحموضة 7.3 مع هيدروكسيد الصوديوم. في ظل هذه الظروف، يمكن رصد فتحات وكما قلتالتيارات الصوديوم nward، والتي سوف تظهر على الذبذبات كما الانحرافات الهبوط من خط الأساس الحالية صفر. وضع تسجيل ماصة على المسرح رئيس مكبر للصوت وتأكد من أن الطلب على HSPC هو عند مستوى الصفر. قبل دخول الحمام، وتطبيق 3-5 ملم زئبقي للضغط إيجابية. باستخدام مياداة مجهرية، وانخفاض ماصة في الحمام، وتحقق للمقاومة ماصة المطلوب، وجلب ماصة على مقربة من الخلية المحددة كما هو موضح في القسم 3.6. تلمس بلطف الخلايا تحت المجهر والتوجيه من خلال رصد الذبذبات، ومراقبة انخفاض طفيف في اتساع اختبار ختم الموجي بطريقة مماثلة كما فعلت لمستقبلات NMDA (القسم 3.7). الافراج بسرعة عن طريق تطبيق الضغط الايجابي على ماصة عن طريق تغيير مستوى الضغط 3-5 عقد إلى 0 مم زئبق. الانتظار للحصول على ختم GΩ لتشكيل عن طريق رصد شكل موجة اختبار الختم. في هذه الحالة، يتم تطبيق أي ضغط سلبي على شكل خاتم. مرة واحدة يتم الحصول على ختم الأمثل اضغط على و# 8216؛. سجل زر 'في يعقوب لبدء الحصول على البيانات الشكل 7 يبين أثر ممثل mPIEZO1 على قناة واحدة التيارات تفعيلها من خلال تطبيق -20 ملم زئبقي للضغط على ماصة التصحيح. وكانت هذه التيارات تمرير منخفض تصفيتها في 2 كيلو هرتز وأخذ عينات عند 20 كيلوهرتز.

وعلى النقيض من يجند بوابات قنوات مع مجالات ملزم يجند خارج الخلية، وتحفيز وتفعيل قنوات mechanosensitive يمكن أن تختلف تحت 2 البروتوكولات. الأول هو "خالية من الفجوة، 'حيث يتم تطبيق الضغط السلبي المستمر إلى التصحيح لمدة تسجيل كامل. هذا البروتوكول هو مفيد في الحصول على تسجيلات دقائق طويلة وأنجح مع المثيرات أصغر الضغط (0-20 مم زئبق)، الذي الحفاظ على سلامة الغشاء. النشاط تنتجها ارتفاع الضغط، والتي من المرجح أن تمزق الغشاء، وأفضل التسجيلات التي تم الحصول عليها مع "العرضية"، حيث نبضات من ضغوط متفاوتة يمكن تطبيقها على التصحيح لفترات زمنية أقصر (<قوي> الشكل 7). كما هو الحال مع قنوات يجند بوابات، تعلق التسجيلات من خلية واحدة توفير بقع قناة ثروة من المعلومات فيما يتعلق بكل من تصرف وخصائص النابضة القناة قيد التحقيق.

NMDA المستقبلات العصبية

الطريقة الموصوفة هنا لتسجيل الخلية المرفقة قناة واحدة يمكن استخدامها للحصول على معلومات حول تصرف وخصائص النابضة من القنوات المحلية إلى نوع خلية معينة و / أو مرحلة النمو. كما هو الحال مع العديد من القنوات الأخرى مغايرة التغصن، التركيب الجزيئي الدقيق للمستقبلات NMDA الأصلي غير معروف. من خلال مقارنة النتائج التي تم الحصول عليها من مستقبلات المؤتلف من تكوين معروفة مع تلك التي تم الحصول عليها من الاستعدادات الأم، فرضيات حول تكوين الوحيدات وظيفة من القنوات في بيئتها الأصلية يمكن أن تصاغ أو اختبار ^17.

تم عزل الخلايا العصبية من الفص الجبهيالقشور من أجنة الفئران ونمت في الثقافة لمدة تصل إلى 6 أسابيع ^17. بالإضافة إلى مكونات وصفها لالمؤتلف التسجيلات NMDA مستقبلات في القسم 2.2، كما يتضمن الحل ماصة CNQX (20 ميكرومتر) وbicuculline (10 ميكرومتر) لمنع المستقبلات GABA أمبا والأم، على التوالي. اعتمادا على سن والثقافة، والسجلات التي تم الحصول عليها من المستقبلات NMDA الأم كشفت حركية التي كانت مختلفة تماما. تسجيلات من وقت مبكر (الشكل 8A، 5 أيام في المختبر) ثقافة أكثر شبها حركية وصفها لمستقبلات GluN1/GluN2B والتسجيلات من أواخر (الشكل 8B، 27 أيام في المختبر) الثقافات أكثر شبها حركية وصفها لمستقبلات GluN1/GluN2A (أرقام 3A و5A). هذه الملاحظة بما يتفق مع أنماط الأشكال الإسوية NMDA مستقبلات التعبير والأوصاف مع الحذر من التيارات المسجلة من خلية المرفقة بقع قناة واحدة في الورك الثقافات pocampal ^16.

الشكل 1. تحديد خلية لخلية تسجيل HEK293 المرفقة. أ) يتم وضعها HEK293 الخلايا المستزرعة في صحن 35 ملم على المسرح المجهر وينظر إليها على النقيض من المرحلة 40X التكبير. B) GFP مضان من نفس المجال البصري كما هو الحال في لوحة A يحدد الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل. السهم يشير إلى الخلية التي تعبر عن GFP، ويبدو بصحة جيدة، وهو في موقف قابلة للماصة الوصول. C) يتم جلب ماصة تسجيل في منطقة قريبة من الخلية المحددة باستخدام مناور الحركة غرامة بموجب التوجيه البصري. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ether.within صفحة = "دائما">
الشكل 2. خلية المرفقة تشكيل الختم. A) A حقنة صغيرة متصلة إلى جانب حامل ماصة يسمح التحكم اليدوي من الضغط داخل ماصة. ب) إصدار الحالي من خلال ماصة منغمسين في حل حمام ردا على اختبار مكبر للصوت، والتي في 5 بالسيارات (0.5 كيلو هرتز) هو 18 السلطة الفلسطينية، ويتوافق مع حجم ماصة من 28 MΩ. عند لمس الخلية (السهم الأيسر)، ومستوى من الانخفاض الحالي لوحظ، مما يدل على زيادة مقاومة ماصة. تطبيق الضغط السلبي من خلال ماصة (السهم الأيمن) يبدأ تشكيل ختم ويقلل من إشارة تنتجها نبض الاختبار فقط العابرين بالسعة. C) وفي ظل غياب أي نبض الاختبار، وإذا لم يتم تطبيق الجهد من خلال ماصة (0 V)، خط الأساس هو مستقر (يسار السهم). تطبيق الجهد الإيجابي (السهم، +100 بالسيارات) العلاقات العامة العامة oduces تيارات وحدوية العشوائية التي تشير إلى فتحات قناة. خط منقط أحمر يشير إلى خط الأساس الحالية صفر.

الشكل 3 خلية التيارات المرفقة المسجلة من المستقبلات GluN1/GluN2A A) قناة واحدة التصحيح: شريحة 50 ثانية من التسجيل المتواصل يوضح فتحات قناة واحدة موحدة السعة ب) متعددة القنوات التصحيح: شريحة 50 ثانية من التسجيل المتواصل يوضح فتحات القناة إلى مستويين السعة مشيرا إلى أن التصحيح يحتوي على الأقل 2 القنوات النشطة. الخط المنقط الأحمر يشير الصفر خط الأساس الحالية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

">
الشكل 4. معالجة البيانات. A) لتصحيح ارتفاع الضوضاء. عرض البيانات التي لم تتم تصفيتها ويدويا استبدال إشارة غريبة (الحمراء) مع إشارة خط الأساس. يوضح عرض موسع تصاعد قبل (وسط) وبعد (أقل) تم استبدال ارتفاع (الحمراء) مع إشارة خط الأساس. ب) تصحيح للانحراف خط الأساس. في السجل في وقت مبكر، حدد شريحة صغيرة من خط الأساس وتعيينه مستوى الصفر الحالية للسجل كامل (الخط البنفسجي). الانجراف خط الأساس الصحيح عن طريق اختيار جزء صغير من انجرف خط الأساس (السهم) وإضافة عقدة الأساس (دائرة البنفسجية). C) فترات أطول من سجل مع خط الأساس صاخبة (الحمراء) التي يصعب تصحيح يمكن حذفها. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

سجلت الرقم 5. بالتمجيد البيانات. أ) آثار الحالي (أسود) من أحد مستقبلات GluN1/GluN2A يمر فقط أيونات الصوديوم مع تقنية التصحيح، المشبك الخلية المرفقة. ويوضح نقاط البيانات المثالية (أحمر) بالنسبة لشريحة قناة واحدة و 30 ثانية. هذه تتداخل بشكل جيد، مشيرا إلى أن بالتمجيد دقيقة. ب) من الرسم البياني سعة الحالية توضح توزيع الموضح بشكل جيد من قبل اثنين فقط من وظائف جاوس مع قمم في صفر (0.02 ± 0.8 السلطة الفلسطينية)، مما يدل على الأحداث قناة مغلقة و10.3 ± 1.3 في السلطة الفلسطينية يدل على نوع واحد فقط من الأحداث قناة مفتوحة لمدة تسجيل كامل (130 دقيقة). C) مغلق (يسار) وفتح (يمين) يسكن رسوم بيانية الوقت لتسجيل كامل هو مبين في (A). وprobabilومضافين دالة الكثافة إيتي لرسوم بيانية (خطوط سميكة) والمكونات الحركية الفردية (خطوط رقيقة) وحسبت من المناسب البيانات إلى نموذج يحتوي على خمس ولايات المغلقة والمفتوحة ثلاث ولايات. توفير إدراجات ثابت الزمن (τ) ومنطقة النسبي (أ) لكل من المكونات الحركية الفردية.

سجلت الرقم 6. التيارات الكالسيوم من خلال مستقبلات NMDA واحد. أ) آثار الحالي (أسود) من أحد مستقبلات GluN1/GluN2A يمر فقط أيونات الكالسيوم مع تقنية التصحيح، المشبك الخلية المرفقة. ويوضح نقاط البيانات المثالية (الأحمر) لمدة 30 ثانية الجزء باء) من الرسم البياني سعة الحالية توضح توزيع الموصوفة جيدا من قبل ثلاث وظائف جاوس مع قمم في صفر (0 ± 0.3 السلطة الفلسطينية)، مما يدل على وثيقةالأحداث د القناة، 1.3 ± 0.4 السلطة الفلسطينية يدل على الأحداث قناة مفتوحة إلى تصرف sublevel، و 2.1 ± 0.3، مما يدل على الأحداث قناة مفتوحة إلى المستوى تصرف الرئيسي. C) مغلق (يسار)، ومستوى الدولة تصرف الرئيسية مفتوحة (وسط) و تصرف الدولة sublevel المفتوحة (يمين) يسكن رسوم بيانية الوقت لتسجيل كامل هو مبين في (A). وغشى دالة الكثافة الاحتمالية للرسوم بيانية (خطوط سميكة) والمكونات الحركية الفردية (خطوط رقيقة) وحسبت من المناسب البيانات إلى نموذج يحتوي على خمس ولايات مغلقة، دولتين الرئيسي المستوى تصرف مفتوحة وتصرف دولة واحدة مفتوحة sublevel. توفير إدراجات ثابت الزمن (τ) ومنطقة النسبي (أ) لكل من المكونات الحركية الفردية.

الرقم 7. خلية تعلق تسجيل قناة واحدةمن mPIEZO1 أعرب في الخلايا HEK293. وانتزع آخر عن طريق تطبيق الضغط -20 ملم زئبقي مع جهاز HSPC من خلال ماصة التصحيح، خلال التطبيق المستمر للالجهد (+80 بالسيارات). خط منقط أحمر يشير إلى مستوى الصفر الحالية.

الرقم 8. خلية تعلق تسجيل قناة واحدة من قنوات الأم. كان يعلق ماصة في سوما من الخلايا العصبية التي تم فصلها من قشرة الفص الجبهي من جنين فأر وتمت المحافظة في الثقافة لمدة 5 أيام (A) أو 27 يوما (B) . وسجلت المستمر نشاط مستقبلات NMDA مع حلول ماصة تحتوي على الغلوتامات (1 ملم) والجلايسين (0.1 ملم)، وأيضا CNQX (20 ميكرومتر) وbicuculline (10 ميكرومتر) لمنع المستقبلات GABA أمبا والأم، على التوالي. وقد أثارت النشاط من خلال تطبيق +100 بالسيارات رhrough تسجيل ماصة. خط منقط أحمر يشير إلى مستوى الصفر الحالية.

Discussion

في مجال القناة الايونية، وتكرس مجال هام من مجالات البحوث لفهم تسلسل الأحداث التي تؤدي إلى توجيه أو آلية النابضة افتتاح القناة. بالنسبة لمعظم القنوات، وهذه العملية هي عملية معقدة وتنطوي على عدة خطوات الحركية التي لا يمكن استنتاجها من العيانية إشارة متعدد القنوات. في المقابل، يمكن تصميم التجارب حيث مراقبة تسلسل الأحداث مفتوحة / مغلقة في سجل قناة واحدة يمكن أن تنتج معلومات أكثر تفصيلا حول آليات النابضة. في الأساليب المذكورة هنا، وتقع خارجيا يجند ملزم المجال التي تمتلكها مستقبلات NMDA يسمح لمينيملي التسجيلات التصحيح، المشبك التي يتعين القيام بها في ظل ظروف ثابتة. قد تحتاج إلى أن تتكيف من أجل أن تكون مناسبة للتحقيق يجند بوابات القنوات الأيونية الأخرى اعتمادا على كل من يجند وخصائص مستقبلات هذا البروتوكول.

سجلات النشاط قناة واحدة توفر نوعين من المعلومات القيمة. الأولى،لأن السعة الحالية وحدوي يمكن قياسها مباشرة، والتجارب يمكن أن تكون مصممة للحصول على معلومات حول خصائص المسام مثل قناة الموصلية والنفاذية والانتقائية. الثاني، لأن مدة الأحداث المفتوحة والمغلقة ويمكن أيضا أن تقاس مباشرة من السجل، ويمكن تصميم التجارب للحصول على معلومات حول الحركية النابضة، وبالتالي، وجعل استنتاجات حول الآلية التنفيذية للقناة. لكلا النوعين من التجارب، يتطلب التحليل الإحصائي مغزى binning كل نقطة على حدة من التتبع الحالية إلى فئة تصرف معين. قدم هنا كان أسلوب واحد من هذا القبيل للقيام بذلك، وذلك باستخدام وسائل قطعي ك (SKM) ¹¹ الخوارزمية، ومع ذلك، وهذا يمكن أن يتحقق من خلال عدة خوارزميات أكثر أو أقل تطورا بما في ذلك نصف عتبة، SCAN ^12، باوم-ولش، فيتربي، إلخ

التسجيلات باستخدام التكوين الخلية المرفقة هي قوية في أن القنوات الأيونية يتم الاحتفاظ في البيولوجيةالأغشية مع الأوساط داخل الخلايا رابط الجأش. لهذا السبب، فمن الأهمية بمكان أن الأختام غشاء تتشكل على نحو كاف والحفاظ في جميع أنحاء تسجيل لغرضين: 1) استمرارية التجريبية و2) الحفاظ على نسبة مواتية إشارة إلى الضوضاء (الذروة إلى الذروة ضجيج خط الأساس <2 سنويا). حجم وشكل غيض ماصة ولدت يحدد احتمال حدوث ختم غشاء الناجحة التي تحتوي على قناة واحدة بالضبط. وهناك معلومات مسطحة يضمن أنه عندما تقترب من ماصة الخلية فإنه سيتم لمس والضغط على غشاء الخلية مع سطح طرف كامل في آن واحد، مما يساعد على ختم موحد على الخلية. وهناك مع طرف ماصة واسعة جدا أن تكون أقل احتمالا أن يؤدي إلى بقع قناة واحدة؛ في المقابل، على سحب ماصة مع طرف أن ضيق جدا سوف يؤدي في حلقة الغشاء على شكل أوميغا التي قد ختم في القاعدة وتسد ماصة ^10.

إشارة إلى نسبة الضوضاء مواتية يمكن أن تدار عن طريق تقليل مصادر الكهربائيةالضوضاء. وقد أتاح ميزة التبريد headstage على Axopatch 200B لقرار إشارة الأمثل؛ ومع ذلك الضجيج لا يزال ينتج من قبل أي من الأجهزة المعنية في إعداد الكهربية، فضلا عن مصادر خارجية مثل الضوء والإلكترونيات ذات صلة. لحسن الحظ، هناك عدة استراتيجيات يمكن تنفيذها للحد من الضوضاء إلى المستوى المطلوب ^{2، 27.} لفترة وجيزة، تأكد من أن قطعة من المعدات التي هي قادرة على انتاج الضوضاء ترتكز إلى نقطة واحدة ضمن الإعداد. عند القيام بذلك، فمن المهم لمنع تشكيل حلقات الأرض والتي سوف تسبب ضوضاء كبيرة. بالإضافة إلى ذلك، إذا الضوضاء 60 دورة موجود، تأكد من إيقاف أي أضواء التي يمكن أن تتداخل مع إشارة التسجيل. أخيرا، ووضع قفص فاراداي حول جهاز تسجيل سيمنع العوائق القريبة من التسبب في الضجيج الكهربائي.

مراقبة قناة واحدة لفترة طويلة من الوقت قد أثبتت أن تبوبيمكن أن تحدث تغييرات متعلق بتكوين على طائفة واسعة من النطاقات الزمنية. زمنيا، وبيانات التصحيح، المشبك تقتصر في نهاية 'قصيرة' من عرض النطاق الترددي من مكبر للصوت والمعدل الذي هو إشارة تضخيم الرقمية، وفي نهاية "الطويل" من نافذة المراقبة. لإجراء تغييرات متعلق بتكوين التي هي أسرع من الحد منخفضة، ويمكن تسجيلات التصحيح، المشبك تقدم المعلومات فقط عندما يقترن مع النهج التجريبي مكملة. ليتم أخذ عينات التغييرات متعلق بتكوين التي تحدث مع معدلات بطيئة جدا، وبالتالي نادرا، يمكن للمرء أن زيادة عدد الملاحظات أو زيادة مدة قياسية، ولكن هذا قد لا يكون من الممكن دائما.

على الرغم من هذه القيود، وبيانات التصحيح، المشبك، وخصوصا عندما تم الحصول عليها من قناة فردية، غالبا ما تحتوي على معلومات أكثر من استخراجها فورا مع المنهجيات الحسابية الحالية. وبالتالي، فإن التوقع هو أن الزيادات المستقبلية في القدرات الحسابية وفي sophسوف istication من خوارزميات تحليل جعل التطبيقات الإضافية الممكنة. عند ظهور مثل هذه التطورات، فمن المتوقع أن التسجيلات التصحيح، المشبك من القنوات واحدة قد تكون قادرة على أن تحدث بالتزامن مع القياسات الحنق، والتصوير الكالسيوم أو حتى في الاستعدادات الجسم الحي لتقديم مزيد من المعلومات بشأن الهيكل والوظيفة وديناميات القنوات الأيونية في كلا البيئتين المحلية والتي تسيطر عليها.

كما حققت في تنوع القنوات الأيونية الزيادات، فهم مفصل لآليات النابضة وفهم في نهاية المطاف كيفية مساهمة عملية من أجل الوظائف البيولوجية فريدة من نوعها سوف تستفيد من الملاحظات جزيء واحد. على وجه الخصوص، البيانات التي تم الحصول عليها مع قناة واحدة التصحيح، المشبك وعد لإعلام حول خصائص تصرف الوحدوي وتسلسل تبوب للقنوات المؤتلف والأم.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals	Sigma	Various
Borosillicate Glass	Sutter	BF-150-86-10
Bright field inverted microscope	Olympus	1x51	Nikon also has similar microscopes
Fluroescent box	X-cite	Series 120
Liquid Light Guide	X-cite	OEX-LG15
Micromanipulator	Sutter Instruments	MP-225
Oscilloscope	Tektronix	TDS1001
Amplifier	Molecular Devices	Axon Axopatch 200B
Table	TMC	63561
NIDAQ card	National Instruments	776844-01
Puller	Narishige	PC-10
Polisher	Narishige	Microforge MF-830
Faraday Cage	TMC	8133306
High Speed Pressure Clamp	ALA Scientific Instruments	ALA HSPC
Pressue/Vaccuum Pump	ALA Scientific Instruments	ALA PV-PUMP	For HSPC-1