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Biology

एक चैनल सेल संलग्न पैच दबाना रिकॉर्डिंग

Published: June 9, 2014 doi: 10.3791/51629
Automatic Translation
1, 2, 1, 3, 4
1Graduate Program in Neuroscience, SMBS, University at Buffalo, SUNY, 2Department of Biochemistry, SMBS, University at Buffalo, SUNY, 3Molecular and Cellular Neuroscience Department, The Scripps Research Institute, 4Department of Biochemistry and Graduate Program in Neuroscience, SMBS, University at Buffalo, SUNY

Summary

यहाँ वर्णित सेल संलग्न पैच दबाना तकनीक के साथ एक आयन चैनल से वर्तमान रिकॉर्डिंग की लंबी हिस्सों प्राप्त करने के लिए एक प्रक्रिया है. इस विधि, वास्तविक समय में अवलोकन के लिए अनुमति देता है, जैविक संकेत कायम करना है कि खुले करीब चैनल रचना के पैटर्न. इन आंकड़ों अबाधित जैविक झिल्लियों में चैनल गुणों के बारे में सूचित करें.

Abstract

आयन चैनल प्रोटीन जैविक झिल्ली भर में तेजी से संचार के लिए यूनिवर्सल उपकरणों रहे हैं. वे उत्पन्न आयनिक प्रवाह के अस्थायी हस्ताक्षर प्रत्येक चैनल प्रोटीन के साथ ही यह उत्पन्न होता है और नियंत्रित किया जाता है जिसके द्वारा तंत्र को आंतरिक गुणों पर निर्भर करता है और वर्तमान अनुसंधान का एक महत्वपूर्ण क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करता है. आयन चैनल प्रोटीन का परिचालन गतिशीलता के बारे में सूचना एक ही अणु के द्वारा उत्पादित वर्तमान की लंबी हिस्सों देख द्वारा प्राप्त किया जा सकता है. एक ligand gated आयन चैनल, NMDA रिसेप्टर के लिए एक चैनल सेल संलग्न पैच दबाना वर्तमान रिकॉर्डिंग प्राप्त करने के लिए एक प्रोटोकॉल यहाँ है वर्णित है, cortical न्यूरॉन्स में HEK293 कोशिकाओं में या natively heterologously व्यक्त किया. इसके अलावा mechano संवेदनशील चैनल PIEZO1 का उदाहरण पेश करके ब्याज की अन्य आयन चैनलों के लिए विधि अनुकूलित करने के निर्देश हैं प्रदान की. इस विधि चैनल के प्रवाहकत्त्व गुण और ope के अस्थायी अनुक्रम के बारे में डेटा प्रदान कर सकते हैंइस प्रकार स्वास्थ्य और रोग में उनके कार्यों को समझने में मदद करने, चैनल के सक्रियण तंत्र को बनाने वाली N-बंद रचना.

Introduction

जैविक झिल्ली भर में तेजी से संचार सामान्यतः चैनल के रूप में भेजा oligomeric ताकना गठन झिल्ली प्रोटीन, पर लगभग विशेष रूप से निर्भर करता है. ये प्रोटीन सक्रियण संकेतों, gating तंत्र, और प्रवाहकत्त्व गुणों में व्यापक रूप से भिन्न होते हैं. जिसका pores आयनों को चयनात्मक हैं चैनल प्रोटीन आयन चैनल के रूप में वर्गीकृत कर रहे हैं; उनके सक्रियण झिल्ली भर आयनिक धाराओं पैदा करता है, और अपनी प्रतिक्रिया electrophysiologic तकनीक का उपयोग कर वास्तविक समय में उच्च संकल्प के साथ दर्ज किया जा सकता है. सक्रियण संकेतों एकाग्रता ढ़ाल, मैकेनिकल और इलेक्ट्रिकल बलों, और तापमान सहित रासायनिक और भौतिक आदानों की एक व्यापक सरणी अवधि; इस प्रकार, आगे ligand में आयन चैनल वर्गीकृत, gated mechanosensitive, वोल्टेज gated, या गर्मी संवेदनशील प्रकार के. इस अनुच्छेद में, प्रोटोकॉल पैच दबाना तकनीक का उपयोग कर, एक ligand gated चैनल, NMDA रिसेप्टर, और एक mechanosensitive चैनल, PIEZO1 से एक चैनल गतिविधि को रिकॉर्ड करने के लिए वर्णित हैं.0;

पैच दबाना इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी एकल अणुओं 1, 2 के अवलोकन की अनुमति के लिए पर्याप्त रूप से संवेदनशील पहली और सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया प्रयोगात्मक विधि है. इस अति सुंदर संवेदनशीलता के अलावा, यह बेहद electrophysiologic रिकॉर्डिंग करने के लिए उत्तरदायी जैविक तैयारी का विस्तार किया गया है और यह भी बरकरार झिल्ली में आयन चैनल के अवलोकन की अनुमति दी है. वोल्टेज clamping और वर्तमान रिकॉर्डिंग दोनों एक ही इलेक्ट्रोड के साथ पूरा कर रहे हैं, क्योंकि सबसे पहले, यह छोटे कोशिकाओं या झिल्ली पैच भर में संकेत रिकॉर्ड करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. तकनीक आयन चैनल मेंढक की मांसपेशियों, मछली electroplaques, या विद्रूप विशाल axons 3, 4, बल्कि वे transmembrane संकेतन तंत्र की देशव्यापी फिक्स्चर का प्रतिनिधित्व करते हैं और विश्वविद्यालय या की सभी सेलुलर झिल्ली प्रकार के आंतरिक कर रहे हैं कि के उत्तेजनीय झिल्ली तक ही सीमित नहीं रहे हैं कि पता चला बहुकोशिकीय जीव, और भी intracellular झिल्ली को. आयातantly, बस एक अक्षुण्ण सेल करने के लिए एक गिलास विंदुक संलग्न द्वारा transmembrane धाराओं रिकॉर्ड करने की क्षमता उनके पैतृक undisrupted झिल्ली में आयन चैनल से गतिविधि को रिकॉर्ड करने के लिए अभूतपूर्व अवसर प्रदान किया. इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल में वर्णित है जो सेल संलग्न पैच दबाना तकनीक, मिनट के दसियों या उनके पैतृक वातावरण में लंबे समय तक के लिए लगातार आयन चैनलों की गतिविधि की निगरानी परमिट.

सामान्य थर्मल उतार चढ़ाव के तहत, आयन चैनल प्रोटीन सहित सभी प्रोटीन,, पक्ष श्रृंखला आंदोलनों और पूरे के repositioning द्वारा प्रतिनिधित्व बहुत धीमी है, कम लगातार परिवर्तन से सबसे अधिक संभावना प्रतिनिधित्व सबसे तेज और सबसे लगातार rearrangements के साथ, एक व्यापक समय के पैमाने पर संरचनात्मक परिवर्तन से गुजरना डोमेन या सब यूनिटों, या पोस्ट translational संशोधनों या प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत 5, 6 के द्वारा कुछ मामलों में. एक अणु के द्वारा उत्पन्न की गतिविधि की लंबी अवधि के अवलोकन समारोह को समझने में मदद कर सकते हैंराष्ट्रीय बरकरार शारीरिक झिल्ली में आयन चैनल की गतिशीलता और मनाया अणु का परिचालन तंत्र के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान करता है.

सेल प्रकार के और विकास के चरणों में आयन चैनल, देशी झिल्ली में आयन चैनल की आणविक संरचना के बारे में ज्ञान की विविधता की बढ़ती समझ के विपरीत अभी भी सीमित है. सभी आयन चैनल multimeric प्रोटीन होते हैं और देशी आयन चैनल का बहुमत अक्सर विविध प्रवाहकत्त्व और gating संपत्तियों के साथ साथ है, जो विस्तृत आणविक विविधता, के प्रोटीन के उत्पादन यूनिटों के कई प्रकार से एकत्र कर लें. इस कारण से, परिभाषित आणविक संरचना के आयन चैनल heterologous प्रणाली में अभिव्यक्ति पर अध्ययन कर रहे हैं. विशेष रूप से, अमर मानव भ्रूण गुर्दे की कोशिकाओं 7 का एक प्रतिरूप लाइन हैं जो HEK293 कोशिकाओं, पुनः संयोजक आयन चैनल का heterologous अभिव्यक्ति के लिए पसंदीदा प्रणाली के रूप में व्यापक स्वीकृति प्राप्त की. आदमी के बीचआयन चैनल इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के लिए चुनाव प्रणाली के रूप में HEK293 कोशिकाओं बुलंद है कि y फायदे आसानी और संवर्धन की खरीदने की क्षमता हैं और लंबे समय रहते स्थिर संस्कृतियों को बनाए रखने, बाद translational तह, प्रसंस्करण और स्तनधारी प्रोटीन की तस्करी से बाहर ले जाने के लिए उनकी क्षमता, और कई मामलों में , उनके कम स्तर या ब्याज 7, 8 चैनल के लिए अंतर्जात अभिव्यक्ति की भी अभाव. पुनः संयोजक आयन चैनल व्यक्त करने और HEK293 कोशिकाओं में उनके कार्यात्मक गुणों का अध्ययन संरचना समारोह आयन चैनल के गुणों के साथ ही आयन चैनल isoforms और देशी ऊतक में उनकी भूमिकाओं के विशिष्ट गुणों के बारे में जानकारी प्राप्त करने के लिए एक मूल्यवान दृष्टिकोण होना जारी है. इस आलेख में वर्णित प्रोटोकॉल HEK293 कोशिकाओं में व्यक्त पुनः संयोजक आयन चैनलों के लिए और देशी आयन चैनलों के लिए समान रूप से अच्छी तरह से लागू किया जा सकता है.

संक्षेप में, अपने अभूतपूर्व क्षमता के माध्यम से पैच दबाना तकनीक, संकेत हल करने के लिएएक अणु से है, आज तक, एकल अणुओं के व्यवहार के अवलोकन के लिए सबसे प्रत्यक्ष विधि बनी हुई है. अपने सेल संलग्न मोड में, पैच दबाना रिकॉर्डिंग एक अणु के लिए जब किया, आयन चैनल के आपरेशन में असाधारण अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं, जो लंबे समय से अवलोकन अवधि की अनुमति देता है. नीचे एक आयन चैनल प्रोटीन युक्त सेल संलग्न पैच से उच्च संकल्प वर्तमान रिकॉर्डिंग प्राप्त करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है.

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Protocol

1. सेल संस्कृति और प्रोटीन अभिव्यक्ति

  1. HEK293 कोशिकाओं 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ पूरक DMEM में monolayer संस्कृति में, ATCC द्वारा निष्पादित मार्ग भी शामिल है जो अंश 22 और 40 के बीच (ATCC संख्या सीआरएल-1573), और 5% सीओ 2 में 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन मिश्रण बनाए रखें और 37 डिग्री सेल्सियस प्रयोगों के बीच, 10 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा में 5-20 गुना dilutions में T25 बोतल में पारित होने कोशिकाओं. नोट: इन मार्ग दौरान कोशिकाओं का प्रयोग इष्टतम मुहर गठन और पैच स्थिरता के लिए अनुमति देगा जो अनुकूल सेल स्वास्थ्य की गारंटी देता है.
  2. अभिकर्मक के लिए, पकवान प्रति सेल निलंबन के लिए ~ 0.5-0.6 मिलीग्राम मेल खाती है ~ 10 5 कोशिकाओं / पकवान की एक घनत्व, पर 35 मिमी व्यंजन में HEK293 कोशिकाओं की थाली और 18-24 घंटे के लिए 2 मिलीलीटर मध्यम में कोशिकाओं को विकसित.
  3. एक बाँझ 1.5 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में, (इस क्रम में) जोड़कर चार 35 मिमी व्यंजन के लिए अभिकर्मक मिश्रण तैयार: प्रत्येक सीडीएनए (GluN1, GluN2A, और GFP) के (1) 1 ग्राम; (2) 315 μl कीदोहरा आसुत जल (DDH 2 हे); (2 hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic एसिड (HEPES), और वेग के लिए फार्म का प्रयोग किया जाता है जो बुद्धिमान 2.5 एम 2 CaCl ड्रॉप, (4) 35 μl - (3) 350 42 मिमी 4 के μl.
  4. भंवर 5 सेकंड के लिए ट्यूब और चार 35 मिमी व्यंजन में से प्रत्येक में अभिकर्मक निलंबन की 175 μl जोड़ने अब 50-60% संगम पर कोशिकाओं शामिल है, और 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं सेते हैं जो एक दिन पहले, चढ़ाया.
  5. अभिकर्मक मध्यम बंद महाप्राण, पीबीएस के साथ धोने और NMDA रिसेप्टर excitotoxicity 9 मध्यस्थता को रोकने के लिए 2 मिमी 2 MgCl के साथ पूरक मध्यम विकास के 2 मिलीलीटर के साथ बदलें. नोट: कोशिकाओं electrophysiological रिकॉर्डिंग 24-48 घंटे बाद अभिकर्मक के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

2. इलेक्ट्रोड तैयारी

  1. एक ऊर्ध्वाधर खींचने के साथ borosilicate ग्लास ट्यूब पर खींच कर 2 सममित रिकॉर्डिंग pipettes उत्पन्न करें. जिसके परिणामस्वरूप टिप के आकार और ज्यामिति, आगे आकार pipettes के आधार परएक पालिशगर का उपयोग कर. नोट: टिप आकार नेत्रहीन और विद्युत का मूल्यांकन किया जा सकता है. नेत्रहीन, बाहरी व्यास 1.4-5.6 माइक्रोन सीमा में होना चाहिए. विद्युत, एक इष्टतम आकार टिप, कोशिकी समाधान के साथ भरा है, जब (चित्रा 2B देखें) 12-24 MΩ रेंज में प्रतिरोधों का उत्पादन करना चाहिए.
  2. सेल संलग्न प्रयोगों के लिए अधिक से अधिक चैनल गतिविधि और उच्च वर्तमान आयाम उत्पादन होगा कि बाह्य परिवेश का प्रतिनिधित्व करता है जो एक विंदुक समाधान, का प्रयोग करें. नोट: NMDA रिसेप्टर्स के लिए, इस एगोनिस्ट (ग्लूटामेट और ग्लाइसिन), द्विसंयोजक cationic inhibitors और ब्लॉकर्स chelates जो 1 मिमी EDTA, के saturating सांद्रता युक्त समाधान से मेल खाती है, और एकमात्र permeant आयन (के रूप में सोडियम की शारीरिक सांद्रता (150 मिमी) है मिमी में: 1 ग्लूटामेट, 0.1 ग्लाइसिन, 150 NaCl, 2.5 KCl, 1 एन NaOH के साथ 8.0 पीएच पर बफर 1 EDTA, और 10 HEPBS,).

3. सेल संलग्न पैच दबाना रिकॉर्डिंग

  1. ओपन QuB डाटा अधिग्रहण softwa(www.qub.buffalo.edu) फिर से, और 'लेआउट' के तहत अधिग्रहण की खिड़की का चयन करें. हकदार ड्रॉप डाउन मेनू 'फ़ाइल' के तहत 'नया डेटा' पर क्लिक करके एक नया QuB डेटा फ़ाइल (QDF) खोलें और निम्न प्रारंभिक पैरामीटर दाखिल: नमूना दर, 40 kHz; ए / डी स्केलिंग, 3000; उत्पादन चैनल, 1; और ए / डी डेटा आकार, 2., डेटा फ़ाइल राइट क्लिक करके गुण का चयन, और 'डेटा' टैब पर क्लिक करके 0.1 वी / पीए को आयाम स्केलिंग को समायोजित करें. नोट: ये पैरामीटर सेल संलग्न मोड में एक मॉडल सेल का उपयोग करते हुए प्रत्येक स्थापना के लिए परिष्कृत किया जा सकता है. QuB सॉफ्टवेयर और QDF गुणों के साथ डाटा अधिग्रहण पर अतिरिक्त अनुदेश www.qub.buffalo.edu पर ऑनलाइन कर रहे हैं.
  2. कोशिकाओं को व्यक्त आयन चैनल युक्त एक 35 मिमी पकवान का चयन करें और कैल्शियम और मैग्नीशियम युक्त 2 मिलीलीटर पीबीएस के साथ मध्यम विकास की जगह; खुर्दबीन मंच पर पकवान माउंट और कोशिकाओं को स्वस्थ हैं और अच्छी तरह से पकवान से जुड़ी है कि मूल्यांकन करने के लिए चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी का उपयोग सेलुलर क्षेत्र पर ध्यान केंद्रितmonolayer फैशन (चित्रा 1 ए) में. अभिकर्मक (चित्रा 1 बी) सफल रहा है, इसकी पुष्टि करने के लिए प्रतिदीप्ति का पता लगाने के लिए स्विच. नोट: प्रतिदीप्ति तीव्रता की रेंज प्रोटीन अभिव्यक्ति के एक कच्चे उपाय के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है.
  3. एक चैनल रिकॉर्डिंग के लिए, X10 के लिए एम्पलीफायर उत्पादन लाभ, = 1 β के लिए पैच विन्यास, 10 kHz करने के लिए अनुरूप फिल्टर, दबाना वोल्टेज मोड सेट और 100 एम वी वोल्टेज लागू किया. रवाना की स्थिति में वोल्टेज होल्डिंग आदेश के साथ, 'मुहर परीक्षण' बटन का चयन करें.
  4. प्रतिदीप्ति और सेल स्वास्थ्य के आधार पर, पैच करने के लिए एक सेल का चयन करें. सेल अच्छी तरह से पकवान से जुड़ा हुआ है कि चरण विपरीत तहत सत्यापित करें, पट्टी के लिए खुल कोशिका की सतह का एक बड़ा हिस्सा है और अन्यथा स्वस्थ लग रहा है. नोट: दृष्टिकोण और पैच clamping के दौरान सेल विरंजन से बचने के लिए चरण विपरीत रोशनी बनाए रखें.
  5. यह Electrod के साथ संपर्क में आता है तो सिर्फ पर्याप्त समाधान के साथ एक हौसले पॉलिश पिपेट भरेंई और धीरे से मिलाने टिप में फंस जा सकता है कि हवाई बुलबुले बेदखल करने के लिए. पिपेट धारक की सीलिंग पेंच कस और चांदी के तार पिपेट समाधान में डूब जाता है कि यकीन है कि बनाकर एम्पलीफायर headstage पर रिकॉर्डिंग पिपेट सुरक्षित.
  6. ट्यूबिंग द्वारा पिपेट धारक से जुड़ा है जो एक छोटे (5 सीसी) प्लास्टिक सिरिंज, का प्रयोग धीरे (2A चित्रा) में प्रवेश करने और दृष्टिकोण दौरान टिप clogging से अशुद्धियों को रोकने के लिए सकारात्मक दबाव लागू होते हैं.
  7. Micromanipulator का उपयोग, स्नान में पिपेट प्रत्यक्ष और बिजली के सर्किट बंद (चित्रा 1C) पट्टी के लिए चयनित कक्ष के ऊपर सीधे यह स्थिति. एम्पलीफायर की मुहर परीक्षण संकेत (चित्रा 2 बी) को इसी एक आयताकार तरंग संकेत चाहिए, जो आस्टसीलस्कप का ध्यान रखना. नोट: स्नान में प्रवेश पर, इष्टतम सीमा के भीतर पिपेट प्रतिरोध 12-24 MΩ है. एक 5 एम वी परीक्षण के संकेत के लिए, मापा वर्तमान rAnge ~ 20-40 पीए से मेल खाती है.
  8. आस्टसीलस्कप पर विद्युत माइक्रोस्कोप और पिपेट प्रतिरोध के माध्यम से नेत्रहीन पिपेट स्थिति की निगरानी करते हैं, पिपेट सेल पर धीरे impinges तक छोटे वेतन वृद्धि में दृष्टिकोण जारी है, और परीक्षण के संकेत बढ़ा प्रतिरोध (चित्रा 2B) से संकेत मिलता है थोड़ा कम हो जाती है.
  9. , एक सील फार्म सिरिंज लेने और रिकॉर्डिंग पिपेट की नोक में सेलुलर झिल्ली खींचती है और एक GΩ प्रतिरोध मुहर 10 का गठन शुरू जो सिरिंज सवार, खींच कर पार्श्व ट्यूबिंग के माध्यम से मामूली नकारात्मक दबाव लागू करने के लिए. सील गठन दिखाई केवल capacitive यात्रियों चित्रा (2 बी) के साथ अपने पूर्ण सपाट ने संकेत दिया है जिसमें आस्टसीलस्कप पर परीक्षण संकेत तरंग, का ध्यान रखना. नोट: संकेत पूरी तरह से समतल नहीं है या आधारभूत शोर हो जाता है, तो इस मुहर के आसपास पर्याप्त वर्तमान रिसाव के साथ एक कमजोर मुहर इंगित करता है. इस अनुसंधान को रोकने जाएगाएक चैनल धाराओं esolving. यदि यह मामला है, सेल से विंदुक वापस लेने और दूर से स्नान, सिर मंच से हटा दें और इसे त्यागने. पर्याप्त रेंज (≥ 1 GΩ) में एक मुहर प्राप्त करने के लिए जब तक एक हौसले पॉलिश विंदुक के साथ इस प्रक्रिया को दोहराएं.
  10. एम्पलीफायर पर, 'बंद' को 'सील परीक्षण' से बाहरी कमांड टॉगल स्विच; ('बंद' करने के लिए पहले से निर्धारित किया गया है) सकारात्मक वोल्टेज पकड़े आदेश स्विच; और X100 के लिए लाभ में वृद्धि. अगर मौजूद है, पहले से फ्लैट आधारभूत (चित्रा -2) से वर्ग को ऊपर की ओर deflections के रूप में प्रदर्शित किया जाएगा, जो चैनल गतिविधि के लिए आस्टसीलस्कप, ध्यान से देखें.
  11. चैनल गतिविधि आस्टसीलस्कप पर प्रदर्शित किया जाता है, 'रिकॉर्ड' बटन के बाद 'प्ले' बटन दबाकर, QuB में पहले से खोला डिजिटल फाइल में डेटा प्राप्त. , डेटा प्राप्त रोक QuB में रोक बटन दबाएँ, और एक आसानी से retriev को QDF फ़ाइल को बचाने के लिए'फ़ाइल' हकदार ड्रॉप डाउन मेनू में 'सेव डेटा के रूप में ...' का चयन करके कंप्यूटर की हार्ड ड्राइव पर सक्षम स्थान.

4. पूर्वप्रक्रमन और आदर्श बनाना

नोट: महत्वपूर्ण जानकारी (सरल मामले में, बंद है या खुला) एक उपयुक्त प्रवाहकत्त्व वर्ग के लिए प्रत्येक डेटा बिंदु प्रदान करती है जो सांख्यिकीय विश्लेषण द्वारा एक चैनल रिकॉर्डिंग से निकाला जा सकता है. इस प्रक्रिया डेटा आदर्श बनाना और कमानी कश्मीर साधन (एसकेएम) QuB में विधि 11 नीचे वर्णित है साथ डेटा आदर्शीकरण का एक संक्षिप्त विवरण के रूप में जाना जाता है.

  1. QuB में डेटा फ़ाइल खोलें, और 'लेआउट' के अंतर्गत 'पूर्व' अंतरफलक में वर्तमान निशान देखने. लेबल बॉक्स करें द्वारा (डिजिटल फिल्टर हटाने) अनफ़िल्टर्ड दर्ज फ़ाइल प्रदर्शन 'एफसी.'
  2. दिखने में अनियमितताओं और कलाकृतियों (चित्रा -4 ए) हाजिर करने के लिए रिकॉर्ड को स्कैन. सही संक्षिप्त मौजूदा spikes कि occuआर ट्रेस भीतर, एक ही प्रवाहकत्त्व वर्ग का एक आसन्न साफ क्षेत्र का चयन इस क्षेत्र पर प्रकाश डाला, राइट क्लिक करके और चयन करके (चित्रा -4 ए) 'सेट मिटा बफर.' व्यक्तिगत नमूना अंक दिखाई दे रहे हैं जब तक कील पर ज़ूम, प्रतिस्थापित किया जाना क्षेत्र का चयन करें और केवल इस क्षेत्र पर प्रकाश डाला और फिर 'मिटा' राइट क्लिक करके मिटा.
  3. आधारभूत स्थिर है जहाँ रिकॉर्ड का एक प्रारंभिक भाग का चयन करके पूरे रिकॉर्ड के लिए शून्य वर्तमान आधारभूत परिभाषित करें, उजागर, राइट क्लिक करें और 'सेट आधारभूत' का चयन करें. सही प्रतीत होता है जो दिशानिर्देश (4B चित्रा में बैंगनी) आधारभूत स्तर का प्रतिनिधित्व करता है कि सत्यापित करें
  4. कच्चे डेटा बेस लाइन सेट आधारभूत से दिख भटक जहां रिकॉर्ड में बिंदुओं की पहचान. Deviating क्षेत्र के अंतर्गत आधारभूत का एक छोटा सा वर्ग का चयन करके यह सही है, राइट क्लिक करें और 'एक आधारभूत नोड जोड़ने के' आदेश का चयन करें.
  5. टी के क्षेत्रों की पहचानवह आसानी से (चित्रा 4C) सही नहीं किया जा सकता है कि अतिरिक्त शोर या कलाकृतियों युक्त रिकॉर्डिंग. त्याग किया क्षेत्र हाइलाइट करें, ठीक क्लिक करें, और चुनें 'को हटा दें.' नोट: इस मामले में गतिज जानकारी खो जाएगा: संसाधित रिकॉर्ड कम हो जाएगा और ब्याह बाद होने वाली अंक पूर्व शोर क्षेत्र के साथ निरंतर हो दिखाई देगा.
  6. एसकेएम एल्गोरिथ्म 11 का उपयोग करते हुए रिकॉर्ड आदर्श बनाना, खुला और घटनाओं को बंद कर दिया जिसमें दोनों का पता लगाने के एक हिस्से पर प्रकाश डाला और तहत 'आधुनिक' इंटरफेस में प्रवेश 'लेआउट.' "मॉडल" पैनल में, काले वर्ग (बंद राज्य) राइट क्लिक करें और "पकड़ो" का चयन करें, फ़ाइल भर में आधारभूत का प्रतिनिधि है कि पता लगाने के लिए एक साफ हिस्से पर प्रकाश डाला. खुले प्रवाहकत्त्व को उजागर करके चैनल के उद्घाटन के लिए एक ही है, ठीक है "मॉडल" पैनल में लाल चौक पर क्लिक करें और "पकड़ो" का चयन करें.
  7. Idealiza प्रदर्शन करनाके तहत 'फ़ाइल' बटन का चयन करके पूरे रिकॉर्ड के लिए tion 'डेटा स्रोत.' विश्लेषण के लिए वांछित मापदंडों सही हैं सत्यापित करें कि, और उसके बाद क्लिक करने के लिए 'मॉडलिंग' अनुभाग के नीचे 'आदर्श बनाना' टैब पर राइट क्लिक करें 'भागो.' आदर्शीकरण का परिणाम है, पूरी फ़ाइल के लिए आयाम हिस्टोग्राम के साथ, आदर्शीकरण के दृश्य निरीक्षण (चित्रा 5) के लिए अनुमति देने के लिए डेटा के साथ मढ़ा है. नोट: अपर्याप्त आदर्श बनाना QuB चैनल के उद्घाटन और वास्तव में नहीं होती है कि क्लोजर का पता लगाता है, जिसमें 'झूठी घटनाओं,' की पीढ़ी को जन्म दे सकती है. एम्पलीफायर के अनुरूप फिल्टर और नमूना दर से सेट किया जाता है, जो रिकॉर्डिंग संकल्प, भीतर, एसकेएम खुले और बंद की घटनाओं का पता लगाता है, जिसके साथ संकल्प विश्लेषण के लिए एक मृत समय सेट के द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है. इष्टतम मृत बार परीक्षण और त्रुटि के द्वारा चुना जाना चाहिए और नमूना दर पर निर्भर करेगा, हालांकि, अंगूठे का एक अच्छा नियम है2-3 नमूने 12 है कि एक मरे हुए समय का चयन करने के लिए.
  8. आदर्श बनाना सही कच्चे डेटा का प्रतिनिधित्व करता है, इसकी पुष्टि करने के लिए मैन्युअल idealized ट्रेस स्कैन. आदर्शीकरण में त्रुटियों की पहचान पर, झूठी घटना पर ट्रेस उजागर, ठीक क्लिक करें और चुनें 'आईडीएल में शामिल हों.' नोट: अतिरिक्त विकल्प और QuB में विभिन्न कमानों और कार्यों का विस्तृत विवरण के लिए, QuB मैनुअल ऑनलाइन (www.qub.buffalo.edu) से परामर्श करें.

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Representative Results

संयोजक NMDA रिसेप्टर्स

NMDA रिसेप्टर्स बाँध और दो सह agonists के सहवर्ती कार्रवाई का जवाब: ग्लूटामेट और ग्लाइसिन. वे GluN1 सब यूनिटों और GluN2 सब यूनिटों बंधन दो ग्लूटामेट बंधन दो ग्लाइसिन के heterotetramers के रूप में इकट्ठा. GluN2 सब यूनिटों दिमाग में सबसे व्यापक रूप से लिखित रूपों किशोर जानवरों में वयस्क और GluN2B में GluN2A हैं चार जीनों (ई.) द्वारा और इनमें से इनकोडिंग हैं. क्योंकि (चित्रा 1 ए) सबयूनिट संरचना का नियंत्रण है, साथ ही एक पतले पॉलिश कांच विंदुक (चित्रा 1C) का उपयोग चैनलों से मौजूदा रिकॉर्ड करने की क्षमता के लिए अनुमति देता है HEK293 कोशिकाओं में रिसेप्टर्स व्यक्त देशी तैयारी में NMDA रिसेप्टर उपप्रकार, की विविधता की.

पिपेट सेल से छू जाने के बाद, परीक्षण नाड़ी तरंग के आयाम में एक स्पष्ट कमी एक मुहर फार्म की क्षमता का संकेत है, चित्रा (2 बी) में होता है. एक युक्त एक पर्याप्त मुहरचैनल एक सकारात्मक वोल्टेज (चित्रा -2) के आवेदन पर शोर अनुपात करने के लिए एक अच्छा संकेत के साथ, आधारभूत से नीचे deflections के रूप में प्रदर्शित स्पष्ट चैनल गतिविधि, उत्पादन करता है. दोनों एगोनिस्ट उच्च सांद्रता में मौजूद हैं जब जंगली प्रकार पुनः संयोजक NMDA रिसेप्टर्स के लिए अधिक से अधिक चैनल गतिविधि प्राप्त किया जा सकता है, और inhibitors और चैनल ब्लॉकर्स अनुपस्थित रहे हैं. एक पैच एक से अधिक चैनल हैं, तो एक साथ खुलने के तुरंत स्पष्ट कर रहे हैं 13 (3B चित्रा) इतना है कि यह आदर्श है. चैनल खुला संभावना जाना जाता है या 14 approximated किया जा सकता है, तो बहुत कम गतिविधि के स्तर के साथ प्रोटीन के लिए, एक स्तर के उद्घाटन के एक खंड में केवल एक चैनल से निकलती है कि संभाव्यता की गणना की जा सकती है. इस वजह से, अब प्रेक्षण अवधि आवश्यक हो सकता है.

इन शर्तों के तहत, और (-120 एम वी की एक अनुमानित झिल्ली क्षमता के प्रमुख) 100 एम वी के एक पिपेट होल्डिंग क्षमता जब आवेदन, सीngle पुनः संयोजक GluN1/GluN2A और GluN1/GluN2B एक अपेक्षाकृत उच्च प्रवाहकत्त्व स्तर (> 50 पी एस) (आंकड़े 3 ए और 5 ब) 15-17 को उच्च संभावना (पी ओ, 0.3-0.5) के साथ खुले हैं. जब रिकॉर्डिंग, वर्तमान शोर spikes, आधारभूत drifts, या अत्यधिक शोर की अवधि संक्षिप्त और मामूली अगर इन सुधारा जा सकता है, उल्लेख किया है तथापि के रूप में, (आंकड़े -4 ए सी) प्रकट हो सकता है. यह चैनल गतिविधि चैनल व्यवहार की पूरी चौड़ाई पर कब्जा कर लिया है कि गारंटी करने के लिए समय की एक पर्याप्त राशि (≥ 10 मिनट, 10,000 घटनाओं) के लिए निर्बाध दर्ज की गई है, तथापि, महत्वपूर्ण है.

ऐसे रिकॉर्डिंग से प्राप्त आंकड़ों चैनल कैनेटीक्स और पारगमन गुण दोनों के बारे में जानकारी प्रदान कर सकते हैं. यहाँ, हम हालांकि डेटा आदर्श बनाना, ऐसे pClamp के रूप में अन्य सॉफ्टवेयर प्रोग्राम का उपयोग कर प्रदर्शन या 12 स्कैन किया जा सकता है, एसकेएम एल्गोरिथ्म (चित्रा 5A) का उपयोग QuB द्वारा प्रदर्शन आदर्शीकरण का प्रदर्शन एकएन डी के अपने फायदे और नुकसान से युक्त इन विकल्पों में से प्रत्येक के साथ, अलग एल्गोरिदम या इस तरह के आधा सीमा पद्धति के रूप में मानदंड का उपयोग किया जा सकता है. गतिज मॉडल के लिए इन आंकड़ों की फिटिंग आयन चैनल के व्यवहार में और अधिक जानकारी हासिल करने के लिए किया जा सकता है. अधिकतम संभावना फिटिंग प्रत्येक कार्यक्रम द्वारा कार्यान्वित एल्गोरिदम अपने स्वयं के लाभ है, जिसमें इस तरह के QuB के रूप में सॉफ्टवेयर या HJCFIT 18 के साथ प्रदर्शन किया जा सकता है. चित्रा 5 में प्रदर्शन आदर्शीकरण केवल एक आयन चैनल के लिए एक पूर्ण गतिज मॉडल ढाले प्रदर्शन किया जाएगा, एक बंद राज्य की सरल संभव मॉडल और एक खुला राज्य की आवश्यकता है जबकि एक निश्चित कसौटी पर पहुँचने तक क्रमिक रूप से जोड़ने के बंद और खुले राज्यों की आवश्यकता है. यह प्रक्रिया, जंगली प्रकार GluN1/GluN2A रिसेप्टर्स पांच kinetically अलग बंद राज्यों और दो ​​से चार kinetically अलग खुला राज्यों (चित्रा 5C) है कि 19 का प्रदर्शन किया है, जिसमें इनgating विशेषताओं synaptic संकेत 20, 21 मध्यस्थता NMDA रिसेप्टर के आकार का निर्धारण करने के लिए महत्वपूर्ण हैं. विश्लेषण की यह शैली उनकी अपनी अलग gating तंत्र 22,23,24 को जानकारी हासिल करने के लिए, ऐसे AMPA रिसेप्टर्स के रूप में छोटे प्रवाहकत्त्व के अन्य आयन चैनल, के लिए बढ़ाया जा सकता है. AMPA रिसेप्टर्स QuB का उपयोग सफल आदर्शीकरण अतिरिक्त राज्यों एक prebuilt मॉडल में शामिल कर रहे हैं की आवश्यकता हो सकती एकाधिक प्रवाहकत्त्व स्तर, के बाद से एक चेतावनी है, हालांकि, है.

इन तरीकों में भी permeating आयन रचना और / या एकाग्रता बदलकर आयन चैनल पारगमन और प्रवाहकत्त्व के बारे में जानकारी हासिल करने के लिए बढ़ाया जा सकता है. यहाँ वर्णित तरीकों का उपयोग कर एक GluN1/GluN2A रिसेप्टर्स के माध्यम से गतिविधि रिकॉर्डिंग, लेकिन रिकॉर्डिंग पिपेट में 75 मिमी 2 CaCl साथ 150 मिमी NaCl, की जगह (~ 10 पीएस) प्रवाहकत्त्व के 20% ~ साथ धाराओं पैदावार. यह दर्शाता है कि कैल्शियम नमस्ते NMDA रिसेप्टर्स व्याप्त है, जबकिशारीरिक स्थितियों में जी एच स्तर, यह वास्तव में पारगमन मार्ग के भीतर एक संभावित कैल्शियम बाध्यकारी साइट हो सकता है, यह दर्शाता है और धीरे धीरे सोडियम आयनों की तुलना में चैनल बहती है. साथ ही, यह छोटे प्रवाहकत्त्व के बावजूद, रिकॉर्डिंग पर्याप्त रूप से मुख्य प्रवाहकत्त्व स्तर की वर्तमान आयाम (आंकड़े 6A और बी) के बारे में 50% है जो एक मध्यवर्ती sublevel प्रवाहकत्त्व, के अस्तित्व का अनावरण, QuB में एसकेएम कलन विधि का उपयोग idealized किया जा सकता है. एक अतिरिक्त प्रवाहकत्त्व वर्ग प्रारंभिक गतिज मॉडल में शामिल किया है जब इन sublevel उद्घाटन, तथापि, केवल QuB में idealized किया जा सकता है. इसके अलावा गतिज विश्लेषण इन परिस्थितियों में, रिसेप्टर्स अभी भी हालांकि इन राज्यों चैनल केवल सोडियम आयनों (चित्रा 6C) गुजरता है जब की तुलना में बेहद अलग समय स्थिर और ऑक्यूपेंसी है, पांच kinetically अलग बंद राज्यों का प्रदर्शन, कि पता चला. इसके अलावा, केवल दो खुला राज्यों यू मनाया जाता हैnder प्रदर्शन है कि इन स्थितियों, चैनल प्रवाहकत्त्व को प्रभावित करने के अलावा, कैल्शियम आयनों रिसेप्टर gating मिलाना करने में सक्षम हैं.

केवल एक चैनल पैच प्राप्त करने के लिए कोई निश्चित तरीका नहीं है. इसके बजाय, कई प्रयोगात्मक जोड़तोड़ सफलता की संभावना बढ़ाने के लिए योगदान कर सकते हैं. सबसे पहले, ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं (चित्रा 1 बी) के प्रतिदीप्ति तीव्रता का मूल्यांकन द्वारा चैनल अभिव्यक्ति की कम स्तर के लिए लक्ष्य. ; अभिकर्मक के लिए या GluN1 है, के रूप में एक आवश्यक सबयूनिट के लिए सीडीएनए की मात्रा को कम करने के लिए इस्तेमाल किया सीडीएनए की कुल राशि में कमी: सफल दृष्टिकोण करने के लिए हो सकता है डीएनए / कैल्शियम फॉस्फेट वेग के साथ ऊष्मायन के समय को कम करने के लिए; और देखने के क्षेत्र से केवल dimly फ्लोरोसेंट कोशिकाओं पट्टी के लिए चयन करने के लिए. प्राप्त पैच अक्सर कई चैनलों होते अगर इन तरीकों अपनाई जानी चाहिए. इसके अलावा, पिपेट टिप का आकार कम भी patc में केवल एक चैनल को फँसाने के लिए योगदान कर सकते हैंज. अंततः हालांकि, एक व्यवस्थित ढंग से स्पष्ट रूप से एक से अधिक चैनल होते हैं कि पैच से लंबी अवधि के लिए रिकॉर्ड करने से रोकने के द्वारा एक चैनल पैच प्राप्त करने में सफल हो जाता है.

संयोजक PIEZO1 चैनल

इस प्रोटोकॉल में वर्णित विधियों आसानी से किसी भी ligand gated आयन चैनल के लिए लागू किया जा सकता है, और वास्तव में रसायन, वोल्टेज, बल, तापमान, या अन्य साधनों से सक्रिय है, चाहे किसी भी आयन चैनल से एक चैनल गतिविधि को रिकॉर्ड करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. इस प्रोटोकॉल अन्य आयनों चैनलों से एक चैनल धाराओं रिकॉर्ड करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है की एक उदाहरण है, विशेष रूप से माउस PIEZO1, एक mechanosensitive आयन चैनल, चित्रा (7) 25, 26 के नीचे प्रस्तुत है.

NMDA रिसेप्टर चैनल के साथ के रूप में, PIEZO1 और GFP कैल्शियम फॉस्फेट की मध्यस्थता अभिकर्मक से HEK293 कोशिकाओं में व्यक्त कर रहे हैं और कोशिकाओं के रूप में 24-48 घंटे बाद अभिकर्मक उपयोग किया जाता हैखंड 1.2 में वर्णित है. PIEZO1 झिल्ली खिंचाव से सक्रिय है क्योंकि उपलब्ध होना चाहिए, देखभाल पैच गठन और लागू यांत्रिक शक्ति के वितरण और नियंत्रण के लिए उपयुक्त उपकरणों के दौरान धीरे झिल्ली में हेरफेर करने के लिए लिया जाना चाहिए. इन शर्तों 2-3 MΩ रेंज में प्रतिरोध के साथ, बड़ा रिकॉर्डिंग pipettes बनाने और एम्पलीफायर headstage पर विंदुक धारक के माध्यम से रिकॉर्डिंग पिपेट से जुड़े एक उच्च गति दबाव दबाना डिवाइस (HSPC) का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है. एम्पलीफायर सेटिंग्स एम्पलीफायर अधिग्रहण सॉफ्टवेयर के माध्यम से नियंत्रित किया जा सकता है, ताकि 'बाहरी' कमांड घुंडी पर जाने के लिए छोड़कर, धारा 3.3 में NMDA रिसेप्टर्स के लिए वर्णित उन लोगों के लिए समान हैं.

, PIEZO1 से गतिविधि रिकॉर्ड (मिमी) से भरा एक रिकॉर्डिंग पिपेट का उपयोग करने के लिए: 130 NaCl, 5 KCl, 10 HEPES, 1 2 CaCl, 1 2 MgCl, 10 चाय सीएल, NaOH के साथ 7.3 पीएच. इन शर्तों के तहत, उद्घाटन मैं के रूप में नजर रखी जा सकतीएक शून्य वर्तमान आधारभूत से नीचे deflections रूप आस्टसीलस्कप पर दिखाई देगा जो nward सोडियम धाराओं,. एम्पलीफायर सिर मंच पर रिकॉर्डिंग पिपेट प्लेस और HSPC पर डायल शून्य पर है सुनिश्चित करें. स्नान में प्रवेश करने से पहले, सकारात्मक दबाव के 3-5 mmHg लागू होते हैं. Micromanipulator का उपयोग, स्नान में पिपेट कम वांछित पिपेट प्रतिरोध के लिए जाँच, और धारा 3.6 में वर्णित के रूप में चयनित कक्ष के पास पिपेट लाना. धीरे माइक्रोस्कोप मार्गदर्शन में सेल स्पर्श और NMDA रिसेप्टर्स (धारा 3.7) के लिए किया रूप आस्टसीलस्कप निगरानी के द्वारा, इसी तरह फैशन में सील परीक्षण तरंग के आयाम में मामूली कमी निरीक्षण करते हैं. जल्दी से 3-5 करने के लिए 0 mmHg से दबाव होल्डिंग स्तर बदलकर पिपेट के माध्यम से लागू सकारात्मक दबाव जारी है. सील परीक्षण लहर फार्म की निगरानी के द्वारा फार्म करने के लिए एक GΩ मुहर के लिए प्रतीक्षा करें. इस मामले में, कोई नकारात्मक दबाव एक मुहर के रूप में लागू किया जाता है. एक इष्टतम सील और प्रेस प्राप्त हो जाने के बाद# 8216;. डेटा प्राप्त शुरू करने के लिए QuB में रिकॉर्ड 'बटन 7 पैच विंदुक का दबाव -20 mmHg लगाने से सक्रिय mPIEZO1 एकल चैनल धाराओं के एक प्रतिनिधि ट्रेस पता चलता है. इन धाराओं 2 kHz पर फ़िल्टर और 20 kHz पर नमूना कम पास थे.

कोशिकी ligand बाध्यकारी डोमेन के साथ ligand gated चैनलों के विपरीत, mechanosensitive चैनलों को सक्रिय प्रोत्साहन 2 प्रोटोकॉल के तहत विभिन्न जा सकता है. पहला है 'अंतराल मुक्त,' एक निरंतर नकारात्मक दबाव पूरी रिकॉर्डिंग की अवधि के लिए पैच को लागू किया जाता है जहां. इस प्रोटोकॉल मिनट लंबा रिकॉर्डिंग प्राप्त करने में उपयोगी है और झिल्ली अखंडता की रक्षा जो छोटे दबाव उत्तेजनाओं (0-20 एमएमएचजी), के साथ सबसे सफल है. झिल्ली टूटना की संभावना है जो उच्च दबाव, द्वारा उत्पादित गतिविधि, सबसे अच्छा अलग दबावों की दालों कम समय अवधि के लिए पैच पर लागू किया जा सकता है, जहां 'प्रासंगिक' रिकॉर्डिंग, (<के साथ प्राप्त की हैमजबूत> चित्रा 7). Ligand gated चैनलों के साथ के रूप में, सेल से रिकॉर्डिंग एक चैनल पैच प्रवाहकत्त्व और जांच के तहत चैनल के gating गुण दोनों के बारे में जानकारी का खजाना प्रदान संलग्न.

Neuronal NMDA रिसेप्टर्स

सेल संलग्न एक चैनल रिकॉर्डिंग के लिए विधि यहाँ वर्णित एक विशेष सेल प्रकार और / या विकास मंच के प्रवाहकत्त्व और चैनलों अंतर्जात के gating संपत्तियों के बारे में जानकारी प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. कई अन्य heteromeric चैनलों के मामले में है, देशी NMDA रिसेप्टर्स की सटीक आणविक संरचना ज्ञात नहीं है. देशी तैयारी से प्राप्त उन लोगों के साथ ज्ञात रचना की पुनः संयोजक रिसेप्टर्स से प्राप्त परिणामों की तुलना करके, सबयूनिट संरचना और उनके पैतृक वातावरण में चैनल के समारोह में तैयार की या 17 का परीक्षण किया जा सकता है के बारे में परिकल्पना.

न्यूरॉन्स प्रीफ्रंटल से अलग थेचूहा भ्रूण की cortices और अप करने के लिए 6 सप्ताह 17 के लिए संस्कृति में विकसित. खंड 2.2 में पुनः संयोजक NMDA रिसेप्टर रिकॉर्डिंग के लिए वर्णित घटकों के अलावा, पिपेट समाधान भी क्रमश: देशी AMPA और GABA रिसेप्टर्स को बाधित करने CNQX (20 माइक्रोन) और bicuculline (10 माइक्रोन) निहित. संस्कृति की उम्र पर निर्भर करता है, देशी NMDA रिसेप्टर्स से प्राप्त रिकॉर्ड काफी अलग थे कि कैनेटीक्स का पता चला. जल्दी (चित्रा 8A, इन विट्रो में 5 दिन) से रिकॉर्डिंग संस्कृति और अधिक बारीकी से देर से (चित्रा 8B, इन विट्रो में 27 दिन) संस्कृतियों और अधिक बारीकी से GluN1/GluN2A रिसेप्टर्स के लिए वर्णित कैनेटीक्स सदृश (आंकड़े 3 ए से GluN1/GluN2B रिसेप्टर्स और रिकॉर्डिंग के लिए वर्णित कैनेटीक्स सदृश और 5 ए). इस अवलोकन NMDA रिसेप्टर अभिव्यक्ति isoforms की पैटर्न के साथ और कूल्हे में सेल संलग्न एक चैनल पैच से दर्ज धाराओं के सावधान characterizations के अनुरूप हैpocampal संस्कृतियों 16.

चित्रा 1
चित्रा 1. सेल संलग्न रिकॉर्डिंग के लिए एक HEK293 कक्ष का चयन. ए) एक 35 मिमी पकवान में सुसंस्कृत HEK293 कोशिकाओं खुर्दबीन मंच पर रखा और एक पैनल के रूप में ही दृश्य क्षेत्र से 40x बढ़ाई. बी) GFP प्रतिदीप्ति पर चरण विपरीत के साथ देखा जाता है ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं की पहचान करता है. तीर, GFP व्यक्त कि एक सेल इंगित करता है स्वस्थ दिखाई देता है, और रिकॉर्डिंग पिपेट दृश्य मार्गदर्शन में एक ठीक गति जोड़तोड़ का उपयोग कर चयनित सेल करने के लिए पास के इलाके में लाया जाता है पिपेट का उपयोग. सी) के लिए उत्तरदायी की स्थिति में है. एक देखने के लिए यहां क्लिक करें इस आंकड़े का बड़ा संस्करण.


चित्रा 2. सेल सील गठन संलग्न. ए) विंदुक धारक की ओर से जुड़ा एक छोटा सा सिरिंज 5 एम वी (0.5 kHz) पर है जो एम्पलीफायर परीक्षण, के जवाब में स्नान समाधान में डूबे पिपेट के माध्यम से पिपेट. बी) वर्तमान गुजर भीतर दबाव के मैनुअल नियंत्रण की अनुमति देता है 18 फिलीस्तीनी अथॉरिटी, और 28 MΩ की एक पिपेट आकार से मेल खाती है. सेल (बाएँ तीर), वृद्धि हुई पिपेट प्रतिरोध का संकेत मनाया वर्तमान कम हो जाती है, के स्तर को छू पर. पिपेट (सही तीर) के माध्यम से नकारात्मक दबाव लागू मुहर गठन शुरू और. सी) एक परीक्षण पल्स अनुपस्थित केवल capacitive यात्रियों को परीक्षण नाड़ी द्वारा उत्पादित संकेत कम कर देता है, और कोई वोल्टेज (0 वी), आधारभूत पिपेट के माध्यम से लागू किया जाता है (तीर के बाएँ) स्थिर है. सकारात्मक वोल्टेज (तीर, 100 एम वी) पीआर लागू करना चैनल के उद्घाटन से संकेत मिलता है कि स्टोकेस्टिक एकात्मक धाराओं oduces. लाल बिंदीदार रेखा शून्य वर्तमान आधारभूत इंगित करता है.

चित्रा 3
. चित्रा 3 GluN1/GluN2A रिसेप्टर्स से दर्ज सेल जुड़ी धाराओं ए) एक चैनल पैच:.. लगातार रिकार्डिंग की एक 50 सेकंड खंड एक समान आयाम बी करने के लिए चैनल के उद्घाटन दिखाता है) एकाधिक चैनल पैच: लगातार रिकार्डिंग की एक 50 सेकंड खंड पैच कम से कम 2 सक्रिय चैनल शामिल संकेत है कि दो आयाम स्तर तक चैनल के उद्घाटन दिखाता है. लाल बिंदीदार रेखा शून्य वर्तमान आधारभूत इंगित करता है. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

"> चित्रा 4
शोर spikes के लिए चित्रा 4. डाटा प्रोसेसिंग. ए) सुधार. मैन्युअल रूप से प्रदर्शन डेटा अनफ़िल्टर्ड और आधारभूत संकेत के साथ बाहरी संकेत (लाल) की जगह. विस्तारित दृश्य (मध्य) से पहले और (कम) के बाद एक कील दिखाता स्पाइक (लाल) आधारभूत बहाव के लिए आधारभूत संकेत. बी) सुधार के साथ बदल दिया गया था. प्रारंभिक रिकॉर्ड में आधारभूत के एक छोटे से क्षेत्र का चयन करें और पूरे रिकॉर्ड (बैंगनी लाइन) के लिए शून्य मौजूदा स्तर के रूप में सेट. एक छोटे से हिस्से का चयन करके सही आधारभूत बहाव आधारभूत (तीर) चली गई और एक आधारभूत नोड (बैंगनी सर्कल) नष्ट किया जा सकता है सही करने के लिए मुश्किल हो जाता है कि शोर आधारभूत (लाल) के साथ रिकॉर्ड की. सी) अब समय जोड़ने. देखने के लिए यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण.

चित्रा 5
चित्रा 5. डाटा आदर्श बनाना. ए) वर्तमान निशान (काला) सेल संलग्न पैच दबाना तकनीक के साथ ही सोडियम आयनों गुजर एक GluN1/GluN2A रिसेप्टर से दर्ज किए गए. आर्दश डेटा बिंदु (लाल) एक 30 सेकंड एक चैनल खंड के लिए सचित्र हैं. ये आदर्श बनाना सही है यह दर्शाता है कि अच्छी तरह से ओवरलैप. बी) वर्तमान आयाम के हिस्टोग्राम अच्छी तरह से शून्य पर चोटियों के साथ ही दो गाऊसी कार्य (0.02 ± 0.8 PA), बंद चैनल की घटनाओं का संकेत और 10.3 ± 1.3 में से वर्णन किया गया है कि एक वितरण को वर्णन पूरी रिकॉर्डिंग की अवधि (130 मिनट) के लिए खुला चैनल की घटनाओं का केवल एक ही प्रकार. सी का संकेत PA) बंद (बाएं) और खुले (सही) (ए) में दिखाया गया है पूरी रिकॉर्डिंग के लिए समय histograms ध्यान केन्द्रित करना. probabilhistograms (मोटी लाइनों) और व्यक्तिगत गतिज घटकों (पतली लाइनों) के लिए अल्पसंख्यक घनत्व समारोह मढ़ा जाता है और पाँच बंद राज्यों और तीन खुले राज्यों से युक्त एक मॉडल के लिए डेटा फिटिंग द्वारा गणना की गई. Insets बार लगातार (τ) और व्यक्तिगत गतिज घटकों में से प्रत्येक के लिए रिश्तेदार क्षेत्र (ए) प्रदान करते हैं.

चित्रा 6
एकल NMDA रिसेप्टर्स. ए) वर्तमान निशान (काला) के माध्यम से चित्रा 6. कैल्शियम धाराओं सेल संलग्न पैच दबाना तकनीक के साथ ही कैल्शियम आयनों गुजर एक GluN1/GluN2A रिसेप्टर से दर्ज किए गए. वर्तमान आयाम की idealized डेटा बिंदु (लाल) 30 सेकंड खंड के लिए सचित्र हैं. बी) हिस्टोग्राम अच्छी तरह से, (0 ± 0.3 प्रति वर्ष) शून्य पर चोटियों के साथ तीन गाऊसी कार्यों बंद का संकेत वर्णन किया गया है कि एक वितरण को वर्णनडी चैनल घटनाओं, 1.3 ± 0.4 पीए एक sublevel प्रवाहकत्त्व के लिए खुला चैनल घटनाओं का संकेत है, और 2.1 ± 0.3, मुख्य प्रवाहकत्त्व स्तर पर खुला चैनल घटनाओं का संकेत है. सी) बंद (बाएं), मुख्य प्रवाहकत्त्व स्तर खुला राज्य (मध्य) और sublevel प्रवाहकत्त्व खुला राज्य (सही) (ए) में दिखाया गया है पूरी रिकॉर्डिंग के लिए समय histograms ध्यान केन्द्रित करना. histograms (मोटी लाइनों) और व्यक्तिगत गतिज घटकों (पतली लाइनों) के लिए प्रायिकता घनत्व समारोह मढ़ा जाता है और पाँच बंद राज्यों, दो मुख्य प्रवाहकत्त्व स्तर खुला राज्यों और एक sublevel प्रवाहकत्त्व खुला राज्य युक्त एक मॉडल के लिए डेटा फिटिंग द्वारा गणना की गई. Insets बार लगातार (τ) और व्यक्तिगत गतिज घटकों में से प्रत्येक के लिए रिश्तेदार क्षेत्र (ए) प्रदान करते हैं.

चित्रा 7
चित्रा 7. सेल एक चैनल रिकॉर्डिंग संलग्नmPIEZO1 HEK293 कोशिकाओं में व्यक्त से. गतिविधि वोल्टेज की लगातार आवेदन (80 एम वी) के दौरान, पैच विंदुक के माध्यम से एक HSPC डिवाइस के साथ -20 mmHg दबाव लागू करने से हासिल की है. लाल बिंदीदार रेखा शून्य मौजूदा स्तर को दर्शाता है.

8 चित्रा
चित्रा 8. सेल देशी चैनलों से एक चैनल रिकॉर्डिंग संलग्न. पिपेट 5 दिन (ए) या ​​27 दिन (बी) के लिए एक चूहे के भ्रूण के प्रीफ्रंटल कॉर्टेक्स से अलग किया गया था और संस्कृति में बनाए रखा गया था कि एक न्यूरॉन की सोमा में संलग्न किया गया था . सतत NMDA रिसेप्टर गतिविधि क्रमशः, देशी AMPA और GABA रिसेप्टर्स को बाधित करने ग्लूटामेट (1 मिमी) और ग्लाइसिन (0.1 मिमी), और भी CNQX (20 माइक्रोन) और bicuculline (10 माइक्रोन) युक्त विंदुक समाधान के साथ दर्ज की गई थी. गतिविधि 100 एम वी टी लगाने से हासिल किया गया थारिकॉर्डिंग पिपेट hrough. लाल बिंदीदार रेखा शून्य मौजूदा स्तर को दर्शाता है.

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Discussion

आयन चैनल क्षेत्र में अनुसंधान का एक महत्वपूर्ण क्षेत्र को खोलने या चैनल के gating तंत्र चैनल की ओर जाता है कि घटनाओं के अनुक्रम को समझने के लिए समर्पित है. सबसे चैनलों के लिए, इस प्रक्रिया जटिल है और एक macroscopic मल्टी चैनल संकेत से deduced नहीं किया जा सकता है कि कई गतिज कदम शामिल है. इसके विपरीत, प्रयोगों एक चैनल रिकॉर्ड में खुला / बंद घटनाओं के अनुक्रम देख तंत्र gating के बारे में अधिक विस्तृत जानकारी उत्पादन कर सकते हैं, जहां बनाया जा सकता है. न्यूनतम इनवेसिव पैच दबाना रिकॉर्डिंग लगातार शर्तों के तहत किया जा करने के लिए यहाँ वर्णित तरीकों में, NMDA रिसेप्टर्स का साया बाह्य स्थित ligand बाध्यकारी डोमेन की अनुमति देता है. इस प्रोटोकॉल ligand और रिसेप्टर गुण दोनों के आधार पर अन्य ligand gated आयन चैनल की जांच के लिए उपयुक्त होने के लिए अनुकूलित किया जाना पड़ सकता है.

एक चैनल गतिविधियों का रिकॉर्ड बहुमूल्य जानकारी के दो प्रकार प्रदान करते हैं. सबसे पहले,एकात्मक वर्तमान आयाम सीधे मापा जा सकता है, क्योंकि प्रयोगों ऐसे चैनल प्रवाहकत्त्व, पारगम्यता और चयनात्मकता के रूप में ध्यान में लीन होना गुणों के बारे में जानकारी हासिल करने के लिए तैयार किया जा सकता है. खुले और बंद की घटनाओं की अवधि भी रिकॉर्ड से सीधे मापा जा सकता है, क्योंकि दूसरा, प्रयोगों gating के बारे में गतिज जानकारी हासिल करने और इस प्रकार, चैनल का संचालन तंत्र के बारे में inferences बनाने के लिए तैयार किया जा सकता है. प्रयोगों के दोनों प्रकार के लिए, सार्थक सांख्यिकीय विश्लेषण एक विशिष्ट प्रवाहकत्त्व वर्ग के लिए वर्तमान ट्रेस से प्रत्येक व्यक्ति बिंदु binning की आवश्यकता है. कमानी कश्मीर साधन (एसकेएम) 11 कलन विधि का उपयोग करके ऐसा करने का ऐसा ही एक तरीका था, यहां प्रस्तुत किया है, हालांकि, यह आधे सीमा, 12 स्कैन सहित कई कम या ज्यादा परिष्कृत एल्गोरिदम द्वारा पूरा किया जा सकता है, बौम-वेल्च, Viterbi, आदि

सेल संलग्न विन्यास का उपयोग रिकॉर्डिंग कि आयन चैनल में शक्तिशाली हैं जैविक में संरक्षित कर रहे हैंबेफिक्र intracellular milieus साथ झिल्ली. 1) प्रयोगात्मक निरंतरता और 2)) आधारभूत शोर <2 पीए पीक करने के लिए एक अनुकूल संकेत करने वाली शोर अनुपात (शिखर को बनाए रखने: इस वजह से, यह झिल्ली जवानों को पर्याप्त रूप से गठन किया है और रिकॉर्डिंग के दौरान संरक्षित दो उद्देश्यों के लिए कर रहे हैं कि महत्वपूर्ण है. उत्पन्न पिपेट टिप के आकार और आकृति ठीक एक चैनल युक्त एक सफल झिल्ली सील की संभावना को निर्धारित करता है. एक फ्लैट टिप पिपेट सेल दृष्टिकोण जब यह सेल पर समान रूप से सील करने के लिए मदद करने, एक ही बार में पूरे टिप सतह के साथ सेल झिल्ली पर स्पर्श और प्रेस होगा कि यह सुनिश्चित करता है. बहुत व्यापक है कि एक टिप के साथ एक पिपेट एक चैनल पैच में परिणाम की संभावना कम हो जाएगा; इसके विपरीत, बहुत संकीर्ण है कि एक टिप के साथ एक विंदुक खींच पर बेस पर मुहर और पिपेट 10 रोकना हो सकता है कि एक ओमेगा के आकार झिल्ली पाश में परिणाम होगा.

शोर अनुपात करने के लिए एक अनुकूल संकेत बिजली के स्रोतों को कम से प्रबंधित किया जा सकताशोर. Axopatch 200B पर headstage ठंडा सुविधा इष्टतम संकेत संकल्प के लिए अनुमति दी गई है; हालांकि शोर अभी भी इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी में शामिल उपकरण के किसी भी स्थापित किया है, साथ ही इस तरह के प्रकाश और असंबंधित इलेक्ट्रॉनिक्स के रूप में बाहरी स्रोतों से उत्पादित किया जा सकता है. सौभाग्य से, कई रणनीतियों एक वांछित स्तर 2, 27 के लिए शोर को कम करने के लिए लागू किया जा सकता है. संक्षेप में, शोर उत्पादन में सक्षम हैं कि उपकरणों के टुकड़े सेटअप के भीतर एक ही मुद्दे पर आधारित हैं कि सुनिश्चित करें. जब यह कर, यह महत्वपूर्ण शोर कारण होगा जो जमीन छोरों के गठन को रोकने के लिए महत्वपूर्ण है. 60 चक्र शोर मौजूद है ही, यदि रिकॉर्डिंग संकेत के साथ हस्तक्षेप हो सकता है कि किसी भी लाइट बंद कर लें. अंत में, रिकॉर्डिंग उपकरण के चारों ओर एक फैराडे पिंजरे रखकर बिजली के शोर के कारण से पास में बाधा को रोकने जाएगा.

समय की एक लंबी अवधि के लिए एक चैनल अवलोकन कि gating प्रदर्शन किया हैगठनात्मक परिवर्तन समय तराजू के एक विस्तृत रेंज पर हो सकता है. अस्थायी, पैच दबाना डेटा एम्पलीफायर की बैंडविड्थ और प्रवर्धित संकेत डिजीटल और प्रेक्षण खिड़की से 'लंबी' अंत में है जिस दर से 'छोटी' अंत में सीमित कर रहे हैं. पूरक प्रायोगिक दृष्टिकोण के साथ मिलकर जब कम सीमा से अधिक तेजी से कर रहे हैं कि गठनात्मक परिवर्तन के लिए, पैच दबाना रिकॉर्डिंग ही जानकारी दे सकते हैं. इस प्रकार बहुत धीमी दर के साथ होते हैं, और कि गठनात्मक परिवर्तन कभी कभी नमूना हैं के लिए, एक टिप्पणियों की संख्या बढ़ाने या रिकॉर्ड की अवधि को बढ़ा सकते हैं, हालांकि, यह हमेशा संभव नहीं हो सकता.

इन सीमाओं के बावजूद, एक व्यक्ति चैनल से प्राप्त विशेष रूप से जब पैच दबाना डेटा,, अक्सर वर्तमान कम्प्यूटेशनल तरीके के साथ तुरंत निष्कर्षण से अधिक जानकारी होती है. इस प्रकार, उम्मीद है कि कम्प्यूटेशनल क्षमता में और Soph में भविष्य बढ़ जाती हैविश्लेषण एल्गोरिदम का istication संभव अतिरिक्त आवेदन करना होगा. ऐसे अग्रिमों के आगमन पर, यह एक चैनल से पैच दबाना रिकॉर्डिंग संरचना, समारोह और में आयन चैनल की गतिशीलता पर अधिक जानकारी प्रदान करने के लिए झल्लाहट माप, कैल्शियम इमेजिंग या भी विवो तैयारी में साथ समवर्ती होते करने में सक्षम हो सकता है कि निकट है देशी और नियंत्रित वातावरण दोनों.

आयन चैनलों की विविधता बढ़ जाती है, उनके gating तंत्र की विस्तृत समझ की जांच की और अंततः उनकी आपरेशन उनके अद्वितीय जैविक कार्यों के लिए योगदान कैसे समझ के रूप में एक अणु टिप्पणियों से लाभ होगा. विशेष रूप से, पुनः संयोजक और देशी चैनलों के लिए एकात्मक प्रवाहकत्त्व गुण और gating दृश्यों के बारे में सूचित करने के लिए एक चैनल पैच दबाना वादे के साथ प्राप्त आंकड़ों.

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Disclosures

इस पांडुलिपि के लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.

Acknowledgments

इस काम F31NS086765 (KAC) द्वारा समर्थित किया गया था, F31NS076235 (एमएपी), और R01 NS052669 (GKP) और EIA9100012. लेखकों विशेषज्ञता और आणविक जीव विज्ञान और टिशू कल्चर के साथ सहायता के लिए Eileen Kasperek धन्यवाद; और जेसन मायर्स जल्दी प्रीफ्रंटल cortical न्यूरॉन्स से प्राप्त आंकड़ों को साझा करने के लिए.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals Sigma Various
Borosillicate Glass Sutter BF-150-86-10
Bright field inverted microscope Olympus 1x51 Nikon also has similar microscopes
Fluroescent box X-cite Series 120
Liquid Light Guide X-cite OEX-LG15
Micromanipulator Sutter Instruments MP-225
Oscilloscope Tektronix TDS1001
Amplifier Molecular Devices Axon Axopatch 200B
Table TMC 63561
NIDAQ card National Instruments 776844-01
Puller Narishige PC-10
Polisher Narishige Microforge MF-830
Faraday Cage TMC 8133306
High Speed Pressure Clamp ALA Scientific Instruments ALA HSPC
Pressue/Vaccuum Pump ALA Scientific Instruments ALA PV-PUMP For HSPC-1

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 88 बायोफिज़िक्स आयन चैनल एक चैनल रिकॉर्डिंग NMDA रिसेप्टर्स gating इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी पैच दबाना गतिज विश्लेषण
एक चैनल सेल संलग्न पैच दबाना रिकॉर्डिंग
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Maki, B. A., Cummings, K. A.,… More

Maki, B. A., Cummings, K. A., Paganelli, M. A., Murthy, S. E., Popescu, G. K. One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording. J. Vis. Exp. (88), e51629, doi:10.3791/51629 (2014).

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