Summary
Koku reseptör aktivasyonu desenler koku kimliğini kodlamak, ancak memeli koku reseptörleri için Odorant ligandlar belirlenmesi yayınlanan verilerin eksikliği koku kodlama kapsamlı bir modelinin gelişmesini engellemektedir. Bu protokol, koku reseptör ligandları ve reseptör aktivasyonunun miktar yüksek throughput belirlenmesini kolaylaştırmak için bir yöntem tarif etmektedir.
Abstract
Parfüm yaklaşık 1000 murin ve 400 insan reseptörleri ailesidir koku binlerce tanımak için izin koku reseptör aktivasyonunun benzersiz ve üst üste gelen desenleri oluşturmak. Odorant ligandlar insan reseptörleri 1-11 az% 6 yayınlanmıştır. Bu veri eksikliği, kısmen fonksiyonel heterolog sistemlerde bu reseptörleri eksprese zorluklar kaynaklanmaktadır. Burada, bir lusiferaz haberci deneyi kullanılarak koku reseptör aktivasyonunun, yüksek verimli değerlendirme ardından Hana3A hücrelerde koku reseptör ailesinin, çoğunluğu ifade etmek için bir yöntem tarif eder. Bu deney, koku reseptörlerinin panel karşı koku maddesi (1) ekran panelleri için de kullanılabilir; (2) doz tepki eğrileri ile odorant / reseptör etkileşimi teyit; ve (3) reseptör varyantlar arasında reseptörü aktivasyon düzeyleri karşılaştırın. Bizim örnek veri, 328 koku reseptörleri 26 koku karşı tarandı. Değişen tepki puanları ile odorant / reseptör çifti selec edildited ve doz yanıt olarak test edilmiştir. Bu veriler, bir ekran, bir koku verici madde için iyi niyetli bir tepki, yani reseptörleri, bir doz cevap deneyi geçecek odorant / alıcı çiftleri için zenginleştirmek için etkili bir yöntem olduğunu göstermektedir. Bu nedenle, bu yüksek verimli bir lusiferaz deney memeli koku koku kodlama sisteminde bir modeline doğru koku reseptörleri temel bir adım karakterize etmek için etkili bir yöntemdir.
Introduction
Memeli koku algılama sistemi, ve koku binlerce ayrım sağlayan, kokulu uyaranlara bir çok sayıda yanıt yeteneğine sahiptir. Koku reseptörleri (OR) koku epiteli 12 koku duyusal nöronlar tarafından ifade moleküler sensörler bulunmaktadır. Memeli koku tanıma koku tarafından ameliyathanelerinde diferansiyel aktivasyonu yoluyla gerçekleşir ve OR gen ailesi kabaca 1.000 kemirgen ve 400 insan reseptörleri 12-16 ile kapsamlıdır. Koku nöronlarda ve heterolog hücrelerde ameliyathanelerinde önceki fonksiyonel analizleri farklı katkılar benzersiz tarafından tanınan olduğunu göstermiştir, ancak OR 10,17-20 arasında toplulukları örtüşen var. Ameliyathanelerinde ligandları Eşleştirme koku kodunu ve koku duyusunun uygulanabilir modeller oluşturmak için gerekli anlamak için önemlidir. Nedeniyle koku ve ORs hem de çok sayıda hem de heterolog sistemlerde eksprese OR'lar zorluklar, bu veriler f büyük ölçüde yok olduield; Gerçekten, insan ameliyathanelerinde azının% 6, yayımlanmış bir ligandı 1-11 var. Bu protokol odorant / veya karakterize etmek için bir etkileşimi lusiferaz tahlilin kullanımını tarif eder. Bu tahlil ameliyathanelerinde yüksek verimlilik karakterizasyonu, Deodorantını / VEYA etkileşimleri anlamak yanı sıra koku kodlama bir model geliştirmek için gerekli bir görevi sağlar.
Ameliyathanelerinde yüksek verimlilik çalışmaları üç büyük sorunlarla karşı karşıyadır. İlk olarak, heterolog hücrelerde ifade edilen ORs ER 'in içinde muhafaza edildi ve daha sonra, deney sisteminde 23-25 koku maddeleri ile etkileşim ORS önlenmesi, proteazom 21,22 parçalanır. Bu sorun OR'lar 19,26,27 geniş bir yelpazede stabil hücre yüzey ifadesini kolaylaştıran aksesuar proteinlerin keşif tarafından ele alındı. Reseptör-taşıyıcı proteinler-1 ve 2 (RTP1 ve 2) desteklemek OR odorant uyarılması 19 tepki olarak hücre yüzey ifadesi ve aktivasyonu. Bu çalışmalara dayanarak, HEK293T hücreleriydikararlı bir şekilde hücre çizgisi 19,27 Hana3A sonuçlanan RTP1 uzun (RTP1L) ve RTP2, reseptör ekspresyon arttırıcı protein 1 ve G αolf ifade için değiştirilebilir. Buna ek olarak, tip 3 muskarinik asetilkolin reseptörü (M3-R), hücre yüzeyinde ORs ile etkileşime girer ve koku 26 yanıt olarak aktivasyonunu artırır. Hücre yüzeyi 27 de ORs geniş bir aralığının, sağlam, tutarlı ve fonksiyonel ifade Hana3A hücreler sonuçlara RTP1S ve M3-R ile bir OR ko-transfeksiyonu. İkinci olarak, memeli ya da repertuarları oldukça büyüktür. İnsanlarda, örneğin, VEYA repertuar tat reseptör repertuvarının daha çok büyüklükte bir sipariş olduğunu ve görsel reseptör repertuvarının daha çok büyüklük 2 emirleri. Tek bir klonlama ya da nispeten basit bir protokoldür, ancak önemli ön nitelikli kapsamlı bir kitaplık oluşturmak için gereklidir. Biz vizyonu olduğunu bilmenize rağmen Üçüncü olarak, dalga boyu renk çevirir veSeçmeler frekans sahası içine çevirir içinde, kokuların organizasyonu kötü zor araştırmacılar koku temsili bir örnek katmak için yapıyor, anlaşılmaktadır. Bazı ilerlemeler bu ön 10,28 üzerinde yapılmış olmasına rağmen, koku manzara haritası eksik kalır. Ameliyathanelerinde yüzlerce karşı onlarca moleküllerinin binlerce Tarama yıldırıcı bir iştir; Bu alanda yüksek verim ekranlar dikkatlice tanımlanmış kampanyalar gerektirebilir. Geri kalan en büyük zorluklar yerine tekniğe özgü problemlere göre lojistik ve maliyet olanlardır. Heterolog tarama yaygın akademik grupları ligandları tanımlamak için kullanılır olmasına rağmen, bir özel şirket 100 insan ameliyathanelerinde 29 ligandlar tanımlamak için aynı tekniği kullandı. Ne yazık ki, bu veriler, özel kalır.
Burada özetlenen yüksek verimli bir lusiferaz deney değerlendirmek veya aktivasyon için kullanılan diğer yöntemlere göre bazı avantajları vardır. Her ne kadar sorumluluğuyerli koku duyu nöronlarının ses elektrofizyoloji ve kalsiyum görüntüleme kullanılarak ölçülmüş, bu teknikler zorluğu nedeniyle koku nöronlar için tepki özellikleri örtüşme bir nöronun tepki yol açar VEYA ayrı alay var. , GFP etiketli reseptör tipi 30,31 in-vurma 32,33 koku nöronlar sıçangile adenovirüs üzerinden belirli reseptörleri teslim, ya da 17,24,33 tek reseptör türlerine kayıtları bağlayabilirsiniz kayıtlarından sonra RT-PCR performans, bu yöntemler olmasına rağmen düşük verimlilik ve büyük ölçekli ekranlar için uygun değildir. Heterolog tarama sistemleri daha ölçeklenebilir, ve iki büyük formları literatürde bulunur: cAMP yolunun muhabirleri ve inositol trifosfat (IP3) yolunun muhabirler. Koku uyarılması üzerine, ORs, siklik AMP (cAMP) 12 üretimi ile sonuçlanan bir sinyal transdüksiyon G αolf kaskadını aktive. Ac kontrolü altında ateş böceği lusiferaz raportör geni ile ko-transfekteAMP yanıt elemanı (CRE), lusiferaz üretimi miktarının ya da aktivasyon sağlayan, koku yanıtı bir fonksiyonu olarak ölçülebilir. Ya da aktivasyon, aynı zamanda, G ya da G α15/16 α15-olf kimera 24,25,34 olarak G-proteinleri ko-ifade ile IP3 yolu ile bağlantılı olabilir. Üç faktörlere dayalı Burada yer alan tahlili seçtik: Rho-etiketli koku reseptörleri ile RTP1 (1) eş-ekspresyon hücre yüzeyi 19,27 az koku reseptör ekspresyonunu iyileştirir; (2) bir cAMP tepki veren bildirici genin kullanımı ölçülmesi OR kanonik ikinci haberci yolu ile aktivasyonu için izin verir; ve (3) deney yüksek verimli taramalar için çok uygundur.
Bu, yüksek verimli lusiferaz deney olfaction alanında değerli çalışmalar çeşitli uygulanabilir. İlk olarak, ORs, çok sayıda, bir sp için reseptör aktivasyon modelini belirlemek amacıyla tek bir koku verici madde karşı taranabilirecific Odorant. Çalışmanın bu tür steroid odorant Androstenone 8 yanıt için OR sorumlu OR7D4 olarak tespit edilmiştir. Bunun tersine, bir ya da reseptör karşılığı profilini 10 belirlemek amacıyla koku bir paneline karşı taranabilir. Aday koku odorant / veya çiftleri bu ekranların ile tespit edilirse, koku verici madde etkileşim artan konsantrasyonları için ya da tepkisini inceleyen bir doz tepki deney ile teyit edilebilir. Doz yanıt eğrileri de ameliyathanede genetik varyasyon vitro Odorant yanıt 8,9,11,35 olarak nasıl etkilediğini değerlendirmek ve bu çalışmaların evrim türlerin ve nedensel mutasyonlar arasında reseptör evrim incelenmesi için izin interspesifik VEYA varyasyona uzatılabilir 36,37, Son olarak, bu deney, antagonize etmek mümkün ya da bilinen bir odorant / reseptör çifti 38,39 için belirli bir koku verici madde için olan koku yanıtı antagonistlerinin taranması için de kullanılabilir. Özet olarak, bu yüksekVerimlilik lusiferaz tahlil karakterize yardımcı VEYA aktivasyon desen ve koku sisteminde koku kodlama daha iyi anlaşılmasını sağlayacak çalışmalar bir dizi uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hana3A Hücreler 1. Culture
- % 10 (v / v) FBS ile en az temel ortam (MEM) ile takviye M10 ortamı hazırlayın.
- Kültür Muhafazası
- M10 ortam içinde hücreler koruyun. Not: RTP1L, RTP2, REEP1 ve G için ifade vektörleri Hana3A hücrelere puromisin direnç kazandıran αolf, ancak bu antibiyotik ile hücrelerin bakımı anlamlı deney sonuçlarını etkilemez.
- 01:08 10 cm tabaklar, 2-3 gün arasında bir oranda alt kültürü.
- % 5 CO2 ile 37 ° C'de inkübe edilir.
Transfeksiyonu 2. Kaplama Hücreler
- Hana3A hücrelerin% 100 konfluent 10 cm çanak medya aspire.
- , 10 ml PBS ekleyerek çanak dönen ve PBS aspire hücreleri yıkayın.
- % 0.05 tripsin / EDTA, 3 ml ilave edilir ve hücreler (yaklaşık 1 dakika) ayırmak için bekleyin.
- 5 ml M10 ekleyerek tripsin inaktive ve kabaca 10x & tritüe hücre kümeleri break up# 160, bir 10 ml pipet ile. Pipet dikkatle medya içine hava kabarcıkları tanıtan önlemek için.
- Her 96 oyuklu plaka, 15 ml konik tüp, 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüje aktarım hücrelerin 1 ml ve hücre pelletini bozmadan süpernatan aspire için.
- Aşama 2.5 transfer hücre 1 ml başına 6 ml M10 hücreleri yeniden süspanse edin.
- Pipet, 96 oyuklu plakanın her oyuğuna hücre 50 ul ve% 5 CO2 ile 37 ° C'de gece boyunca inkübe edilir.
Koku reseptörleri 3. Transfeksiyonu
- Plasmid DNA'nın hazırlanması
- Bir endotoksin içermeyen protokolü ile plazmid DNA hazırlanması. NOT: plasmid DNA hazırlama kiti belirlenen "endotoksin içermez," ya da plasmid DNA hazırlanması için bir protokol, bir fenol-kloroform ekstraksiyon aşamasını ekleyin.
- TE tamponu içinde 100 ng / ul 'lik bir konsantrasyona DNA seyreltin.
- Approxima uygun bir akışkanlığa sağlamak için kaplama hücreleri (Basamak 2.7) dikkattely 30-50 kuyu başına% ve inkübatör dönmek. NOT: Bu confluency lipit transfeksiyon tepkin maddesi için uygun değildir, bu aşamada% 30-50 bir confluency transfeksiyonundan sonra lusiferaz aktivitesi, 24 saat ölçmek için en uygunudur.
- Transfection Mix hazırlanması
- Plasmid karışım yapmak için Tablo 1 'de ayrıntılı olarak açıklanan miktarlar başına MEM ortam içine Pipet RTP1S-pCI, M3-R-pCI, pcre-luc ve pSV40-RL plasmidleri (belirtilen miktarlar 96-çukurlu plaka başına) bulunuyor.
Plazmid mix oyuk başına 96 oyuklu bir plaka başına MEM - 500 ul RTP1S-pCI 5 ng 480 ng M3-R-pCI 2.5 ng 240 ng PCRE-luc 10 ng 960 ng pSV40-RL 5 ng 480 ng
Tablo 1. Plazmid karışım bileşenleri. Başına iyi ve RTP1S-pCI, M3-R-pCI, pcre-Luc ve pSV40-RL, ve MEM 96-plaka hacimleri başına. - Her 96 oyuklu plaka için, 450 ul MEM ortamı içinde 18 ul lipid transfeksiyon ayıracı seyreltin.
- Pipet Plazmid karışımı (Adım 3.3.1 'dan itibaren), pCI plazmid (Rho-OR-pCI) in rodopsin-etiketli koku reseptörü, ve Kompleks detaylı yapmak için (Adım 3.3.2' dan itibaren) lipit transfeksiyon mix
Karmaşık oyuk başına de +% 10 başına Plazmid mix 4.2 ul 4.58 ul Rho-OR-pCI 0.05 ng 0.06 ng Lipid transfeksiyon karışımı 4.2 ul 4.58 ul M10 41.7 ul 45.83 ul
Tablo 2. Complex bileşenler. Başına iyi ve plasmid karışımı (Tablo 1) de +% 10 hacim başına koku reseptör plazmid (Rho-OR-pCI) ve lipit transfeksiyon karışımı. M10, oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edildikten sonra, reaksiyonu söndürmek için ilave edildi.
- Plasmid karışım yapmak için Tablo 1 'de ayrıntılı olarak açıklanan miktarlar başına MEM ortam içine Pipet RTP1S-pCI, M3-R-pCI, pcre-luc ve pSV40-RL plasmidleri (belirtilen miktarlar 96-çukurlu plaka başına) bulunuyor.
- Hücre plakaları üzerinde medyayı dışarı dokunun.
- Pipet 50 de her bir kompleksin ul ve% 5 CO2 ile 37 ° C'de gece boyunca inkübe edilir.
4. Koku Uyarım
- Oyuk başına% 50-80 uygun bir akışkanlığa sağlamak ve kuluçka makinesine geri dönmek için transfekte edilmiş hücrelerin dikkate alınmalıdır. Not: hücreler 50'den az ise% Konfluent, ateşböceği lusiferaz ve Renilla lusiferaz okuma reseptör aktivasyonunun ölçülmesi için çok düşük olabilir. Plakayı çıkardığını düşünün.
- DMSO her koku 1 M stok çözümleri hazırlayın.
- CD293 ortam içinde koku uyarım çözelti hazırlayın.
- Tarama deneyleri, 100 uM koku stok solüsyonu seyreltik. Ayrıca, (sadece CD293) VEYA plan aktivasyonu için kontrol etmek için bir no-koku kontrolü hazırlamak. NOT: eleme deneylerinde, her OR / koku çift sadece deney bir kez test edilir. Kuyular arasında bir koku yayılma mümkün olduğu için, her bir plaka için, bir koku verici madde ile uyarmak için tavsiye edilir.
- Doz tepki deneyleri için, üç kopya halindeki her bir reseptör için 1 mM'den başlayarak koku stok çözeltisi yedi 10-kat seri dilüsyonları hazırlar. Ayrıca, koku arka aktivasyonu için kontrol edilmesi amacıyla boş vektör-transfekte edilmiş hücreler için üç kopya halinde aynı koku dilüsyonları hazırlar. Not: Doz tepkisi deneyleri için, her biri odor konsantrasyonu muamele üç kez yapılmalıdır.
- Hücre plakaları üzerinde medyayı dışarı dokunun.
- Pipet 25 her bir oyuğa koku uyarım çözeltisi ul ve 4 saat için inkübe edilir.
Lüsiferaz Tahlil aracılığıyla 5. Ölçüm YA Etkinliği
- -80 ° C de, üreticinin talimatlarına ve mağaza başına süspanse ateş böceği lusiferaz alt-tabaka
- 96 çukurlu levha başına ateş böceği lusiferaz alt-tabaka 1 ml çözülme.
- Söndürücü taze ateş böceği lusiferaz reaksiyonu hazırlanması ve Renilla lusiferaz alt-tabaka reaktif (1 ml tampon başına 5 ul lusiferaz söndürücü / Renilla lusiferaz substratı). NOT: maddesi yaklaşık 1 ml, 96 oyuklu plaka başına gereklidir.
- Lüminesan mikroplaka okuyucu hazırlayın. Mikroplaka okuyucu yazılımı açın. Sistem simgesi dahilinde:
- "Ön ısıtma" sekmesi altında, "ON" için kutuyu işaretleyin ve 25 ° makinenin sıcaklığını ayarlamak; C.
- "Dispenser" sekmesi altında,% 70 etanol 1000 ul her bir ana dağıtıcı damıtık su 1000 ul eklenmiştir. NOT: Her dağıtıcı için, alkol ve su ayrı alikotları kullanın. Etanol dağıtıcıları dezenfekte etmek için kullanılır ve su artık etanol kaldırır.
- Başbakan havanın 1.500 ul her dağıtıcı (sıvıdan dağıtıcıları kaldırın). Not: hava ile prime lusiferaz alt-tabakalar kalıntı su ile seyreltilir değildir sağlar.
- (Aşama 5.2 'den) ateş böceği lusiferaz substrat 1080 ul Prime dağıtıcı 1. (Adım 5.3 dan itibaren) Renilla lusiferaz alt tabaka ile Başbakan dağıtıcı 2. NOT: değil kontaminasyona lusiferaz yüzeylerde dikkatli olun. Lusiferaz substratlarla emişli reaktif dağıtıcıları ölü boşluğu doldurur.
- Hem ateşböceği ve Renilla lusiferaz lüminesans okumak için aşağıdaki protokol kurmak. Mikrotabak okuyucu, un ile ilişkili yazılım içinde"Dosya" menüsünden der, "Yeni Görev" üzerine tıklayın. "Protokoller" vurgulayın ve "Yeni Oluştur" üzerine tıklayın. Bir sonraki pencerede, bir sonraki "Standart Protokolü" için daire seçilmelidir. "Tamam" ı tıklayın. Ekranın sol tarafındaki "Usul" üzerine çift tıklayın.
- Dağıtıcı 1 kullanarak tüm kuyulara ateşböceği lusiferaz substrat 10 ul dağıtın. "Eylemler" menüsü altında, "dağıtın" tıklayın. "Dağıtın Adım" penceresinde, set: hiçbiri, 10 ul "Dağıtım Volume" ve 225 ul / sn "Oranı" için "Astar" "Dağıtıcı" 1,. "Tamam" ı tıklayın.
- 30 saniye için plakayı sallayın. "Eylemler" menüsü altında, "Salla" tıklayın. SS: "Sarsıntı Adım" penceresinde, Orta ve 00:30 MM "Süre" için "Intensity" olarak ayarlayın. "Tamam" ı tıklayın.
- Oyuk başına 0.5 saniye seyahati kuyuların lüminesans okuyun. "Eylemler" menüsü altında, "Oku" tıklayın;. "Oku Adım" penceresinde, ayarlayın: Lüminesans için "Algılama Yöntemi", 00:00:50 MM, bitiş noktasına "Entegrasyon Time" "Type Oku": SS: ss, "Filtre Setleri" 1, "Emisyon" Hole, Başa "Optik Konumu", 135 için "Kazanç", ve 1.00 mm "Yükseklik oku". "Tamam" ı tıklayın.
- 2 dağıtıcı kullanan tüm oyuklara Renilla lusiferaz alt-tabaka 10 ul koyun. Grubu "Dispenser" 2 dışında, Aşama 5.6.1 gibi koşullarını ayarlayın.
- 30 saniye için plakayı sallayın. Aşama 5.6.2 gibi koşulları ayarlayın.
- 0.5 saniye seyahati kuyu lüminesans okuyun oyuk başına. Aşama 5.6.3 gibi koşulları ayarlayın.
- 96 oyuklu plaka kapağı çıkarın ve mikro-plaka okuyucuda plaka yerleştirilir. Plaka lüminesans okumak için Adım 5.5 kurmak programını başlatın.
- Reaktif dağıtıcı pompaları temizleyin. "Dağıtıcı" sekmesi altında sistem simgesinden:
- F 1000 ul temizleyinbir geri kazanım borusu içine, ateş böceği luciferase dağıtıcıdan irefly lusiferaz alt-tabaka. Not: ateş böceği lusiferaz -80 ° C'de saklanır ve yeniden kullanılabilir.
- Prime% 70 etanol, ardından 1.000 ul damıtık su 1.000 ul, ve son olarak hava 1.500 ul her bir dağıtıcı (sıvıdan dağıtma kaldırmak). NOT: Su reaktif pompaları, etanol dezenfekte ve hava herhangi bir kalıntı etanol kurur lusiferaz tabakaları kaldırır.
6.. Veri Analizi
- Veri Aktarma
- Mikroplaka okuyucu yazılım, ekranın sol tarafındaki "Raporu / İhracat Üreticileri" üzerine çift tıklayın.
- Düğmesi "Excel'e Yeni İhracat" üzerine tıklayın ve "Tamam" a tıklayın.
- Export_1 vurgulayın ve "Düzenle" ye tıklayın.
- "İçerik" "Sistem Açıklama" kontrol "Usul", "Plate Açıklama" ve "Plaka Düzen Matrix" altında. "Ham Veri" a dahilnd "Veri Hesaplanan".
- "İş Akışı" başlığı altında, "prosedürün tamamlanması AutoExecute" check. İhracat Modu altında, "Hepsi aynı çalışma kitabında plakaları" ve "yeni bir çalışma olarak" check.
- "File" dosya adı formatı ve dosya konumu seçin ve "OK" butonuna tıklayınız altında.
- "Rapor / Export İnşaatçılar" penceresini kapatın.
- Normalize edilmiş lusiferaz değerlerini elde etmek için, her bir oyuk için Renilla lüminesans okuma (Adım 5.6.6) ile her bir oyuk için ateşböceği lüsiferaz ışıldama okuma (Aşama 5.6.3) bölün.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Birincil ekran 100 uM bir konsantrasyonda 26 kokulara karşı 328 OR'lar test edilmiştir. Bu koku yoğunluğu etkin bilinen ligandlar 10 ORs önemli bir bölümünü etkinleştirmek için gösterilmiştir. İlk olarak, normalize edilmiş lusiferaz aktivitesi, Renilla lusiferaz okunması ile, ateş böceği luciferase okuma bölünmesi ile hesaplanmıştır. Daha sonra, başlangıç çizgisi değerleri, her bir (Şekil 1) için normalize edilmiş lusiferaz okumalardan herhangi bir koku kontrolü için normalize edilmiş lusiferaz okumaları çıkarılarak hesaplanmıştır. Doz tepki eğrileri, 48 koku verici madde üzerinde gerçekleştirilen / veya çift rasgele, başlangıç çizgisi değerleri aralığında dağıtıldı, Şekil 1 'de renkli çubuklar ile gösterildiği gibi. OR 1 mM 1 nM yayılan koku verici madde 7 konsantrasyonları ile muamele edilmiş ve elde edilen tepkileri uygun idi lineer olmayan regresyon kullanılarak bir sigmoidal eğriye. Üç kriterleri yerine eğer bir odorant / VEYA bir agonisti olarak kabul edildi: (1) standart hata velogEC 50 daha az 1 log birimi oldu; (2) eğri üst ve alt parametreleri için% 95 güven aralıkları çakıştı değildi; ve (3) ilave toplamları-of-kareler testi odorant boş bir vektör ile transfekte edilmiş kontrol hücreleri, önemli ölçüde daha fazla ihtiva eden OR-hücreleri aktive doğruladı. Doz-yanıt Sonuçlar, Tablo 3'te özetlenmiştir.
Bu veriler daha sonra bir birinci ekran deney ölçümler doz tepki eğrisinden sonuçları tahmin ne kadar iyi belirlemek için kullanılmıştır. Şekil 1'de mavi çubuklar kırmızı çubuklar yukarıda özetlenen üç kritere uymuyor ise, tam bir doz tepki deneyde agonistleri olarak sınıflandırıldı çiftlerine karşılık. Birincil ekrandan değerler bizim birincil ekran için yararlı bir yöntem olduğunu gösteren (karakteristik eğrisi (AUC) işletim altında kalan alan = 0.68, p <0.01, Mann-Whitney U testi) tam doz yanıt deney sonuçlarını tahmin tam bir doza cevap deneyi, (Şekil 2) agonistleri olarak sınıflandırılacaktır odorant / veya çiftleri için zenginleştirmek.
Koku reseptörleri ve koku birincil ekranında Herbir koku verici madde / veya çifti için hesaplanan değerler, başlangıç çizgisi lusiferaz frekansının. Histogram (Sayı) bir paneli ile bir ekran için, başlangıç çizgisi Lusiferaz değerleri Şekil 1.. Frekans. Odorant / reseptör aktivasyon çiftleri seyrek olarak, değerlerinin çoğunluğu sıfır merkezli ve büyük merkezi bir dağıtım Bu deney için gürültü dağılımını tahmin edilmektedir. Renkli çubuklar doz tepki analizi için seçilen odorant / reseptör çiftleri gösterir; mavi çubuklar tam doz yanıta göre agonistleri olarak sınıflandırılır ve kırmızı çubuklar agonistleri olarak sınıflandırılmış değil çiftleri vardır edildi çiftleri vardır.f = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/51640/51640fig1highres.jpg" target = "_blank"> büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın.
Odorant / reseptör ekran için Şekil 2. ROC eğrisi. 48 odorant / reseptör çifti agonistleri olma ya da olmama agonistleri olarak sınıflandırıldı. Gerçek pozitif oranı (duyarlılık), daha sonra R istatistik paketi 40 kullanılarak yalancı pozitiflik oranı (1-özgüllük) karşı çizilmiştir. Eğrisi (AUC) altındaki alan yüksek lusiferaz ekran değerleri ile odorant / reseptör çifti düşük değerlere sahip olanlara göre doz yanıt geçmesi daha olası olduğunu gösteren, 0.68 'dir. resmi büyütmek için buraya tıklayın.
| Başlangıç çizgisinde Değer | Doz Tepki |
| ,051793067 | başarısız |
| ,006376956 | başarısız |
| ,331936398 | geçmek |
| ,591006519 | geçmek |
| ,049093369 | geçmek |
| ,396788976 | geçmek |
| -0,013655743 | geçmek | ,011080217 | geçmek |
| ,004203349 | başarısız |
| ,003975049 | başarısız |
| -,077935718 | geçmek |
| -,084488317 | geçmek |
| ,030236078 | başarısız |
| -0,042963576 | başarısız |
| ,031466406 | başarısız |
| ,025897747 | başarısız |
| -0,030434651 | başarısız |
| -,004122795 | başarısız |
| -,010075533 | başarısız |
| ,028883452 | başarısız |
| ,019402373 | başarısız |
| ,047508749 | başarısız |
| 0.00255344 | başarısız |
| ,017221449 | başarısız |
| ,340216655 | geçmek |
| -0,026912181 | başarısız |
| ,037140428 | başarısız |
| ,467763017 | geçmek |
| ,097665337 | başarısız |
| ,080657267 | geçmek |
| ,172819211 | geçmek |
| 0.05568393 | geçmek |
| -0,106721064 | geçmek |
| ,136614849 | geçmek |
| ,457839849 | başarısız |
| ,211751741 | başarısız |
| 0.1581464 | geçmek |
| -,62099155 | geçmek |
| -,066949491 | geçmek |
| -0,78712035 | geçmek |
| ,752503007 | geçmek |
| 1,433407558 | geçmek |
| ,475431098 | geçmek |
| 1,457936815 | geçmek |
| ,048652537 | başarısız |
| ,027196782 | başarısız |
| ,129599842 | başarısız |
| -0,069781272 | başarısız |
| ,016450039 | başarısız |
| -0,025639207 | başarısız |
| ,158152141 | başarısız |
| -,032570055 | başarısız |
| ,140139926 | başarısız |
| -0,052030276 | başarısız |
| ,657140133 | geçmek |
| 1,040410297 | geçmek |
| geçmek | |
| ,399588712 | geçmek |
| ,188094387 | geçmek |
| ,039371424 | geçmek |
| ,016784352 | geçmek |
| ,229959571 | geçmek |
| ,238381997 | başarısız |
| ,074118909 | başarısız |
| ,423901128 | geçmek |
| ,152621022 | geçmek |
| geçmek | |
| ,075301806 | geçmek |
| ,395233972 | geçmek |
| ,261892958 | geçmek |
| ,156693306 | başarısız |
| 2,163418147 | geçmek |
| 3,649862104 | geçmek |
| ,025716169 | geçmek |
| -0,033258008 | geçmek |
| -0,026984127 | başarısız |
| -0,338441868 | geçmek |
| 0.37398618 | geçmek |
Doz yanıt test Tablo 3. Koku reseptör / koku çiftleri., Başlangıç çizgisi lusiferaz değerler ve ekrandan seçilen 48 YA / koku çiftleri için doz tepkisi sonuçları (geçmek veya başarısız). Iki ekranda test edilmiş 30 çiftleri, her iki başlangıç çizgisi lusiferaz değerleri dahildir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Koku maddesi kimlik olfaktori reseptör aktivasyon paternlerinin ile kodlanan, ancak reseptörleri aktive edilmiş ve hangi dereceye kadar olan da dahil olmak üzere alıcı aktivasyonu desenler insan olfaktori reseptör 1-11 arasında daha az% 6 ile tanınırlar. Koku reseptörleri karakterize etmek için çabalar koku reseptör ailesi 17,23,24,33,34 sadece bir alt kendi emek-yoğun yöntemlerle veya uygulanabilirliği ile sınırlı kalmıştır. Hana3A heterolog sentezleme sistemi, test edilen koku reseptörlerinin çoğunluğunun güçlü ifade destekler ve koku reseptör aktivasyonunun 19,26,27 izlemek için bir cAMP tepki veren lusiferaz raportör sistemi ile bağlantılı olarak kullanılabilir. 96 oyuklu bir biçimde, bu deneyde performans etkileşimlerini doğrulamak için odorant / koku reseptör çiftleri ve doz-yanıt eğrileri için olası adaylar belirlemek ve reseptör aktivasyon düzeyleri af kadar değerlendirmek için ekranlar dahil olmak üzere yüksek throughput deney tasarımları, bir dizi destekleyenintra-ve inter-spesifik değişimler tarafından etkilemiştir. Bir ekran daha yüksek aktivite değerleri ile Koku maddesi / reseptör çiftleri önemli bir doz tepki göstermek için daha olasıdır. Bu veriler, bu tarama metodu, böylece odorant ligand ve reseptör aktivasyonu koku desen tanımlanmasını kolaylaştıran, bir doz yanıt geçecek odorant / alıcı çiftleri için zenginleştirmek mümkün olduğunu göstermektedir.
Olfaktori reseptör analizi için optimize edilmiş bu deneyde başarısı birçok faktöre bağlıdır. Tüm plasmid DNA, bir endotoksin içermeyen protokolü ile hazırlanmalıdır. Hücre yüzeyinde tutarlı koku reseptör ekspresyon kritiktir. Hana3A hücre soyu içinde ekspresyonu OR çeşitli yardımcı proteinlerini ifade eder, ancak RTP1S ve M3-R'nin ko-transfeksiyonu, sırasıyla 27, reseptör ekspresyonunu ve aktivasyonunu artırır. Proteini ifade kombinasyonu sağlayan en koku reseptörlerinin güvenilir ifadesi ile sonuçlanır comparison OR deneyler ve reseptörler arasında etkinleştirme. Buna ek olarak, hücre konfluansa izlenmesi tutarlı sonuçlar elde etmek için önemlidir. Yaklaşık% 100 konfluent burada tarif edilen protokol, deney boyunca güvenilir hücre birbirine karışmış hale neden olur sonra, orijinal 10 cm tabak 2 hücreleri varsayarak. Önemli olarak, yeterli hücre ölçülebilir bir lusiferaz okuma elde etmek için kaplı olacaktır, fakat hücre, odorant uyarımı takiben reseptör aktivasyonunu etkileyebilen bir durum aşırı büyümüş olmayacaktır. Hücre yoğunluğu için değil, aynı zamanda transfeksiyon verimliliği için değil sadece yapıcı renilla sentezleme daha ileri derecede kontrol için normalleştirme. Ortalama altında fazla 2.5 standart sapma okuyan bir renilla lusiferaz hücre kaybını gösterebilir. Hücreler seyrek hücrelere göre plaka yüzeyinden daha kolay ayırmak yoğun plaklar kaçınmak için düzgün bir kaplama olmalıdır ve transfeksiyon ve odorant çözeltiler ayırma cel önlemek için kuyunun tarafına hafifçe eklenmelidirls. Hücre kaybı da odorant toksisite,% 0.5 DMSO konsantrasyonu altında tutarak önlenebilir odorant konsantrasyonu veya aşırı DMSO, düşürerek engellenebilecektir bir sorun neden olduğu hücre ölümünden dolayı olabilir. Son olarak, 1 uM forskolin, cAMP-tepkimeli yükseltici lusiferaz raportör ekspresyonunu neden olan bir adenilat siklaz aktivatörü ile birlikte her bir reseptör ifade eden hücre popülasyonu tedavisi deneyi için pozitif bir kontrol olarak hizmet edebilir.
Burada tarif edilen deney, memeli koku reseptör ailesine yüksek verimli bir biçimde ve daha genel dahil olmak üzere alternatif yöntemlerine göre bir iyileşmeyi temsil eder, ancak, bu sınırlamaları vardır. İlk olarak, in vitro deney odorant bağlayıcı proteinler, bir mukoza tabakası, hücre içi molekülleri ve koklama davranışları da dahil olmak üzere, bir in vivo koku alma sistemi, bir çok bileşen yoktur. İkinci olarak, bu yöntem, koku reseptörü ölçmek için bir lusiferaz haberci sistemine dayanırkalsiyum görüntüleme kullanmak yaygın alternatif yöntemlerin aksine aktivasyon. Son çalışmalar bu iki yöntem çelişkili sonuçlar üretebilir olduğunu göstermektedir; kalsiyum görüntüleme değil, lusiferaz deneyi, 41 ile incelenmiş Gerçekten de, birkaç koku reseptörleri, belirli bir koku verici madde yanıt. Bir tahlil tip insan koku algı çalışmalarına daha uygun olup olmadığı belirsiz kalır, ama her iki yöntem bağlamında ve reseptör tipine bağlı olarak yararlı olabilir. Bu işlevsel sentezleme sistemi başarılı bir şekilde test edilen memeli koku reseptörlerinin çoğunluğu ifade etmek için kullanılmıştır Üçüncü olarak, bazı OR bu sistemi kullanarak ifade için uygun olmayabilir. Önce karakterize reseptörleri bir koku yanıt başarısız olursa, bunun yerine koku verici madde ve reseptör arasındaki etkileşim eksikliği daha hücre yüzeyinde ifade eksikliği nedeniyle olabilir. Reseptör hücre yüzey ifadesi negatif testte sonuç çıkarmadan önce immünofloresans üzerinden incelenebilir 27,42 sonuçları 38,39 koku reseptörleri için koku antagonistleri belirlemek için, ilk olarak en reseptörleri lusiferaz aktivitesinde bir azalma gözlemlemek amacıyla bir koku ile teşvik edilmelidir.
Bu kısıtlamalara rağmen, bu deney sistemi büyük ölçüde olfaction alanında veri toplama geliştirmek için yeteneğine sahiptir. İlk olarak, yüksek verimli, 96-kuyulu bir formatın, büyük ölçekli reseptörü ve / veya koku ekranları mümkün hale getirir. İkinci olarak, bu heterolog sentezleme sistemi, memeli koku reseptörlerinin çeşitli uygulanabilir. Üçüncü olarak, lusiferaz aktivitesi, belirli bir koku verici madde için reseptör aktivasyon örüntüleri tarif değerlidir koku reseptör aktivasyonunun ölçülmesi için kullanılabilir. Dördüncü, benzer in vitro deney sistemlerinde daha önceki sonuçları, insan koku algısını 8,11,35 tahmin. Bu özellikler vardır seçemuntazam bir biçimde önemli memeli koku reseptör ailesinin büyüklüğü ve özel kokuları ile ortaya VEYA aktivasyon kalıpları ile ilgili sınırlı bilgimiz verilmiştir. Olfaktori reseptör analizi için optimize edilmiş bu deney sistemi geniş bir uygulama koku reseptörü / odorant etkileşim ve koku kodlama moleküler temelinin, daha kapsamlı bir resim katkıda bulunacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Bu çalışma, R01 DC013339, R03 DC011373 ve Ruth L. Kirschstein Ulusal Araştırma Hizmet Ödülü T32 DC000014 tarafından desteklenmiştir. Işin bir kısmı NIH-NIDCD Çekirdek Grant P30 DC011735 fon tarafından, kısmen desteklenen Monell kimyasal duyusal Reseptör Sinyalizasyon Çekirdek kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Yazarlar veri toplama ile yardım için C. Sezille teşekkür ederim.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hana3A cells | Avaiable from the Matsunami Laboratory upon request | ||
| RTP1S-pCI | Avaiable from the Matsunami Laboratory upon request | ||
| M3-R-pCI | Avaiable from the Matsunami Laboratory upon request | ||
| pCRE-luc | Agilent | 219076 | LUC |
| pSV40-RL | Promega | E2231 | RL |
| Minimum Essential Media, Eagle | Sigma Aldrich | M4655 | MEM |
| FBS | Life Technologies | 16000-044 | FBS |
| PBS (without Ca2+ and Mg2+) | Cellgro | 21-040-CV | PBS |
| Trypsin (0.05% Trypsin EDTA) | Life Technologies | 25300 | Trypsin |
| CD293 | Life Technologies | 11913-019 | CD293 |
| 96-well PDL white/clear plate | BD BioCoat | 356693 | plates |
| Lipid transfection reagent: Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668-019 | Lipofectamine |
| Firefly luciferase substrate, firefly luciferase quencher/Renilla luciferase substrate: Dual-Glo Assay | Promega | E2980 | dual glo |
| Synergy S2 | BioTek | SLAD | BioTek S2 |
| Microplate reader software: Gen5 Data Analysis Software | BioTek | Gen5 | Gen5 |
| BIOSTACK | BioTek | BIOSTACK2WR | BioStack |
| Multiflo | BioTek | MFP | MultiFlo |
| 300 μl GripTips | Integra | 4433 | GripTips |
| 12.5 μl GripTips | Integra | 4414 | GripTips |
| 300 μl GripTips ViaFlo96 | Integra | 6433 | XYZ tips |
| 12.5 μl GripTips 384 XYZ | Integra | 6403 | XYZ tips |
| 384ViaFlo | Integra | 6030 | 384ViaFlo |
| TE buffer | Macherey Nagel | 740797.1 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650-100ML | DMSO |
| Forskolin | Enzo Life Sciences | BML-CN100-0010 | FOR |
References
- Wetzel, C. H., Oles, M., Wellerdieck, C., Kuczkowiak, M., Gisselmann, G., Hatt, H. Specificity and sensitivity of a human olfactory receptor functionally expressed in human embryonic kidney 293 cells and Xenopus Laevis oocytes. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 19 (17), 7426-7433 (1999).
- Spehr, M., et al. Identification of a testicular odorant receptor mediating human sperm chemotaxis. Science. 299 (5615), 2054-2058 (2003).
- Sanz, G., Schlegel, C., Pernollet, J. -C., Briand, L. Comparison of odorant specificity of two human olfactory receptors from different phylogenetic classes and evidence for antagonism. Chemical senses. 30 (1), 69-80 (2005).
- Matarazzo, V., et al. Functional characterization of two human olfactory receptors expressed in the baculovirus Sf9 insect cell system. Chemical senses. 30 (3), 195-207 (2005).
- Jacquier, V., Pick, H., Vogel, H. Characterization of an extended receptive ligand repertoire of the human olfactory receptor OR17-40 comprising structurally related compounds. Journal of neurochemistry. 97 (2), 537-544 (2006).
- Neuhaus, E. M., Mashukova, A., Zhang, W., Barbour, J., Hatt, H. A specific heat shock protein enhances the expression of mammalian olfactory receptor proteins. Chemical senses. 31 (5), 445-452 (2006).
- Shirokova, E., et al. Identification of specific ligands for orphan olfactory receptors. G protein-dependent agonism and antagonism of odorants. The Journal of biological chemistry. 280 (12), 11807-11815 (2005).
- Keller, A., Zhuang, H., Chi, Q., Vosshall, L. B., Matsunami, H. Genetic variation in a human odorant receptor alters odour perception. Nature. 449 (7161), 468-472 (2007).
- Menashe, I., et al. Genetic elucidation of human hyperosmia to isovaleric acid. PLoS biology. 5 (11), (2007).
- Saito, H., Chi, Q., Zhuang, H., Matsunami, H., Mainland, J. D. Odor coding by a Mammalian receptor repertoire. Science signaling. 2 (60), (2009).
- Jaeger, S. R., et al. A Mendelian Trait for Olfactory Sensitivity Affects Odor Experience and Food Selection. Current Biology. 23, 1-5 (2013).
- DeMaria, S., Ngai, J. The cell biology of smell. The Journal of cell biology. 191 (3), 443-452 (2010).
- Zhang, X., Firestein, S. The olfactory receptor gene superfamily of the mouse. Nature nauroscience. 5 (2), 124-1233 (2002).
- Glusman, G., Yanai, I., Rubin, I., Lancet, D. The complete human olfactory subgenome. Genome research. 11 (5), 685-702 (2001).
- Olender, T., Lancet, D., Nebert, D. W. Update on the olfactory receptor (OR) gene superfamily. Human Genomics. 3 (1), 87 (2008).
- Mombaerts, P. Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors. Nature reviews. Neuroscience. 5 (4), 263-278 (2004).
- Malnic, B., Hirono, J., Sato, T., Buck, L. B. Combinatorial receptor codes for odors. Cell. 96 (5), 713-723 (1999).
- Araneda, R. C., Kini, aD., Firestein, S. The molecular receptive range of an odorant receptor. Nature. 3 (12), 1248-1255 (2000).
- Saito, H., Kubota, M., Roberts, R. W., Chi, Q., Matsunami, H. RTP family members induce functional expression of mammalian odorant receptors. Cell. 119 (5), 679-691 (2004).
- Katada, S., Hirokawa, T., Oka, Y., Suwa, M., Touhara, K. Structural basis for a broad but selective ligand spectrum of a mouse olfactory receptor: mapping the odorant-binding site. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 25 (7), 1806-1815 (2005).
- Lu, M., Echeverri, F., Moyer, B. D. Endoplasmic Reticulum Retention, Degradation, and Aggregation of Olfactory G-Protein Coupled Receptors. Traffic. 4 (6), 416-433 (2003).
- McClintock, T. S., et al. Functional expression of olfactory-adrenergic receptor chimeras and intracellular retention of heterologously expressed olfactory receptors. Brain research. Molecular brain research. 48 (2), 270-278 (1997).
- Zhao, H. Functional Expression of a Mammalian Odorant Receptor. Science. 279 (5348), 237-242 (1998).
- Kajiya, K., Inaki, K., Tanaka, M., Haga, T., Kataoka, H., Touhara, K. Molecular bases of odor discrimination: Reconstitution of olfactory receptors that recognize overlapping sets of odorants. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 21 (16), 6018-6025 (2001).
- Krautwurst, D., Yau, K., Reed, R. R., Hughes, H. Identification of Ligands for Olfactory Receptors. Cell. 95, 917-926 (1998).
- Li, Y. R., Matsunami, H. Activation state of the M3 muscarinic acetylcholine receptor modulates mammalian odorant receptor signaling. Science signaling. 4 (155), (2011).
- Zhuang, H., Matsunami, H. Evaluating cell-surface expression and measuring activation of mammalian odorant receptors in heterologous cells. Nature. 3 (9), 1402-1413 (2008).
- Haddad, R., Khan, R., Takahashi, Y. K., Mori, K., Harel, D., Sobel, N. A metric for odorant comparison. Nature methods. 5 (5), 425-429 (2008).
- Veithen, A., Wilkin, F., Philippeau, M., Van Osselaer, C., Chatelain, P. Olfactory Receptors: From basic science to applications in flavors and fragrances. Perfumer and Flavorist. 35 (1), 38-40 (2010).
- Bozza, T., Feinstein, P., Zheng, C., Mombaerts, P. Odorant receptor expression defines functional units in the mouse olfactory system. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 22 (8), 3033-3043 (2002).
- Oka, Y., Katada, S., Omura, M., Suwa, M., Yoshihara, Y., Touhara, K. Odorant receptor map in the mouse olfactory bulb: in vivo sensitivity and specificity of receptor-defined glomeruli. Neuron. 52 (5), 857-869 (2006).
- Zhao, H., Ivic, L., Otaki, J. M., Hashimoto, M., Mikoshiba, K., Firestein, S. Functional expression of a mammalian odorant receptor. Science. 279 (5348), 237-242 (1998).
- Touhara, K., et al. Functional identification and reconstitution of an odorant receptor in single olfactory neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (7), 4040-4045 (1999).
- Zhuang, H., Matsunami, H. Synergism of accessory factors in functional expression of mammalian odorant receptors. The Journal of biological chemistry. 282 (20), 15284-15293 (2007).
- McRae, J. F., Mainland, J. D., Jaeger, S. R., Adipietro, K. A., Matsunami, H., Newcomb, R. D. Genetic variation in the odorant receptor OR2J3 is associated with the ability to detect the "grassy" smelling odor, cis-3-hexen-1-ol. Chemical senses. 37 (7), 585-593 (2012).
- Adipietro, K. A., Mainland, J. D., Matsunami, H. Functional evolution of mammalian odorant receptors. PLoS genetics. 8 (7), (2012).
- Zhuang, H., Chien, M. -S., Matsunami, H. Dynamic functional evolution of an odorant receptor for sex-steroid-derived odors in primates. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (50), 21247-21251 (2009).
- Oka, Y., Nakamura, A., Watanabe, H., Touhara, K. An odorant derivative as an antagonist for an olfactory receptor. Chemical senses. 29 (9), 815-822 (2004).
- Oka, Y., Omura, M., Kataoka, H., Touhara, K. Olfactory receptor antagonism between odorants. The EMBO journal. 23 (1), 120-126 (2004).
- Fawcett, T. An introduction to ROC analysis. Pattern Recognition Letters. 27 (8), 861-874 (2006).
- Baghaei, K. A. Olfactory Receptors. Olfactory Recept. Methods Protoc. 1003, 229-238 (2013).
- Dey, S., Zhan, S., Matsunami, H. Assaying surface expression of chemosensory receptors in heterologous cells. Journal of visualized experiments JoVE. (48), (2011).
