Én-kanals Cell-attached Patch-clamp optagelse

Summary

Beskrevet her er en procedure for at opnå lange strækninger af aktuelle optagelse fra en ion-kanal med celle-attached patch-clamp teknik. Denne metode giver mulighed for at observere, i realtid, mønsteret for open-close kanal konformationer, der ligger til grund for biologisk signal. Disse data informere om kanal ejendomme i uforstyrrede biologiske membraner.

Abstract

Ionkanalproteiner er universelle udstyr til hurtig kommunikation på tværs af biologiske membraner. Den tidsmæssige underskrift ioniske flux de genererer, afhænger af egenskaber iboende hver kanal protein samt den mekanisme, hvormed det er genereret og kontrolleres og repræsenterer et vigtigt område af den aktuelle forskning. Information om de operationelle dynamik ionkanalproteiner kan opnås ved at observere lange strækninger af strøm produceret af et enkelt molekyle. Beskrevet her er en protokol for at opnå en-kanals celle-attached patch-clamp aktuelle optagelser til en ligand ionkanal, NMDA-receptoren, udtrykt heterologt i HEK293-celler eller indbygget i corticalneuroner. Også er vejledning i at tilpasse metoden til andre ionkanaler af interesse ved at præsentere eksemplet med mekanisk-følsomme kanal PIEZO1. Denne metode kan give data om kanalens ledningsevne egenskaber og den tidsmæssige rækkefølge af OPEn-lukkede konformationer, der udgør kanalens aktivering mekanisme, og dermed hjælpe til at forstå deres funktioner i sundhed og sygdom.

Introduction

Hurtig kommunikation på tværs af biologiske membraner bygger næsten udelukkende på oligomere poredannende membranproteiner, der almindeligvis omtales som kanaler. Disse proteiner er meget forskellige i aktivering signaler, gating mekanismer og ledningsevne egenskaber. Kanal proteiner, hvis porer er selektiv for ioner er klassificeret som ionkanaler; deres aktivering producerer ionstrømme over membranen, og deres svar kan optages med høj opløsning i realtid ved hjælp elektrofysiologiske teknikker. Signalerne aktivering spænde en bred vifte af kemiske og fysiske input herunder koncentrationsgradienter, mekaniske og elektriske kræfter og temperatur; således yderligere klassificere ionkanaler i ligand gated, mekanosensitive, spænding gated, eller varmefølsomme typer. I denne artikel, protokoller beskrevet til at optage én kanal aktivitet fra en ligand gated kanal, NMDA-receptoren, og en mekanosensitive kanal, PIEZO1, ved hjælp af patch-clamp teknik.0;

Patch-clamp elektrofysiologi er den første og mest udbredte eksperimentelle metode tilstrækkeligt følsomme til at tillade observation af enkelte molekyler ^{1, 2.} Ud over denne udsøgte følsomhed, er det langt udvidet biologiske præparater kan underkastes elektrofysiologiske optagelse og har også tilladt observation af ionkanaler i intakte membraner. Først, fordi både spændingsfikseringsenheden og aktuelle optagelse opnås med den samme elektrode, kan det bruges til at optage signaler tværs små celler eller membraner patches. Teknikken viste, at ion-kanaler, der ikke er begrænset til overgearet membraner af frøen muskler, ål electroplaques eller blæksprutte gigant axoner ^{3, 4,} men snarere, at de repræsenterer allestedsnærværende inventar af transmembrane signalering mekanismer og er uløseligt forbundet med alle cellulære membran typer af uni-eller flercellede organismer, og også til intracellulære membraner. Importantly, kapacitet til at optage transmembrane strømme ved blot at knytte et glas pipette til en intakt celle forudsat den enestående mulighed for at optage aktivitet fra ion-kanaler i deres oprindelige uafbrudt membraner. Således celle vedhæftet patch-clamp teknik, som er beskrevet i denne protokol, tillader overvågning af aktiviteten af ​​ionkanaler kontinuerligt for snesevis af min eller længere i deres oprindelige miljø.

Under normale termiske fluktuationer, alle proteiner, herunder ionkanalproteiner undergår strukturelle ændringer over en bred tidshorisont, med de hurtigste og mest hyppige omrokeringer repræsenteret mest sandsynligt ved side-chain bevægelser og meget langsommere, mindre hyppige ændringer repræsenteret ved repositionering af hele domæner eller underenheder, eller i nogle tilfælde ved post translationelle modifikationer eller protein-protein interaktioner ^{5, 6.} Observere lange perioder med aktivitet genereret af ét molekyle kan hjælpe med at forstå funknale dynamik ion-kanaler i intakte fysiologiske membraner og giver værdifulde oplysninger om den operationelle mekanisme af molekylet overholdes.

I modsætning til den voksende forståelse af mangfoldigheden i ionkanaler tværs celletyper og udviklingsstadier, viden om den molekylære sammensætning af ionkanaler i native membraner er stadig begrænset. Alle ionkanaler er multimere proteiner og størstedelen af ​​native ionkanaler samle fra flere typer af underenheder, der producerer proteiner af brede molekylære mangfoldighed, der ofte er ledsaget med forskellige ledningsevne og gating egenskaber. Af denne grund er ionkanaler definerede molekylære sammensætning undersøgt ved ekspression i heterologe systemer. Navnlig HEK293-celler, som er en klonal linje af immortaliserede humane embryonale nyreceller ^7, vundet udbredt accept som det foretrukne system til heterolog ekspression af rekombinante ionkanaler. Blandt mandeny fordele, forhøjede HEK293 celler som valget for ion-kanal elektrofysiologi er den lethed og overkommelige dyrkning og vedligeholdelse af langlivede stabile kulturer, deres evne til at udføre post-translationel foldning, forarbejdning og handel med proteiner fra pattedyr, og i mange tilfælde , deres lave niveau eller endda mangel på endogen udtryk for kanalen af interesse ^{7, 8.} Udtrykke rekombinante ionkanaler og studere deres funktionelle egenskaber i HEK293 celler fortsætter med at være en værdifuld metode til at få information om struktur-funktion egenskaber af ionkanaler samt de særlige egenskaber ionkanal isoformer og deres roller i native væv. De er beskrevet i denne artikel, protokoller kan anvendes lige godt rekombinante ionkanaler udtrykt i HEK293 celler og til at indfødte ionkanaler.

Sammenfattende til patch-clamp teknik, gennem sin enestående evne til at løse signals fra et molekyle er til dato den mest direkte metode til iagttagelse af opførslen af ​​enkelte molekyler. I sin celle-tilsluttet tilstand, patch-clamp optagelse giver mulighed for lange observationsperioder, der, når det gøres til et molekyle, kan yde ekstraordinær indsigt i driften af ​​ionkanaler. Nedenfor præsenteres en protokol for at opnå høj opløsning aktuelle optagelser fra celle vedhæftede plastre indeholdende en ion-kanal protein.

Protocol

1. Celledyrkning og Protein Expression

1. Oprethold HEK293-celler (ATCC CRL-1573) mellem passagerne 22 og 40, som indeholder passager udført af ATCC i monolagskultur i DMEM suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin / streptomycin blandingen ved 5% _CO2 og 37 ° C. Mellem eksperimenter passage celler i T25-flasker på 5-20 gange fortyndinger i et endeligt volumen på 10 ml. Bemærk: Brug af celler under disse passager garanterer gunstig celle sundhed, som vil give mulighed for optimal tætning dannelse og patch stabilitet.
2. For transfektion plade HEK293-celler i 35 mm skåle ved en densitet på ~ 10 ⁵ celler / skål, hvilket svarer til ~ 0,5-0,6 ml cellesuspension pr skålen og dyrke cellerne i 2 ml medium i 18-24 timer.
3. I en steril 1,5 ml centrifugeglas forberede transfektion blandingen i fire 35 mm-skåle ved at tilføje (i denne rækkefølge): (1) 1 ug af hver cDNA (GluN1, GluN2A og GFP); (2) 315 pidobbelt destilleret vand _(ddH2O); (3) 350 ul 42 mM 4 - (2-hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsyre (HEPES) og (4) 35 ul 2,5 M _CaCI2 dråbevis, der anvendes til at danne bundfald.
4. Vortexrøret i 5 sek, og der tilsættes 175 pi transfektion suspension i hver af de fire 35 mm skåle belagt dagen før, der nu indeholder celler ved 50-60% konfluens, og inkuberes cellerne ved 37 ° C i 2 timer.
5. Aspirer off transfektion medium, vaskes med PBS og erstatte med 2 ml vækstmedium suppleret med 2 mM _MgCI2 for at forhindre NMDA-receptormedieret excitotoksicitet ^9. Bemærk: Cellerne kan anvendes til elektrofysiologiske optagelser 24-48 timer efter transfektion.

2.. Elektrode Forberedelse

1. Generere to symmetriske optagelse pipetter ved at trække borsilikat glasrør med en lodret aftrækker. Baseret på størrelsen og geometrien af ​​den resulterende spids, yderligere form pipetterved hjælp af en polermaskine. Bemærk: Spidsen størrelse kan vurderes visuelt og elektrisk. Visuelt bør den ydre diameter være i 1,4 til 5,6 um. Elektrisk, en optimal størrelse tip, når den er fyldt med ekstracellulære løsning, bør producere modstande i 12-24 MOhm rækkevidde (se figur 2B).
2. Brug en pipette løsning, som for celle vedhæftet eksperimenter repræsenterer den ekstracellulære miljø, der vil producere maksimal kanal aktivitet og høj nuværende amplituder. Bemærk: NMDA-receptorer, svarer dette til en opløsning indeholdende mættende koncentrationer af agonister (glutamat og glycin), 1 mM EDTA, som chelaterer divalente kationiske hæmmere og blokkere, og har fysiologiske koncentrationer af natrium (150 mM) som eneste permeerende ion ( i mM: 1 glutamat, 0,1 glycin, 150 NaCl, 2,5 KCI, 1 EDTA og 10 HEPBS, pufret ved pH 8,0 med 1 N NaOH).

3.. Celle-attached Patch-clamp optagelse

1. Åbent erhvervelse QUB data software (www.qub.buffalo.edu), og vælg vinduet erhvervelse under 'layout'. Åbn en ny QUB datafil (QDF) ved at klikke på 'nye data "under rullemenuen titlen' Filer 'og indtast følgende indledende parametre: samplingfrekvens 40 kHz; A / D-skalering, 3000; output kanaler, 1; og A / D-data størrelse, 2.. Juster amplitude skalering til 0,1 V / pA ved at højreklikke på datafilen, vælge egenskaber og klikke på fanen "data". Bemærk: Disse parametre kan raffineres for hver opsætning ved hjælp af en model-celle i celle-bundet tilstand. Yderligere instruktion om dataopsamling med QUB software og QDF egenskaber er online på www.qub.buffalo.edu.
2. Vælg en 35 mm skål indeholdende ionkanal-udtrykkende celler og erstatte vækstmedium med 2 ml PBS indeholdende calcium og magnesium; montere parabol på mikroskop scenen og fokusere på det cellulære felt ved hjælp fasekontrast mikroskopi til at vurdere, at cellerne er sunde og godt fastgjort til skåleni monolag måde (figur 1A). Skift til fluorescensdetektion at kontrollere, at transfektion var en succes (figur 1B). Bemærk: Rækken af ​​fluorescensintensiteter kan anvendes som en rå mål for proteinekspression.
3. For enkelt kanal optagelse, skal du indstille forstærkerens output gain til x10, patch-konfiguration til β = 1, analog filter til 10 kHz, tilstanden til spænding-clamp og anvendt spænding til +100 mV. Med spændingen bedriften kommando i OFF position, skal du vælge knappen 'sæl test ".
4. Baseret på fluorescens og celle sundhed, skal du vælge en celle for at lappe. Kontroller under fasekontrast, at cellen er godt fastgjort til skålen, har en stor del af celleoverfladen eksponeret til lapning og ellers ser sund. Bemærk: Oprethold fasekontrastbelysning at undgå blegning cellen i den tilgang og patch-fastspænding.
5. Fyld en frisk poleret pipette med lige nok løsning, så det kommer i kontakt med electrode og ryst forsigtigt for at fjerne luftbobler, der kan være fanget i spidsen. Fastgør optagelsen pipetten på forstærkeren hovedtrin ved at stramme tætningsskruen af ​​pipetten holderen og at sikre, at sølvtråd er nedsænket i pipette løsning.
6. Ved hjælp af en lille (5 cc) plastsprøjte, som er forbundet med pipetten holderen ved slanger, forsigtigt anvende positivt tryk for at forhindre urenheder i at komme ind og tilstopning af spidsen under metode (figur 2A).
7. Ved hjælp af mikromanipulator, dirigere pipetten ind i badet og placer den direkte over udvalgt til patching (figur 1C) celle, lukke det elektriske kredsløb. Vær opmærksom på oscilloskop, der skal angive en rektangulær bølgeform svarende til forstærkeren segl testsignal (figur 2B). Bemærk: Ved indrejse i badet, pipetten modstand indenfor det optimale område er 12-24 MOhm. For en 5 mV testsignal, opmålt strøm range svarer til ~ 20-40 pA.
8. Mens overvågning pipette position visuelt gennem mikroskopet og pipette modstand elektrisk på oscilloskopet, fortsætter tilgangen i små intervaller indtil pipetten griber blidt på cellen, og testen signalet falder lidt at indikere øget modstand (figur 2B).
9. For at danne en forsegling, afhente sprøjten og anvende svagt undertryk gennem den laterale slange ved at trække sprøjtestemplet, som trækker den cellulære membran ind i spidsen af optagelsen pipette og igangsætter dannelsen af en GQ modstand tætning ^10. Vær opmærksom på testsignal bølgeform på oscilloskopet, hvor sæl dannelse er angivet med sin fuldstændige udfladning, med kun kapacitive transienter synlige (figur 2B). Bemærk: Hvis signalet ikke flade helt eller baseline bliver støjende, indikerer dette en svag forsegling med en betydelig strøm lækage omkring forseglingen. Dette vil forhindre resolving én kanal strømninger. Hvis dette er tilfældet, trække pipetten fra cellen og væk fra badet, skal du fjerne det fra hovedet scenen og kassér den. Gentag processen med en frisk poleret pipette indtil der opnås en tætning i tilstrækkelig rækkevidde (≥ 1 GQ).
10. På forstærkeren, skal du skifte den eksterne kommando skift fra 'sæl test' til 'off'; skifte spændingen holder kommando til positiv (som blev sat tidligere på 'off'); og øge gevinsten til x100. Overhold oscilloskopet for kanal aktivitet, som, hvis den findes, vil blive vist som firkantede opad omlægninger fra tidligere flad baseline (figur 2C).
11. Hvis kanal aktivitet vises på oscilloskopet, erhverve data i tidligere åbnet digital fil i QUB, ved at trykke på 'play-knappen efterfulgt af' Record 'knappen. For at stoppe erhverve data, skal du trykke på stopknappen i QUB, og gem QDF fil til en let retrievstand placering på computerens harddisk ved at vælge 'Gem data som ...' i rullemenuen med titlen 'File'.

4.. Data programmeringssproget og idealisering

Bemærk: Vigtig information kan udvindes fra enkelte kanal optagelser ved statistiske analyser, som tildeler hvert datapunkt til en passende ledningsevne klasse (i det simpleste tilfælde, lukket eller åbent). Denne proces kaldes data idealisering og en kort beskrivelse af data idealisering med segmenter k midler (SKM) metode ¹¹ i QUB er beskrevet nedenfor.

1. Åbn datafil i QUB, og se de aktuelle spor i »Pre 'brugerflade under' layout '. Vise den optagede fil ufiltreret (fjern digitalt filter) ved at fjerne markeringen i feltet "Fc. '
2. Visuelt scanne rekord at spotte uregelmæssigheder og artefakter (figur 4A). Korrekt korte spidsværdier som erhvervssygdomr inden for spor (figur 4A) ved at vælge en tilstødende ren region i samme ledningsevne klasse, fremhæver denne region, højreklikke og vælge 'sæt slette buffer. " Zoom ind på spyd, indtil de enkelte prøvepunkter er synlige, skal du vælge den region, der skal udskiftes, og slette ved at fremhæve kun denne region, og højreklik 'Erase ".
3. Definer nul nuværende baseline for hele posten ved at vælge en tidlig del af posten, hvor baseline er stabil, fremhævning, skal du højreklikke og vælge "sæt baseline". Kontroller, at retningslinje, som synes nøjagtigt repræsenterer baseline-niveau (lilla i figur 4B)
4. Identificer punkter i rekord, hvor de rå data baseline afviger synligt fra den indstillede baseline. Ret dette ved at vælge en lille del af baseline i den afvigende region, skal du højreklikke og vælge 'tilføje en baseline node' kommando.
5. Identificere områder af than indspilningen indeholder overskydende støj eller artefakter, der ikke let kan rettes (figur 4C). Fremhæv det område, der skal kasseres, skal du højreklikke og vælge 'slet'. Bemærk: I dette tilfælde kinetiske oplysninger vil blive tabt: forarbejdet rekord vil blive kortere, og de punkter, der opstår efter splejse punkt vil synes at være sammenhængende med den præ-støj-regionen.
6. At idealisere poster ved hjælp af SKM algoritmen ^11, markere en del af sporet, der indeholder både åbne og lukkede arrangementer og indtast "Mod" brugerflade under 'Layout'. I "model" panel, fremhæve en ren del af sporet, der er repræsentativ for den baseline i hele filen, skal du højreklikke den sorte firkant (lukket tilstand) og vælg "gribe". Gør det samme for kanal åbninger ved at fremhæve åbne ledeevne, skal du højreklikke på den røde firkant i "model" panel og vælg "gribe".
7. Udfør idealization for hele rekord ved at vælge knappen 'Filer' under 'Data Source'. Højreklik på den "idealisere" fanen under "Modeling 'sektionen for at kontrollere, at de ønskede parametre for analysen er korrekte, og klik derefter på" Kør. " Resultatet af idealisering, sammen med amplituden histogram for hele filen, overlejres med de data, for at muliggøre visuel inspektion af idealisering (figur 5). Bemærk: Utilstrækkelig idealisering kan føre til dannelse af "falske begivenheder ', hvor QUB registrerer kanal åbninger og lukninger, faktisk ikke forekomme. Inden optagelsen opløsning, som er fastsat af forstærkerens analoge filter og samplingfrekvens kan opløsningen som SKM registrerer åbne og lukkede arrangementer kontrolleres ved at indstille en dødtid til analyserne. Optimale døde tider skal vælges ved trial and error, og vil afhænge af samplingfrekvens dog en god tommelfingerregel erat vælge en død tid, der er 2-3 prøver ^12.
8. At kontrollere, at idealisering nøjagtigt repræsenterer de rå data, scanne manuelt idealiserede spor. Ved identifikation af fejl i idealisering, fremhæve spor over falske begivenhed, skal du højreklikke og vælge "Deltag Idl '. Bemærk: For yderligere muligheder og en detaljeret forklaring af forskellige kommandoer og funktioner i QUB, konsultere QUB Manual online (www.qub.buffalo.edu).

Representative Results

Rekombinant NMDA receptorer

NMDA-receptorer binder og svare den samtidige virkning af to co-agonister: glutamat og glycin. De samle som heterotetramerer for to glycin bindende GluN1-underenheder og to glutamat bindende GluN2 underenheder. GluN2 subunits kodes af fire gener (AD) og af disse de mest transskriberede former i hjernen, er GluN2A hos voksne og GluN2B i unge dyr. På grund af mangfoldigheden af NMDA-receptorsubtyper i native præparater, der udtrykker receptorer i HEK293-celler (figur 1A), muliggør styring af underenheden sammensætning, samt evnen til at optage strøm fra kanalerne ved hjælp af en fint poleret glas pipette (figur 1C).

Når pipetten rører celle, en klar reduktion i amplitude af testen pulsbølgeform forekommer (figur 2B), hvilket viser evnen til at danne en tætning. En tilstrækkelig forsegling indeholdende etkanal producerer klar kanal aktivitet, vises som nedadgående omlægninger fra baseline, med et godt signal støjforhold når en positiv spænding (figur 2C) til. Maksimal kanal aktivitet for vildtype rekombinant NMDA-receptorer kan opnås, når begge agonister er til stede i høje koncentrationer, og når hæmmere og kanalblokkere er fraværende. Dette er ideelt, så at når et plaster indeholder mere end én kanal, samtidige åbninger er umiddelbart indlysende ¹³ (figur 3B). For proteiner med meget lavt aktivitetsniveau, kan sandsynligheden for, at en strækning på én niveau åbninger stammer fra kun én kanal beregnes, hvis den kanal åben sandsynlighed er kendt, eller kan tilnærmes ^14. På grund af dette, kan længere observationsperioder være nødvendig.

Under disse betingelser, og ved anvendelse af en pipette bedrift potentiale på +100 mV (der fører til en omtrentlig membranpotentiale -120 mV), single rekombinant GluN1/GluN2A og GluN1/GluN2B er åbne med høj sandsynlighed (P _o, 0,3-0,5) til en forholdsvis høj ledningsevne-niveau (> 50 PS) (3A og 5B) ^15-17. Når du optager, kan de nuværende støj pigge, baseline driver, eller perioder med overdreven støj manifestere (4A-C), men som nævnt, kan disse rettes, hvis korte og mindre. Det er imidlertid vigtigt, at kanalaktivitet registreres uafbrudt i et tilstrækkeligt tidsrum (≥ 10 min, 10.000 hændelser) at sikre, at den fulde bredde af kanal adfærd er fanget.

De opnåede data fra sådanne optagelser kan give oplysninger om både kanal kinetik og permeationsdata egenskaber. Her viser vi idealisering udført af QUB hjælp SKM algoritme (figur 5A), men data idealisering kan udføres ved hjælp af andre programmer, såsom pClamp eller SCAN ^12, ennd kan udføres ved hjælp af forskellige algoritmer eller kriterier, såsom den halve tærskelmetode, idet hver af disse muligheder, der indeholder deres egne fordele og ulemper. Montering af disse data til kinetiske modeller kan udføres med henblik på at opnå yderligere indsigt i den adfærd af ion-kanal. Maksimal sandsynlighed montering kan udføres med software som QUB eller HJCFIT ^18, hvor de algoritmer, der gennemføres af hvert program har deres egne fordele. Mens idealisering demonstreret i figur 5. kræver kun den enklest mulige model af en lukket tilstand og en åben tilstand, der skal udføres, montere en komplet kinetisk model for en ion-kanal kræver sekventiel tilsætning lukkede og åbne tilstande indtil et bestemt kriterium er nået. Denne proces har vist, at vildtype GluN1/GluN2A receptorer har fem kinetisk adskilte lukkede stater og 03:58 kinetisk distinkte åbne stater (figur 5C) ^19, hvori dissegating egenskaber er afgørende for at bestemme formen af NMDA-receptoren medieret synaptisk signal ^{20, 21.} Denne stil af analyse kan udvides til andre ionkanaler af mindre ledningsevne, såsom AMPA-receptorer, for at få indsigt i deres egne distinkte gating mekanismer ^22,23,24. En advarsel er dog siden AMPA-receptorer har flere ledningsevne niveauer vellykket idealisering hjælp QUB kan kræve yderligere stater er indarbejdet i en forudindstillede model.

Disse metoder kan også udvides til at indhente oplysninger om ion-kanal gennemtrængning og ledningsevne ved at ændre gennemtrænger ion sammensætning og / eller koncentration. Optagelse aktivitet gennem enkelt GluN1/GluN2A receptorer ved hjælp af de metoder, der er beskrevet her, men erstatter 150 mM NaCl med 75 mM _CaCl2 i optagelsen pipette, giver strømninger med ~ 20% af ledningsevne (~ 10 PS). Dette viser, at mens calcium gennemsyrer NMDA-receptorer på hiGH-niveauer i fysiologiske betingelser, er det faktisk krydser kanalen langsommere end natriumioner, hvilket indikerer, at der kan være en potentiel calcium bindingssted inden for gennemtrængning vej. Derudover trods af denne lille ledningsevne, optagelserne kan være tilstrækkeligt idealiseret hjælp af SKM algoritme i QUB, afslører eksistensen af en mellemliggende sublevel ledningsevne, hvilket er omkring 50% strømamplitude af de vigtigste ledningsevne-niveau (figur 6A og B). Disse Sublevel åbninger kan imidlertid kun idealiseret i QUB når en ekstra ledningsevne klasse er indarbejdet i den oprindelige kinetiske model. Yderligere kinetiske analyser viste, at under disse betingelser, receptorer stadig udviser fem kinetisk adskilte lukkede stater, men disse lande har ekstremt forskellige tidskonstanter og occupancies forhold til, når kanalen passerer kun natriumioner (figur 6C). Desuden er der kun to åbne tilstande observeret ufter disse betingelser påviser, at ud over at påvirke kanal konduktans, calciumioner er i stand til at modulere receptoren gating.

Der er ingen bestemt måde at få kun én kanal patches. I stedet kan flere eksperimentelle manipulationer bidrage til at øge sandsynligheden for succes. Først tilstræbe lavt kanal ekspression ved evaluering fluorescensintensiteten af de transficerede celler (Figur 1B). Vellykkede tilgange kan være at: nedsætte den samlede mængde af cDNA anvendt til transfektion eller for at mindske mængden af ​​cDNA for en nødvendig underenhed, som er GluN1; at nedsætte inkubationstiden med DNA / calciumphosphatpræcipitat; og at selektere for patching kun svagt fluorescerende celler fra synsfeltet. Disse metoder bør forfølges, hvis patches opnåede ofte indeholder flere kanaler. Desuden kan mindske størrelsen af ​​pipettespidsen også bidrage til at fange kun én kanal i PATCtime. I sidste ende dog, bliver man succes med at opnå én kanal patches ved systematisk at afstå fra optagelse i lange perioder fra patches, der tydeligt indeholder mere end én kanal.

Rekombinante PIEZO1 Kanaler

De er beskrevet i denne protokol fremgangsmåder kan let anvendes på enhver ligand ionkanal, og faktisk kan være indrettet til at optage én kanal aktivitet fra en ionkanal, enten aktiveres af kemikalier, spænding, kraft, temperatur eller andre midler. Et eksempel på, hvordan denne protokol kan tilpasses til at optage én kanal strømme fra andre ioner kanaler, specielt mus PIEZO1, en ​​mekanosensitive ionkanal, der er præsenteret nedenfor (Figur 7) ^{25, 26.}

Som med NMDA-receptor-kanaler er PIEZO1 og GFP udtrykt i HEK293-celler ved calciumphosphat-medieret transfektion og celler anvendes 24-48 timer efter transfektion sombeskrevet i afsnit 1.2. Fordi PIEZO1 aktiveres ved membran stretch, der skal sørges for at manipulere membranen forsigtigt under patch dannelse og passende anordninger til levering og kontrol af den mekaniske kraft, der påføres, bør være til rådighed. Disse betingelser kan opnås ved at gøre større optagelse pipetter med modstand i 2-3 MOhm området og ved hjælp af en høj hastighed tryk spændeindretning (HSPC) forbundet til optagelsen pipette gennem pipetteholder på forstærkeren hovedtrin. Forstærkerens indstillinger svarer til dem beskrevet for NMDA-receptorer i afsnit 3.3, bortset fra at skifte den "eksterne" kommando knop, så forstærkeren kan styres gennem erhvervelse software.

Hvis du vil optage aktivitet fra PIEZO1 bruge en optagelse pipette fyldt med (i mm): 130 NaCl, 5 KCI, 10 HEPES, 1 _CaCl2, 1 _MgCl2, 10 TEA-Cl, pH 7,3 med NaOH. Under disse betingelser, kan åbninger blive overvåget som jegnward natrium strømninger, som vises på oscilloskopet som nedadgående omlægninger fra et nul aktuelle baseline. Placer optagelsen pipetten på forstærkeren hoved scenen og sørg for, at skiven på HSPC er på nul. Før ind i badet, anvende 3-5 mmHg af positivt tryk. Ved hjælp af mikromanipulator, sænke pipetten i badet, så tjek for ønsket pipette modstand, og bringe pipetten i tæt nærhed til den markerede celle, som beskrevet i afsnit 3.6. Tryk forsigtigt i cellen under mikroskop vejledning og ved at overvåge oscilloskop, iagttage et mindre fald i amplituden af ​​pakningen test bølgeform på en lignende måde som på NMDA-receptorer (afsnit 3.7). Hurtigt frigive positive tryk påføres gennem pipetten ved at ændre trykket bedriftsniveau fra 3-5 til 0 mmHg. Vent et GQ sæl til at danne ved at overvåge segl test kurveform. I dette tilfælde er ingen negative tryk, der påføres for at danne en forsegling. Når en optimal tætning opnås ved at trykke på &# 8216;. Record-knappen i QUB at begynde at erhverve data Figur 7 viser et repræsentativt spor af mPIEZO1 single-channel strømme aktiveres ved at anvende -20 mmHg tryk til patch pipette. Disse strømninger var lavpasfiltreret ved 2 kHz og samples ved 20 kHz.

I modsætning til ligandstyret kanaler med ekstracellulære ligand-bindende domæner, kan stimulus aktiverer mekanosensitive kanaler varieres under 2 protokoller. Den første er "hul-fri," hvor et konstant undertryk påføres patch til hele optagelsen varighed. Denne protokol er nyttig til at opnå minutter lange optagelser og er mest succes med mindre tryk stimuli (0 til 20 mmHg), som bevarer membran integritet. Aktivitet produceret af højt tryk, hvilket sandsynligvis vil briste membranen, opnås bedst med "episodisk 'optagelser, hvor pulser af varierende tryk kan anvendes til patch til kortere perioder (<strong> figur 7). Som med ligand gated kanaler, optagelser fra celle vedhæftet én kanal patches giver et væld af oplysninger om både ledningsevne og gating egenskaberne af kanalen under efterforskning.

Neuronal NMDA receptorer

Kan bruges beskrevet her for celle-attached én-kanals optagelse metode til at indhente oplysninger om ledningsevne og gating egenskaber af kanaler endogent til en bestemt celletype og / eller udviklingsstadiet. Som det er tilfældet med mange andre heteromere kanaler er den nøjagtige molekylære sammensætning af indfødte NMDA-receptorer er ikke kendt. Ved at sammenligne resultaterne fra rekombinante receptorer af kendt sammensætning med dem, der opnås fra indfødte præparater, hypoteser om underenhed sammensætning og funktion af kanaler i deres oprindelige miljø kan formuleres eller testes ^17.

Neuroner blev isoleret fra præfrontalecortex af rotte embryoner og dyrket i kultur i op til 6 uger ^17. Ud over komponenter, der er beskrevet for rekombinante NMDA-receptoren optagelser i afsnit 2.2, pipetten løsningen også indeholdt CNQX (20 uM) og bicucullin (10 uM) for at hæmme indfødte AMPA og GABA-receptorer, hhv. Afhængigt af alder af kulturen, de registre opnået fra indfødte NMDA-receptorer afslørede kinetik, der var helt anderledes. Optagelser fra tidlig (figur 8A, 5 dage in vitro) kultur mere ligner kinetik beskrevet for GluN1/GluN2B receptorer og optagelser fra sent (figur 8B, 27 dage in vitro) kulturer mere ligner kinetik beskrevet for GluN1/GluN2A receptorer (figur 3A og 5A). Denne observation er i overensstemmelse med mønstre af NMDA receptor-ekspression isoformer og med omhyggelige beskrivelser af strømninger optaget fra celle vedhæftet en-kanals pletter i hoftepocampal kulturer ^16.

Fig. 1. Valg af en HEK293 celle for celle fastgjort optagelse. A) HEK293-celler dyrket i en 35 mm skål anbringes på objektbordet og ses med fasekontrast ved 40X forstørrelse. B) GFP-fluorescens fra det samme synsfelt som i panel A identificerer transficerede celler. Pil angiver en celle, der udtrykker GFP, vises sundt, og er i en position modtagelig for pipette adgang. C) Optagelsen pipette bringes i tæt nærhed til den markerede celle med en fin bevægelse manipulator under visuel vejledning. Klik her for at få vist en større version af dette tal.

Figur 2. Cell. Fastgjort tætning formation. A) En lille sprøjte forbundet til den side af pipetteholder giver mulighed for manuel styring af trykket inden i pipetten. B) den strøm, der passerer gennem pipetten nedsænket i badopløsningen som reaktion på forstærkeren test, som ved 5 mV (0,5 kHz) er 18 Pa, og svarer til en pipette størrelse på 28 MOhm. Ved at berøre celle (venstre pil), er niveauet af de observerede strømmen aftager, indikerer øget pipette modstand. Anvendelse af undertryk gennem pipetten (højre pil) initierer sæl dannelse og reducerer signal produceret af testen puls til kun kapacitive transienter. C) fraværende en test puls, og hvis ingen spænding påføres gennem pipetten (0 V), baseline er stabil (til venstre for pilen). Anvendelse positiv spænding (pil, +100 mV) pr oduces stokastiske enhedsrettigheder strømninger, der angiver kanal åbninger. Rød stiplede linje indikerer nul aktuelle baseline.

. Figur 3 Cell vedhæftede strømme optaget fra GluN1/GluN2A receptorer A) Kun kanal patch:. En 50 sek segment af kontinuerlig optagelse illustrerer kanal åbninger til en enkelt ensartet amplitude B) Multiple-kanal patch:. En 50 sek segment af kontinuerlig optagelse illustrerer kanalåbninger til to amplitudeniveauer indikerer, at plasteret indeholder mindst to aktive kanaler. Rød stiplede linje indikerer nul aktuelle baseline. Klik her for at se en større version af dette tal.

">
Figur 4.. Databehandling. A) Korrektion for støjspidser. Display data ufiltreret og manuelt erstatte den fremmede signal (rød) med baseline signal. Udvidet visning illustrerer et spyd før (i midten) og efter (nederst) spike (rød) blev erstattet med baseline signal. B) Korrektion for baseline afdrift. Tidligt i posten, skal du vælge et lille segment af baseline og indstille det som det aktuelle niveau nul for hele posten (lilla linie). Korrekt basislinjedrift ved at vælge en lille del af gled baseline (pil) og tilføje en baseline node (lilla cirkel). C) Længere rekord med støjende baseline (rød), der er vanskelige at rette kan slettes. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5.. Data idealisering. A) Aktuelle spor (sort) blev registreret fra én GluN1/GluN2A receptor passerer kun natriumioner med celle-attached patch-clamp teknik. Idealiserede datapunkter (rød) er illustreret for en 30 sek én kanal segment. Disse overlapper godt, hvilket indikerer, at idealisering er korrekte. B) Histogram af de nuværende amplituder illustrere en fordeling, der er godt beskrevet ved kun to Gaussiske funktioner med toppe ved nul (0,02 ± 0,8 Pa) tegn på lukket kanal begivenheder og mindst 10,3 ± 1,3 pA betegnende for kun én type af åben kanal arrangementer for hele optagelsen varighed (130 minutter). C) Lukket (til venstre) og åben (højre) opholdstid histogrammer for hele optagelsen er vist i (A). Den sandsynhed tæthedsfunktionen for histogrammerne (tykke linjer) og individuelle kinetiske komponenter (tynde linjer) er overlejret og blev beregnet ved at tilpasse data til en model med fem lukkede stater og tre åbne stater. Mellemværker give tidskonstant (τ), og relative areal (a) for hvert af de individuelle kinetiske komponenter.

Figur 6.. Calcium strømme gennem enkelt NMDA-receptorer. A) Aktuelle spor (sort) blev registreret fra én GluN1/GluN2A receptor passerer kun calciumioner med celle-attached patch-clamp teknik. Idealiserede datapunkter (rød) er illustreret i 30 sek segment. B) Histogram nuværende amplituder illustrerer en fordeling, der er godt beskrevet ved tre gaussiske funktioner med toppe ved nul (0 ± 0,3 Pa), hvilket indikerer tætd kanal begivenheder, 1,3 ± 0,4 pA tegn på åben kanal arrangementer til et underniveau ledningsevne, og 2,1 ± 0,3, hvilket indikerer åben kanal begivenheder til de vigtigste ledningsevne-niveau. C) Lukket (til venstre), vigtigste ledningsevne niveau åben tilstand (i midten) og sublevel ledningsevne åben tilstand (til højre) opholdstid histogrammer for hele optagelsen er vist i (A). Tæthedsfunktionen for histogrammer (tykke linjer) og individuelle kinetiske komponenter (tynde linjer) er overlejret og blev beregnet ved at tilpasse data til en model med fem lukkede stater, to vigtigste åbne stater ledningsevne niveau og et underniveau ledningsevne åben tilstand. Mellemværker give tidskonstant (τ), og relative areal (a) for hvert af de individuelle kinetiske komponenter.

Figur 7.. Cell tilknyttet én kanal optagelsefra mPIEZO1 udtrykt i HEK293 celler. Aktivitet fremkaldes ved at anvende -20 mmHg tryk med en HSPC enhed via patch-pipetten under konstant anvendelse af spænding (+80 mV). Rød stiplede linje angiver det aktuelle niveau nul.

Figur 8 Cell. Fastgjort en kanal optagelse fra native kanaler. Pipetten blev fastgjort i soma af en neuron, der blev adskilt fra den præfrontale cortex i en rotte foster og blev opretholdt i kultur i 5 dage (A) eller 27 dage (B) . Kontinuerlig NMDA-receptor-aktivitet blev optaget med pipette opløsninger indeholdende glutamat (1 mM) og glycin (0,1 mM) og også CNQX (20 uM) og bicucullin (10 uM) til at inhibere native AMPA og GABA-receptorer hhv. Aktiviteten blev fremkaldt ved anvendelse af 100 mV through optagelsen pipette. Rød stiplede linje angiver det aktuelle niveau nul.

Discussion

I feltet ionkanal er et vigtigt forskningsområde dedikeret til at forstå rækkefølgen af ​​begivenheder, der fører til at kanalisere åbning eller kanalens gating mekanisme. For de fleste kanaler, denne proces er kompleks og involverer flere kinetiske trin, som ikke kan udledes af et makroskopisk multikanal-signal. I modsætning hertil kan man udvikle hvor observere sekvens af åbne / lukkede arrangementer i enkelt kanal rekord kan producere mere detaljerede oplysninger om gating mekanismer. I de her beskrevne metoder, den eksternt placerede ligandbindingsdomænet besat af NMDA-receptorer tillader minimalt invasive patch-clamp optagelser, der skal udføres under konstante betingelser. Denne protokol skal muligvis tilpasses for at være egnet til at undersøge andre ligand ionkanaler afhængig af både ligand og receptor egenskaber.

Registreringer af enkelt kanal aktivitet giver to typer af værdifulde oplysninger. Førstfordi kan måles direkte enhedskarakter aktuelle amplitude, kan forsøg tilrettelægges at få oplysninger om pore egenskaber såsom kanal ledningsevne, permeabilitet og selektivitet. For det andet, fordi kan også måles varigheden af ​​åbne og lukkede arrangementer direkte fra posten, eksperimenter kan designes til at opnå kinetisk information om gating og dermed drage slutninger om den operationelle mekanisme af kanalen. For begge typer af eksperimenter, meningsfuld statistisk analyse kræver udsmidningen enkelte point fra det nuværende spor til en specifik ledningsevne klasse. Præsenteret her var en sådan metode til at gøre dette, ved hjælp af segmentariske k-midler (SKM) ^11. algoritme, men dette kan ske ved en række mere eller mindre avancerede algoritmer, herunder halv-tærskel, SCAN ^12, Baum-Welch, Viterbi, etc.

Optagelser ved hjælp af celle-attached konfiguration er stærke i at ionkanaler er bevaret i biologiskmembraner med uforstyrrede intracellulære miljøer. På grund af dette, er det afgørende, at membranforseglinger tilstrækkeligt dannes og bevares under hele optagelsen til to formål: 1) eksperimentel kontinuitet og 2) at opretholde en gunstig signal-til-støj-forhold (spids til spids baseline støj <2 PA). Størrelsen og formen af ​​pipettespidsen genereret bestemmer sandsynligheden for en vellykket membrantætning indeholdende nøjagtigt én kanal. En flad spids sikrer, at når pipetten nærmer cellen vil berøre og trykke på cellemembranen med hele spids overflade er, at hjælpe til at forsegle ensartet på cellen. En pipette med en spids, der er for bred, vil være mindre tilbøjelige til at resultere i en kanal patches; I modsætning hertil vil efter trækker en pipette med en spids, der er for smal resultere i en omega-formet membran loop, der kan forsegle på basen og tilstoppe pipetten ^10.

En gunstig signal-støj-forholdet kan styres ved at minimere kilder til elektriskstøj. Den hovedtrin afkøling funktion på Axopatch 200B har tilladt for optimal signal resolution; dog støj kan stadig blive produceret af nogen af ​​de involverede i elektrofysiologi instrumentering sat op, samt eksterne kilder såsom lys og uafhængige elektronik. Heldigvis kan flere strategier skal gennemføres for at minimere støj til et ønsket niveau ^{2, 27..} Kort fortalt, så sørg for at stykker af udstyr, der er i stand til at producere støj er funderet på et enkelt punkt i opsætningen. Når du gør dette, er det vigtigt at forhindre dannelsen af ​​jordsløjfer hvilket vil forårsage betydelig støj. Desuden, hvis 60 cyklus støj er til stede, skal du sørge for at slukke noget lys, der kan forstyrre optagelsen signalet. Endelig vil placere et Faradays bur omkring optageapparatet forhindre nærheden hindringer forårsage elektrisk støj.

Observation af en kanal til en lang tid har vist, at gatingkonformationsændringer kan ske over en bred vifte af tidsskalaer. Tidsmæssigt, er patch-clamp-data er begrænset på den "korte" ende af båndbredden af ​​forstærkeren og den hastighed, hvormed det forstærkede signal er digitaliseret og på den "lange" ende af den observation vinduet. For konformationsændringer, der er hurtigere end den lave grænse, kan patch-clamp optagelser tilbyder kun information, når kombineret med komplementære eksperimentelle tilgange. For konformationsændringer der opstår med meget langsomme satser og dermed samples sjældent, kan man øge antallet af observationer eller øge varigheden af ​​den rekord, men dette kan ikke altid være muligt.

På trods af disse begrænsninger, patch-clamp data, især når der er opnået fra en enkelt kanal, ofte indeholder mere information end umiddelbart ekstraherbare med de nuværende beregningsmæssige metoder. Således er det forventningen, at fremtidige stigninger i beregningsmæssige kapacitet og i sophistication af algoritmer vil gøre det muligt yderligere applikationer. Efter fremkomsten af sådanne fremskridt, er det forventeligt, at patch-clamp optagelser fra enkelte kanaler kan være i stand til at opstå samtidig med FRET målinger, calcium imaging eller endda in vivo forberedelser til at give yderligere oplysninger om struktur, funktion og dynamik ion-kanaler i både indfødte og kontrollerede miljøer.

Som mangfoldigheden af ​​ionkanaler undersøgte stiger, detaljeret forståelse af deres gating mekanismer og i sidste ende at forstå, hvordan deres drift bidrager til deres unikke biologiske funktioner vil drage fordel af enkelt molekyle observationer. Især data opnået med den ene kanal patch-clamp lover at informere om enhedsstat ledningsevne egenskaber og gating-sekvenser for rekombinante og indfødte kanaler.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals	Sigma	Various
Borosillicate Glass	Sutter	BF-150-86-10
Bright field inverted microscope	Olympus	1x51	Nikon also has similar microscopes
Fluroescent box	X-cite	Series 120
Liquid Light Guide	X-cite	OEX-LG15
Micromanipulator	Sutter Instruments	MP-225
Oscilloscope	Tektronix	TDS1001
Amplifier	Molecular Devices	Axon Axopatch 200B
Table	TMC	63561
NIDAQ card	National Instruments	776844-01
Puller	Narishige	PC-10
Polisher	Narishige	Microforge MF-830
Faraday Cage	TMC	8133306
High Speed Pressure Clamp	ALA Scientific Instruments	ALA HSPC
Pressue/Vaccuum Pump	ALA Scientific Instruments	ALA PV-PUMP	For HSPC-1