Summary
Olfactorische receptor activering patronen coderen geur identiteit, maar het gebrek aan gepubliceerde gegevens identificeren geurstof liganden voor zoogdieren reukreceptoren belemmert de ontwikkeling van een alomvattend model van geur codering. Dit protocol beschrijft een werkwijze voor zeer snelle identificatie van olfactorische receptor liganden en kwantificering van receptoractivering vergemakkelijken.
Abstract
Geurstoffen creëren unieke en overlappende patronen van olfactorische receptor activering, zodat een familie van ongeveer 1.000 muizen en 400 menselijke receptoren tot duizenden geurstoffen herkennen. Odorant liganden verschenen voor minder dan 6% van de humane receptoren 1-11. Dit gebrek aan gegevens is deels te wijten aan moeilijkheden functioneel uiten van deze receptoren in heterologe systemen. Hier beschrijven we een werkwijze voor het uitdrukken van de meerderheid van de olfactorische receptor familie in Hana3A cellen, gevolgd door een hoge-doorvoer beoordeling van olfactorische receptoractivering met een luciferase reporter assay. Deze test kan worden gebruikt om (1) scherm panelen geurstoffen tegen panelen reukreceptoren; (2) bevestigen geurstof / receptor interactie via dosisresponscurven; en (3) vergelijken met receptor activering niveaus onder receptor varianten. In ons voorbeeld, werden 328 reukreceptoren gescreend tegen 26 geurstoffen. Geurstof / receptor paren met verschillende respons scores waren selectieted en getest dosisrespons. Deze gegevens geven aan dat een scherm is een effectieve methode om verrijken geurstof / receptor paren die een dosis respons experiment passen, namelijk receptoren die een bona fide reactie op een geurstof hebben. Daarom is deze hoog-luciferase assay is een effectieve methode om reukreceptoren-een essentiële stap naar een model van geur codering in het zoogdier olfactorische systeem karakteriseren.
Introduction
De zoogdieren olfactorische systeem heeft de mogelijkheid om te reageren op een groot aantal geurende stimuli, waardoor de detectie en discriminatie van duizenden geurstoffen. Reukreceptoren (UPR) zijn de moleculaire sensoren door de olfactorische sensorische neuronen in de olfactorische epitheel 12 uitgedrukt. Zoogdieren geur herkenning gebeurt door verschil in activatie van de UPR door geurstoffen en de OR gen-familie is uitgebreid met zo'n 1.000 muizen en 400 menselijke receptoren 12-16. Vorige functionele analyses van de UPR in olfactorische neuronen en in heterologe cellen hebben aangetoond dat verschillende geurstoffen worden herkend door unieke, maar overlappende ensembles van UPR 10,17-20. Bijpassende liganden voor de UPR is van cruciaal belang voor het begrijpen van de olfactorische code en essentieel voor het opbouwen van levensvatbare modellen van de reukzin. Vanwege problemen uiten UPR in heterologe systemen evenals het grote aantal van zowel geurstoffen en ultraperifere regio's heeft deze gegevens grotendeels afwezig van de f geweestield; inderdaad, minder dan 6% van de menselijke UPR een bekend ligand 1-11. Dit protocol beschrijft het gebruik van een luciferase assay geurstof / of interacties te karakteriseren. Deze test kan de hoge-doorvoer analyse van de UPR, een taak die essentieel is voor het begrijpen van geurstof / of interacties, evenals het ontwikkelen van een model van geur codering.
High-throughput studies van de UPR geconfronteerd drie grote uitdagingen. Eerst UPR expressie in heterologe cellen werden vastgehouden in het ER en vervolgens afgebroken in het proteasoom 21,22, waardoor de UPR interageren met geurstoffen in het testsysteem 23-25. Dit probleem is aangepakt door de ontdekking van accessoire eiwitten die stabiele celoppervlak-expressie van een groot aantal UPR 19,26,27 vergemakkelijken. Receptor-transporter-eiwit 1 en 2 (RTP1 en 2) bevorderen of celoppervlak expressie en activering in respons op stimulatie geurstof 19. Op basis van dit werk, HEK293T cellengemodificeerd om stabiel tot expressie RTP1 lang (RTP1L) en RTP2, receptor-expressieversterkende eiwit 1 en G αolf, waardoor de Hana3A cellijn 19,27. Bovendien, het type 3 muscarine acetylcholine receptor (M3-R) samenwerkt met OR's op het celoppervlak en verbetert activering in reactie op geurstoffen 26. Co-transfectie van een OR met RTP1S en M3-R in Hana3A cellen resulteert in een robuuste, consistente en functionele expressie van een brede waaier van UR op het celoppervlak 27. Ten tweede, zoogdier of repertoires vrij groot. Bij de mens, bijvoorbeeld de OR repertoire is een orde van grootte talrijker dan de smaak receptor repertoire, en 2 ordes van grootte talrijker dan de visuele receptor repertoire. Hoewel het klonen van een OR is een relatief eenvoudig protocol, wordt belangrijke up-front inspanning die nodig is om een uitgebreide bibliotheek te genereren. Ten derde, hoewel we weten dat in de visie, golflengte vertaalt in kleur enin auditie frequentie vertaalt in toonhoogte, wordt de organisatie van geuren slecht begrepen, waardoor het moeilijk voor onderzoekers om interpoleren uit een representatieve steekproef van geurstoffen. Hoewel enige vooruitgang is geboekt op dit front 10,28, de kaart van de olfactorische landschap nog steeds niet voltooid. Screening tienduizenden moleculen tegen honderden UPR is een moeilijke taak; high-throughput-schermen op dit gebied vereisen zorgvuldig gedefinieerd campagnes. De belangrijkste overblijvende uitdagingen die logistiek en kosten dan problemen verbonden wat de techniek. Hoewel heterologe screening is niet op grote schaal gebruikt om liganden te identificeren door academische groepen, is een particuliere onderneming dezelfde techniek gebruikt om liganden te identificeren voor 100 menselijke UPR 29. Helaas, deze gegevens blijven eigendom.
De high-throughput luciferasetest hier geschetst heeft een aantal voordelen ten opzichte van alternatieve methoden die worden gebruikt om te beoordelen of activering. Hoewel de verantwoordelijkheidses van inheemse olfactorische sensorische neuronen zijn gemeten met behulp van elektrofysiologie en calcium beeldvorming, deze technieken hebben moeite plagen elkaar, die of dat leidt tot de reactie van een neuron als gevolg van de overlap in reactie woningen te reukneuronen. Hoewel kloppen in een GFP-gelabeld receptortype 30,31, levert specifieke receptoren via adenovirus reukneuronen muriene 32,33, of het uitvoeren van RT-PCR na opname 17,24,33 kunnen opnamen koppelen aan enkele soorten receptoren zijn deze werkwijzen low-throughput en niet geschikt voor grootschalige schermen. Heterologe screening systemen zijn schaalbaar, en twee belangrijke vormen zijn te vinden in de literatuur: cAMP pathway verslaggevers en inositol trifosfaat (IP3) route verslaggevers. Bij geur stimulatie, UPR activeren G αolf transductie signalerende cascade die leidt tot de productie van cyclisch AMP (cAMP) 12. Door co-transfectie van een vuurvlieg luciferase reportergen onder controle van acAMP respons elementen (CRE), kan luciferase productie worden gemeten als functie van geur respons, waardoor de kwantificering van of activering. OR activering kan ook worden gekoppeld aan de IP3 pad door co-expressie G-eiwitten zoals G α15/16 of G α15-OLF chimeer 24,25,34. We hebben de test hier gepresenteerde gebaseerd op drie factoren gekozen: (1) de co-expressie van RTP1 met Rho-tagged reukreceptoren verbetert de expressie van olfactorische receptoren op het celoppervlak 19,27; (2) gebruik van een cAMP-responsieve reporter gen maakt voor het meten van of activering via canonieke tweede boodschapperpad; en (3) test is zeer geschikt voor high-throughput screens.
Deze high-throughput luciferase assay is voor verschillende studies waardevol voor het gebied van reukzin. Ten eerste kan een groot aantal UPR afgeschermd van een geurstof om de receptoractivering patroon voor een sp bepalenecifieke geurstof. Dit type van studie identificeerde OR7D4 als OR verantwoordelijk voor het reageren op de steroïde geurstof androstenon 8. Omgekeerd kan een of afgeschermd van een panel van geurstoffen teneinde de receptor responsprofiel 10 bepalen. Als kandidaat olfactorische reukstof / OF paren geïdentificeerd via deze schermen kan de interactie worden bevestigd door het uitvoeren van een dosis-respons-experiment onderzoekt de respons van de OF toenemende concentraties van geurstof. Dosisresponscurven kan ook beoordelen hoe genetische variatie in een OR invloed in vitro geurstof reactie 8,9,11,35, en deze studies kan worden uitgebreid tot interspecifieke OF variatie, waardoor het onderzoek van receptor evolutie tussen soorten en causale mutaties in de evolutie 36,37, tenslotte deze test kan worden gebruikt om te screenen op antagonisten die geur kunnen tegenwerken of reactie op een bepaalde geurstof voor een bekende geurstof / receptor paar 38,39 zijn. Samengevat, deze hogeThroughput luciferase assay is toepasbaar op een reeks studies die zullen helpen karakteriseren of activeringspatronen en een beter begrip van geur codering in het olfactorische systeem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Culture of Hana3A Cells
- Bereid M10 media door aanvulling minimum essentieel medium (MEM) met 10% (v / v) FBS.
- Cultuur Onderhoud
- Handhaaf cellen in M10 media. OPMERKING: De expressievectoren voor RTP1L, RTP2, REEP1 en G αolf verlenen puromycine resistentie tegen Hana3A cellen, maar behoud van de cellen met dit antibioticum heeft geen significante invloed testresultaten.
- Subcultuur in een verhouding van 1:08 in 10 cm schalen om de 2-3 dagen.
- Incubeer bij 37 ° C met 5% CO2.
2. Plating Cellen voor transfectie
- Aspireren media uit een 100% confluent 10 cm schotel van Hana3A cellen.
- Was de cellen door toevoeging van 10 ml PBS, wervelen de schotel en opzuigen PBS.
- Voeg 3 ml van 0,05% trypsine / EDTA en wacht tot cellen van elkaar te scheiden (ongeveer 1 minuut).
- Inactiveren trypsine door toevoeging van 5 ml M10 en breken celklonten door fijnwrijven ongeveer 10x &# 160, met een pipet 10 ml. Pipet zorgvuldig te voorkomen dat er luchtbellen in de media.
- Voor elke 96-well plaat, breng 1 ml cellen in een 15 ml conische buis, centrifuge bij 200 xg gedurende 5 minuten, en het supernatans aspireren zonder de celpellet.
- Resuspendeer de cellen in 6 ml M10 per 1 ml cellen overgebracht in stap 2.5.
- Pipetteer 50 ul van cellen aan elk putje van een plaat met 96 putjes en incubeer overnacht bij 37 ° C met 5% CO2.
3. Transfectie van reukreceptoren
- Bereiding van plasmide DNA
- Bereid plasmide DNA via een endotoxinevrij protocol. OPMERKING: Gebruik plasmide-DNA preparaat kits aangeduid "endotoxinevrij" of voeg een fenol-chloroform extractiestap om het plasmide DNA bereiding protocol.
- Verdun DNA tot een concentratie van 100 ng / pl in TE-buffer.
- Observeren plated cellen (Stap 2.7) om een juiste confluentie van onderlinge waarborgentely 30-50% per putje en terug te keren naar incubator. Opmerking: deze confluentie niet optimaal is voor de lipide transfectie reagens, een confluentie van 30-50% in deze stap is optimaal voor het meten van luciferase-activiteit 24 uur na transfectie.
- Bereiding van transfectiemengsel
- Pipetteer RTP1S pCI-, M3-R-pCI, pCRE-luc en pSV40-RL plasmiden in MEM-medium per volumes in tabel 1 bij de plasmide mix maken (volumes opgegeven per 96-well plaat).
Plasmide mix per putje per 96-well plaat MEM - 500 pi RTP1S PCI 5 ng 480 ng M3-R-pCI 2,5 ng 240 ng pCRE-luc 10 ng 960 ng pSV40-RL 5 ng 480 ng
Tabel 1. Plasmide mengsel onderdelen. Per putje en per 96-well plaat volumes RTP1S pCI-, M3-R-pCI, pCRE-luc en pSV40-RL en MEM. - Voor elke 96-well plaat, verdunnen 18 pi lipide transfectiereagens in 450 pi MEM medium.
- Pipetteer Plasmide mix (uit stap 3.3.1), rhodopsine-gelabeld reukreceptor in pCI plasmide (Rho-OR-pCI) en lipide transfectie mix (uit stap 3.3.2) aan het complex opgenomen in maken
Complex per putje per goed + 10% Plasmide mix 4,2 pl 4,58 pi Rho-OF-pCl 0,05 ng 0,06 ng Lipide transfectiemengsel 4,2 pl 4,58 pi M10 41,7 ul 45.83 pi
Tabel 2. Complex componenten Per putje en per well + 10% volumina plasmide mengsel (tabel 1), reukreceptor plasmide (Rho-OR-pCI) en lipide transfectie mix.. M10 wordt toegevoegd aan de reactie na 15 min incubatie bij kamertemperatuur doven.
- Pipetteer RTP1S pCI-, M3-R-pCI, pCRE-luc en pSV40-RL plasmiden in MEM-medium per volumes in tabel 1 bij de plasmide mix maken (volumes opgegeven per 96-well plaat).
- Kraan uit de media op de cel platen.
- Pipetteer 50 ul van complex aan elk putje en incubeer overnacht bij 37 ° C met 5% CO2.
4. Geur Stimulatie
- Let op de getransfecteerde cellen om een goede confluentie van 50-80% per goed verzekeren en terug te keren naar incubator. OPMERKING: Als de cellen minder dan 50% Confluent, vuurvlieg luciferase en Renilla luciferase waarden te laag zijn voor het meten van receptoractivering. Overweeg gooi de plaat.
- Bereid 1 M voorraad oplossingen van elke geur in DMSO.
- Bereid geur stimulatie oplossingen CD293 medium.
- Voor screening experimenten, verdunnen voorraad oplossing van geur tot 100 uM. Ook de voorbereiding van een no-geurbestrijding (CD293 alleen) om te controleren voor OR achtergrond activering. OPMERKING: Voor screening experimenten, elk OR / geur paar is getest slechts eenmaal per experiment. Omdat sommige geur diffusie over putten mogelijk is, is het raadzaam om te stimuleren met een geurstof voor elke plaat.
- Voor dosis-respons experimenten bereiden zeven 10-voudige seriële verdunningen van geur voorraadoplossing in drievoud vanaf 1 mM voor elke receptor. Bereiden ook dezelfde geur verdunningen in drievoud voor lege-vector getransfecteerde cellen om te controleren voor geur achtergrond activatie. OPMERKING: Voor dosis-respons experimenten, elk odor concentratie behandeling moet worden uitgevoerd in drievoud.
- Kraan uit de media op de cel platen.
- Pipetteer 25 ul van geur stimulatie oplossing in elk putje en incubeer gedurende 4 uur.
5. Meten of activiteit via Luciferase Assay
- Resuspendeer vuurvlieg luciferase substraat volgens de instructies van de fabrikant en bewaar bij -80 ° C.
- Ontdooi 1 ml vuurvlieg luciferase substraat per 96-well plaat.
- Bereid deze vuurvlieg luciferase reactie quencher en Renilla luciferase substraat reagens (5 ul luciferase quencher / Renilla luciferase substraat per 1 ml buffer). Opmerking: Ongeveer 1 ml reagens nodig per 96-well plaat.
- Bereid de lichtgevende microplaatlezer. Open de microplaatlezer software. Binnen het pictogram systeem:
- Onder de "Pre-verwarming" Tab, vinkt u het vakje voor "ON" en stel de temperatuur van de machine tot 25 °; C.
- Onder het tabblad "Dispenser", prime elk dispenser met 1000 pi van 70% ethanol, gevolgd door 1000 pi gedestilleerd water. OPMERKING: Gebruik afzonderlijke porties van alcohol en water voor iedere dispenser. Ethanol wordt gebruikt om de dispensers desinfecteren en water verwijdert de resterende ethanol.
- Prime elk dispenser met 1500 pi lucht (verwijder dispensers van vloeistof). OPMERKING: het ontluchten zorgt ervoor dat luciferase substraten niet worden verdund met restwater.
- Prime dispenser 1 met 1080 pi vuurvliegluciferase substraat (uit stap 5.2). Prime dispenser 2 met Renilla luciferase substraat (uit stap 5.3). LET OP: Wees voorzichtig niet te cross-besmetten het luciferase substraten. Primeren met luciferase substraten vult de dode ruimte in het reagens dispensers.
- Stel de volgende protocol om zowel vuurvlieg en Renilla luciferase luminescentie lezen. Binnen de software in verband met de microplaatlezer, under het menu "Bestand", klik op "Nieuwe taak". Markeer "Protocols" en klik op "Create New". In het volgende venster, moet de cirkel naast "standaard protocol" worden geselecteerd. Klik op "OK." Dubbelklik op "uitvoeren" op de linkerkant van het scherm.
- Doseer 10 pl vuurvliegluciferase substraat aan alle putjes met behulp dispenser 1. Onder het menu "Acties", klik op "Dispense". In het venster "Verdeel Step", stelt: "Dispenser" naar 1, "Priming" voor niemand, "Doseer Volume" naar 10 pl en "Rate" tot 225 ul / sec. Klik op "OK".
- Schud de plaat gedurende 30 sec. Onder het menu "Acties", klik op "Shake". In het venster "Shake Step", stelt u "Intensity" naar Medium en 'Duur' om 00:30 MM: SS. Klik op "OK".
- Lees de luminescentie van alle putjes voor 0,5 sec per goed. Onder het menu "Acties", klik op "Lees";. In het venster "Lees Step", stelt: "Detection Method" om Luminescentie, "Lees Type" naar Endpoint, "Integratie tijd" om 00:00:50 MM: SS: ss, "Sets Filter" op 1, "Emissie" Hole, "Optics Position" naar boven, "Gain" naar 135, en "Lees Hoogte" tot 1,00 mm. Klik op "OK".
- Doseer 10 pl Renilla luciferasesubstraat aan alle putjes met behulp verdeler 2. Stel de voorwaarden zoals in stap 5.6.1, behalve set "Dispenser" naar 2.
- Schud plaat gedurende 30 sec. Stel de voorwaarden zoals in stap 5.6.2.
- Lees luminescentie van alle putjes voor 0,5 sec per goed. Stel de voorwaarden zoals in stap 5.6.3.
- Verwijder het deksel van de 96-well plaat en plaats de plaat in de microplaat lezer. Start de set-up in stap 5.5 tot plaat luminescentie lezen programma.
- Reinig het reagens dispenser pompen. Via het pictogram systeem onder de tab "Dispenser":
- Zuiver 1.000 III firefly luciferasesubstraat van de vuurvliegluciferase dispenser in een herstel buis. OPMERKING: Firefly luciferase kan worden opgeslagen bij -80 ° C en hergebruikt.
- Prime elke dispenser met 1000 pi gedestilleerd water, gevolgd door 1000 ui 70% ethanol en uiteindelijk 1500 ui lucht (verwijder dispensers vloeistof). OPMERKING: Water verwijdert luciferase substraten van het reagens pompen, ethanol desinfecteert en lucht droogt eventueel resterende ethanol.
6. Data Analysis
- Gegevens exporteren
- In de microplaatlezer software, dubbelklik op "Rapport / Export bouwers 'aan de linkerkant van het scherm.
- Klik op de knop "Nieuw Exporteren naar Excel" en klik op "OK".
- Markeer EXPORT1 en klik op "Bewerken".
- Onder "Content" check "System Beschrijving", "procedure", "Plate Beschrijving" en "plaatindeling Matrix". Zijn "Raw data" eennd "Berekend gegevens".
- Onder "Workflow", vink "Autoexecute na afloop van de procedure". Onder Export Mode, vink "Alle platen in dezelfde werkmap" en "Als een nieuw werkblad".
- Onder "Bestand" kiezen bestandsnaam formaat en file locatie en klik op "OK".
- Sluit het venster "Rapport / Export Builders".
- Genormaliseerde luciferase waarden te komen, verdeel de vuurvliegluciferase luminescentie lectuur voor elk putje (stap 5.6.3) door de Renilla luminescentie lectuur voor elk putje (stap 5.6.6).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een primaire scherm getest 328 UPR tegen 26 geuren bij een concentratie van 100 uM. Deze geur concentratie is aangetoond effectief activeren een groot deel van UR met bekende liganden 10. Eerst werd genormaliseerd luciferase-activiteit berekend door het vuurvliegluciferase lezing door het Renilla luciferase lezen verdelen. Vervolgens werden baseline waarden berekend door de luciferase genormaliseerde waarden voor de niet geurbestrijding het luciferase genormaliseerde waarden voor elk putje (Figuur 1). Dosis-respons curves werden uitgevoerd op 48 reukstof / OF paren willekeurig verdeeld over de reeks van baseline waarden, zoals aangegeven door gekleurde balken in Figuur 1. UPR behandeld met 7 concentraties geurstof spanning 1 nM tot 1 mM, en de responsen waren pasvorm een sigmoïdale kromme met lineaire regressie. Een geurstof / OF werd beschouwd als een agonist als het voldeed aan drie criteria: (1) de standaardfout vande logEC 50 was minder dan 1 log-eenheid; (2) de 95% betrouwbaarheidsintervallen voor de bovenste en onderste parameters van de curve niet overlappen; en (3) extra-sommen van kwadraten test bevestigde dat de geurstof geactiveerd OF-bevattende cellen aanzienlijk meer dan de controle cellen, die zijn getransfecteerd met een lege vector. Dosis respons resultaten zijn samengevat in Tabel 3.
Deze gegevens werden vervolgens gebruikt om te bepalen hoe goed assay metingen in een primaire screening voorspellen resultaten uit de dosis-responscurve. Blauwe balken in figuur 1 corresponderen met paren die werden geclassificeerd als agonisten met een volledige dosis-respons-experiment, terwijl rode balken niet aan onze drie criteria hierboven beschreven. Waarden van het hoofdscherm voorspelde resultaat van de volledige dosis respons experiment (oppervlakte onder de ROC-curve (AUC) = 0,68, p <0,01, Mann-Whitney U test), wat aangeeft dat onze primaire screening is een nuttige methode te verrijken geurstof / of paren die worden aangemerkt als agonisten in een volledige dosis respons experiment (Figuur 2).
Figuur 1. Frequentie van baseline luciferase waarden voor een scherm met een panel van olfactorische receptoren en geurstoffen. Histogram van de frequentie (graaf) van baseline luciferase worden berekend voor ieder geurstof / OF pair in het primaire scherm. Als geurstof / receptoractivering paren zijn schaars, de meeste waarden gecentreerd op nul en de grote centrale verdeling schat de Ruisdistributie voor deze test. Gekleurde balken geven geurstof / receptor paren gekozen voor dosis-respons analyse; blauwe balken zijn paren die werden geclassificeerd als agonisten basis van de volledige dosisrespons en rode balken zijn paren die niet zijn geclassificeerd als agonisten.f = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/51640/51640fig1highres.jpg" target = "_blank"> Klik hier voor grotere afbeelding.
Figuur 2. ROC curve voor de geurstof / receptor scherm. 48 geurstof / receptor paren werden geclassificeerd als zijnde agonisten of als niet-agonisten. True positief tarief (gevoeligheid) werd vervolgens uitgezet tegen de valse positieve tarief (1-specificiteit) met behulp van de R statistisch pakket 40. Het gebied onder de curve (AUC) is 0,68, wat aangeeft dat de geurstof / receptor paren met hogere luciferase scherm waarden hebben meer kans om dosis-respons dan die met lagere waarden doorgeven. Klik hier voor grotere afbeelding.
| Gebaselined Waarde | Dose Response |
| 0,051793067 | mislukken |
| 0,006376956 | mislukken |
| 0,331936398 | passeren |
| 0,591006519 | passeren |
| 0,049093369 | passeren |
| 0,396788976 | passeren |
| -0,013655743 | passeren | 0,011080217 | passeren |
| 0,004203349 | mislukken |
| 0,003975049 | mislukken |
| -,077935718 | passeren |
| -,084488317 | passeren |
| 0,030236078 | mislukken |
| -0,042963576 | mislukken |
| 0,031466406 | mislukken |
| 0,025897747 | mislukken |
| -0,030434651 | mislukken |
| -,004122795 | mislukken |
| -,010075533 | mislukken |
| 0,028883452 | mislukken |
| 0,019402373 | mislukken |
| 0,047508749 | mislukken |
| 0.00255344 | mislukken |
| 0,017221449 | mislukken |
| 0,340216655 | passeren |
| -0,026912181 | mislukken |
| 0,037140428 | mislukken |
| 0,467763017 | passeren |
| 0,097665337 | mislukken |
| 0,080657267 | passeren |
| 0,172819211 | passeren |
| 0.05568393 | passeren |
| -0,106721064 | passeren |
| 0,136614849 | passeren |
| 0,457839849 | mislukken |
| 0,211751741 | mislukken |
| 0.1581464 | passeren |
| -,62099155 | passeren |
| -,066949491 | passeren |
| -0,78712035 | passeren |
| 0,752503007 | passeren |
| 1,433407558 | passeren |
| 0,475431098 | passeren |
| 1,457936815 | passeren |
| 0,048652537 | mislukken |
| 0,027196782 | mislukken |
| 0,129599842 | mislukken |
| -0,069781272 | mislukken |
| 0,016450039 | mislukken |
| -0,025639207 | mislukken |
| 0,158152141 | mislukken |
| -,032570055 | mislukken |
| 0,140139926 | mislukken |
| -0,052030276 | mislukken |
| 0,657140133 | passeren |
| 1,040410297 | passeren |
| passeren | |
| 0,399588712 | passeren |
| 0,188094387 | passeren |
| 0,039371424 | passeren |
| 0,016784352 | passeren |
| 0,229959571 | passeren |
| 0,238381997 | mislukken |
| 0,074118909 | mislukken |
| 0,423901128 | passeren |
| 0,152621022 | passeren |
| passeren | |
| 0,075301806 | passeren |
| 0,395233972 | passeren |
| 0,261892958 | passeren |
| 0,156693306 | mislukken |
| 2,163418147 | passeren |
| 3,649862104 | passeren |
| 0,025716169 | passeren |
| -0,033258008 | passeren |
| -0,026984127 | mislukken |
| -0,338441868 | passeren |
| 0.37398618 | passeren |
Tabel 3. Reukreceptor / geur paren getest in dosis-respons. Baseline luciferase waarden en dosis-respons resultaten (slagen of zakken) voor 48 OR / geur paren gekozen uit het scherm. Voor 30 paar getest tweemaal op het scherm, zijn beide gebaselined luciferase waarden bijgevoegd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Geurstof identiteit wordt gecodeerd door reukreceptor activeringspatronen, maar receptoractivering patronen, waaronder die receptoren geactiveerd en in welke mate, zijn bekend om minder dan 6% van de menselijke olfactorische receptoren 1-11. Pogingen om reukreceptoren karakteriseren zijn beperkt door hun arbeidsintensief en toepasbaarheid slechts een subset van de olfactorische receptorfamilie 17,23,24,33,34. De Hana3A heterologe expressie ondersteunt de robuuste expressie van de meeste geteste reukreceptoren en kan worden gebruikt in combinatie met een cAMP-responsief luciferase reporter systeem olfactorische receptoractivering 19,26,27 controleren. De prestaties van deze test in een 96-well formaat ondersteunt een aantal high-throughput experimentele ontwerpen, waaronder schermen om waarschijnlijke kandidaten voor de geurstof / olfactorische receptor paren en de dosis-respons curven bepalen om de interacties te bevestigen en te beoordelen hoe receptor activering niveaus affected door intra-en inter-specifieke variaties. Geurstof / receptor paren met hogere activiteit waarden in een scherm hebben meer kans op een significante dosis-respons te tonen. Deze gegevens suggereren dat deze screeningswerkwijze kan verrijken geurstof / receptor paren die dosisrespons passeert, waardoor de identificatie van liganden en geurstof reukreceptor activeringspatronen vergemakkelijken.
Het succes van deze assay geoptimaliseerd voor reukreceptor analyse is afhankelijk van verschillende factoren. Alle plasmide-DNA worden bereid via een endotoxinevrij protocol. Consistente olfactorische receptor expressie op het celoppervlak kritiek. De Hana3A cellijn stabiel uitdrukt verschillende accessoire eiwitten die helpen bij het OR-expressie, maar co-transfectie van RTP1S en M3-R verbetert receptor expressie en activering, respectievelijk 27. Deze combinatie van accessoire eiwit expressie resulteert in de expressie van het meest betrouwbare olfactorische receptoren, waardoor de comparison van OR activering tussen experimenten en receptoren. Bovendien controle cel confluentie Belangrijk voor een consistente resultaten. Aangenomen dat de cellen in de oorspronkelijke 10 cm schaal 2 zijn ongeveer 100% confluent, na de hierin beschreven protocol leidt tot betrouwbare cel confluentie gedurende het experiment. Belangrijk is dat voldoende cellen worden uitgeplaat op een meetbare luciferase aanwijzing wordt verkregen, maar cellen zal niet worden over-gegroeid, een aandoening die receptor activering volgende geurstof stimulatie kunnen beïnvloeden. Normaliseren voor constitutieve expressie Renilla verdere beheersing niet alleen celdichtheid, maar ook voor transfectie efficiëntie. Een Renilla luciferase lezen meer dan 2,5 standaarddeviaties onder het gemiddelde kan cel verlies te geven. De cellen moeten gelijkmatig uitgeplaat dichte plaques die gemakkelijker losmaken van het plaatoppervlak dan schaarser cellen voorkomen en transfectie of reukstoffen oplossingen moeten voorzichtig worden toegevoegd aan de zijde van de put losmaken cel voorkomenls. Celverlies kan ook worden veroorzaakt celdood door geurstof toxiciteit, een probleem dat kan worden omzeild door het verlagen van de concentratie geurstof of overmatige DMSO, dat kan worden vermeden door hem DMSO concentraties onder 0,5%. Tenslotte behandelen elk-receptor tot expressie celpopulatie met 1 uM forskoline, een adenylaat cyclase activator luciferase-expressie veroorzaakt van het cAMP-responsieve promoter, kan dienen als een positieve controle voor de assay.
Hoewel de hierin beschreven test betekent een verbetering ten opzichte van andere methoden, zoals een high-throughput formaat en meer algemene toepasbaarheid voor de zoogdier olfactorische receptor familie, heeft beperkingen. Allereerst onze in vitro assay mist veel onderdelen van het in vivo reuksysteem, waaronder geurstof bindingseiwitten, een mucosale laag intracellulaire moleculen en snuiven gedrag. Ten tweede voert deze methode een luciferase reporter systeem reukreceptor metenactivatie andere dan algemene alternatieve methoden die calcium beeldvorming gebruiken. Recent onderzoek suggereert dat deze twee methoden tegenstrijdige resultaten kan leiden; inderdaad, een paar olfactorische receptoren reageren op een bepaalde geurstof toen via calcium beeldvorming maar niet luciferasetest 41 onderzocht. Of men test type is meer relevant voor studies van menselijke olfactorische perceptie blijft onduidelijk, maar beide methoden kunnen nuttig zijn, afhankelijk van de context en het type receptor. Ten derde, hoewel deze functionele expressiesysteem is met succes gebruikt om de meerderheid van de geteste zoogdieren olfactorische receptoren sommige UPR mogelijk niet vatbaar voor expressie met behulp van dit systeem. Als eerder niet gekenmerkte receptoren niet reageren op een geur, kan het gebrek aan expressie op het celoppervlak dan een gebrek aan interactie tussen geurstof en receptor. Receptor expressie op het celoppervlak kan via immunofluorescentie worden onderzocht alvorens conclusies te trekken van negatieve testresultaten 27,42 38,39 bepalen, moeten de meeste receptoren eerst gestimuleerd met een geur om een vermindering van luciferaseactiviteit observeren.
Ondanks deze beperkingen deze test systeem heeft de mogelijkheid om sterk toenemen gegevensverwerving op het gebied van reukzin. Ten eerste, de hoog-96-well formaat met grote receptor en / of geur schermen mogelijk. Ten tweede, de heterologe expressie-systeem is toepasbaar op een verscheidenheid van zoogdieren reukreceptoren. Ten derde kan luciferaseactiviteit worden gebruikt olfactorische receptoractivering, die waardevol beschrijven de receptoractivering patronen voor een bepaalde geurstof meten. Ten vierde, eerdere resultaten uit soortgelijke bepaling in vitro systemen voorspellen menselijk reukvermogen 8,11,35. Deze kenmerken zijn bijzonderularly belangrijk gezien de grote omvang van de zoogdieren olfactorische receptor familie en onze beperkte kennis over de OR activeringspatronen uitgelokt door specifieke geuren. Brede toepassing van deze test systeem geoptimaliseerd voor olfactorische receptor analyse zal bijdragen aan een meer volledig beeld van olfactorische receptor / odorant interactie en de moleculaire basis van geur codering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door R01 DC013339, R03 DC011373, en Ruth L. Kirschstein National Research Service Award T32 DC000014. Een deel van het werk werd uitgevoerd met het Monell chemosensory receptor signalering Core, die wordt ondersteund, voor een deel, door financiering van de NIH-NIDCD Core Grant P30 DC011735. De auteurs danken C. Sezille voor hulp bij het verzamelen van gegevens.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hana3A cells | Avaiable from the Matsunami Laboratory upon request | ||
| RTP1S-pCI | Avaiable from the Matsunami Laboratory upon request | ||
| M3-R-pCI | Avaiable from the Matsunami Laboratory upon request | ||
| pCRE-luc | Agilent | 219076 | LUC |
| pSV40-RL | Promega | E2231 | RL |
| Minimum Essential Media, Eagle | Sigma Aldrich | M4655 | MEM |
| FBS | Life Technologies | 16000-044 | FBS |
| PBS (without Ca2+ and Mg2+) | Cellgro | 21-040-CV | PBS |
| Trypsin (0.05% Trypsin EDTA) | Life Technologies | 25300 | Trypsin |
| CD293 | Life Technologies | 11913-019 | CD293 |
| 96-well PDL white/clear plate | BD BioCoat | 356693 | plates |
| Lipid transfection reagent: Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668-019 | Lipofectamine |
| Firefly luciferase substrate, firefly luciferase quencher/Renilla luciferase substrate: Dual-Glo Assay | Promega | E2980 | dual glo |
| Synergy S2 | BioTek | SLAD | BioTek S2 |
| Microplate reader software: Gen5 Data Analysis Software | BioTek | Gen5 | Gen5 |
| BIOSTACK | BioTek | BIOSTACK2WR | BioStack |
| Multiflo | BioTek | MFP | MultiFlo |
| 300 μl GripTips | Integra | 4433 | GripTips |
| 12.5 μl GripTips | Integra | 4414 | GripTips |
| 300 μl GripTips ViaFlo96 | Integra | 6433 | XYZ tips |
| 12.5 μl GripTips 384 XYZ | Integra | 6403 | XYZ tips |
| 384ViaFlo | Integra | 6030 | 384ViaFlo |
| TE buffer | Macherey Nagel | 740797.1 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650-100ML | DMSO |
| Forskolin | Enzo Life Sciences | BML-CN100-0010 | FOR |
References
- Wetzel, C. H., Oles, M., Wellerdieck, C., Kuczkowiak, M., Gisselmann, G., Hatt, H. Specificity and sensitivity of a human olfactory receptor functionally expressed in human embryonic kidney 293 cells and Xenopus Laevis oocytes. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 19 (17), 7426-7433 (1999).
- Spehr, M., et al. Identification of a testicular odorant receptor mediating human sperm chemotaxis. Science. 299 (5615), 2054-2058 (2003).
- Sanz, G., Schlegel, C., Pernollet, J. -C., Briand, L. Comparison of odorant specificity of two human olfactory receptors from different phylogenetic classes and evidence for antagonism. Chemical senses. 30 (1), 69-80 (2005).
- Matarazzo, V., et al. Functional characterization of two human olfactory receptors expressed in the baculovirus Sf9 insect cell system. Chemical senses. 30 (3), 195-207 (2005).
- Jacquier, V., Pick, H., Vogel, H. Characterization of an extended receptive ligand repertoire of the human olfactory receptor OR17-40 comprising structurally related compounds. Journal of neurochemistry. 97 (2), 537-544 (2006).
- Neuhaus, E. M., Mashukova, A., Zhang, W., Barbour, J., Hatt, H. A specific heat shock protein enhances the expression of mammalian olfactory receptor proteins. Chemical senses. 31 (5), 445-452 (2006).
- Shirokova, E., et al. Identification of specific ligands for orphan olfactory receptors. G protein-dependent agonism and antagonism of odorants. The Journal of biological chemistry. 280 (12), 11807-11815 (2005).
- Keller, A., Zhuang, H., Chi, Q., Vosshall, L. B., Matsunami, H. Genetic variation in a human odorant receptor alters odour perception. Nature. 449 (7161), 468-472 (2007).
- Menashe, I., et al. Genetic elucidation of human hyperosmia to isovaleric acid. PLoS biology. 5 (11), (2007).
- Saito, H., Chi, Q., Zhuang, H., Matsunami, H., Mainland, J. D. Odor coding by a Mammalian receptor repertoire. Science signaling. 2 (60), (2009).
- Jaeger, S. R., et al. A Mendelian Trait for Olfactory Sensitivity Affects Odor Experience and Food Selection. Current Biology. 23, 1-5 (2013).
- DeMaria, S., Ngai, J. The cell biology of smell. The Journal of cell biology. 191 (3), 443-452 (2010).
- Zhang, X., Firestein, S. The olfactory receptor gene superfamily of the mouse. Nature nauroscience. 5 (2), 124-1233 (2002).
- Glusman, G., Yanai, I., Rubin, I., Lancet, D. The complete human olfactory subgenome. Genome research. 11 (5), 685-702 (2001).
- Olender, T., Lancet, D., Nebert, D. W. Update on the olfactory receptor (OR) gene superfamily. Human Genomics. 3 (1), 87 (2008).
- Mombaerts, P. Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors. Nature reviews. Neuroscience. 5 (4), 263-278 (2004).
- Malnic, B., Hirono, J., Sato, T., Buck, L. B. Combinatorial receptor codes for odors. Cell. 96 (5), 713-723 (1999).
- Araneda, R. C., Kini, aD., Firestein, S. The molecular receptive range of an odorant receptor. Nature. 3 (12), 1248-1255 (2000).
- Saito, H., Kubota, M., Roberts, R. W., Chi, Q., Matsunami, H. RTP family members induce functional expression of mammalian odorant receptors. Cell. 119 (5), 679-691 (2004).
- Katada, S., Hirokawa, T., Oka, Y., Suwa, M., Touhara, K. Structural basis for a broad but selective ligand spectrum of a mouse olfactory receptor: mapping the odorant-binding site. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 25 (7), 1806-1815 (2005).
- Lu, M., Echeverri, F., Moyer, B. D. Endoplasmic Reticulum Retention, Degradation, and Aggregation of Olfactory G-Protein Coupled Receptors. Traffic. 4 (6), 416-433 (2003).
- McClintock, T. S., et al. Functional expression of olfactory-adrenergic receptor chimeras and intracellular retention of heterologously expressed olfactory receptors. Brain research. Molecular brain research. 48 (2), 270-278 (1997).
- Zhao, H. Functional Expression of a Mammalian Odorant Receptor. Science. 279 (5348), 237-242 (1998).
- Kajiya, K., Inaki, K., Tanaka, M., Haga, T., Kataoka, H., Touhara, K. Molecular bases of odor discrimination: Reconstitution of olfactory receptors that recognize overlapping sets of odorants. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 21 (16), 6018-6025 (2001).
- Krautwurst, D., Yau, K., Reed, R. R., Hughes, H. Identification of Ligands for Olfactory Receptors. Cell. 95, 917-926 (1998).
- Li, Y. R., Matsunami, H. Activation state of the M3 muscarinic acetylcholine receptor modulates mammalian odorant receptor signaling. Science signaling. 4 (155), (2011).
- Zhuang, H., Matsunami, H. Evaluating cell-surface expression and measuring activation of mammalian odorant receptors in heterologous cells. Nature. 3 (9), 1402-1413 (2008).
- Haddad, R., Khan, R., Takahashi, Y. K., Mori, K., Harel, D., Sobel, N. A metric for odorant comparison. Nature methods. 5 (5), 425-429 (2008).
- Veithen, A., Wilkin, F., Philippeau, M., Van Osselaer, C., Chatelain, P. Olfactory Receptors: From basic science to applications in flavors and fragrances. Perfumer and Flavorist. 35 (1), 38-40 (2010).
- Bozza, T., Feinstein, P., Zheng, C., Mombaerts, P. Odorant receptor expression defines functional units in the mouse olfactory system. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 22 (8), 3033-3043 (2002).
- Oka, Y., Katada, S., Omura, M., Suwa, M., Yoshihara, Y., Touhara, K. Odorant receptor map in the mouse olfactory bulb: in vivo sensitivity and specificity of receptor-defined glomeruli. Neuron. 52 (5), 857-869 (2006).
- Zhao, H., Ivic, L., Otaki, J. M., Hashimoto, M., Mikoshiba, K., Firestein, S. Functional expression of a mammalian odorant receptor. Science. 279 (5348), 237-242 (1998).
- Touhara, K., et al. Functional identification and reconstitution of an odorant receptor in single olfactory neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (7), 4040-4045 (1999).
- Zhuang, H., Matsunami, H. Synergism of accessory factors in functional expression of mammalian odorant receptors. The Journal of biological chemistry. 282 (20), 15284-15293 (2007).
- McRae, J. F., Mainland, J. D., Jaeger, S. R., Adipietro, K. A., Matsunami, H., Newcomb, R. D. Genetic variation in the odorant receptor OR2J3 is associated with the ability to detect the "grassy" smelling odor, cis-3-hexen-1-ol. Chemical senses. 37 (7), 585-593 (2012).
- Adipietro, K. A., Mainland, J. D., Matsunami, H. Functional evolution of mammalian odorant receptors. PLoS genetics. 8 (7), (2012).
- Zhuang, H., Chien, M. -S., Matsunami, H. Dynamic functional evolution of an odorant receptor for sex-steroid-derived odors in primates. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (50), 21247-21251 (2009).
- Oka, Y., Nakamura, A., Watanabe, H., Touhara, K. An odorant derivative as an antagonist for an olfactory receptor. Chemical senses. 29 (9), 815-822 (2004).
- Oka, Y., Omura, M., Kataoka, H., Touhara, K. Olfactory receptor antagonism between odorants. The EMBO journal. 23 (1), 120-126 (2004).
- Fawcett, T. An introduction to ROC analysis. Pattern Recognition Letters. 27 (8), 861-874 (2006).
- Baghaei, K. A. Olfactory Receptors. Olfactory Recept. Methods Protoc. 1003, 229-238 (2013).
- Dey, S., Zhan, S., Matsunami, H. Assaying surface expression of chemosensory receptors in heterologous cells. Journal of visualized experiments JoVE. (48), (2011).
