Tek kanallı bir hücre-bağlı Patch-clamp kayıt

Summary

Burada tarif edilen hücre-bağlı patch-clamp tekniği ile, bir iyon kanalının güncel kayıt uzun uzanır elde edilmesi için bir işlemdir. Bu yöntem, gerçek zamanlı olarak, gözlemlemek için izin veren, biyolojik sinyali altında yer open-close kanal konformasyonlarının desen. Bu veriler rahatsız biyolojik membranların kanal özellikleri hakkında bilgilendirmek.

Abstract

Iyon kanal proteinleri biyolojik zarların üzerinden hızlı iletişim için evrensel cihazlardır. Ürettikleri iyonik akının zamansal imzası her kanal proteini bunun yanı sıra oluşturulur ve kontrol edildiği mekanizma içsel özelliklerine bağlıdır ve güncel araştırma önemli bir alanını temsil eder. Iyon kanalı proteinlerin işlevsel dinamikleri ile ilgili bilgiler, tek bir molekül tarafından üretilen akımın uzun uzanır gözlemleyerek elde edilebilir. Ligand kapılı iyon kanalı, NMDA reseptörü için bir kanalı, hücre bağlı patch-clamp kayıtları akım elde etmek için bir protokol, aşağıda tarif edilmiştir, kortikal nöronlarda HEK293 hücrelerinde doğal olarak ya da heterolog bir şekilde eksprese. Ayrıca mekano duyarlı kanal PIEZO1 örneğini sunarak ilgi diğer iyon kanallarına yöntemi nasıl adapte talimatları vardır sağladı. Bu yöntem, kanal iletkenlik özellikleri ve ope zamansal dizisi ile ilgili verileri sağlayabilirBöylece sağlık ve hastalık onların işlevlerini anlamak için yardımcı kanalın aktivasyon mekanizmasını oluşturan n-kapalı konformasyonlar.

Introduction

Biyolojik zarları arasında hızlı iletişim kanalları yaygın olarak adlandırılan oligomerik gözenek oluşturma membran proteinleri, neredeyse sadece dayanır. Bu proteinler aktivasyon sinyalleri, yolluk mekanizmaları ve iletkenlik özellikleri çok farklıdır. Gözenekleri iyonları seçici kanal proteinleri, iyon kanalları olarak sınıflandırılır; onların aktivasyon zarından iyonik akımları üretir ve bunların yanıtları elektrofizyolojik teknikler kullanarak gerçek zamanlı olarak yüksek çözünürlük ile kaydedilebilir. Aktivasyon sinyalleri konsantrasyon dereceleri, mekanik ve elektrik kuvvetleri, ve sıcaklık gibi kimyasal ve fiziksel girdilerin geniş bir dizi kapsar; Böylece, başka bir bağ içine iyon kanallarını sınıflandırmak, kapı mechanosensitive, voltaj kapılı veya ısıya duyarlı türleri. Bu makalede, protokoller patch-clamp tekniği kullanılarak, bir ligand kapılı kanal, NMDA reseptörü ve bir mechanosensitive kanal PIEZO1 gelen tek kanal aktivitesini kaydetmek için tarif edilmiştir.0;

Patch-clamp elektrofizyoloji tek moleküllerin ^{1, 2} gözlem izin vermek için yeterince hassas ilk ve en yaygın olarak kullanılan bir deney yöntemidir. Bu zarif hassasiyete ek olarak, bu çok elektrofizyolojik kayıt için uygun biyolojik hazırlıkları genişletilmiş ve aynı zamanda sağlam zarlarında iyon kanallarının gözlem izin verdi. Gerilim ve akım sıkıştırma kaydı hem de aynı elektrot ile gerçekleştirilir, çünkü İlk olarak, bu küçük hücreler ya da zarlar üzerinde yamalar sinyalleri kaydetmek için kullanılabilir. Teknik iyon kanalları kurbağa kasları, yılan balığı electroplaques veya kalamar dev akson ^{3, 4,} ancak bunun yerine transmembran sinyal mekanizmalarının her yerde demirbaş temsil eden ve tek veya her hücresel membran türlerine özgü olan bunun heyecanlı zarlarına sınırlı olmadığını ortaya koydu çok hücreli organizmalar ve aynı zamanda hücre içi zarlarına. Ithalatantly, sadece sağlam bir hücreye bir cam pipet takarak zar akımları kaydetmek için yeteneği kendi ana undisrupted zarlarında iyon kanalları aktivite kayıt için benzersiz bir fırsat sağladı. Böylece, bu protokol açıklanan hücre bağlı patch-clamp tekniği, on dakika ya da doğal bir ortamda uzun bir süre sürekli olarak iyon kanallarının etkinliği izleme izin verir.

Normal termal dalgalanmalardan altında, iyon kanal proteinleri dahil tüm proteinler, yan zincir hareketleri ve bütünün yeniden konumlandırılması tarafından temsil çok daha yavaş, daha az sık değişikliklerden büyük olasılıkla temsil hızlı ve en sık düzenlenmeleri ile, geniş bir zaman ölçeğinde yapısal değişikliklere etki veya alt birimleri veya translasyon sonrası modifikasyon veya protein-protein etkileşimleri ^{5, 6,} bazı durumlarda. Bir molekül tarafından oluşturulan faaliyet uzun süre gözlemleyerek fonk anlamak için yardımcı olabilirtional sağlam fizyolojik zarlarında iyon kanalları dinamikleri ve gözlenen molekülün işletme mekanizması hakkında değerli bilgiler sağlar.

Hücre tipleri ve gelişim aşamaları boyunca iyon kanalları, doğal membran iyon kanallarının moleküler bileşimi hakkında bilgi çeşitliliğinin artan anlaşılması aksine hala sınırlıdır. Tüm iyon kanalları multimerik proteinleri ve doğal iyon kanallarının çoğunluğu genellikle çeşitli iletkenlik ve perdeleme özellikleri ile birlikte olan, geniş moleküler çeşitlilik, proteinleri üretme alt birimlerinin çeşitli türlerinden monte edin. Bu nedenle, tanımlanan terkibin moleküler iyon kanalları heterolog sistemlerde tanımlanması üzerine çalışılmıştır. Özellikle, ölümsüzleştirilmiş insan embriyonik böbrek hücreleri ⁷ klonal çizgi HEK293 hücreleri, yeniden birleştirici iyon kanallarının heterolog ekspresyonu için tercih edilen bir sistem olarak yaygın bir kabul gördü. Adam arasındaiyon kanal elektrofizyoloji için seçim sistemi olarak HEK293 hücreleri yükselmiş y avantajları kolaylığı ve Kültüre uygun fiyatta ve uzun ömürlü istikrarlı kültürlerini koruyarak, post-translasyon katlama, işleme ve memeli proteinlerinin ticaretini yürütmek için kendi yetenek ve birçok durumda , düşük düzeyde veya ilgi duyulan ^{7, 8,} kanalın endojen ekspresyonunun da olmaması. Rekombinant ifade iyon kanallarını ve HEK293 hücrelerinde fonksiyonel özelliklerini inceleyerek yapı-işlev iyon kanalları özellikleri yanı sıra, bir iyon kanalı izoformları ve doğal doku içinde rolleri spesifik özellikleri hakkında bilgi elde etmek için bir değerli bir yaklaşım olmaya devam etmektedir. Bu makalede açıklanan protokoller HEK293 hücrelerinde eksprese edilen rekombinant iyon kanalları ve yerel iyon kanalları için eşit ölçüde iyi uygulanabilir.

Özetle, onun eşi görülmemiş kapasitesi ile yama kelepçe tekniği, sinyal çözmek içinbir molekülden s, bugüne kadar, tek moleküllerin davranışını gözlemlemek için en doğrudan yöntem olmaya devam etmektedir. Kendi hücre-bağlı modunda, patch-clamp kayıt bir molekül için tamamlandığı zaman, iyon kanallarının devreye olağanüstü bilgi sağlar, uzun gözlem süreleri sağlar. Aşağıda, bir iyon kanalı protein ihtiva eden hücre bağlı yamalar yüksek çözünürlüklü akım kayıtları elde etmek için bir protokol sunulmuştur.

Protocol

1.. Hücre Kültürü ve Protein Expression

1. HEK293 hücreleri,% 10 Fetal Sığır Serumu (FBS) ile takviye edilmiş DMEM içinde tek tabakalı kültürü, ATCC tarafından gerçekleştirilen parçaları içerir geçitleri 22 ve 40 arasında (ATCC numarası CRL-1573) ve% 5 _CO2,% 1 penisilin / streptomisin karışımı tutun ve 37 ° C. Deneyler arasında, 10 ml'lik bir final hacmi içinde, 5-20 kat seyreltmelerde T25 şişeleri içine geçiş hücreleri. Not: Bu geçişleri sırasında hücreleri kullanarak optimum mühür oluşumu ve yama istikrar sağlayacak olumlu hücre sağlığını garanti eder.
2. Transfeksiyon için, çanak başına hücre süspansiyonu için ~ 0.5-0.6 ml karşılık gelen ~ 10 ⁵ hücre / kap yoğunluğunda, 35 mm tabaklar içinde HEK293 hücreleri plaka ve 18-24 saat boyunca 2 ml ortam içinde hücreler büyür.
3. 1.5 ml steril santrifüj tüpü içinde, (bu sıraya göre) eklenmesi ile dört adet 35 mm tabaklar için transfeksiyon karışımı hazırlandı: Her cDNA (GluN1, GluN2A ve GFP) (1) 1 ug; (2) 315 ulçift ​​distile su (GKD ₂ O); (2-hidroksietil)-1-piperazinetansülfonik asit (HEPES), ve çökelti oluşturmak için kullanılan akıllı 2.5 M _CaCl2 damla, (4) 35 ul (3) - 350 42 mM 4 ul.
4. Vortex 5 saniye için boru ve dört adet 35 mm tabaklar her transfeksiyon süspansiyonu 175 ul ekle hemen% 50-60 izdiham hücreleri içerir, ve 2 saat boyunca 37 ° C'de inkübe hücreleri bir gün önce, kaplama.
5. Transfeksiyon ortamı aspire, PBS ile yıkayın ve NMDA reseptör eksitotoksisiteyi ⁹ aracılı önlemek için 2 mM _MgCl2 ile desteklenmiş büyüme ortamında 2 ml ile değiştirin. Not: Hücreler, elektrofizyolojik 24-48 saat sonrası transfeksiyonu için kullanılabilir.

2.. Elektrot Hazırlanması

1. Dikey çektirmesi ile borosilikat cam tüpler çekerek 2 simetrik kayıt pipetler oluşturmak. Elde edilen ucunun büyüklüğüne ve geometrisine, ayrıca şekil pipetler görebir parlatıcı kullanılmıştır. Not: uç boyutu görsel ve elektriksel değerlendirilebilir. Görsel olarak, dış çapı 1,4-5,6 um aralığında olmalıdır. Elektrikle, optimum bir boyut ucu, dışı çözelti ile dolu iken, (Şekil 2B) 12-24 MQ aralığında dirençleri üretmek gerekir.
2. Hücre bağlı deneyler için maksimum kanal aktivitesi ve yüksek akım genlikleri üretecek hücre dışı ortamı temsil eden bir çözelti pipet kullanın. Not: NMDA reseptörleri için, bu agonistleri (glutamat ve glisin), çift değerli katyonik inhibitörleri ve blokerleri kelat 1 mM EDTA içinde doyurarak konsantrasyonlarını ihtiva eden bir çözeltiye karşılık gelen ve tek bir geçirgenlik iyonu (sodyum gibi fizyolojik konsantrasyonlarda (150 mM) sahiptir mM olarak: 1 glutamat, 0.1 glisin, 150 NaCl, 2.5 KCl, 1 N NaOH ile pH 8.0 'da tamponlu 1 EDTA ve 10 HEPBS).

3. Hücre bağlı Patch-kelepçe Kaydı

1. Açık qub veri toplama softwa(www.qub.buffalo.edu) yeniden ve 'düzen' başlığı altında satın alma penceresini seçin. Başlıklı açılır menüden 'Dosya' başlığı altında 'Yeni Verileri' tıklayarak yeni qub veri dosyası (KFY) açın ve aşağıdaki başlangıç ​​parametreleri girin: örnekleme oranı, 40 kHz; A / D ölçekleme, 3000; çıkış kanalı, 1; ve A / D veri boyutu 2., veri dosyasını sağ tıklayıp özellikleri seçerek, ve 'veri' sekmesini tıklayarak 0,1 V / Pa için genlik ölçeklendirme ayarlayın. Not: Bu parametreler, hücreye bağlı modunda bir model hücre kullanarak her bir kurulum için rafine edilebilir. Qub yazılım ve QDF özellikleri ile veri edinme hakkında ek talimat www.qub.buffalo.edu online vardır.
2. Hücreleri ifade iyon kanalı ihtiva eden bir 35 mm tabak seçip kalsiyum ve magnezyum ihtiva eden 2 ml PBS ile büyüme ortamı yerine; mikroskop sahneye çanak montaj ve hücrelerin sağlıklı ve iyi çanak bağlı olduğunu değerlendirmek için faz kontrast mikroskobu kullanarak hücresel alanında odaklanmaktek tabaka moda (Şekil 1A) içinde. Transfeksiyon (Şekil 1B) başarılı olduğunu doğrulamak için floresan tespiti geçin. Not: floresan yoğunlukları aralığı protein ifade ham bir ölçüsü olarak kullanılabilir.
3. Tek kanallı kayıt için, x10 amplifikatör çıkış kazancını, = 1 β için yama yapılandırma, 10 kHz analog filtre,-kelepçe voltaj modunu ayarlamak ve +100 mV gerilim uygulanır. OFF konumunda gerilim tutma komutu ile, 'sızdırmazlık' düğmesini seçin.
4. Floresan ve hücre sağlığı dayanarak, yama için bir hücreyi seçin. Hücre de çanak bağlı olduğu faz kontrast altında doğrulama, yama maruz hücre yüzeyinde büyük bir kısmına sahip ve sağlıklı görünüyor. Not: yaklaşımı ve patch-sıkma esnasında hücre beyazlatma önlemek için faz kontrast aydınlatma koruyun.
5. Bu elektrod ile temas yapar bu yüzden sadece yeterli bir çözüm ile taze cilalı pipet doldurune ve hafifçe sallayın ucu tuzak olabilir hava kabarcıklarını çıkarmak için. Pipet tutucusunun sıkma vidasını sızdırmazlık ve gümüş tel pipet solüsyonuna batırılır emin yaparak amplifikatör headstage üzerine kayıt pipet edin.
6. Boru ile pipet tutucu bağlı bir küçük (5 cc) plastik şırınga kullanarak, yumuşak (Şekil 2A) giren ve yaklaşma sırasında ucu tıkanmasını önlemek için kirleri pozitif basınç uygulanır.
7. Mikromanipülatör kullanarak, banyo içine pipet doğrudan ve elektrik devresini kapatarak, (Şekil 1C) yama için seçilen hücrenin üzerinde doğrudan yerleştirin. Amfinin mühür test sinyali (Şekil 2B) karşılık gelen bir dikdörtgen dalga belirtmelidir ki, osiloskop not alın. Not: banyoya girmesinden sonra, optimum aralığında pipet direnci 12-24 MQ olduğunu. 5 mV test sinyali için, ölçülen akım range ~ 20-40 pA karşılık gelir.
8. Osiloskopta elektriksel mikroskop ve pipet direnç yoluyla görme pipet konumunu izlerken, pipet hücre üzerinde hafifçe çarpmasına kadar küçük artışlarla yaklaşımı devam ve test sinyali artan direnci (Şekil 2B) belirtmek için hafifçe düşer.
9. , Bir mühür formu şırınga pick up ve kayıt pipet ucu içine hücresel membran çeker ve bir GΩ direnç mühür ¹⁰ oluşumunu başlatır şırınga pistonu, çekerek yanal boru içinden hafif negatif basınç uygulayın. Mühür oluşumu görülebilir sadece kapasitif geçici (Şekil 2B) ile, onun tam düzleşme ile belirtilir hangi osiloskopta test sinyali dalga, not alın. Not: Sinyal tamamen dümdüz değil veya temel gürültülü hale gelirse, bu mühür etrafında önemli akım kaçağı ile zayıf bir mühür gösterir. Bu r önleyecektirbir kanal akımları esolving. Bu durumda ise, hücreden pipet çekilme ve uzak banyosundan, baş aşamasından çıkarın ve atın. Yeterli bir aralık (≥ 1 GΩ) bir mühür elde edilinceye kadar taze cilalı pipet ile işlemi tekrarlayın.
10. Amplifikatör, 'kapalı' için 'sızdırmazlık testi' dan dış komut geçiş anahtarı; ('off' Önceden ayarlanmış olan) pozitif gerilim tutan komutunu geçiş; ve x100 için kazancı artırmak. Varsa, önce düz taban (Şekil 2C) adlı kare yukarı deplasmanlar gibi görünecektir, kanal etkinlik için osiloskop, gözlemlemek.
11. Kanal etkinliği osiloskoptan ise, 'rekor' düğmesinin ardından 'oyun' düğmesine basarak, qub yılında daha önce açılmış dijital dosyaya veri elde. , Veri edinme durdurmak qub içinde durdurma düğmesine basın, ve kolay retriev için QDF dosyayı kaydetmek için'Dosya' başlıklı açılır menüden de 'Save Data As ...' seçerek bilgisayarın sabit diskinde güçlü konumu.

4. Veri Ön işleme ve Idealleştirme

Not: Önemli bilgiler (basit durumda, kapalı veya açık) uygun bir iletkenlik sınıfa her bir veri noktası atar istatistiksel analizler ile tek kanallı kayıtları elde edilebilir. Bu işlem veri idealize ve segmental k araçlarının (SKM) qub in yöntemi ¹¹ aşağıda açıklanan veri idealize kısa bir açıklama olarak adlandırılır.

1. Qub veri dosyasını açın ve 'düzen' başlığı altında 'Pre' arayüzüne geçerli izlerini görmek. Etiketli kutunun işaretini kaldırarak (dijital filtreyi kaldırmak) filtresiz kaydedilen dosyayı görüntüler 'Fc.'
2. Görme usulsüzlük ve eserler (Şekil 4A) nokta kayıt tarayın. Doğru kısa akım ani ki istediğimiz anr iz içinde, aynı iletkenlik sınıfının bir komşu temiz bir bölgeyi seçerek bu bölgeyi vurgulayarak, sağ tıklayarak ve seçerek (Şekil 4A) 'set silme tampon.' Bireysel örnek noktaları görünür kadar başak yakınlaştırmak, değiştirilmesi gereken bölgeyi seçmek ve sadece bu bölgeyi vurgulayarak ve ardından 'silme' sağ-tıklayın, silmek.
3. Temel istikrarlı kaydın erken bir kısmını seçerek tüm kayıt için sıfır akım temel tanımlayın, vurgulamak, sağ tıklayın ve 'set temel' seçeneğini seçin. Doğru görünen kılavuz (Şekil 4B mor) temel düzeyde temsil doğrulayın
4. Ham veri taban kümesi başlangıca gözle sapma kaydında noktaları belirlemek. Sapan bölgede taban küçük bir bölümünü seçerek bu düzeltin, sağ tıklayın ve 'bir temel düğüm eklemek' komutunu seçin.
5. T bölgeleri belirlemekO kolayca (Şekil 4C) düzeltilmiş olamaz aşırı gürültü ya da eserler içeren kayıtlarının tutulması. Atılması gereken bölgeyi vurgulamak, sağ tıklatın ve 'sil.' Not: Bu durumda kinetik bilgiler kaybolur: işlenmiş rekor daha kısa olacak ve ekleme noktasından sonra oluşan puan öncesi gürültü bölge sürekli olarak görünür.
6. SKM algoritması ¹¹ kullanarak kayıtları idealize etmek, açık ve kapalı etkinlik hem de içeren iz bir kısmını vurgulamak ve altında 'Mod' arayüzüne girin 'Düzen.' "Model" panelinde, siyah kare (kapalı hali) sağ tıklayın ve "kapmak" seçeneğini seçin, dosya boyunca taban temsili iz temiz bir kısmını vurgulayın. Açık iletkenliği vurgulayarak kanal açıklıklar için aynı yapmak, doğru "model" panelinde kırmızı kareyi tıklatın ve "kapmak" seçeneğini seçin.
7. Idealiza gerçekleştirinaltında 'Dosya' düğmesini seçerek tüm kayıt için korunma 'veri kaynağı.' Analizi için istenen parametreler doğru olduğunu doğrulayın ve ardından tıklatın 'Modelleme' bölümünün altındaki 'idealize' sekmesine sağ tıklayın 'Çalıştır.' Idealize sonucu, tüm dosya için genlik Histogram ile birlikte, idealize görsel inceleme (Şekil 5) için izin veri ile kaplanır. Not: Yetersiz idealizasyon qub kanal açıklıkları ve aslında meydana gelmez kapanışları tespit ettiği 'sahte olaylar,' bir nesil yol açabilir. Amfinin analog filtresi ve örnekleme oranı ile ayarlanır kayıt çözünürlüğü, içinde, SKM, açık ve kapalı olayları algılar hangi ile çözünürlük analizler için ölü bir zaman ayarı ile kontrol edilebilir. Optimal ölü zamanlar deneme yanılma tarafından seçilmelidir ve örnekleme hızına bağlıdır, ancak, başparmak iyi bir kuraldır2-3 örnekleri ¹² olan ölü bir zaman seçin.
8. Idealleştirme doğru ham verileri temsil ettiğini doğrulamak için, elle idealize iz tarayın. Idealize hataların belirlenmesi üzerine, sahte olay üzerine iz vurgulayın, sağ tıklayın ve 'IdL katılın.' Not: Ek seçenekler ve qub çeşitli komutlar ve işlevleri ayrıntılı bir açıklama için, qub Manual çevrimiçi (www.qub.buffalo.edu) danışın.

Representative Results

Rekombinant NMDA Reseptör

NMDA reseptörleri bağlayan ve iki eş agonistlerinin birlikte eyleme yanıt: glutamat ve glisin. Bunlar GluN1 alt birimleri ve GluN2 alt birimleri bağlayıcı iki glutamat bağlanması, iki glisin heterotetramers olarak monte edin. GluN2 alt birimleri beyindeki en yaygın formları transkribe çocuk ve yetişkin hayvanlarda GluN2B olarak GluN2A dört gen (MS) ile ve bunlardan kodlanır. Çünkü (Şekil 1A) alt birimi bileşimin kontrol, hem de ince perdahlı cam pipet (Şekil 1C) kullanılarak kanal güncel kayıt yeteneği sağlar HEK293 hücrelerinde reseptörlerini ifade eden doğal preparasyonlarda NMDA reseptör alt tiplerinin, çeşitliliğinin.

Pipet hücreyi temas sonra, test darbe genlik dalga biçiminin belirgin bir azalma bir conta oluşturmak yeteneği gösteren (Şekil 2B) ortaya çıkar. Birini ihtiva eden yeterli bir sızdırmazlıkkanal, bir pozitif voltaja (Şekil 2C) uygulanması üzerine gürültü oranı için iyi bir sinyal ile, başlangıçtaki aşağı doğru yer değiştirmeye kadar gösterilen açık kanal aktivitesi, üretir. Her iki agonistleri yüksek konsantrasyonlarda mevcut olduğunda vahşi tip rekombinant NMDA reseptörleri için maksimum kanal etkinliği elde edilebilir ve inhibitörleri ve kanal blokerleri yok olduğunda. Bir yama birden çok kanal içerdiğinde, eşzamanlı açıklıklar hemen görülür ¹³ (Şekil 3B) Bu, böylece ideal. Kanal açık olasılık bilinen ya da ^14, yaklaşık olarak eğer çok düşük bir aktivite düzeyi ile protein için, bir seviye açıklıklar bir gerilme tek bir kanaldan kaynaklanan olasılık hesaplanabilir. Bu nedenle, uzun gözlem süreleri gerekli olabilir.

Bu koşullar altında, ve (-120 mV ile yaklaşık bir zar potansiyeline yol açar) +100 mV bir tutma pipet potansiyel uygulanması single rekombinant GluN1/GluN2A GluN1/GluN2B ve nispeten yüksek bir iletkenlik seviyesi (> 50 pS) (Şekil 3A ve 5B), ^15-17 için yüksek bir olasılık (P _o, 0,3-0,5) ile açıktır. Kaydederken, mevcut gürültü kramponları, bazal sürüklenir, ya da aşırı gürültü dönemleri kısa ve az ise bu düzeltilebilir, ancak belirtildiği gibi, (Şekil 4A-C) ortaya çıkabilir. Bu kanal etkinliği kanal davranışların tam genişliği yakalanır olduğunu garanti etmek için yeterli bir zaman miktarı (≥ 10 dakika, 10.000 vaka) kesintisiz kaydedilmiş olduğu, ancak, önemlidir.

Böyle kayıtlardan elde veri kanalı kinetik ve geçirgenlik özelliklerine hem de bilgi sağlayabilir. Burada, biz ancak veri idealleştirme gibi pClamp gibi diğer yazılım programları kullanılarak gerçekleştirilen veya ¹² TARAMA olabilir, SKM algoritması (Şekil 5A) kullanılarak qub tarafından gerçekleştirilen idealleştirmenin göstermek birnd kendi avantajları ve dezavantajları içeren bu seçeneklerin her biri ile, farklı algoritmalar veya yarı eşik yöntemi olarak kriterler kullanılarak gerçekleştirilebilir. Kinetik modellerine bu verilerin takılması iyon kanalının davranışlar içine daha fazla fikir edinmek için yapılabilir. Maksimum olabilirlik uydurma her program tarafından uygulanan algoritmalar kendi yararları var ki, bu tür qub gibi yazılım veya HJCFIT ¹⁸ ile yapılabilir. Şekil 5'de gösterildiği idealize tek bir iyon kanalı için tam bir kinetik model uydurma, ifa edilecek olan bir kapalı durum arasında olası bir model basit ve açık bir durumu gerektiriyorsa, belirli bir kriter ulaşılana kadar art arda ilave kapalı ve açık şart koşmaktadır. Bu süreç, yabani tip GluN1/GluN2A reseptörleri beş kinetik ayrı kapalı durumlarını ve 2-4 kinetik ayrı açık devletleri (Şekil 5C) sahip olduğu ¹⁹ göstermektedir ki buperdeleme özellikleri sinaptik sinyal ^{20, 21} aracılığı ile, NMDA reseptör şeklini belirlemek için çok önemlidir. Bu analiz tarzı kendi ayrı yolluk mekanizmaları ^22,23,24 fikir kazanmak için, bu tür AMPA reseptörleri gibi küçük iletkenliği diğer iyon kanalları, uzatılabilir. AMPA reseptörleri qub kullanarak başarılı idealizasyon ek devletler hazır bir modele dahil edilmiştir gerekebilir birden iletkenlik seviyeleri var yana bir ihtar, ancak,.

Bu yöntemler aynı zamanda nüfuz iyon bileşimi ve / veya konsantrasyonunu değiştirerek iyon kanalı geçirgenliği ve iletkenliği hakkında bilgi elde etmek için uzatılabilir. Burada açıklanan yöntemler kullanılarak bir GluN1/GluN2A reseptörleri aracılığıyla kayıt aktivitesi, ancak kayıt pipet 75 mM _CaCI2 ile 150 mM NaCl yerine (~ 10 pS) iletkenlik% 20 ~ ile akımları oluşur. Bu gösteriyor ki, kalsiyum hi NMDA reseptörlerini nüfuz ederekfizyolojik koşullarda gh seviyeleri, aslında bu geçirgenlik yol içinde, potansiyel bir kalsiyum bağlama sahası olabileceğini gösteren, daha yavaş sodyum iyonları daha kanalı erişir. Buna ek olarak, bu küçük iletkenliği rağmen kayıtları yeterli ana iletkenlik seviyesi mevcut genliği (Şekil 6A ve B) yaklaşık% 50 olan bir orta alt düzey iletkenlik, varlığını meydana, qub olarak SKM algoritması kullanılarak idealize edilebilir. Ek bir iletkenlik sınıfı başlangıç ​​kinetik modele dahil edildiğinde bu alt düzey açıklıklar, ancak, sadece qub olarak idealize edilebilir. Bundan başka kinetik analizleri, bu koşullar altında, ancak bu reseptörler, hala Birleşik Devletleri kanal sadece sodyum iyonu (Şekil 6C) geçtiğinde ile karşılaştırıldığında, son derece farklı zaman sabitleri ve doluluk sahip, beş kinetik ayrı kapalı durumları sergileyen, ortaya koymuştur. Buna ek olarak, sadece iki açık durumları u gözlenmektedirnder gösteren bu koşullar, kanal iletkenliği etkileyen ek olarak, kalsiyum iyonlarının reseptörü modüle yolluk edebiliyoruz.

Sadece tek bir kanal yamaları elde etmek için kesin bir yolu yoktur. Bunun yerine, birkaç deneysel manipülasyonlar başarı olasılığını artırarak katkıda bulunabilir. İlk olarak, transfekte edilmiş hücreler (Şekil 1 B) ve floresans yoğunluğu değerlendirerek kanal ekspresyonunun düşük düzeyde amaçlamaktadır. , Transfeksiyon ya da GluN1 olduğu gibi, gerekli bir alt ünitesi için cDNA miktarını azaltmak için kullanılan bir cDNA'nın toplam miktarını azaltmak: başarılı yaklaşımların olabilir DNA / kalsiyum fosfat çökelti ile inkübasyon süresini azaltmak için; ve görüş alanında sadece loş floresan hücreleri yama seçmek için. Elde yamalar sıklıkla çoklu kanal içeriyorsa, bu yaklaşımlar takip edilmelidir. Buna ek olarak, pipet ucu boyutunu azaltarak da Patc olarak tek bir kanal bindirme katkıdah. Sonuçta ancak, sistematik olarak açıkça daha fazla kanal içeren yamalar uzun süre kayıt kaçınmaktadır tek kanallı yamaları elde başarılı olur.

Rekombinant PIEZO1 Kanallar

Bu protokol açıklanan yöntemler hali hazırda herhangi bir ligand kapılı iyon kanalı uygulanabilir, ve gerçekten de kimyasal maddeler, gerilim, güç, sıcaklık veya başka yollarla aktive edilmiş olsun, herhangi bir iyon kanalından bir kanal aktivitesini kaydetmek için adapte edilebilir. Bu protokol, diğer iyonlar kanalların bir kanal akımları kayıt etmekte adapte edilebilir bir örneği, spesifik olarak fare PIEZO1, bir mechanosensitive iyon kanalı, (Şekil 7) ^{25, 26} aşağıda sunulmuştur.

NMDA reseptör kanalları gibi, PIEZO1 ve GFP kalsiyum fosfat aracılığı ile transfeksiyon ile HEK293 hücrelerinde ifade edilir ve hücreleri gibi 24-48 saat transfeksiyondan kullanılır1.2 bölümünde tanımlanan. PIEZO1 zar streç ile aktive olduğu için mevcut olmalıdır, bakım yama oluşumu ve uygulanan mekanik kuvvet dağıtım ve kontrolü için uygun cihazlar boyunca yavaşça membran işlemek için alınmalıdır. Bu koşullar, 2-3 MQ aralığında direnci ile, daha büyük bir kayıt pipetler yapma ve amplifikatör headstage pipet tutucu yoluyla kayıt pipetine bağlı bir yüksek hızlı basınç kıskaç cihazı (HSPC) kullanılarak elde edilebilir. Amplifikatör ayarlar amplifikatör toplama yazılımı ile kontrol edilebilir, böylece 'dış' komutu düğmesi üzerinde geçiş hariç olmak üzere, bölüm 3.3 'de NMDA reseptörleri için tarif edilenlere benzerdir.

, PIEZO1 dan aktivite kayıt (mM olarak) ile dolu bir kayıt pipet kullanın: 130 NaCl, 5 KCl, 10 HEPES, 1 _CaCl2, 1 _MgCl2, 10 TEA-Cl, NaOH ile pH 7.3. Bu koşullar altında, açıklıklar i olarak izlenebilirsıfır akım taban aşağıya deplasmanlar gibi osiloskop görünecektir nward sodyum akımlar. Amplifikatör kafa sahnede kayıt pipet yerleştirin ve HSPC üzerinde arama sıfır olduğundan emin olun. Banyo girmeden önce, pozitif basınç 3-5 mmHg geçerlidir. Mikromanipülatör kullanarak, banyo içine pipet düşürmek istenen pipet direnci kontrol edin ve bölüm 3.6 de açıklandığı gibi seçilen hücreye yakın pipet getirmek. Yavaşça mikroskop eşliğinde hücreyi dokunma ve NMDA reseptörleri (bölüm 3.7) için yapıldığı gibi Osilaskopu izleyerek, benzer bir şekilde mühür test dalga genlik hafif bir azalma görüyoruz. Çabuk 3-5 0 mmHg den basınç tutma düzeyini değiştirerek pipet aracılığıyla uygulanan pozitif basınç bırakın. Sızdırmazlık dalga formunu izleyerek oluşturmak için bir GΩ mühür bekleyin. Bu durumda, herhangi bir negatif basınç bir yalıtım oluşturmak için uygulanır. Optimal bir kapama ve basın elde edildikten sonra# 8216;. Veri edinme başlamak qub rekor 'düğmesi 7 yama pipet basınç -20 mmHg uygulanarak aktive mPIEZO1 tek kanallı akımların temsili bir iz göstermektedir. Bu akımlar 2 kHz'de filtre edildi ve 20 kHz frekansta örneklenir düşük geçiş olmuştur.

Hücre-dışı ligand bağlanma alanları olan ligand kapılı kanallar aksine, mechanosensitive kanal aktive edici uyaran 2 protokolleri altında değişebilir. Birincisi 'boşluk içermez, "sabit bir negatif basınç tüm kayıt süresi için yama uygulanır burada. Bu protokol, dakikalar uzun kayıtları elde etmek yararlıdır ve membran bütünlüğünü korumak küçük basınç uyaranlara (0-20 mmHg) ile en başarılı olur. Membran kopma olasılığı yüksek basınç tarafından üretilen Aktivite, en değişen basınçlar darbeleri daha kısa zaman dilimleri için yama uygulanabilir 'epizodik' kayıtları, (<elde edilirstrong> Şekil 7). Ligand kapılı kanallar gibi, hücre kayıtları tek kanal yamalar iletkenliğinin ve soruşturma kapsamında kanalın yolluk özellikleri hem ilgili bilgi zenginliği sağlamak eklenmiş.

NMDA reseptörleri nöronal

Hücreye bağlı bir kanal kayıt için burada tarif edilen metot, özel bir hücre tipi ve / veya gelişim aşamasına ait iletkenliği ve kanallar endojen perdeleme özellikleri hakkında bilgi elde etmek için kullanılabilir. Diğer birçok heteromerik kanallar ile olduğu gibi, yerli NMDA reseptörlerinin tam moleküler bileşimi bilinmemektedir. Yerel preparasyonlar elde edilenler ile ilgili bilinen bileşim rekombinant alıcılarından elde edilen sonuçların karşılaştırılmasıyla, alt-birimi bileşimi ve doğal ortamında kanalların fonksiyonu formüle edilmiş veya ¹⁷ test edilebilir ilgili hipotezler.

Nöronlar prefrontal izole edilmiştirsıçan embriyo kortisler ve 6 hafta boyunca ¹⁷ kültüründe yetiştirilen. Bölüm 2.2 'de rekombinant NMDA reseptör kayıtları için tarif edilen bileşenlere ek olarak, pipet çözüm de, sırasıyla yerli AMPA ve GABA reseptörlerini inhibe etmek CNQX (20 uM) ve Bicuculline (10 uM) ihtiva etmiştir. Kültür yaşına bağlı olarak, yerli NMDA reseptörleri elde kayıtları oldukça farklı kinetik ortaya çıkardı. Erken (Şekil 8A, in vitro olarak 5 gün) için kayıtlar Kültür daha yakından geç (Şekil 8B'de, in vitro olarak 27 gün) kültürleri daha yakından GluN1/GluN2A reseptörleri için tarif kinetiği benzer (Şekil 3A ikinci GluN1/GluN2B reseptörleri ve kayıt için açıklanan benzer kinetik ve 5A). Bu gözlem, NMDA reseptör ekspresyon izoformlannın desenleri ile ve kalça hücre ekteki tek kanallı yamalar kaydedilen akımların dikkatli nitelendirmeler ile tutarlıdırpocampal kültürler ^16.

Şekil 1. Bağlı hücre kayıt için bir HEK293 hücre seçme. A), 35 mm tabak içinde kültürlenmiş HEK293 hücreler mikroskop kademesinin üzerine yerleştirilir ve panel A'da olduğu gibi aynı görsel alandan 40X büyütmede. B) GFP floresan de faz kontrast ile görüntülenir transfekte edilmiş hücreleri tanımlar. Ok, GFP ifade eden bir hücreyi gösterir, sağlıklı görünür ve kayıt pipet görsel rehberliği altında ince bir hareket manipülatör kullanarak seçili hücreye yakın çevresinde getirilir pipet erişim. C) için mükellef bir konumda. bir görüntülemek için lütfen buraya tıklayınız Bu rakamın büyük bir versiyonu.

Şekil 2.. Hücre conta oluşumunu eklenmiş. A) pipet tutucusunun tarafına bağlı küçük bir şırınga 5 mV (0.5 kHz) en olan amplifikatör test tepki olarak banyo solüsyonuna daldırılan pipet ile pipetle. B) Mevcut geçen içindeki basıncın kontrol edilmesini sağlar kılavuzu 18 pA ve 28 MQ bir pipet boyutuna karşılık gelir. Hücre (sol ok), artan pipet direncinin bir göstergesidir gözlemlenen akım azalır, düzeyini temas üzerine. Pipet (sağ ok) ile negatif basınç uygulanarak mühür oluşumunu başlatır ve. C) bir test darbe yerine gelmediği sadece kapasitif Geçicilere test darbesi tarafından üretilen sinyali azaltır ve hiçbir gerilim (0 V), bazal pipet aracılığıyla uygulandığı takdirde (okun sol) stabildir. Pozitif gerilim (ok, +100 mV) pr uygulanması kanal açıklıkları işaret Stokastik üniter akımları oduces. Kırmızı noktalı çizgi sıfır akım temel gösterir.

. Şekil 3 GluN1/GluN2A reseptörleri kaydedildi Hücre bağlı akımlar A) Tek kanallı yama:.. Sürekli kayıt 50 saniye segment tek bir üniforma genlik B kanal açıklıkları göstermektedir) Çok kanallı yama: sürekli kayıt 50 saniye segmenti yama, en azından 2 aktif kanal içerdiğini belirten iki genlik düzeyleri kanal açıklıkları göstermektedir. Kırmızı noktalı çizgi sıfır akım temel gösterir. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.

">
Gürültü ani Şekil 4. Veri işleme. A) Düzeltme. Elle Ekran veri filtresiz ve bazal sinyali ile yabancı sinyali (kırmızı) değiştirin. Genişletilmiş görünüm (ortada) öncesi ve (alt) sonra bir başak göstermektedir başak (kırmızı) temel sürüklenme için temel sinyal. B) Düzeltme ile değiştirildi. Erken kayıtta, başlangıca küçük bir bölümünü seçin ve kaydın tamamını (mor çizgi) için sıfır akım düzeyi olarak ayarlayın. Küçük bir kısmını seçerek doğru bazal sürüklenme temel (ok) sürüklendi ve bir temel düğümü (mor daire) silinebilir düzeltmek zor gürültülü başlangıca (kırmızı) ile kayıt. C) uzun dönemleri ekleyerek. görmek için buraya tıklayınız Bu rakamın büyük bir versiyonu.

Şekil 5,. Veri idealize. A) Mevcut izleri (siyah), hücre-bağlı patch-clamp tekniği ile sadece sodyum iyonlarını geçen bir GluN1/GluN2A reseptöründen kaydedildi. Idealize veri noktaları (kırmızı), 30 saniyelik bir kanal kesimi için gösterilmiştir. Bu idealleştirme doğru olduğunu gösteren, iyi örtüşüyor. B) akım genliklerinin Histogram sıfırın zirveleri ile sadece iki Gauss fonksiyonları (0.02 ± 0.8 pA), kapalı kanal olayları gösteren ve 10.3 ± 1.3 milyon tarafından açıklanan bir dağılım göstermektedir tüm kayıt süresi (130 dakika) açık kanal olayların sadece bir tür. C göstergesidir pA) Kapalı (sol) ve açık (sağ) (A) gösterilen tüm kayıt zamanı histogramlarını yaşamak. Probabilhistogramlar (kalın çizgiler) ve bireysel kinetik bileşenleri (ince çizgiler) için Sığ yoğunluk fonksiyonu bindirilir ve beş kapalı devletler ve üç açık durumlarını içeren bir model verilere uyan hesaplanmıştır. Insets zaman sabiti (τ) ve bireysel kinetik bileşenlerin her biri için nispi alan (a) sağlar.

Tek bir NMDA reseptörleri. A) Mevcut izleri (siyah) üzerinden Şekil 6. Kalsiyum akımları hücreye bağlı patch-clamp tekniği ile sadece kalsiyum iyonu geçen bir GluN1/GluN2A reseptöründen kaydedildi. Akım genliklerinin idealize veri noktaları (kırmızı) 30 saniye segmenti için gösterilmektedir. B) Histogram iyi (0 ± 0.3 pA) sıfırdan zirveleri üç Gauss fonksiyonları ile yakın göstergesi açıklanan bir dağılım göstermektedird kanal olaylar, 1.3 ± 0.4 pA bir alt düzey iletkenlikten açık kanal olayları gösteren ve 2.1 ± 0.3, ana iletkenlik seviyesine açık kanal olayların göstergesidir. C) Kapalı (solda), ana iletkenlik seviyesi açık devlet (orta) ve tonlarca iletkenlik açık devlet (sağ) (A) gösterilen tüm kayıt zamanı histogramlarını yaşamak. Histogramlar (kalın çizgiler) ve bireysel kinetik bileşenleri (ince çizgiler) için olasılık yoğunluk fonksiyonu bindirilir ve beş kapalı durumları, iki ana iletkenlik düzeyde açık durumlarını ve bir alt düzey iletkenlik açık durumunu içeren bir model verilere uyan hesaplanmıştır. Insets zaman sabiti (τ) ve bireysel kinetik bileşenlerin her biri için nispi alan (a) sağlar.

Şekil 7. Hücre bir kanal kaydı eklimPIEZO1 HEK293 hücrelerinde ifade edilmiş. Activity geriliminin sürekli uygulama (+80 mV) sırasında, yama pipet ile HSPC cihaz ile -20 mmHg basınç uygulanmasıyla açığa çıkartılır. Kırmızı noktalı çizgi sıfır akım seviyesini gösterir.

Şekil 8,. Cell yerel kanalları bir kanal kayıt eklenmiş. Pipet 5 gün (A) ya da 27 gün (B) için, bir sıçan embriyo prefrontal korteks ayrışmış ve kültür içinde muhafaza edilen bir nöronun soma de bağlıydı . Sürekli NMDA reseptör aktivitesi sırasıyla doğal AMPA ve GABA reseptörlerini inhibe glutamat (1 mM) ve glisin (0.1 mM) ve aynı zamanda CNQX (20 uM) ve bicuculline (10 uM) ihtiva eden çözeltiler pipet ile kaydedildi. Etkinlik +100 mV t uygulanarak açığa çıkarıldıkayıt pipet hrough. Kırmızı noktalı çizgi sıfır akım seviyesini gösterir.

Discussion

Iyon kanalı alanında, araştırma önemli bir alan açılmasını veya kanalın yolluk mekanizmasını kanal açan olaylar dizisini anlamak için adamıştır. En çok kanal için, bu işlem karmaşıktır ve gözle görülebilir çok kanallı sinyalden çıkarılabilir edilemez kinetik çeşitli adımlar içerir. Buna karşılık, deneyler tek kanallı kayıt, açık / kapalı olaylar dizisini gözlemleyerek mekanizmaları yolluk hakkında daha detaylı bilgi üretebilir nerede dizayn edilebilir. Minimal invaziv patch-clamp kayıtları sabit koşullar altında gerçekleştirilebilir için burada tarif edilen yöntemler olarak, NMDA reseptörleri tarafından sahip harici merkezi bir ligand bağlama alanı sağlar. Bu protokol, ligand ve reseptör özelliklerinden hem de bağlı olarak başka ligand kapılı iyon kanalı araştırmak için uygun olması için adapte edilmesi gerekebilir.

Tek kanallı faaliyet kayıtları değerli iki tür bilgi sağlayabilir. İlk olarak,üniter geçerli genliği doğrudan ölçülebilir, çünkü deneyler böyle kanal iletkenlik, geçirgenlik ve seçicilik gibi gözenek özellikleri hakkında bilgi elde etmek için tasarlanmış olabilir. Açık ve kapalı olayların süresi de kayıt şirketinden ölçülebilir, çünkü ikinci olarak, deneyler gating ilgili kinetik bilgi elde etmek ve böylece, kanalın çalışma mekanizması ile ilgili çıkarımlar yapmak için tasarlanabilir. Deneyler iki tip için, istatistiksel olarak anlamlı bir analiz, belirli bir iletkenlik sınıfa geçerli iz, her bir nokta kutulamanın gerektirir. Segmental k-ortalama (SKM) ¹¹ algoritması kullanarak, bunu yapmanın bir böyle bir yöntem, burada sunulan olduğu, bununla birlikte, bu yarı-eşik, ¹² SCAN dahil olmak üzere, çok daha fazla ya da daha az karmaşık algoritmalar ile gerçekleştirilebilir, Baum-Welch, Viterbi, vb

Hücre bağlı yapılandırma kullanarak kayıtları bu iyon kanallarının güçlü biyolojik korunursoğukkanlı içi çevrelere membranlar. 1) Deneysel süreklilik ve 2)) bazal gürültü <2 pA zirve için olumlu bir sinyal-gürültü oranı (peak bakımı: Bu nedenle, bu zar mühürler yeterince oluşmuş ve kayıt boyunca korunmuş iki amaçlı olduğu çok önemlidir. Oluşturulan pipet ucu büyüklüğü ve şekli tam bir kanal ihtiva eden bir başarılı zar contanın olasılığını belirler. Bir düz uçlu pipet hücreyi yaklaştığında o hücrenin üzerine düzgün bir mühür yardımcı, bir kerede tüm uç yüzeyi ile hücre zarı üzerine dokunun ve basın olmasını sağlar. Çok geniş bir ucu ile bir pipet tek kanallı yamalar sonuçlanması olasılığı daha az olacaktır; aksine, çok dar olan bir ucu olan bir pipet çekerek üzerine tabanında mühür ve pipet ¹⁰ tıkayabilir bir omega biçimli zar döngü neden olur.

Gürültü oranı elverişli bir sinyali, elektrik kaynaklarının en aza indirerek yönetilebilirgürültü. Axopatch 200B üzerinde headstage soğutma özelliği optimal sinyal çözünürlüğü için izin verdi; Ancak gürültü hala elektrofizyoloji katılan enstrümantasyon herhangi kurmak yanı sıra hafif ve ilgisiz elektronik gibi harici kaynaklardan ile üretilebilir. Neyse ki, birkaç stratejileri istenen düzeyde ^{2, 27} gürültüyü en aza indirmek için uygulanabilir. Kısaca, gürültü üretebilen teçhizat parçalarıdır kurulum içinde tek bir noktaya topraklı emin olun. Bunu yaparken, bu önemli gürültü neden olacaktır zemin döngü oluşumunu önlemek için önemlidir. 60 döngü gürültü varsa Ayrıca, kayıt sinyali ile müdahale edilebilir herhangi ışıkları kapatmak için emin olun. Son olarak, kayıt cihazının etrafına bir Faraday kafesi yerleştirilmesi ile elektriksel gürültü neden olan yakındaki engelleri önleyecektir.

Uzun bir süre için, bir kanal izlenmesi bu yolluk göstermiştiryapısal değişiklikler zaman ölçekleri geniş bir yelpazede üzerinde oluşabilir. Geçici olarak, patch-clamp veri amplifikatörün bant genişliği ve sinyal dijital büyütülmüş ve gözlem penceresi tarafından 'uzun' ucunda olduğundaki oranı ile "kısa 'ucunda sınırlıdır. Tamamlayıcı deneysel yaklaşımlar ile birleştiğinde düşük sınırından daha hızlı olan yapısal değişiklikler için, patch-kelepçe kayıtları sadece bilgi sunabilir. Bu şekilde çok yavaş oranları ile ortaya çıkar ve konformasyonel değişiklikler seyrek örneklenir için, bir gözlem sayısını artırmak ya da kaydın süresini arttırabilir, ancak bu her zaman mümkün olmayabilir.

Bu kısıtlamalara rağmen, tek bir kanaldan elde edilen, özellikle yama-kelepçe veriler, çoğu zaman mevcut hesaplama metodolojileri ile hemen çıkarılabilir daha fazla bilgi içerir. Böylece, beklenti olduğunu hesaplama kapasitesi ve soph gelecek artışlaranalizi algoritmaları istication olası ek uygulamaları yapacak. Bu tür gelişmeler gelişi üzerine, bu tek kanaldan yama-kelepçe kayıtları yapısı, işlevi ve iyon kanallarının dinamikleri hakkında daha fazla bilgi sağlamak için FRET ölçümleri, kalsiyum görüntüleme hatta vivo hazırlıklarına ile eş zamanlı olarak gerçekleşmesi mümkün olabilir öngörülebilir yerli ve kontrollü ortamlarda hem de.

Iyon kanallarının çeşitliliği artar, onların yolluk mekanizmaları ayrıntılı bir anlayış incelenmiş ve sonuçta bunların çalışma benzersiz biyolojik fonksiyonları katkıda nasıl bir anlayış olarak tek bir molekülün gözlemler yararlanacaktır. Özellikle, yeniden birleştirici ve doğal kanallar için üniter iletkenlik özellikleri ve yolluk dizileri ile ilgili bilgilendirmek için bir kanal patch-clamp söz ile elde edilen veriler.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals	Sigma	Various
Borosillicate Glass	Sutter	BF-150-86-10
Bright field inverted microscope	Olympus	1x51	Nikon also has similar microscopes
Fluroescent box	X-cite	Series 120
Liquid Light Guide	X-cite	OEX-LG15
Micromanipulator	Sutter Instruments	MP-225
Oscilloscope	Tektronix	TDS1001
Amplifier	Molecular Devices	Axon Axopatch 200B
Table	TMC	63561
NIDAQ card	National Instruments	776844-01
Puller	Narishige	PC-10
Polisher	Narishige	Microforge MF-830
Faraday Cage	TMC	8133306
High Speed Pressure Clamp	ALA Scientific Instruments	ALA HSPC
Pressue/Vaccuum Pump	ALA Scientific Instruments	ALA PV-PUMP	For HSPC-1