En-kanals Cell-ansluten Patch-clamp inspelning

Summary

Beskrivs här är ett förfarande för att få långa sträckor av aktuell inspelning från en jonkanal med cell bifogade patch-clamp teknik. Denna metod gör det möjligt att observera, i realtid, mönstret av öppen-nära kanalkonformationer som ligger bakom den biologiska signalen. Dessa data informera om kanal fastigheter i ostörda biologiska membran.

Abstract

Jonkanalsproteiner är universella enheter för snabb kommunikation över biologiska membran. Den tidsmässiga underskrift joniska flux de genererar beror på egenskaperna inneboende i varje kanal protein samt den mekanism genom vilken den genereras och kontrolleras och utgör ett viktigt område av aktuell forskning. Information om de operativa dynamik jonkanalproteiner kan erhållas genom observation av långa sträckor av ström som produceras av en enda molekyl. Beskrivet här är ett protokoll för att erhålla en-kanaliga cell bifogade patch-clamp nuvarande inspelningar för en ligand jonkanal, NMDA-receptorn, uttryckt heterologt i HEK293-celler eller inbyggt i kortikala neuroner. Också är instruktioner om hur man ska anpassa metoden till andra jonkanaler av intresse genom att presentera exempel på mekano känsliga kanal PIEZO1. Denna metod kan ge uppgifter om kanalens konduktans egenskaper och den tidssekvens av OPEn-slutna konformationer som utgör kanalens aktiveringsmekanism, vilket bidrar till att förstå deras funktion vid hälsa och sjukdom.

Introduction

Snabb kommunikation över biologiska membran bygger nästan uteslutande på oligomeric por bildar membranproteiner, som vanligtvis kallas kanaler. Dessa proteiner skiljer sig mycket i aktiveringssignaler, grindmekanismer och konduktans egenskaper. Kanal proteiner vars porer är selektiva för joner klassificeras som jonkanaler; deras aktivering producerar jonströmmar över membranet, och deras svar kan spelas in med hög upplösning i realtid med hjälp av elektrofysiologiska metoder. De aktiveringssignaler spänner över ett brett spektrum av kemiska och fysiska ingångar inklusive koncentrationsgradienter, mekaniska och elektriska krafter, och temperatur; alltså, ytterligare klassificera jonkanaler i ligand gated, mechanosensitive, spänning gated, eller värmekänsliga typer. I den här artikeln, är protokoll beskrivs för att spela in en kanal aktivitet från en ligand gated kanal, NMDA-receptorn, och en mechanosensitive kanal, PIEZO1, med hjälp av patch-clamp teknik.0;

Patch-clamp-elektrofysiologi är det första och mest använda experimentella metoden tillräckligt känsligt för att medge observation av enstaka molekyler ^{1, 2.} Förutom denna utsökta känslighet finns det omfattande utökad de biologiska preparat som lämpar sig för elektrofysiologisk registrering och även har tillåtit observationen av jonkanaler i intakta membran. Först, eftersom både spänning fastspänning och ström inspelning åstadkoms med samma elektrod, kan den användas för att spela in signaler över små celler eller membran patchar. Tekniken visade att jonkanaler inte är begränsade till hetsiga membran av groda muskler, ål electroplaques eller bläckfisk jätte axoner ^{3, 4,} utan snarare att de representerar ubiquitous fixturer för transsignaleringsmekanismer och är inneboende i alla cellulära membran typer av uni-eller multicellulära organismer, och även till intracellulära membran. Importoch art, möjlighet att spela in trans strömmar genom att helt enkelt ansluta ett glas pipett till en intakt cell gett helt nya möjligheter att spela in aktivitet från jonkanaler i deras infödda störningsfri membran. Således cellen bifogade patch-clamp teknik, som beskrivs i detta protokoll, tillåter övervakning av aktiviteten av jonkanaler kontinuerligt under tiotals minuter eller längre i sin ursprungliga miljö.

Under normala termiska variationer, alla proteiner, inklusive jonkanalsproteiner, genomgå strukturella förändringar över en bred tidsskala, med de snabbaste och mest frekventa omdisponeringar representerade troligen vid sida-kedja rörelser och mycket långsammare, mindre frekventa förändringar som representeras av ompositionering av hela domäner eller subenheter, eller i vissa fall av posttranslationella modifieringar eller protein-proteininteraktioner ^{5, 6.} Observation långa perioder av verksamhet som genereras av en molekyl kan hjälpa till att förstå funktionentionella dynamiken i jonkanaler i intakta fysiologiska membran och ger värdefull information om det operativa system av molekylen observeras.

I motsats till den ökande förståelsen av mångfalden av jonkanaler över celltyper och utvecklingsstadier, kunskap om den molekylära sammansättningen av jonkanaler i infödda membran är fortfarande begränsad. Alla jonkanaler är multimera proteiner och majoriteten av inhemska jonkanaler ihop från flera typer av subenheter som producerar proteiner med breda molekylära mångfalden, som ofta åtföljs med olika konduktans och gating egenskaper. Av denna anledning är jonkanaler med definierad molekylär sammansättning studerades vid expression i heterologa system. I synnerhet HEK293-celler, som är en klonal linje av immortaliserade humana embryonala njurceller ^7, vunnit bred acceptans som det föredragna systemet för heterolog expression av rekombinanta jonkanaler. Bland manneny fördelar som förhöjda HEK293 celler som valet system för jonkanal elektrofysiologi är den lätthet och överkomliga priser på odling och bibehålla långlivade stabila kulturer, deras förmåga att utföra post-translationell vikning, förädling och handel med däggdjursproteiner, och i många fall , deras låga eller till och med frånvaro av endogen expression för kanal av intresse ^{7, 8.} Att uttrycka rekombinanta jonkanaler och studera deras funktionella egenskaper i HEK293 celler fortsätter att vara en värdefull metod för att få information om struktur-funktionsegenskaper jonkanaler samt specifika egenskaper jonkanal isoformer och deras roller i infödda vävnad. De protokoll som beskrivs i denna artikel kan tillämpas lika väl på rekombinanta jonkanaler som uttrycks i HEK293 celler och infödda jonkanaler.

Sammanfattningsvis, för att patch-clamp teknik, genom sin exempellösa förmåga att lösa signals från en molekyl förblir hittills den mest direkta metoden för att observera beteendet hos enskilda molekyler. I sin cell-anslutna läge, gör patch-clamp inspelning långa observationsperioder som, när det görs för en molekyl, kan ge exceptionell insikt i driften av jonkanaler. Nedan presenteras ett protokoll för att få hög upplösning nuvarande inspelningar från cell bifogade plåster innehållande en jonkanal protein.

Protocol

1. Cellodling och Protein Expression

1. Bibehåll HEK293-celler (ATCC-nummer CRL-1573) mellan passagerna 22 och 40, som omfattar passagerna utförda av ATCC, i monolagerkultur i DMEM kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS) och 1% penicillin / streptomycin blandningen vid 5% _CO2 och 37 ° C. Mellan experiment, passage celler i T25-kolvar vid 5-20 faldiga späd i en slutlig volym på 10 ml. Anm: Med hjälp av celler under dessa passager garanterar gynnsam cell hälsa som gör det möjligt för optimal tätning bildning och patch stabilitet.
2. För transfektion, Plate HEK293-celler i 35 mm skålar vid en densitet av ~ 10 ⁵ celler / skål, vilket motsvarar ~ 0,5 till 0,6 ml cellsuspension per skål och odla cellerna i 2 ml medium under 18 till 24 timmar.
3. I en steril 1,5 ml centrifugrör, förbereda transfektion blandningen i fyra 35 mm skålar genom att lägga till (i denna ordning): (1) 1 pg av varje cDNA (GluN1, GluN2A, och GFP); (2) 315 pl avdubbeldestillerat vatten (DDH ₂ O); (3) 350 | il av 42 mM 4 - (2-hydroxietyl)-1-piperazinetansulfonsyra (HEPES), och (4) 35 | il av 2,5 M _CaCl2 droppvis, vilket används för att bilda fällningen.
4. Vortex-röret för 5 sek och tillsätt 175 pl av transfektion suspensionen i var och en av de fyra 35 mm skålar ströks dagen innan, som nu innehåller celler vid 50-60% konfluens, och inkubera cellerna vid 37 ° C under 2 timmar.
5. Sug bort transfektionen mediet, tvätta med PBS och ersätta med 2 ml tillväxtmedium kompletterat med 2 mM _MgCl2 för att förhindra NMDA-receptorförmedlad excitotoxicitet ^9. Anmärkning: De celler kan användas för elektrofysiologiska inspelningar 24-48 h efter transfektion.

2. Elektrod Förberedelse

1. Generera 2 symmetriska inspelning pipetter genom att dra i borosilikatglas rör med en vertikal avdragare. Baserat på storleken och geometrin hos den resulterande spets, ytterligare formpipettermed hjälp av en polermaskin. OBS: Spetsen storlek kan utvärderas visuellt och elektriskt. Visuellt bör ytterdiametern vara i 1,4 till 5,6 | im intervallet. Elektriskt, en optimal storlek spets, när den är fylld med extracellulär lösning bör producera resistanser i 12-24 Mohm intervallet (se Figur 2B).
2. Använd en pipett lösning, som för cell bifogade experiment representerar den extracellulära miljön som kommer att ge maximal kanalaktivitet och höga ström amplituder. Anm: NMDA-receptorer, motsvarar detta en lösning innehållande mättande koncentrationer av agonister (glutamat och glycin), 1 mM EDTA, som kelaterar divalenta katjoniska inhibitorer och blockerare och har fysiologiska koncentrationer av natrium (150 mM) som enda permeant jon ( i mM: ett glutamat, 0,1 glycin, 150 NaCl, 2,5 KCl, 1 EDTA och 10 HEPBS, buffrad vid pH 8,0 med 1 N NaOH).

3. Cell-ansluten Patch-clamp inspelning

1. Öppen QUB datainsamling software (www.qub.buffalo.edu), och välj förvärvs fönstret under "layout". Öppna en ny QUB datafil (QDF) genom att klicka på "Ny data" under rullgardinsmenyn med rubriken "Arkiv" och skriv in följande initiala parametrar: samplingsfrekvens, 40 kHz; A / D-skalning, 3.000; utgångskanal, en; och A / D-datastorlek, 2. Justera amplituden skalning till 0,1 V / pA genom att högerklicka på datafilen, välja egenskaper, och klicka på fliken "uppgifter". Notera: Dessa parametrar kan förfinas för varje inställning med en modell-cell i cell bifogade läge. Ytterligare instruktioner om datainsamling med QUB programvara och QDF egenskaper är online på www.qub.buffalo.edu.
2. Välj en 35 mm skål innehållande jonkanal-uttryckande celler och ersätta tillväxtmedium med 2 ml PBS innehållande kalcium och magnesium; montera skålen på mikroskop scenen och fokusera på den cellulära området med hjälp av faskontrastmikroskopi för att utvärdera att cellerna är friska och väl fäst till skåleni monoskikt mode (Figur 1A). Växla till fluorescensdetektering för att verifiera att transfektion var framgångsrik (Figur 1B). Notera: De olika fluorescensintensiteter kan användas som en rå mått på proteinuttryck.
3. För en kanal inspelning, ställ in förstärkarens utgångsförstärkning till x10, patch-konfiguration för att β = 1, analogt filter till 10 kHz, mode till spänning-klämma och pålagd spänning till +100 mV. Med spännings innehavet kommandot i läget väljer du "sigill test"-knappen.
4. Baserat på fluorescens-och cell hälsa, väljer en cell att lappa. Verifiera enligt faskontrast att cellen är väl fäst vid skålen, har en stor del av cellytan exponeras för lappning, och annars ser friska. Notera: Behåll faskontrast belysning för att undvika blekning cellen under inflygningen och patch-fastspänning.
5. Fyll en färskt polerad pipett med bara tillräckligt med lösning så att den kommer i kontakt med den Electrode och skaka försiktigt för att få bort luftbubblor som kan ha fastnat i dricks. Säkra inspelningen pipetten på förstärkaren huvudsteg genom att dra åt tätningsskruven på pipetten hållaren och se till att silvertråden är nedsänkt i pipetten lösningen.
6. Med hjälp av en liten (5 cc) plastspruta, vilken är ansluten till pipetten hållaren genom slangar, försiktigt på positivt tryck för att förhindra föroreningar från att komma in och täpper till spetsen under inflygningen (Figur 2A).
7. Använda mikromanipulator, rikta pipetten in i badet och placera den direkt över cell som valts för lappning (Figur 1C), stänga den elektriska kretsen. Ta del av oscilloskopet där man beskriver en rektangulär vågform som motsvarar förstärkarens sigill testsignal (Figur 2B). OBS: Vid inträde i badet, är pipetten motståndet inom det optimala intervallet 12-24 Mohm. För en 5 mV testsignal, den uppmätta ström rAnge motsvarar ~ 20-40 pA.
8. Under övervakning pipett läge visuellt genom mikroskopet och pipetten motstånd elektriskt på oscilloskopet, fortsätta inflygningen i små steg tills pipetten inkräktar försiktigt på cellen, och testsignalen minskar något för att indikera ökad resistens (Figur 2B).
9. För att bilda en tätning, ta upp sprutan och anbringa ett lätt negativt tryck genom sidoslangen genom att dra ut sprutkolven, som drar det cellulära membranet in i spetsen hos lagrings-pipett och initierar bildandet av en GΩ motstånd tätning ^10. Ta del av testsignalen vågform på oscilloskopet, där tätningsbildning indikeras av sin fullständiga plattning, med endast kapacitiva transienter synliga (Figur 2B). Obs: Om signalen inte plattar helt eller baslinjen blir högljudd, indikerar detta en svag tätning med betydande ström läcka runt tätningen. Detta kommer att förhindra resolving en kanalströmmarna. Om så är fallet, ta ut pipetten ur cellen och bort från badet, ta bort den från huvudet scenen och kassera den. Upprepa processen med en nyligen polerad pipett tills erhålla en tätning i tillfredsställande urval (≥ 1 GΩ).
10. På förstärkaren, koppla den externa kommando växla från "säl-test 'på' av '; växla kommandospänningen som håller till positiv (som tidigare var inställd på 'av'); och öka vinsten till x100. Observera oscilloskopet för kanalverksamhet, som, om den finns, kommer att visas som kvadrat uppåt omläggningar från tidigare platta baslinjen (figur 2C).
11. Om kanal aktivitet visas på oscilloskopet, förvärva data i tidigare öppnade digital fil i QUB, genom att trycka på "play"-knappen följt av "rekord"-knappen. För att stoppa skaffa uppgifter, tryck på stoppknappen i QUB, och spara QDF filen till en lätt retrievkunna plats på datorns hårddisk genom att välja "Spara data som ..." i rullgardinsmenyn med rubriken "Arkiv".

4. Data förbehandlingen och Idealisering

OBS: Viktig information kan extraheras från enstaka kanalinspelningar av statistiska analyser som tilldelar varje datapunkt till en lämplig konduktans klass (i det enklaste fallet, öppen eller sluten). Denna process kallas uppgifter idealisering och en kort beskrivning av uppgifter idealisering med segment k organet (SKM) metod ¹¹ i QUB beskrivs nedan.

1. Öppna datafilen i QUB, och visa de aktuella spåren i "Pre-gränssnitt under" layout ". Visa den inspelade filen ofiltrerade (ta bort digitalt filter) genom att avmarkera rutan "Fc."
2. Skanna Visuellt rekordet att upptäcka oegentligheter och artefakter (Figur 4A). Rätta korta strömspikar som yrkesr inom spår (Figur 4A) genom att välja en intilliggande ren region i samma konduktans klass, belyser denna region, högerklicka och välja "set raderbufferten." Zooma in på spiken tills enskilda provpunkterna är synliga väljer du den region som ska bytas ut och radera genom att markera endast denna region och sedan högerklicka på "Radera".
3. Definiera noll nuvarande baslinjen för hela posten genom att välja en tidig del av posten där baslinjen är stabil, markera, högerklicka och välj "set baseline". Kontrollera att den riktlinje som visas exakt representerar utgångsnivån (lila i figur 4B)
4. Identifiera punkter i posten där det rådata baslinjen avviker märkbart från den inställda baslinjen. Korrigera detta genom att välja en mindre del av utgångsvärdet inom det avvikande området, högerklicka och välj "Lägg till en baslinje nod"-kommandot.
5. Identifiera regioner av than inspelningen innehåller onödigt buller eller artefakter som inte enkelt kan korrigeras (Figur 4C). Markera det område som ska kasseras, högerklicka och välj "Ta bort". OBS: I detta fall kinetisk information förloras: den bearbetade posten blir kortare och de punkter som inträffar efter skarvpunkten ser ut att vara kontinuerlig med den pre-brus-regionen.
6. Att idealisera poster med hjälp av SKM algoritmen ^11, markera en del av spåret som innehåller både öppna och slutna händelser och ange "Mod" gränssnitt under "Layout". I den "modell"-panelen, markera en ren del av spår som är representativ för baslinjen genom hela filen, högerklicka på den svarta fyrkanten (stängt läge) och välj "ta tag". Gör samma sak för kanalöppningar genom att lyfta fram det öppna konduktans, högerklicka på den röda torget i "modell"-panelen och välj "ta tag".
7. Utför idealizaning för hela posten genom att välja "File"-knappen under "datakälla." Högerklicka på "idealisera" fliken under "Modeling" avsnitt för att kontrollera att de önskade parametrarna för analys är korrekt, och klicka sedan på "Kör". Resultatet av idealisering, tillsammans med amplitud histogram för hela filen, överdras med data för att möjliggöra visuell inspektion av idealisering (Figur 5). OBS: Otillräcklig idealisering kan leda till uppkomsten av falska händelser, "där QUB upptäcker kanal och nedlagda som egentligen inte förekomma. Inom inspelningsupplösning, som sätts av förstärkarens analoga filter och samplingsfrekvens, kan den upplösning med vilken SKM upptäcker öppna och slutna händelser styras genom att en dödtid för analyserna. Optimala döda tider måste väljas genom försök och misstag och beror på samplingshastighet är dock en bra tumregelför att välja en dödtid som är 2-3 prov ^12.
8. För att verifiera att den idealise representerar exakt rådata, scanna den idealiserade spår manuellt. Vid identifiering av fel i idealisering, markera spår över den falska händelsen, högerklicka och välj "Gå Idl." Obs: För fler möjligheter och en utförlig förklaring av olika kommandon och funktioner i QUB, rådfråga QUB Manual nätet (www.qub.buffalo.edu).

Representative Results

Rekombinant NMDA-receptorer

NMDA-receptorer binder och svara på den åtföljande handlingen av två co-agonister: glutamat och glycin. De monterar som heterotetramerer av två glycin bindande GluN1 subenheter och två glutamat bindande GluN2 subenheter. GluN2 subenheter kodas av fyra gener (AD) och av dessa de mest transkriberade former i hjärnan är GluN2A i vuxen och GluN2B hos unga djur. På grund av mångfalden av NMDA-receptor subtyper hos infödda beredningar, som uttrycker receptorer i HEK293-celler (Figur 1A) möjliggör styrning av subenheten sammansättning, samt möjlighet att spela in ström från kanaler med hjälp av ett fint polerat glas pipett (Figur 1C).

När pipetten kommer i kontakt med cellen, en tydlig minskning av amplituden för provpulsen vågformen inträffar (figur 2B), vilket indikerar förmågan att bilda en tätning. En adekvat tätning som innehåller enkanal ger tydlig kanal aktivitet, visas som nedåtgående omläggningar från baslinjen, med en bra signalbrusförhållande på ansökan av en positiv spänning (figur 2C). Maximal kanal aktivitet för vildtyp rekombinant NMDA-receptorer kan uppnås när båda agonister är närvarande i höga koncentrationer, och när hämmare och kanalblockerare är frånvarande. Detta är idealiskt, så att när ett plåster innehåller mer än en kanal, samtidiga öppningar är omedelbart uppenbara ¹³ (figur 3B). För proteiner med mycket låg aktivitetsnivå, kan sannolikheten för att en sträcka av en nivåöppningar kommer från endast en kanal beräknas om kanalen öppen sannolikheten är känd eller kan approximeras ^14. På grund av detta kan längre observationsperioder är nödvändig.

Under dessa betingelser, och vid tillämpning av en pipett holdingpotential av 100 mV (vilket leder till en ungefärlig membranpotential av -120 mV), siOPIC rekombinant GluN1/GluN2A och GluN1/GluN2B är öppna med hög sannolikhet (P _o, 0,3-0,5) till en relativt hög ledningsförmåga nivå (> 50 pS) (Figur 3A och 5B) ^15-17. När du spelar in, kan strömbrusspikar, baslinjen drivor, eller perioder av kraftigt buller manifestera (Figur 4A-C), men som sagt, dessa kan korrigeras om kort och moll. Det är dock viktigt att kanal aktivitet spelas in utan avbrott för en tillräckligt lång tid (≥ 10 min, 10000 händelser) för att garantera att den fulla bredden av kanal beteenden fångas.

Resultatet av sådana inspelningar kan ge information om både kanal kinetik och trängnings egenskaper. Här visar vi idealisering utföras genom QUB använder SKM algoritm (fig. 5A), men data som idealisering kan utföras med användning av andra mjukvaruprogram såsom pCLAMP eller SCAN ^12, ennd kan utföras med hjälp av olika algoritmer eller kriterier, såsom halv tröskelmetoden, med var och en av dessa alternativ som innehåller sina egna fördelar och nackdelar. Montering av dessa data till kinetiska modeller kan utföras i syfte att få ökad insikt i de beteenden av jonkanaler. Maximal sannolikhet montering kan utföras med program som QUB eller HJCFIT ^18, där de algoritmer som används av varje program har sina egna fördelar. Medan den idealisering visas i figur 5 endast kräver enklast möjliga modell av ett stängt tillstånd och ett öppet tillstånd som skall utföras, att montera en fullständig kinetisk modell för en jonkanal kräver sekventiellt addera slutna och öppna tillstånd tills ett visst kriterium uppnås. Denna process har visat att vildtyp GluN1/GluN2A receptorer har fem kinetiskt distinkt slutna stater och 03:58 kinetiskt distinkta öppna stater (figur 5C) ^19, i vilka dessagrind egenskaper är avgörande för att bestämma formen av den NMDA-receptorförmedlad synaptisk signal ^{20, 21.} Denna typ av analys kan utökas till andra jonkanaler av mindre konduktans, såsom AMPA-receptorer, för att få insikt i sina egna distinkta grindmekanismer ^22,23,24. En varning är dock, eftersom AMPA-receptorer har flera konduktans nivåer, framgångsrik idealisering med hjälp QUB kan kräva ytterligare stater införlivas i en färdiga modellen.

Dessa metoder kan också utvidgas till att få information om jonkanal permeation och konduktans genom att förändra genomträngande jon kompositionen och / eller koncentration. Inspelning aktivitet genom enstaka GluN1/GluN2A receptorer med användning av de metoder som beskrivs här, men genom att ersätta 150 mM NaCl med 75 mM _CaCl2 i inspelnings pipett ger strömmar med ~ 20% av konduktansen (~ 10 pS). Detta visar att medan kalcium genomsyrar NMDA-receptorer på hiGH-nivåer i fysiologiska betingelser, det faktiskt korsar kanalen långsammare än natriumjoner, vilket indikerar att det kan finnas en potentiell kalciumbindningsställe inom genomträngningsreaktionsvägen. Dessutom trots detta små konduktans, inspelningarna kan adekvat idealiserad använder SKM algoritmen i QUB, avslöja förekomsten av en mellanliggande undernivå konduktans, vilket är ca 50% den aktuella amplituden hos huvud konduktans nivå (fig. 6A och B). Dessa Sublevel öppningar kan emellertid endast idealiseras i QUB när ytterligare en konduktans klass är inkorporerad i den initiala kinetiska modellen. Ytterligare kinetiska analyser visade att, under dessa förhållanden, receptorer fortfarande uppvisar fem kinetiskt distinkt slutna stater, men dessa stater har extremt olika tidskonstanter och occupancies jämfört med när kanalen passerar endast natriumjoner (figur 6C). Dessutom är bara två öppna stater observerade under dessa förhållanden visar att, förutom att påverka kanal konduktans, kalciumjoner kan modulera receptor gating.

Det finns inget säkert sätt att få bara en kanal fläckar. Istället kan ett flertal experimentella manipulationer bidra till att öka sannolikheten för framgång. Först, sikta på låg nivå på kanaluttryck genom att utvärdera fluorescensintensiteten hos de transfekterade cellerna (figur 1B). Framgångsrika metoder kan vara att minska den totala mängden av cDNA används för transfektion eller för att minska mängden cDNA för en krävs subenhet, som är GluN1; för att minska tiden för inkubation med DNA / kalciumfosfatfällning; och för att välja för lappning endast svagt fluorescerande celler från synfältet. Dessa metoder bör fortsätta om de patchar som erhålls innehåller ofta flera kanaler. Dessutom ökar storleken av pipettspetsen kan också bidra till att fånga endast en kanal i patctim. I slutändan dock, blir man lyckas få en kanals fläckar genom att systematiskt avstå från inspelning under långa perioder från fläckar som tydligt innehåller mer än en kanal.

Rekombinanta PIEZO1 Kanaler

De metoder som beskrivs i detta protokoll kan lätt tillämpas på alla ligand gated jonkanaler, och faktiskt kan anpassas för att spela in en kanal aktivitet från någon jonkanal, oavsett aktiveras av kemikalier, spänning, kraft, temperatur, eller på annat sätt. Ett exempel på hur detta protokoll kan anpassas för att spela in en kanal strömmar från andra joner kanaler, speciellt mus PIEZO1, en ​​mechanosensitive jonkanal, presenteras nedan (Figur 7) ^{25, 26.}

Såsom med de NMDA-receptorkanaler är PIEZO1 och GFP uttrycktes i HEK293-celler genom kalciumfosfat-medierad transfektion och celler används 24 till 48 h efter transfektion såsombeskrivs i avsnitt 1.2. Eftersom PIEZO1 aktiveras av membran sträcka, bör försiktighet iakttas för att manipulera membranet försiktigt under patch bildning och lämpliga hjälpmedel för dosering och styrning av den mekaniska kraft som anbringas ska vara tillgängliga. Dessa betingelser kan uppnås genom att göra större inspelningspipetter, med motstånd i 2-3 Mohm intervall och med användning av ett tryckklämanordning (HSPC) med hög hastighet som är ansluten till inspelnings pipett genom pipetten hållaren på förstärkaren huvudsteg. Inställningarna förstärkare liknar dem som beskrivs för NMDA-receptorer i avsnitt 3.3, med undantag för inkoppling av "externa" kommandoratten så att förstärkaren kan styras genom förvärvet programvara.

För att spela in aktiviteten från PIEZO1, använd en inspelning pipett fylld med (i mm): 130 NaCl, 5 KCl, 10 HEPES, 1 _CaCl2, 1 _MgCl2, 10 TEA-Cl, pH 7,3 med NaOH. Under dessa förhållanden kan öppningar övervakas som jagnward natriumströmmar, som kommer att visas på oscilloskopet som nedåtgående omläggningar från noll ström baslinje. Placera inspelnings pipetten på förstärkaren huvudet scenen och se till att ratten på HSPC är på noll. Innan man går in i badet, gäller 3-5 mmHg av övertryck. Använda mikromanipulator, sänk pipetten i badet, kontrollera om önskad pipett motstånd, och föra pipetten i nära anslutning till den valda cellen som beskrivs i avsnitt 3.6. Rör försiktigt cellen under mikroskop vägledning och genom att övervaka oscilloskop, observera en liten minskning av amplituden av tätningen testvågform på ett liknande sätt som görs för NMDA-receptorer (avsnitt 3.7). Snabbt på övertryck appliceras genom pipetten genom att ändra tryckhållning nivån från 3-5 till 0 mmHg. Vänta en GΩ tätning för att bilda genom att övervaka förseglingen prov vågform. I detta fall finns inget negativt tryck som appliceras för att bilda en tätning. När en optimal tätning erhålls tryck &# 8216;. Rekord "-knappen i QUB att börja skaffa uppgifter Figur 7 visar ett representativt spår av mPIEZO1 enkanaliga strömmar som aktiveras genom att tillämpa -20 mmHg tryck på plåstret pipetten. Dessa strömningar var lågpassfiltrerad vid 2 kHz och samplas i 20 kHz.

I motsats till ligand-gated kanaler med extracellulära ligandbindande domäner kan stimulus aktiverande mechanosensitive kanaler varieras i enlighet med två protokoll. Den första är "gap-fri," där ett konstant negativt tryck appliceras på plåstret för hela inspelningstiden. Detta protokoll är användbart få minuter långa inspelningar och är mest framgångsrika med mindre tryckstimuli (0-20 mmHg), vilket bevarar membranintegritet. Aktivitet produceras av högt tryck, vilket sannolikt kommer att brista membranet, är bäst erhålls med "episodiska" inspelningar, där pulser av varierande tryck kan appliceras på plåstret under kortare tidsperioder (<strong> Figur 7). Som med ligand gated kanaler, inspelningar från cell fäst en kanal patchar ger en mängd information om både konduktans och grind egenskaperna för kanalen under utredning.

Neuronal NMDA-receptorer

Den metod som beskrivs här för cell-anslutna en-kanalsinspelning kan användas för att få information om ledningsförmågan och grind egenskaper kanaler endogena till en viss celltyp och / eller utvecklingsstadiet. Som är fallet med många andra heteromera kanaler, är den exakta molekylära sammansättningen av inhemska NMDA-receptorer inte känd. Genom att jämföra resultaten från rekombinanta receptorer av känd sammansättning med de som erhållits från infödda förberedelser, hypoteser om subenheten sammansättning och funktion av kanaler i sin ursprungliga miljö kan formuleras eller testat ^17.

Neuroner isolerades från prefrontalcortex av råttembryon och odlas i kultur i upp till 6 veckor ^17. Förutom komponenter som beskrivs för rekombinanta NMDA-receptor inspelningar i avsnitt 2.2, pipetten lösningen innehöll också CNQX (20 M) och bikukullin (10 ^ M) för att hämma infödda AMPA-och GABA-receptorer, respektive. Beroende på ålder av kulturen, de poster som erhålls från inhemska NMDA-receptorer visade kinetik som var helt annorlunda. Inspelningar från början (Figur 8A, 5 dagar in vitro) kultur mer liknar kinetik beskrivna för GluN1/GluN2B receptorer och inspelningar från slutet (Figur 8B, 27 dagar in vitro) kulturer liknar närmare kinetik beskrivna för GluN1/GluN2A receptorer (fig. 3A och 5A). Denna observation är förenlig med mönster av NMDA-receptoruttryck isoformer och med noggranna beskrivningar av strömmarna som spelats in från cell fäst en-kana fläckar i höftenpocampal kulturer ^16.

Figur 1. Välja en HEK293 cell för cell bifogade inspelning. A) HEK293 celler odlade i en 35 mm maträtt placeras på mikroskop scenen och visade med fas kontrast på 40X förstoring. B) GFP fluorescens från samma synfält som i panel A identifierar transfekterade celler. Pilen visar en cell som uttrycker GFP, verkar frisk, och är i ett läge mottaglig för pipett åtkomst. C) Inspelnings pipetten förs i nära anslutning till den markerade cellen med hjälp av en fin rörelse manipulator under visuell vägledning. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 2. Cell bifogad tätningsbildning. A) En liten spruta som är ansluten till den sida av pipetten hållaren tillåter manuell styrning av trycket i pipetten. B) den ström som passerar genom pipetten nedsänkas i badlösningen som svar till förstärkaren test, som på 5 mV (0,5 kHz) är 18 pA, och motsvarar en pipett storlek på 28 Mohm. Efter att röra cellen (vänsterpil), nivån på det aktuella priset minskar, tyder på ökad pipett motstånd. Tillämpa undertryck genom pipetten (högerpil) initierar tätningsbildning och minskar signalen som produceras av testpulsen till endast kapacitiva transienter. C) Frånvarande en testpuls, och om ingen spänning appliceras genom pipetten (0 V), baslinjen är stabil (till vänster om pilen). Tillämpa positiv spänning (pil, +100 mV) pr oduces stokastiska enhetliga strömningar som visar kanalöppningar. Röd streckad linje indikerar noll nuvarande baslinjen.

. Figur 3 Cell bifogade strömmar inspelade från GluN1/GluN2A receptorer A) En-kanals patch:. A 50 sek segment av kontinuerlig inspelning visar kanalöppningar till en enda enhetlig amplitud B) Flera kanaler patch:. A 50 sek segment av kontinuerlig inspelning illustrerar kanal öppningar till två amplitudnivåer indikerar att plåstret innehåller minst 2 aktiva kanaler. Röd streckad linje visar noll nuvarande grund. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

">
Figur 4. Databehandling. A) Korrigering för bullertoppar. Visa data ofiltrerat och manuellt ersätta den främmande signalen (röd) med utgångssignalen. Utökad vy illustrerar en spik innan (mitten) och efter (undre) spetsen (röd) ersattes med baslinjen signal. B) Korrigering för baslinjedrift. Tidigt i posten väljer du ett litet segment av baslinjen och ange det som noll nuvarande nivån för hela posten (lila linje). Korrekt baslinjedrift genom att välja en liten del av drev baslinje (pil) och lägga till en baslinje nod (lila cirkel). C) Längre perioder av rekordet med bullrig baslinjen (röd) som är svåra att rätta till kan tas bort. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Dataidealisering. A) Figur 5. Nuvarande spår (svart) registrerades från en GluN1/GluN2A receptor passerar enbart natriumjoner med cell bifogade patch-clamp teknik. Idealiserade datapunkter (röd) illustreras för en 30 sek en kanal segment. Dessa överlappar väl, vilket indikerar att den idealisering är korrekt. B) Histogram av nuvarande amplituder illustrerar en fördelning som är väl beskrivet av endast två Gaussiska funktioner med toppar vid noll (0,02 ± 0,8 Pa) indikativ för slutna händelser kanal och vid 10,3 ± 1,3 pA tecken på endast en typ av öppna kanalhändelser under hela inspelningstiden (130 min). C) Stängd (vänster) och öppna (höger) Väntetid histogram för hela inspelningen visas i (A). Den sannoliktetstäthetsfunktion för histogrammen (tjocka linjer) och individuella kinetiska komponenter (tunna linjer) är överlagrade och beräknades genom anpassning av data till en modell som innehåller fem slutna stater och tre öppna stater. Infällningar tillhandahålla tidskonstant (τ) och relativa arean (A) för var och en av de individuella kinetiska komponenter.

Figur 6. Kalcium strömmar genom enstaka NMDA-receptorer. A) strömspår (svart) registrerades från en GluN1/GluN2A receptor passerar enbart kalciumjoner med cell bifogade patch-clamp teknik. Idealiserade datapunkter (röd) visas i 30 sekunder segmentet. B) Histogram av nuvarande amplituder visar en fördelning som väl beskrivs av tre Gaussiska funktioner med toppar på noll (0 ± 0,3 pA), tyder på närad kanalhändelser, 1,3 ± 0,4 pA tecken på öppna kanalhändelser till en undernivå konduktans, och 2,1 ± 0,3, tyder på öppna kanalhändelser till huvud konduktans nivån. C) Stängd (vänster), huvud konduktans nivån öppet tillstånd (mitten) och undernivå konduktans öppet tillstånd (höger) Väntetid histogram för hela inspelningen visas i (A). Den sannolikhetstäthetsfunktionen för histogrammen (tjocka linjer) och individuella kinetiska komponenter (tunna linjer) är överlagrade och beräknades genom anpassning av data till en modell som innehåller fem slutna stater, två öppna stater konduktans nivå och en undernivå konduktans öppet tillstånd. Infällningar tillhandahålla tidskonstant (τ) och relativa arean (A) för var och en av de individuella kinetiska komponenter.

Figur 7. Cell fäst en kanal inspelningfrån mPIEZO1 uttryckt i HEK293-celler. aktivitet framkallas genom att applicera -20 mmHg tryck med en HSPC enhet genom plåstret pipetten, under ständig tillämpning av spänning (+80 mV). Röd streckad linje indikerar noll nuvarande nivå.

Figur 8. Cell fäst en kanal inspelning från nativa kanaler. Pipetten anslöts till soma av en neuron som dissocieras från prefrontala cortex av en råttembryo och upprätthölls i odling under 5 dagar (A) eller 27 dagar (B) . Kontinuerlig NMDA-receptoraktivitet registrerades med pipett lösningar innehållande glutamat (1 mM) och glycin (0,1 mM), och även CNQX (20 pM) och bikukullin (10 ^ M) för att hämma nativa AMPA-och GABA-receptorer, respektive. Aktivitet framkallades genom att applicera 100 mV through inspelnings pipett. Röd streckad linje indikerar noll nuvarande nivå.

Discussion

I jonkanalen fältet, är ett viktigt forskningsområde tillägnad förstå händelseförlopp som leder till kanalöppningen eller kanalens slussmekanismen. För de flesta kanaler, är processen komplex och involverar flera kinetiska steg som inte kan härledas från en makroskopisk flerkanalig signal. Däremot kan experiment utformas där observera sekvensen av öppna / stängda händelser i en kanal rekord kan producera mer detaljerad information om slussmekanismer. I de metoder som beskrivs här, gör det externt belägna ligandbindningsdomänen besatt av NMDA-receptorer för minimalt invasiva patch-clamp inspelningar som ska utföras under konstanta förhållanden. Detta protokoll kan behöva anpassas för att vara lämpliga för att undersöka andra ligand gated jonkanaler beroende på både ligand och receptor egenskaper.

Rekord av en kanal aktivitet ger två typer av värdefull information. Försteftersom det enhetliga strömamplituden kan mätas direkt, kan experiment utformas för att få information om por egenskaper såsom kanal konduktans, permeabilitet och selektivitet. För det andra, eftersom varaktigheten av öppna och slutna händelser kan också mätas direkt från skivan, experiment kan utformas för att uppnå kinetisk information om slussning och därmed dra slutsatser om det operativa system för kanalen. För båda typerna av experiment, kräver meningsfull statistisk analys binning varje enskild punkt från det aktuella spåret till en specifik konduktans klass. Presenteras här var en sådan metod att göra detta, med hjälp av segment k-medel (SKM) ¹¹ algoritm, men detta kan åstadkommas genom ett flertal mer eller mindre sofistikerade algoritmer inklusive halv tröskel, SCAN ^12, Baum-Welch, Viterbi, etc.

Inspelningar med hjälp av cell bifogade konfiguration är kraftfulla i att jonkanaler bevaras i biologiskmembran med ostörda intracellulära miljöer. På grund av detta är det viktigt att membrantätningar är tillräckligt bildas och bevaras under hela inspelningen för två ändamål: 1) experimentell kontinuitet och 2) att upprätthålla en positiv signal-till-brus-förhållande (topp till topp baslinjen buller <2 pA). Storleken och formen av pipettspetsen genereras bestämmer sannolikheten av en framgångsrik membrantätning, som innehåller exakt en kanal. En platt spets garanterar att när pipetten närmar sig cellens det kommer att beröra och tryck på cellmembranet med hela spetsytan på en gång, vilket hjälper för att försegla jämnt på cellen. En pipett med ett tips som är för stort kommer att vara mindre sannolikt att resultera i en kanal fläckar; däremot vid dragning av en pipett med en spets som är för smal resulterar i en omega-formad membran slinga som kan täta vid basen och täppa till pipetten ^10.

En positiv signal till brusförhållandet kan hanteras genom att minimera källor till elektriskabrus. Den huvudsteg kylningsfunktionen på Axopatch 200B har gjort för optimal signal upplösning; men buller kan fortfarande tillverkas av någon av instrument inblandade i elektrofysiologi inrättas, samt externa källor såsom ljus och orelaterade elektronik. Lyckligtvis kan flera strategier skall genomföras för att minimera buller till en önskad nivå ^{2, 27.} Kortfattat, se till att delar av utrustning som kan producera ljud är jordade till en enda punkt i installationen. När man gör detta är det viktigt att förhindra bildning av jordslingor, som kommer att orsaka betydande störningar. Dessutom, om 60 cykel buller förekommer, se till att stänga av alla lampor som kan störa inspelningen signalen. Slutligen kommer placera en Faradays bur runt inspelningsapparaten hindra närliggande hinder från att orsaka elektriska störningar.

Observation av en kanal för en lång tid har visat att grindkonformationella förändringar kan ske över ett brett intervall av tidsskalor. Tidsmässigt är patch-clamp uppgifter begränsad vid den "korta-änden av bandbredden hos förstärkaren och den hastighet med vilken den förstärkta signalen digitaliseras och vid den" lång-änden av observationsfönstret. För konformationsförändringar som är snabbare än den låga gränsen, kan patch-clamp inspelningar endast erbjuda information när den kombineras med kompletterande experimentella metoder. För konformationsförändringar som sker med mycket låga hastigheter, och därmed samplas sällan, kan man öka antalet observationer eller öka längden på posten, men det kanske inte alltid är möjligt.

Trots dessa begränsningar, patch-clamp uppgifter, särskilt när de från en enskild kanal, innehåller ofta mer information än omedelbart utdrag med nuvarande beräkningsmetoder. Därför är förhoppningen att framtida ökningar av beräkningskapacitet och i Sophistication av analysalgoritmer kommer att göra eventuella ytterligare applikationer. Vid tillkomsten av sådana framsteg, kan man förutse att patch-clamp inspelningar från enstaka kanaler kanske kan ske samtidigt med FRET mätningar, kalcium avbildning eller till in vivo-förberedelser för att ge ytterligare information om struktur, funktion och dynamik jonkanaler i både inhemska och kontrollerade miljöer.

Eftersom mångfalden av jonkanaler undersökta ökar, detaljerad förståelse av deras grindmekanismer och i slutändan förstå hur deras verksamhet bidrar till deras unika biologiska funktioner kommer att gynnas enda molekyl observationer. Särskilt uppgifter som erhållits med en-kanals patch-clamp lovar att informera om enhetliga konduktans egenskaper och grindsekvenser för rekombinanta och inhemska kanaler.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals	Sigma	Various
Borosillicate Glass	Sutter	BF-150-86-10
Bright field inverted microscope	Olympus	1x51	Nikon also has similar microscopes
Fluroescent box	X-cite	Series 120
Liquid Light Guide	X-cite	OEX-LG15
Micromanipulator	Sutter Instruments	MP-225
Oscilloscope	Tektronix	TDS1001
Amplifier	Molecular Devices	Axon Axopatch 200B
Table	TMC	63561
NIDAQ card	National Instruments	776844-01
Puller	Narishige	PC-10
Polisher	Narishige	Microforge MF-830
Faraday Cage	TMC	8133306
High Speed Pressure Clamp	ALA Scientific Instruments	ALA HSPC
Pressue/Vaccuum Pump	ALA Scientific Instruments	ALA PV-PUMP	For HSPC-1