Summary
Olfaktoriske receptor aktivering mønstre indkode lugt identitet, men manglen på offentliggjorte data, der identificerer lugtstof ligander for pattedyr olfaktoriske receptorer hindrer udviklingen af en omfattende model af lugt kodning. Denne protokol beskriver en fremgangsmåde til at lette højkapacitetsidentifikation af olfaktoriske receptorligander og kvantificering af receptor-aktivering.
Abstract
Lugtstoffer skabe unikke og overlappende mønstre af olfaktoriske receptor-aktivering, så en familie på cirka 1.000 murine og 400 menneskelige receptorer til at genkende tusindvis af lugtstoffer. Lugtstof ligander er blevet offentliggjort for mindre end 6% af de menneskelige receptorer 1-11. Denne mangel på data er dels på grund af vanskeligheder funktionelt udtrykker disse receptorer i heterologe systemer. Her beskriver vi en fremgangsmåde til at udtrykke et flertal af det olfaktoriske receptor familien i Hana3A celler, efterfulgt af en høj-throughput vurdering af olfaktoriske receptor-aktivering ved hjælp af en luciferase reporter assay. Dette assay kan anvendes til (1) screen paneler af lugtstoffer mod paneler af olfaktoriske receptorer; (2) bekræfte lugtstof / receptor interaktion via dosisreaktionskurver; og (3) sammenligne receptor aktivering niveauer blandt receptor varianter. I vores eksempeldata blev 328 olfaktoriske receptorer afskærmet mod 26 duftstoffer. Lugtstof / receptor par med varierende respons scoringer var selektivted og testet i dosisrespons. Disse data indikerer, at en skærm er en effektiv metode til at berige for odorant / receptor par, der vil passere en dosis-respons eksperiment, dvs receptorer, der har en bona fide reaktion på et lugtstof. Derfor er denne high-throughput luciferaseassayet er en effektiv metode til at karakterisere olfaktoriske receptorer-et vigtigt skridt i retning af en model af lugt kodning i pattedyrs olfaktoriske system.
Introduction
Pattedyrs olfaktoriske system har evnen til at reagere på et utal af lugtende stimuli, der giver mulighed for påvisning og diskrimination af tusindvis af lugtstoffer. Olfaktoriske receptorer (periferi) er de molekylære sensorer, som fremsættes af de olfaktoriske sensoriske neuroner i lugtepithelet 12. Mammalian lugt anerkendelse sker gennem differentieret aktivering af regioners af lugtstoffer, og OR gen familien er omfattende, med omtrent 1.000 murine og 400 humane receptorer 12-16. Tidligere funktionelle analyser af yderste periferi i olfaktoriske neuroner og i heterologe celler har vist, at forskellige lugtstoffer er anerkendt af unikke, men overlappende ensembler af regioners 10,17-20. Matchende ligander til yderste periferi er afgørende for forståelsen af olfaktoriske kode og afgørende for at opbygge levedygtige modeller af lugtesansen. På grund af vanskeligheder, der udtrykker periferi i heterologe systemer samt det store antal af både lugtstoffer og periferi, har disse data været stort set fraværende fra field; ja, mindre end 6% af de menneskelige yderste periferi har en offentliggjort ligand 1-11. Denne protokol beskriver anvendelsen af et luciferase assay for at karakterisere lugtstof / ELLER interaktioner. Denne analyse gør det muligt for high-throughput karakterisering af yderste periferi, en opgave, der er nødvendigt for at forstå lugtstof / eller interaktioner samt udvikle en model af lugt kodning.
High-throughput studier af den yderste periferi står over for tre store udfordringer. Først blev periferi udtrykt i heterologe celler bevares i Skadestuen og efterfølgende nedbrydes i proteasomet 21,22, hvilket forhindrer den yderste periferi i at interagere med lugtstoffer i assaysystemet 23-25. Dette problem blev løst ved opdagelsen af accessoriske proteiner, der fremmer en stabil celleoverfladeekspression af en bred vifte af yderste periferi 19,26,27. Receptor-transporter-proteiner 1 og 2 (RTP1 og 2) fremme eller celleoverfladeekspression og aktivering som reaktion på lugtstof stimulation 19. Baseret på dette arbejde, var HEK293T cellermodificeres til stabilt at udtrykke RTP1 lange (RTP1L) og RTP2 receptor ekspression-forøgende protein 1, og G αolf, hvilket resulterer i Hana3A cellelinie 19,27. Desuden type 3 muskarine acetylcholin-receptor (M3-R) samvirker med den yderste periferi på celleoverfladen og forbedrer aktivering som reaktion på lugtstoffer 26. Co-transfektion af en OR med RTP1S og M3-R i Hana3A celler resulterer i robust, konsekvent og funktionelle udtryk for en bred vifte af yderste periferi på celleoverfladen 27. Andet pattedyr eller repertoirer er temmelig store. Hos mennesker, for eksempel, OR repertoire er en størrelsesorden mere talrige end smagssansen receptor repertoire, og 2 størrelsesordener mere talrige end den visuelle receptor repertoire. Selv klone et enkelt eller er en forholdsvis enkel protokol, er betydelig up-front indsats, der kræves for at generere et omfattende bibliotek. For det tredje, selv om vi ved, at i et syn, bølgelængde udmønter sig i farve ogi audition frekvens udmønter sig i tonehøjde, er tilrettelæggelsen af lugte dårligt forstået, hvilket gør det svært for forskerne at interpolere fra en repræsentativ stikprøve af lugtstoffer. Selvom der er gjort på denne front 10,28 visse fremskridt, kortet over den olfaktoriske landskab er stadig ufuldstændig. Screening titusinder af molekyler mod hundredvis af yderste periferi er en skræmmende opgave; high-throughput skærme i dette domæne kræver nøje definerede kampagner. De største resterende udfordringer er dem af logistik og omkostninger snarere end problemer forbundet med teknikken. Selvom heterolog screening ikke har været meget anvendt til at identificere ligander med akademiske grupper har et privat selskab brugt den samme teknik til at identificere ligander for 100 menneskelige yderste periferi 29. Desværre er der stadig disse data proprietære.
High-throughput luciferaseassayet beskrevet her, har flere fordele i forhold til alternative metoder anvendes til evaluering eller aktivering. Selvom ansvarses af indfødte olfaktoriske sensoriske neuroner er blevet målt ved hjælp af elektrofysiologi og calcium imaging, disse teknikker har svært ved at drille hinanden, hvilket ELLER fører til en neuron reaktion på grund af overlapningen i respons egenskaber for olfaktoriske neuroner. Selv banke-på et GFP-mærket receptortype 30,31, der leverer specifikke receptorer via adenovirus for murine olfaktoriske neuroner 32,33, eller udfører RT-PCR efter optagelser 17,24,33 kan linke optagelser til en enkelt receptor typer, disse metoder er lav-throughput og ikke egnet til store skærme. Heteroloqe screening systemer er mere skalerbar og to store former er fundet i litteraturen: cAMP pathway reportere og inositoltriphosphat (IP3) pathway journalister. Ved lugt stimulering, aktivere periferi en G αolf transduktion signaleringskaskade, som resulterer i produktionen af cyklisk AMP (cAMP) 12.. Ved co-transfektion af en ildflue-luciferase-reportergen under kontrol af acAMP-responselement (CRE), kan måles luciferase produktionen som en funktion af lugt respons, giver mulighed for kvantificering af OR-aktivering. Eller aktivering kan også være knyttet til IP3 vej ved co-udtrykker G-proteiner, såsom G α15/16 eller en G α15-olf kimære 24,25,34. Vi har valgt analysen præsenteres her baseret på tre faktorer: (1) co-ekspression af RTP1 med Rho-mærkede olfaktoriske receptorer forbedrer udtryk for olfaktoriske receptorer på celleoverfladen 19,27; (2) brug af en cAMP-responsiv reporter gen giver mulighed for måling af OR aktivering via den kanoniske anden messenger vej; og (3) assayet er velegnet til high-throughput skærme.
Denne high-throughput luciferaseassayet er anvendelig til en række undersøgelser værdifulde til området for lugtesansen. For det første kan et stort antal periferi screenes mod en enkelt lugtstof for at bestemme receptor aktivering mønster for en specific duftstof. Denne type undersøgelse identificerede OR7D4 som eller er ansvarlige for at reagere på den steroid lugtstof androstenon 8. Omvendt kan en eller screenes mod et panel af lugtstoffer for at bestemme receptor reaktionsprofil 10. Når kandidat olfaktoriske lugtstof / ELLER par er identificeret via disse skærme, kan interaktion bekræftes ved at gennemføre en dosis-respons eksperiment undersøger svaret fra OR til stigende koncentrationer af lugtstof. Dosisreaktionskurver kan også vurdere, hvordan den genetiske variation i en OR påvirker in vitro lugtstof respons 8,9,11,35, og disse undersøgelser kan udvides til interspecifikke ELLER variation, der giver mulighed for undersøgelse af receptor-evolution på tværs af arter og kausale mutationer i evolution 36,37, Endelig, dette assay kan anvendes til screening for lugt-antagonister der er i stand til at antagonisere eller reaktion på en bestemt lugtstof til en kendt lugtstof / receptor par 38,39. Sammenfattende denne høje-Throughput luciferaseassayet er anvendelig til en række undersøgelser, der vil hjælpe karakterisere eller aktivering mønstre og give en bedre forståelse af lugt kodning i det olfaktoriske system.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Kultur Hana3A Cells
- Forbered M10 medier ved at supplere minimum essentielt medium (MEM) med 10% (v / v) FBS.
- Kultur Vedligeholdelse
- Opretholde celler i M10 medier. BEMÆRK: ekspressionsvektorer til RTP1L, RTP2, REEP1 og G αolf give puromycinresistens til Hana3A celler, men at opretholde cellerne med dette antibiotikum påvirker ikke signifikant analyseresultater.
- Subkultur i et forhold på 1:08 i 10 cm skåle hver 2-3 dage.
- Inkuberes ved 37 ° C med 5% CO2.
2. Plating Celler til transfektion
- Aspirer medier fra en 100% sammenflydende 10 cm skål af Hana3A celler.
- Vask cellerne ved tilsætning af 10 ml PBS, hvirvlende fadet, og aspirere til PBS.
- Tilsæt 3 ml 0,05% trypsin / EDTA og vente for celler til at dissociere (ca. 1 min.)
- Inaktivere trypsin ved tilsætning af 5 ml M10 og bryde op celleklumper ved findeling omtrent 10x &# 160; med en 10 ml pipette. Pipette forsigtigt for at undgå at indføre luftbobler i medierne.
- For hver 96-brønds plade, overføres 1 ml celler i et 15 ml konisk rør, centrifugeres ved 200 xg i 5 minutter, og aspireres supernatanten uden at forstyrre cellepelleten.
- Opblande cellerne i 6 ml M10 per 1 ml af celler, der er overført i trin 2.5.
- Afpipetteres 50 ul celler til hver brønd i en plade med 96 brønde og inkuber natten over ved 37 ° C med 5% CO2.
3.. Transfektion af olfaktoriske receptorer
- Fremstilling af plasmid DNA
- Forbered plasmid-DNA via et endotoksin-fri protokol. BEMÆRK: Brug plasmid DNA forberedelsesmateriale betegnet "endotoxin-fri", eller tilføje en phenol-chloroform ekstraktion skridt til plasmid-DNA forberedelse protokol.
- Fortynd DNA til en koncentration på 100 ng / ul i TE-buffer.
- Overhold belagte celler (trin 2.7) til at sikre en ordentlig confluency af indbyrdesbart 30-50% per brønd og vende tilbage til inkubatoren. BEMÆRK: Mens dette konfluens er ikke optimal for lipid transfektionsreagens en konfluens på 30-50% på dette trin er optimalt for måling af luciferaseaktivitet 24 timer efter transfektion.
- Fremstilling af Transfektion Mix
- Pipette RTP1S-PCI, M3-R-PCI, PCRE-Luc, og pSV40-RL plasmider i MEM medium pr mængderne er beskrevet i tabel 1 for at gøre Plasmid mix (mængder er per 96-brønds plade).
Plasmid mix per brønd per plade med 96 brønde MEM - 500 pi RTP1S-PCI 5 ng 480 ng M3-R-PCI 2,5 ng 240 ng PCRE-Luc 10 ng 960 ng pSV40-RL 5 ng 480 ng
Tabel 1.. Plasmid mix komponenter. Brønd og per 96-brønds plade mængder RTP1S-PCI, M3-R-PCI, PCRE-Luc, og pSV40-RL, og MEM. - For hver 96-brønds plade, fortyndes 18 pi lipid transfektionsreagens i 450 pi MEM-medium.
- Pipette Plasmid mix (fra trin 3.3.1), rhodopsin-tagget olfaktoriske receptor i pCI plasmid (Rho-ELLER-PCI), og lipid transfektion mix (fra trin 3.3.2) for at gøre Complex detaljeret i
Complex per brønd brønd + 10% Plasmid mix 4.2 pi 4,58 pi Rho-OR-PCI 0,05 ng 0,06 ng Lipid Transfektionsblandingen 4.2 pi 4,58 pi M10 41,7 pi 45,83 pi
Tabel 2. Komplekse komponenter. Per godt og per brønd + 10% volumen plasmid mix (tabel 1), olfaktoriske receptor plasmid (Rho-ELLER-pCl) og lipid transfektion mix. M10 tilsættes for at standse reaktionen efter 15 minutters inkubation ved stuetemperatur.
- Pipette RTP1S-PCI, M3-R-PCI, PCRE-Luc, og pSV40-RL plasmider i MEM medium pr mængderne er beskrevet i tabel 1 for at gøre Plasmid mix (mængder er per 96-brønds plade).
- Tryk ud medierne cellepladerne.
- Afpipetteres 50 pi kompleks til hver brønd og inkuberes natten over ved 37 ° C med 5% CO2.
4.. Lugt Stimulation
- Overhold de transficerede celler for at sikre en ordentlig konfluens på 50-80% pr godt og vende tilbage til inkubatoren. BEMÆRK: Hvis cellerne er mindre end 50% Sammenflydende, ildflue-luciferase og Renilla luciferase aflæsninger kan være for lav til måling af receptor-aktivering. Overvej at kassere pladen.
- Forbered 1 M stamopløsninger af hver lugt i DMSO.
- Forbered lugt stimulation løsninger i CD293 medium.
- For screening eksperimenter, fortyndet stamopløsning af lugt til 100 um. Også forberede en no-lugt kontrol (CD293 kun) for at kontrollere om eller baggrund aktivering. BEMÆRK: screening eksperimenter, er hver OR / lugt parret kun testet én gang pr forsøg. Fordi nogle lugt diffusion over brønde er muligt, anbefales det at stimulere med et lugtstof til hver plade.
- Til dosis-respons-forsøg, forberede syv 10-fold seriefortyndinger af lugt stamopløsning i tre eksemplarer begyndende ved 1 mM for hver receptor. Forberede også den samme lugt fortyndinger i tre eksemplarer for tomme vektor-transficerede celler for at kontrollere for aktivering lugt baggrund. BEMÆRK: dosis-respons eksperimenter, hver odor koncentration behandling bør gennemføres i tre eksemplarer.
- Tryk ud medierne cellepladerne.
- Tilsættes med pipette 25 pi lugt stimulation løsning til hver brønd og inkuberes i 4 timer.
5.. Måling eller aktivitet via Luciferase Assay
- Resuspender ildflueluciferase substrat pr fabrikantens anvisninger og opbevares ved -80 ° C.
- Tø 1 ml ildflueluciferase substrat pr 96-brønds plade.
- Forbered frisk ildflueluciferaseaktivitet reaktion quencher og Renilla luciferasesubstrat reagens (5 ul luciferase quencher / Renilla luciferasesubstrat per 1 ml buffer). BEMÆRK: der er behov Ca. 1 ml reagens pr 96-brønds plade.
- Forbered selvlysende mikropladeaflæser. Åbn mikropladelæseren software. Inden ikonet system:
- Under "Forvarmning" Tab, markere feltet for "ON" og sæt temperaturen på maskinen til 25 °; C.
- Under "Dispenser" fanen, prime hver dispenser med 1.000 pi 70% ethanol efterfulgt af 1.000 pi destilleret vand. BEMÆRK: Brug separate portioner af alkohol og vand for hver dispenser. Ethanol anvendes til at desinficere dispensere og vand fjerner den resterende ethanol.
- Prime hver dispenser med 1.500 ul luft (fjern dispensere fra væske). BEMÆRK: priming med luft sikrer, at luciferase substrater ikke fortyndes med overskydende vand.
- Prime dispenser 1 med 1.080 ul ildflueluciferase substrat (fra trin 5.2). Prime dispenser 2 med Renilla luciferase-substrat (fra trin 5.3). BEMÆRK: Vær forsigtig med ikke at cross-kontaminere luciferase substrater. Priming med luciferase substrater fylder døde plads i reagensdispensere.
- Opsæt følgende protokol til at læse både ildflue og Renilla luciferase luminescens. I softwaren forbundet med mikropladelæseren unwho "Filer" menuen, klik på "Ny opgave". Fremhæv "Protokoller", og klik på "Opret ny". I det næste vindue, skal cirklen ved siden af "Standard Protocol" vælges. Klik på "OK". Dobbeltklik på "fremgangsmåde" på venstre side af skærmen.
- Dispensér 10 ul ildflueluciferase substrat til alle brønde med dispenser 1. Under menuen "Actions", klik på "Dispense". I "Doser Step"-vinduet, skal du indstille "Dispenser" til 1 "Priming" til ingen, "dispenseringsvolumen" til 10 pi og "Rate" til 225 gl / sek. Klik på "OK".
- Ryst pladen i 30 sek. Under menuen "Actions", klik på "Shake". I "Shake Step" vinduet, sæt "Intensitet" til Medium og "varighed" til 0:30 MM: SS. Klik på "OK".
- Læs luminescens af alle brønde til 0,5 sek per brønd. Under "Handlinger", klik på "Læs". I "Læs Step"-vinduet, skal du indstille "Detection Method" til Luminescence, "Læs Type" til Endpoint "Integration Time" til 0:00:50 MM: SS: ss "Filter sæt" til 1 "Emission" til Hole, "Optik Position" til top, "Gain" til 135, og "Læs Højde" til 1,00 mm. Klik på "OK".
- Dispensér 10 ul Renilla luciferasesubstrat til alle brønde med dispenser 2. Indstil betingelser som i trin 5.6.1, undtagen sæt "Dispenser" til 2.
- Ryst plade til 30 sek. Sæt betingelser som i trin 5.6.2.
- Læs luminescens af alle brønde til 0,5 sek per brønd. Sæt betingelser som i trin 5.6.3.
- Fjern låget fra den 96-brønds plade og placere pladen i mikropladeaflæser. Start programmet oprettet i trin 5.5 for at læse plade luminescens.
- Rengør reagenser dispenser pumper. Fra ikonet system under "Dispenser" fanebladet:
- Purge 1.000 pi firefly luciferasesubstrat fra ildflueluciferase dispenser ind i et opsving rør. BEMÆRK: Firefly luciferase kan opbevares ved -80 ° C og genanvendes.
- Prime hver dispenser med 1.000 pi destilleret vand, efterfulgt af 1000 pi 70% ethanol, og endelig 1.500 pi luft (fjern dispensere fra væske). BEMÆRK: Vand fjerner luciferase substrater fra reagens pumper, ethanol desinficerer og lufttørrer enhver resterende ethanol.
6.. Dataanalyse
- Data Export
- I mikropladelæseren software, dobbeltklik på "Rapport / Export Builders" på venstre side af skærmen.
- Klik på knappen "Ny Eksporter til Excel" og klik på "OK".
- Fremhæv eksportere1 og klik på "Rediger".
- Under "Indhold" check "System Beskrivelse", "Procedure", "Plate Beskrivelse" og "pladelayout Matrix". Medtag "Rådata" and "Beregnet data".
- Under "Workflow" kontrolleres "Autoexecute efter afslutningen af proceduren". Under Export Mode tjek "Alle plader i samme projektmappe" og "som et nyt regneark".
- Under "File" vælger filnavn format og fil placering, og klik "OK".
- Luk "Rapport / Export Builders" vinduet.
- For at opnå normaliserede luciferase værdier opdele ildflueluciferase luminescence læsning for hver brønd (trin 5.6.3) med Renilla luminescens læsning for hver brønd (trin 5.6.6).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En primær skærm testet 328 periferi mod 26 lugte i en koncentration på 100 uM. Denne lugt koncentration er blevet demonstreret til effektivt at aktivere en stor del af den yderste periferi med kendte ligander 10. Først blev normaliseret luciferaseaktivitet beregnes ved at dividere ildflueluciferase læsning af Renilla luciferase læsning. Derefter blev baselined værdier beregnes ved at trække de normaliserede luciferase aflæsninger til ingen lugt kontrol fra de normaliserede luciferase aflæsninger for hver brønd (figur 1). Dosisreaktionskurver blev udført på 48 lugtstof / ELLER par tilfældigt fordelt over hele spektret af baselined værdier, som indikeret af farvede søjler i figur 1.. Yderste periferi blev behandlet med 7 koncentrationer af lugtstof spænder 1 nM til 1 mM, og de resulterende reaktioner var egnet til en S-formet kurve ved hjælp af lineær regression. Lugtstof / ELLER blev betragtet som en agonist, hvis den opfylder tre kriterier: (1) standardafvigelsen afDen logEC 50 var mindre end 1 log enhed; (2) konfidensintervallerne 95% for de øverste og nederste parametre kurven ikke overlapper; og (3) det ekstra beløb-af-kvadrater test bekræftede, at lugtstoffet aktiveret ELLER-holdige celler væsentligt mere end kontrol-celler, som var transficeret med tom vektor. Dosisresponseffekter Resultaterne er opsummeret i tabel 3..
Disse data blev derefter anvendt til at bestemme, hvor godt assay målinger i en primær screening forudsige resultaterne fra dosisresponskurven. Blå søjler i figur 1 svarer til par, der var klassificeret som agonister i en fuld dosis-respons eksperiment, mens røde bjælker ikke opfylder vores tre kriterier, der er skitseret ovenfor. Værdier fra den primære screening forudsagte resultater fra hele dosis-respons eksperiment (arealet under receiver operating characteristic kurven (AUC) = 0,68, p <0,01, Mann-Whitney U test), hvilket indikerer, at vores primære screening er en nyttig metode at berige for lugtstof / ELLER par der vil blive klassificeret som agonister i en fuld dosis-respons eksperiment (figur 2).
Figur 1.. Hyppigheden af baselined luciferase værdier for en skærm med et panel af olfaktoriske receptorer og lugtstoffer. Histogram af frekvensen (Count) af baselined luciferase er beregnet for hver lugtstof / ELLER pair i den primære skærm. Som lugtstof / receptor-aktivering par er sparsomme, er de fleste af de værdier, centreret på nul, og det store centrale fordeling anslår støj fordeling til denne analyse. Farvede linjer angiver lugtstof / receptor par valgt til dosis-respons-analyse; blå søjler er par, der var klassificeret som agonister baseret på fuld dosis respons, og røde bjælker er par, der ikke var klassificeret som agonister.f = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/51640/51640fig1highres.jpg" target = "_blank"> Klik her for at se større billede.
Figur 2. ROC-kurven for lugtstoffet / receptor-skærmen. 48 odorant / receptor par blev klassificeret som værende agonister eller som ikke værende agonister. Sand positiv rate (følsomhed) blev derefter plottet mod falsk positiv rate (1-specificitet) ved hjælp af R statistisk pakke 40. Arealet under kurven (AUC) er 0,68, hvilket indikerer, at lugtstof / receptor par med højere luciferase skærm værdier er mere tilbøjelige til at passere dosis-respons end dem med lavere værdier. Klik her for at se større billede.
| Baselined Value | Dosisrespons |
| 0,051793067 | mislykkes |
| 0,006376956 | mislykkes |
| 0,331936398 | pass |
| 0,591006519 | pass |
| 0,049093369 | pass |
| 0,396788976 | pass |
| -0,013655743 | pass | 0,011080217 | pass |
| 0,004203349 | mislykkes |
| 0,003975049 | mislykkes |
| -,077935718 | pass |
| -,084488317 | pass |
| 0,030236078 | mislykkes |
| -0,042963576 | mislykkes |
| 0,031466406 | mislykkes |
| 0,025897747 | mislykkes |
| -0,030434651 | mislykkes |
| -,004122795 | mislykkes |
| -,010075533 | mislykkes |
| 0,028883452 | mislykkes |
| 0,019402373 | mislykkes |
| 0,047508749 | mislykkes |
| 0.00255344 | mislykkes |
| 0,017221449 | mislykkes |
| 0,340216655 | pass |
| -0,026912181 | mislykkes |
| 0,037140428 | mislykkes |
| 0,467763017 | pass |
| 0,097665337 | mislykkes |
| 0,080657267 | pass |
| 0,172819211 | pass |
| 0.05568393 | pass |
| -0,106721064 | pass |
| 0,136614849 | pass |
| 0,457839849 | mislykkes |
| 0,211751741 | mislykkes |
| 0.1581464 | pass |
| -,62099155 | pass |
| -,066949491 | pass |
| -0,78712035 | pass |
| 0,752503007 | pass |
| 1,433407558 | pass |
| 0,475431098 | pass |
| 1,457936815 | pass |
| 0,048652537 | mislykkes |
| 0,027196782 | mislykkes |
| 0,129599842 | mislykkes |
| -0,069781272 | mislykkes |
| 0,016450039 | mislykkes |
| -0,025639207 | mislykkes |
| 0,158152141 | mislykkes |
| -,032570055 | mislykkes |
| 0,140139926 | mislykkes |
| -0,052030276 | mislykkes |
| 0,657140133 | pass |
| 1,040410297 | pass |
| pass | |
| 0,399588712 | pass |
| 0,188094387 | pass |
| 0,039371424 | pass |
| 0,016784352 | pass |
| 0,229959571 | pass |
| 0,238381997 | mislykkes |
| 0,074118909 | mislykkes |
| 0,423901128 | pass |
| 0,152621022 | pass |
| pass | |
| 0,075301806 | pass |
| 0,395233972 | pass |
| 0,261892958 | pass |
| 0,156693306 | mislykkes |
| 2,163418147 | pass |
| 3,649862104 | pass |
| 0,025716169 | pass |
| -0,033258008 | pass |
| -0,026984127 | mislykkes |
| -0,338441868 | pass |
| 0.37398618 | pass |
Tabel 3. Olfaktoriske receptor / lugt testet i dosis-respons par. Baselined luciferase værdier og dosis-respons resultater (bestået eller) for 48 eller / lugt par valgt fra skærmen. For 30 testede på skærmen to gange par, er begge baselined luciferase værdierne er inkluderet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Lugtstof identitet er kodet af olfaktoriske receptor aktivering mønstre, men receptor aktivering mønstre, herunder hvilke receptorer aktiveres og i hvilken grad, er kendt for mindre end 6% af de menneskelige olfaktoriske receptorer 1-11. Bestræbelserne på at karakterisere olfaktoriske receptorer er blevet begrænset af deres arbejdsintensive metoder eller anvendelighed til kun en delmængde af det olfaktoriske receptor familien 17,23,24,33,34. Den Hana3A heterolog ekspression system understøtter den robuste udtryk for hovedparten af testede olfaktoriske receptorer, og kan bruges i forbindelse med en cAMP-responsiv luciferase reporter system til at overvåge olfaktoriske receptor aktivering 19,26,27. Ydelse af denne analyse i en 96-brønds format understøtter en række af high-throughput eksperimentelle designs, herunder skærme til at bestemme sandsynlige kandidater til lugtstof / olfaktoriske receptor par og dosis-respons kurver for at bekræfte interaktioner og vurdere, hvordan receptor aktivering niveauer er ofpåvirket af intra-og inter-specifikke variationer. Duftstof / receptor par med højere aktivitet værdier i en skærm er mere tilbøjelige til at udvise en signifikant dosis-respons. Disse data tyder på, at denne screeningsmetode er i stand til at berige for lugtstof / receptor par, der vil passere dosis-respons og dermed lette identifikationen af lugtstof ligander og olfaktoriske receptor-aktivering mønstre.
Succesen for denne analyse er optimeret til olfaktoriske receptor analyse er afhængig af flere faktorer. Alle plasmid-DNA skal fremstilles via et endotoksin-fri protokol. Konsekvent olfaktoriske receptor ekspression på celleoverfladen er kritisk. Den Hana3A cellelinie stabilt udtrykker flere accessoriske proteiner, at støtte i eller udtryk, men co-transfektion af RTP1S og M3-R øger receptor-ekspression og aktivering henholdsvis 27. Denne kombination af tilhørende protein ekspression resulterer i pålideligt udtryk for de fleste olfaktoriske receptorer, så SAMMENLIGNINGn af eller aktivering blandt eksperimenter og receptorer. Desuden er det vigtigt for at opnå konsistente resultater overvågning af cellekonfluens. Under forudsætning af celler i den oprindelige 10 cm2 skål er ca 100% konfluente, ved at følge protokollen beskrevet heri vil resultere i pålidelige cellekonfluens hele eksperimentet. Vigtigere er det, vil tilstrækkelig mange celler være belagt for at opnå en målbar luciferase læsning, men celler vil ikke blive over-vokset, men en tilstand, som kan påvirke receptor-aktivering efter lugtstof stimulation. Normalisering til konstitutive Renilla udtryk yderligere kontrol, ikke kun for celletæthed, men også for transfektionseffektivitet. En Renilla luciferase læsning mere end 2,5 standardafvigelser under middelværdien kan indikere celletab. Celler bør udplades ensartet for at undgå tætte plaques, løsnes lettere fra pladens overflade end sparsom celler og transfektions-og lugtstof løsninger bør tilsættes forsigtigt til den side af brønden for at undgå afmontering cells. Celletab kan også skyldes celledød forårsaget af lugtstof toksicitet, et problem, som kan omgås ved at sænke lugtstof koncentration eller overdreven DMSO, som kan undgås ved at holde DMSO-koncentrationer under 0,5%. Endelig kan behandling af hver receptor-udtrykkende cellepopulation med 1 uM forskolin, en adenylylcyclase aktivator, der forårsager luciferase reporter ekspression fra cAMP-responsiv promotor, tjener som en positiv kontrol for assayet.
Selvom den heri beskrevne assay er en forbedring i forhold til andre metoder, herunder en high-throughput format og mere generelt anvendelige pattedyr olfaktoriske receptorfamilie, har det begrænsninger. Først vores in vitro assay mangler mange komponenter i en in vivo olfaktoriske system, herunder lugtstof bindingsproteiner et slimhindelag intracellulære molekyler og sniffing adfærd. For det andet, er denne metode baseret på en luciferase reporter system til at måle olfaktoriske receptoraktivering i modsætning til almindelige alternative metoder, der udnytter calcium imaging. Nyere undersøgelser tyder på, at disse to metoder kan producere modstridende resultater; ja, et par olfaktoriske receptorer reagere på en bestemt lugtstof, når de undersøges via calcium imaging men ikke luciferaseassayet 41.. Om man assay type er mere relevant for studier af menneskets olfaktoriske opfattelse fortsat uklart, men begge metoder kan være nyttige afhængigt af kontekst og receptor type. For det tredje, mens dette funktionelle udtryk systemet med succes er blevet brugt til at udtrykke de fleste af de testede pattedyr olfaktoriske receptorer, nogle yderste periferi kan ikke være egnede til udtryk ved hjælp af dette system. Hvis tidligere karakteriserede receptorer undlader at reagere på en lugt, kan det være på grund af manglende udtryk på celleoverfladen snarere end en mangel på interaktion mellem lugtstof og receptor. Receptor celleoverfladeekspression kan undersøges via immunfluorescens, før der drages konklusioner fra negativ analyseresultater 27,42 38,39, må de fleste receptorer først blive stimuleret med en duft for at observere en reduktion i luciferaseaktivitet.
Trods disse begrænsninger dette assaysystem, har evnen til i høj grad øge dataopsamling på lugtesansen. Første, high-throughput 96-brønds format gør store receptor og / eller lugt skærme muligt. For det andet, dets heterolog ekspression finder anvendelse på en række af mammale olfaktoriske receptorer. For det tredje kan luciferaseaktivitet anvendes til at måle olfaktoriske receptor aktivering, som er værdifulde i beskriver receptor aktivering mønstre for et bestemt duftstof. For det fjerde, tidligere resultater fra lignende in vitro-systemer forudsige menneskelige olfaktoriske opfattelse 8,11,35. Disse karakteristika er syncielt vigtigt i betragtning af den store størrelse af pattedyrs olfaktoriske receptor familie og vores begrænsede viden om de eller aktivering mønstre fremkaldt af bestemte lugte. Bred anvendelse af denne analyse er optimeret til olfaktoriske receptor analyse vil bidrage til et mere sammenhængende billede af olfaktoriske receptor / lugtstof interaktion og det molekylære grundlag for lugt kodning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af R01 DC013339, R03 DC011373, og Ruth L. Kirschstein National Research Service Award T32 DC000014. En del af arbejdet blev udført ved hjælp af Monell chemosensory receptorsignallering Core, som støttes delvist af finansiering fra NIH-NIDCD Core Grant P30 DC011735. Forfatterne takker C. Sezille hjælp til indsamling af data.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hana3A cells | Avaiable from the Matsunami Laboratory upon request | ||
| RTP1S-pCI | Avaiable from the Matsunami Laboratory upon request | ||
| M3-R-pCI | Avaiable from the Matsunami Laboratory upon request | ||
| pCRE-luc | Agilent | 219076 | LUC |
| pSV40-RL | Promega | E2231 | RL |
| Minimum Essential Media, Eagle | Sigma Aldrich | M4655 | MEM |
| FBS | Life Technologies | 16000-044 | FBS |
| PBS (without Ca2+ and Mg2+) | Cellgro | 21-040-CV | PBS |
| Trypsin (0.05% Trypsin EDTA) | Life Technologies | 25300 | Trypsin |
| CD293 | Life Technologies | 11913-019 | CD293 |
| 96-well PDL white/clear plate | BD BioCoat | 356693 | plates |
| Lipid transfection reagent: Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668-019 | Lipofectamine |
| Firefly luciferase substrate, firefly luciferase quencher/Renilla luciferase substrate: Dual-Glo Assay | Promega | E2980 | dual glo |
| Synergy S2 | BioTek | SLAD | BioTek S2 |
| Microplate reader software: Gen5 Data Analysis Software | BioTek | Gen5 | Gen5 |
| BIOSTACK | BioTek | BIOSTACK2WR | BioStack |
| Multiflo | BioTek | MFP | MultiFlo |
| 300 μl GripTips | Integra | 4433 | GripTips |
| 12.5 μl GripTips | Integra | 4414 | GripTips |
| 300 μl GripTips ViaFlo96 | Integra | 6433 | XYZ tips |
| 12.5 μl GripTips 384 XYZ | Integra | 6403 | XYZ tips |
| 384ViaFlo | Integra | 6030 | 384ViaFlo |
| TE buffer | Macherey Nagel | 740797.1 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650-100ML | DMSO |
| Forskolin | Enzo Life Sciences | BML-CN100-0010 | FOR |
References
- Wetzel, C. H., Oles, M., Wellerdieck, C., Kuczkowiak, M., Gisselmann, G., Hatt, H. Specificity and sensitivity of a human olfactory receptor functionally expressed in human embryonic kidney 293 cells and Xenopus Laevis oocytes. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 19 (17), 7426-7433 (1999).
- Spehr, M., et al. Identification of a testicular odorant receptor mediating human sperm chemotaxis. Science. 299 (5615), 2054-2058 (2003).
- Sanz, G., Schlegel, C., Pernollet, J. -C., Briand, L. Comparison of odorant specificity of two human olfactory receptors from different phylogenetic classes and evidence for antagonism. Chemical senses. 30 (1), 69-80 (2005).
- Matarazzo, V., et al. Functional characterization of two human olfactory receptors expressed in the baculovirus Sf9 insect cell system. Chemical senses. 30 (3), 195-207 (2005).
- Jacquier, V., Pick, H., Vogel, H. Characterization of an extended receptive ligand repertoire of the human olfactory receptor OR17-40 comprising structurally related compounds. Journal of neurochemistry. 97 (2), 537-544 (2006).
- Neuhaus, E. M., Mashukova, A., Zhang, W., Barbour, J., Hatt, H. A specific heat shock protein enhances the expression of mammalian olfactory receptor proteins. Chemical senses. 31 (5), 445-452 (2006).
- Shirokova, E., et al. Identification of specific ligands for orphan olfactory receptors. G protein-dependent agonism and antagonism of odorants. The Journal of biological chemistry. 280 (12), 11807-11815 (2005).
- Keller, A., Zhuang, H., Chi, Q., Vosshall, L. B., Matsunami, H. Genetic variation in a human odorant receptor alters odour perception. Nature. 449 (7161), 468-472 (2007).
- Menashe, I., et al. Genetic elucidation of human hyperosmia to isovaleric acid. PLoS biology. 5 (11), (2007).
- Saito, H., Chi, Q., Zhuang, H., Matsunami, H., Mainland, J. D. Odor coding by a Mammalian receptor repertoire. Science signaling. 2 (60), (2009).
- Jaeger, S. R., et al. A Mendelian Trait for Olfactory Sensitivity Affects Odor Experience and Food Selection. Current Biology. 23, 1-5 (2013).
- DeMaria, S., Ngai, J. The cell biology of smell. The Journal of cell biology. 191 (3), 443-452 (2010).
- Zhang, X., Firestein, S. The olfactory receptor gene superfamily of the mouse. Nature nauroscience. 5 (2), 124-1233 (2002).
- Glusman, G., Yanai, I., Rubin, I., Lancet, D. The complete human olfactory subgenome. Genome research. 11 (5), 685-702 (2001).
- Olender, T., Lancet, D., Nebert, D. W. Update on the olfactory receptor (OR) gene superfamily. Human Genomics. 3 (1), 87 (2008).
- Mombaerts, P. Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors. Nature reviews. Neuroscience. 5 (4), 263-278 (2004).
- Malnic, B., Hirono, J., Sato, T., Buck, L. B. Combinatorial receptor codes for odors. Cell. 96 (5), 713-723 (1999).
- Araneda, R. C., Kini, aD., Firestein, S. The molecular receptive range of an odorant receptor. Nature. 3 (12), 1248-1255 (2000).
- Saito, H., Kubota, M., Roberts, R. W., Chi, Q., Matsunami, H. RTP family members induce functional expression of mammalian odorant receptors. Cell. 119 (5), 679-691 (2004).
- Katada, S., Hirokawa, T., Oka, Y., Suwa, M., Touhara, K. Structural basis for a broad but selective ligand spectrum of a mouse olfactory receptor: mapping the odorant-binding site. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 25 (7), 1806-1815 (2005).
- Lu, M., Echeverri, F., Moyer, B. D. Endoplasmic Reticulum Retention, Degradation, and Aggregation of Olfactory G-Protein Coupled Receptors. Traffic. 4 (6), 416-433 (2003).
- McClintock, T. S., et al. Functional expression of olfactory-adrenergic receptor chimeras and intracellular retention of heterologously expressed olfactory receptors. Brain research. Molecular brain research. 48 (2), 270-278 (1997).
- Zhao, H. Functional Expression of a Mammalian Odorant Receptor. Science. 279 (5348), 237-242 (1998).
- Kajiya, K., Inaki, K., Tanaka, M., Haga, T., Kataoka, H., Touhara, K. Molecular bases of odor discrimination: Reconstitution of olfactory receptors that recognize overlapping sets of odorants. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 21 (16), 6018-6025 (2001).
- Krautwurst, D., Yau, K., Reed, R. R., Hughes, H. Identification of Ligands for Olfactory Receptors. Cell. 95, 917-926 (1998).
- Li, Y. R., Matsunami, H. Activation state of the M3 muscarinic acetylcholine receptor modulates mammalian odorant receptor signaling. Science signaling. 4 (155), (2011).
- Zhuang, H., Matsunami, H. Evaluating cell-surface expression and measuring activation of mammalian odorant receptors in heterologous cells. Nature. 3 (9), 1402-1413 (2008).
- Haddad, R., Khan, R., Takahashi, Y. K., Mori, K., Harel, D., Sobel, N. A metric for odorant comparison. Nature methods. 5 (5), 425-429 (2008).
- Veithen, A., Wilkin, F., Philippeau, M., Van Osselaer, C., Chatelain, P. Olfactory Receptors: From basic science to applications in flavors and fragrances. Perfumer and Flavorist. 35 (1), 38-40 (2010).
- Bozza, T., Feinstein, P., Zheng, C., Mombaerts, P. Odorant receptor expression defines functional units in the mouse olfactory system. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 22 (8), 3033-3043 (2002).
- Oka, Y., Katada, S., Omura, M., Suwa, M., Yoshihara, Y., Touhara, K. Odorant receptor map in the mouse olfactory bulb: in vivo sensitivity and specificity of receptor-defined glomeruli. Neuron. 52 (5), 857-869 (2006).
- Zhao, H., Ivic, L., Otaki, J. M., Hashimoto, M., Mikoshiba, K., Firestein, S. Functional expression of a mammalian odorant receptor. Science. 279 (5348), 237-242 (1998).
- Touhara, K., et al. Functional identification and reconstitution of an odorant receptor in single olfactory neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (7), 4040-4045 (1999).
- Zhuang, H., Matsunami, H. Synergism of accessory factors in functional expression of mammalian odorant receptors. The Journal of biological chemistry. 282 (20), 15284-15293 (2007).
- McRae, J. F., Mainland, J. D., Jaeger, S. R., Adipietro, K. A., Matsunami, H., Newcomb, R. D. Genetic variation in the odorant receptor OR2J3 is associated with the ability to detect the "grassy" smelling odor, cis-3-hexen-1-ol. Chemical senses. 37 (7), 585-593 (2012).
- Adipietro, K. A., Mainland, J. D., Matsunami, H. Functional evolution of mammalian odorant receptors. PLoS genetics. 8 (7), (2012).
- Zhuang, H., Chien, M. -S., Matsunami, H. Dynamic functional evolution of an odorant receptor for sex-steroid-derived odors in primates. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (50), 21247-21251 (2009).
- Oka, Y., Nakamura, A., Watanabe, H., Touhara, K. An odorant derivative as an antagonist for an olfactory receptor. Chemical senses. 29 (9), 815-822 (2004).
- Oka, Y., Omura, M., Kataoka, H., Touhara, K. Olfactory receptor antagonism between odorants. The EMBO journal. 23 (1), 120-126 (2004).
- Fawcett, T. An introduction to ROC analysis. Pattern Recognition Letters. 27 (8), 861-874 (2006).
- Baghaei, K. A. Olfactory Receptors. Olfactory Recept. Methods Protoc. 1003, 229-238 (2013).
- Dey, S., Zhan, S., Matsunami, H. Assaying surface expression of chemosensory receptors in heterologous cells. Journal of visualized experiments JoVE. (48), (2011).
