Abstract
心筋炎、心筋の炎症であるが、影響を受ける人々の唯一の約10％は、疾患の臨床症状を示しています。心筋傷害の免疫事象を研究するために、心筋の種々のマウスモデルが広く用いられている。本研究では、A / Jマウスの心臓ミオシン重鎖（MyHCの）-α334から352を用いて誘導実験的自己免疫性心筋炎（EAM）を関与;影響を受けた動物は、リンパ球性心筋炎を発生するが、明白な臨床徴候と。このモデルでは、α-MyHCの334から352で免疫した動物における心臓の構造的および機能的変化を決定するための非侵襲的な様式として、磁気共鳴顕微鏡法（MRM）の有用性が示されている。 EAMおよび健康なマウスでは4センチヤスデ、高周波イメージングプローブおよび100g / CM三軸勾配を搭載した9.4 T（400 MHz）の89ミリメートル、縦コアボアスキャナを用いて画像化した。心臓画像は、麻酔をかけたグラディエントエコーベースシネパルスシーケンスを用いて動物、およびアニマから入手したlsコマンドは、呼吸およびパルスオキシメトリーによりモニターした。分析は、健康なマウスと比較して、心室の内径の対応する減少と、EAMマウスにおける心室壁の厚さの増加を明らかにした。データは、炎症を起こした心臓の形態学的および機能的変化を非侵襲的に生きている動物にMRMによりモニターすることができることを示唆している。結論として、MRMは進行と回帰感染性病原体によって引き起こされる疾患における心筋傷害のほか、治療に対する反応を評価することの利点を提供しています。
Introduction
心不全は、死亡の主要な原因であり、心筋炎、若年青年1における心不全の主な原因の一つである。心筋炎に罹患し、ほとんどの患者は無症候性のままであり、この疾患は、自然に2を解決します。しかし、影響を受ける人々の10〜20％は、拡張型心筋症（DCM）3につながる、慢性疾患を開発することができます。種々の動物モデルは、心筋炎の免疫病因を研究するために開発されてきた。この疾患は、心臓ミオシン重鎖（MyHCの）-αまたはその免疫優勢ペプチドフラグメントまたはコクサッキーウイルスB3 4-9のような病原体に感染させることによって動物を免疫化することによって心筋炎感受性A / JおよびBalb / cマウスにおいて誘導することができる。本研究では、A / JマウスにおけるMyHCの-α334から352に誘導される心筋炎を伴う。心筋の浸潤を示すにもかかわらず、心筋炎の影響を受けた動物は、臨床的に正常に見える。診断は炎症7 Aの心の組織学的評価に基づいているND心エコー10。
磁気共鳴顕微鏡法（MRM）は、（直径10μm以下）微小血管のレベルに機能的詳細の評価を可能にする、高分解能三次元平面と心血管イメージングを得るために一般的に用いられる方法であるが、解像力のこのレベルは解像度は、一般に1ミリメートル11-14までに得られているルーチン磁気共鳴画像（MRI）スキャン手順と達成できない。それは疾患過程14の初期の時点でのパフォーマンスパラメータを導出することも、高解像度画像の取得を可能にし、MRMとしては、利点を提供する。臨床的には、MRM撮像は、広範囲に罹患した心臓、肺または脳15-17の機能パラメータを研究するために適用されている。本研究では、自己免疫性心筋炎に罹患したA / Jマウスにおける心臓の異常を把握するための非侵襲的なツールとしてのMRM技術の使用が示されている。具体的には、T彼のMRMイメージングはできますよう、合理的な精度18と左心室（LV）拡張末期容積と駆出率（EF）などの機能的なパラメータの定量化。各パラメータの定義は次のとおりです。左室拡張末期容積、拡張期のサイクルの終わりに左心室の血液の量、および駆出率、拍出量/拡張末期容積。データ分析は、磁気共鳴スキャナ19により取得されたDICOM準拠の心臓血管画像を処理するために開発された自由に利用できるセグメント·ソフトウェアを用いて行われる。データは、健常マウスにおけるこれらの機能パラメータと比較して、LVの拡張末期容量、一回拍出量と駆出率の低下に対応する、心筋炎の動物におけるLV壁の厚さの増加を明らかにした。
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Protocol
倫理声明：
全ての動物手順は、実験動物の管理と使用に関するガイドラインに沿って行われ、ネブラスカ大学リンカーン、リンカーン、ネブラスカ大学によって承認された。
実験的自己免疫性心筋炎の1。誘導
- 2 mg/1.5 mlの最終濃度になるように、1Xリン酸緩衝生理食塩水でMyHCの-α334から352を溶解することにより、ペプチド溶液を調製する。
- 50 NG /μLのストック濃度を得るために、凍結乾燥されたPTの50μgのを含むバイアルに無菌1X PBSを1ミリリットルを追加することによって、百日咳毒素（PT）を準備します。滅菌した1.5ミリリットルチューブにストックの20μLを取り、1 NG /μLの作業濃度を得るために、無菌1X PBSを980μlを加える。
- 結核菌H37Rv、40mgの（MTB）を加えることにより、完全フロイントアジュバント（CFA）を調製し、最終濃度を得るために、CFAの10mlの抽出5 mg / mlと。
- ペプチド - CFAエマルジョンを準備します。注：EAM誘導のために、ペプチド-CFAエマルジョンは動物当たりMyHCの-α334から352の100μgのを含む150μLで投与した。例えば、10匹のマウスがMyHCの334から352-α1mgを含有するペプチドCFAエマルジョンを1.5mlを使用して免疫化する。
- エマルジョンの1.5ミリリットルを準備するために、一定分量750 1 1.5ミリリットルチューブに334から352ペプチド溶液をMyHCのは、-αのμL、およびCFAを別の1.5ミリリットルチューブにMTBを補った。 CFA / MTBエキスが続き、3ミリリットルルアーロック注射器を用いて、最初のペプチド溶液を描く。
- 3方活栓にシリンジを取り付け、空の3ミリリットル注射器に活栓の他のコンセントに接続します。活栓の開通性を調節するため、ペプチド - CFAの混合物が適度に良好な耐性を有する他に1シリンジから流出する。
- 〜1分間繰り返し、他に1シリンジからコンテンツをプッシュすることで混合し、次いで〜3分間氷上にアセンブリ全体を置きます。これを繰り返します手順10倍の最小。
- 慎重に100ミリリットルのガラス製ビーカーに、まだ水の上に小さな水滴を配置することによって、エマルジョンの一貫性を決定する。液滴が水に分散しないと予想される。それがない場合は、所望のコンシステンシーが得られるまで混合を続ける。
- 1mlシリンジと活栓に取り付けられた2つの3-mlの注射器のいずれかを置き換えることにより、1ミリリットルルアーロックシリンジに3ミリリットルの注射器から、エマルションの内容を転送し、1ミリリットルの注射器に27½G針を取り付けます。
- 6対8週齢の雌のA / Jマウス（〜75μLずつ）の2鼠径地域で皮下に分割用量でペプチド - CFAエマルジョン150μlのを注入する。
- 0日目と2日目免疫後に腹腔内に各動物にPT懸濁液（100 NG）を100μlを管理します。
- 皮下Tのいずれかの側に分割用量でペプチド - CFAエマルジョン150μlのを投与することにより、7日目に免疫化手順を繰り返します彼は胸骨（〜75μLずつ）。上記のように新鮮なこのエマルジョンを準備します。その後、21日目に、ステップ3を参照して、MRMイメージングに動物をさらす。
2。動物の取り扱い
- 暖かさを維持し、特別に設計された動物のホルダー（ 図1）に動物を転送するために下に配置加熱パッドで2％イソフルランと空気の混合物を含む麻酔導入チャンバー内に各マウスを置きます。
- 動物ホルダーの腹臥位で動物を固定するので、その鼻は麻酔（ 図1）を維持するためにノーズコーンに適合します。マウスの前歯に装着一口バーでマウスの頭部を固定します。
- 実験中、動物の体温を維持するために、スキャナの垂直穴に挿入され、その出口ホースとエアーブローヒーターの電源をオンにします。
- 全体のイメージングセッションの間に2ml /分の流速で0.5 2％イソフルランで麻酔を維持する。確認するつま先ピンチ方式を用いて麻酔、全く動きが期待できない。
- 空気圧センサ枕、マウス尾/足首光ファイバーパルスオキシメトリセンサ、及びそれぞれ呼吸、心拍数および体温をモニターする直腸温度プローブ、（ 図1）を設定する。注：心臓ゲーティングは動脈血酸素飽和度の非侵襲的モニタリングを可能にするパルスオキシメトリ、を介して行われる。パルスオキシメトリセンサが左足首に装着する必要があり、足が糸ループで固定し、センサ内の足首を維持するためにテープする必要があります。 MRMイメージングは、任意の造影剤を使用せずに呼吸と心臓信号をゲーティングすることによって達成される。
3。画像取得
- 動物（ 図1）を調製した後、磁場均一度が最大となる視野（FOV）の中心に位置する心臓とMRMスキャナの中心にマウスを置き。注：ワイドボア（89 mm）の三重100 G / cmで軸勾配及び4センチ無線周波数（RF）イメージングコイルを備えた9.4 Tの垂直ボア磁石は、高解像度の三次元（3D）画像を得るために使用されるべきである。注：MRIスキャナを使用する際に、非磁性の供給するようにしてください。
- イメージングインタフェースを実行し、「留学オプション」メニューから「新しい研究」を選択します。コマンドバーの「mtuneへ」と入力し、「チューニングGUIの「プルアップするためにそれを実行してください。その後、 "スタートプローブチューニング」を選択し、「オートスケール」ボタンをクリックしてください。チューンGUIは、RF信号を表示するように変更されます。プロトン共鳴周波数（400 MHz）でのRFコイルチューニングしたコイルの端にあるリモートチューン/マッチノブを使用してください。 「スタート」タブに関連するボタンをクリックすることで周波数とパワーキャリブレーションを実行するために「プレスキャン」ページに移動します。シムページをプルアップするためのタブ「研究シム "のタブで" '上のXYZ（クイック）ボタンを押してください。シムページに移動し、繰り返しのすべてを選択して、自動シミングを実行するためにシムボタンを押してください。
- マウス心臓をローカライズするイメージング·インターフェースの「研究」タブからスカウトシーケンスを選択します。 「取得」タブで35ミリメートル2にFOVを変更して、マシンのデフォルト設定を保持します。シーケンスを実行するには[スタート]ボタンをクリックし、心臓がFOVの中心にない場合、動物ホルダの位置を調整するRFコイルを再調整し、再スカウト画像を得た。
- その後、短軸と心臓20,21の長軸に沿って二つの直交する平面を得るために、対応する「取得」タブの収集パラメータを入力し、「研究」タブの「GEMS」配列]ボタンをクリックします。注：グラディエントエコースキャンの典型的な取得パラメータは、以下のとおりです。スライス厚、1ミリメートル;繰り返し時間（TR）、200ミリ秒;エコー時間（TE）、2.67ミリ秒（最小）;フリップ角、25°;面内マトリックスサイズ128×128; FOV、22ミリメートル2;取得数、4;そして1分30秒のおおよその取得時間。
- 「前売」タブでLV解剖学的および機能的なパラメータを測定するために、パルスオキシメータ·ゲーティッド短軸シネMR画像を収集するために「シネ」シーケンスを選択します。マウスのホバリングとドラッグすることで、心臓の長軸像に基づいて撮像スライスの位置や角度を調整します。グラディエントエコーシネ·シーケンス取得するために、「取得」タブでは、次の撮像パラメータを入力してください：TR、500ミリ秒; TE、5ミリ秒; FOV、22ミリメートル2。買収行列、256×256;スライス厚さ1mm;取得数、8;フレーム数、6;そして17分〜の取得時間。取得を開始するには、[開始]をクリックします。
- イメージングソフトウェアの「I / O」タブを使用して、DICOMフォーマットに取得された画像を変換し、処理のためにデータセンターに対応するファイルを転送する。
- 撮像手順の終了時に、すべてのOWマウスは、フィルタートップケージ内で麻酔から回復する。彼らは胸骨横臥を維持し、必要に応じて更なる研究のためにそれらを保つために十分な意識を取り戻すまで、無人のマウスを放置しないでください。
心臓磁気共鳴顕微鏡イメージングの4。データ解析
- LV 19の解剖学的および機能的なパラメータを分析するために、セグメントのソフトウェアを使用してください。 「オープン画像ファイル（複数可）」「ファイル」メニューのサブメニューを使用してソフトウェアにDICOMフォーマットのシネ画像をロードすることによって。 GUI上の画像の種類や画像表示面として「短軸半ば心室」などのイメージング技術、「シネ」として「MRGE 'を選択します。
- 「拡張期を終了するために現在の時間枠を設定する」をそれぞれ「編集」メニューのサブメニュー「収縮期を終了するために現在の時間枠を設定する」を通して拡張末期と収縮末期に使用する時間枠を指定してください。
- 最初の「LV」コマンドボタンをクリックし、右下のパネルにある「エンド」と「EPI」コマンドボタンを手動でそれぞれ左心室心内膜と心外膜を描画する。計算の精度を高めるために、対応するコマンドボタンを押すことで乳頭筋を除去する。
- このような拡張末期容積、収縮末期容積、ストローク量、右上パネルの駆出分画として定量のLVパラメータを読み込む。 「その他」のコマンドボタンを押して、壁の厚さ、および心室直径22などのLVパラメータを測定する「測定キャリパー」コマンドボタンをクリックします。
- 必要に応じて画像を再処理する」。マット」の形式で、セグメント化を含む画像を、保存するために「ファイル」メニューのサブメニュー「両方画像スタックとセグメンテーションを保存」をクリックしてください。
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Representative Results
本報告書では、EAMに罹患した動物の心の中に構造的および機能的変化を測定するための非侵襲的なモダリティとして、MRM法の有用性が示されている。心筋炎は、CFA 7におけるMyHCの-α334から352で動物を免疫することにより、A / Jマウスに誘導し、動物は21日目免疫後に、MRM実験に供した。 MRMイメージングは、トリプル軸勾配（最大強度は100g / CM）を装備した89ミリメートル垂直ボア磁石を用いた9.4 T（プロトンの400 MHz）で、イソフルラン麻酔下で生きている動物について行った。スカウト像は、長軸4腔像を取得するために、軸方向の画像に続いて、視野の中央にマウス心臓を見つけて、配置するために買収されました。心臓は、2室ビューの画像化されたときの角度は、 図2Aに示されている。心臓画像は、グラディエントエコー系シネパルスシーケンスを用いて4センチヤスデRFイメージングプローブを用いて取得した。心機能MEASurements（撮影：LV壁厚;出力：LV拡張終期容積および駆出率）を、次いで、セグメントソフトウェアを用いて分析した。 EAMの影響を受けたマウスの心臓の構造欠陥は左室拡張末期容積[18.0±4.2μL対の対応する減少で、約1.5倍（P = 0.018）（ 図2Bおよび表1）でのLV厚みの増加によって証明された。37.5±3.5μL、 図2C（I）;はp = 0.002]および駆出率[49.4±2.3％対71.5±6.0％、p = 0.00066; 図2C（ii）は健康なマウスと比較する。 図2D）。予想したように、我々はこれまで7実証したように、心筋炎のが、健康ではないマウスの心臓の組織学的評価は、多発性リンパ球の浸潤を示した。データは、炎症を起こした心臓の形態学的および機能的変化を非侵襲的にMRMのiで監視することができることを示唆しているNの動物を生きています。
図1：マウスの心臓からMRM画像の取得のためのプローブの動物の調製および位置決め。心臓から画像を取得するために、麻酔したマウスは、特別MRMイメージングのために設計された動物のホルダーに配置し、維持するためにエアブローヒータに接続されている体温。連続麻酔下で、動物は腹臥位に固定されている。空気式枕、光ファイバオキシメトリセンサと温度センサは、心臓画像のMRM取得が完了するまで、それぞれ、呼吸、脈拍、体温を監視するように設定されています。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図2。自己免疫性心筋炎に罹患したマウスのMRMイメージングは、心臓の異常を明らかにしている。心筋炎は、CFA中MyHCの-α334から352で動物を免疫することにより、A / Jマウスに誘導した。動物は心臓の異常を評価するために21日目免疫後に、MRMイメージングを行った。MRM·スライシングの（A）の位置にします。心臓が画像取得のためにスライスした角度が表示されている。（B）のMRMイメージング 。心の短軸スライスが500ミリ秒のTRで8時間枠でエコーベースシネパルスシーケンスを使用してキャプチャされた（TE、5ミリ秒、フリップ角、20°、買収、4の数、取得行列、256×256） [矢印：左室壁の厚さ（C）心拍出量心拍出量が健康で心筋炎のマウスのu（I）において、左室拡張末期容積および（ii）駆出率に基づいて測定した。セグメント別のソフトウェアとの定量的な医用画像解析を歌う。マウスの群についての平均値は、SEM（n = 2の群当たり5）（D）組織学示されている。上記の処置群からの心臓をヘマトキシリンおよびエオシン染色することによって炎症を評価した。サークル：多発性リンパ球浸潤は、 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
| 動物 | 健康な（n = 3）で | EAM（n = 5）の |
| マウス1 | 1.03 | 1.48 |
| マウス2 | 1.3 | 1.59 |
| マウス3 | 0.94 | 1.44 |
| マウス4 | 2.11 | |
| マウス5 | 1.92 | |
| 平均±SEM | 1.71±0.1 |
表1。健康的で実験的自己免疫性心筋炎（EAM）マウス。21日目免疫後に3人の健康や5 EAM誘導マウスを磁気共鳴顕微鏡にかけた（MRM）イメージングの間に左心室（LV）壁の厚さの比較 。 MRMによって心臓の画像を取得した後、LV壁の厚さは、プロトコルに記載のようにセグメント·ソフトウェアを使用して測定した。テーブルに表示される値はmm単位のLV壁の厚さを表しています。
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Discussion
本研究は、自己免疫性心筋炎に罹患したマウスで心臓の異常を把握するための非侵襲的なツールとして、MRMプロシージャとその有用性を説明しています。 EAMの組織学的特徴は、ヒトの感染後心筋炎に似ているので、マウスモデルは、一般に、心筋傷害23-25 の免疫機構を描写するために使用される。しかし、心筋炎に罹患した動物は、臨床的に正常に表示され、診断、実験7の終了時に組織学に基づいて行われる。動物は通常、21日目に免疫後に屠殺する。一度に、このように疾患プロセスを評価することは、特に治療を受けて病気の進行の監視が重要な要件である医薬品の研究では、これらのモデルの限界の使用を指しています。
生きている動物に心臓の異常を確認するために、MRMのような非侵襲的なモダリティの使用が便利です。ここで説明したMRM技術造影剤を使用する必要なしに、心臓の構造的および機能的特性を得るという利点を提供する。しかしながら、この技術は、強磁場における高分解能の3D解剖画像の取得を必要とする。画像が取得されると、それにもかかわらず、例えば、LV拡張終期容積および駆出率などの機能パラメータは、さらに、MRM装置を組み立てる必要なしに、市販のソフトウェアを使用して後で分析することができる。 図2に示すように、MyHCの-α334から352で免疫した動物のMRM試験は、機能の出力（LV拡張終期容積および駆出率の対応する減少と共に、健康なマウス（ 図2B）よりも大きくなるようにLV壁厚を明らかにした; 図2C）。予想されたように、免疫されたが、健康ではないから心が、動物は炎症性浸潤（ 図2D）を持っていた。このように、MRM技術と組織学のCORからの知見お互いをroborate。
それにもかかわらず、MRMによって再現性のある結果を得るために、以下の3つの要因が対処する必要がある。心臓を最大均質性を有する磁場にそれらを露出させるために磁石の中心に配置されているように、（a）は、動物は、MRMスキャナ内に配置されるべきである。 （b）は、モーションアーチファクトは、生きた動物実験では懸念される。による呼吸および心臓の動き、パルス酸素濃度計および呼吸計測に画像ぶれを低減するためにゲートMRM取得動物監視システムの使用を必要とし、呼吸と心臓サイクル·内の特定の時点で個別の画像信号を取得することであるのに使用した。 （C）高解像度の3D心臓画像の取得は、心臓の異常の詳細な分析を可能にするために重要な要件である。すべての三次元画像を得るために、信号対雑音比を高めるために、正確な許可およびコムMRMに特異的なより感度のイメージングコイルを設計することが重要である動物スキャナ内短軸方向に強い磁場内の画像のpleteのキャプチャ。
結論として、生きた動物において心臓異常を評価するためのMRM技術の開発が困難である。これは、人間の26に比べて自分の小さい心の大きさ（〜1月2日、000人の心臓の質量）より高い心拍数（毎分〜600拍）を、マウスでは特に顕著です。それにもかかわらず、いったん開発され、検証され、MRM法は、健康と病気の動物の間の心臓の解剖学的および機能的変化を比較するために使用することができる。これにより、MRM法は、疾患過程の急性および慢性の両方の性質に関連する炎症性心筋病理の長手方向の進行を評価するため、および生きた動物における治療に対する応答をモニターするために貴重な、非侵襲的なツールとして役立つことができる。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Myhc-a 334-352 (DSAFDVLSFTAEEKAGVYK) | Neopeptide, Cambridge, MA | Store at 4 °C | |
| CFA | Sigma Aldrich, St Louis, MO | 5881 | Store at 4 °C |
| MTB H37Rv extract | Difco Laboratories, Detroit, MI | 231141 | Store at 4 °C |
| PT | List Biologicals Laboratories, Campbell, CA | 181 | Store at 4 °C |
| 1x PBS | Corning, Manassas, VA | 21-040-CV | Store at 4 °C |
| Isoflurane | Piramal Healthcare, Mumbai, India | NDC66794-013-25 | |
| Female A/J mice | Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME | 646 | |
| Luer-lok sterile 1 ml syrringe | BD, Franklin Lakes, NJ | 309628 | |
| Luer-lok sterile 3 ml syrringe | BD, Franklin Lakes, NJ | 309657 | |
| Sterile needle, 18 G | BD, Franklin Lakes, NJ | 305195 | |
| Sterile needle, 27 1/2 G | BD, Franklin Lakes, NJ | 305109 | |
| 3-way stopcock | Smiths Medical ASD, Inc. Dublin, OH | MX5311L | |
| Kerlix gauze bandage rolls | Covidien, Mansfield, MA | 6720 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professional, Roswell, GA | 34155 | |
| Protouch Stockinette | Medline Industries, Mundelein, IL | 30-1001 | |
| Sterile surgical scissors and forceps | INOX tool Corporation | ||
| Micro oven | GE Healthcare, | ||
| ThermiPAQ hot and cold therapy system | Theramics Corporation, Springfield, IL | ||
| Reptile heating lamp | Energy Savers Unlimited, Inc. Carson, CA | ||
| 3M Transpore tapes | Target Corporation, MN | ||
| Up and Up Polymyxin B sulfate/Bacitracin/Neomycin sulfate antibiotic ointment | Target Corporation, MN | ||
| North Safety DeciDamp-2PVC foam ear plugs | North Safety Products, Smithfield, RI | ||
| Cotton tipped applicator, 6’’ wooden stem | Jorgensen Laboratories, Inc. Loveland, CO | ||
| Anesthesia induction chamber | Summit Anesthesia Solutions, Ann Harbor, MI | ||
| Summit Anesthesia Support system for regulating flow of anesthesia | Summit Anesthesia Solutions, Ann Harbor, MI | ||
| Specially designed animal holder | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | ||
| Bickford Omnicon F/Air anesthesia gas filter unit | A.M. Bickford, Inc. Wales Center, NY | ||
| Pulse-oximeter module, MR compatible small animal monitoring and gating system | Small Animal Instruments, Inc. Stony Brook, NY | ||
| Oxygen cylinder | Matheson-Tri Gas, North-Central Zone, Lincoln, NE | ||
| Gas regulator | Western Medica, West Lake, OH | ||
| Signal breaking module, MR compatible small animal monitoring and gating system | Small Animal Instruments, Inc. Stony Brook, NY | ||
| 9.4 T (400 MHz) 89 mm vertical core bore MR scanner | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | ||
| 4 cm millipede micro-imaging RF coil | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | ||
| SAM PC monitor | Small Animal Instruments, Inc. Stony Brook, NY | ||
| Quantitative Medical Image analysis software | http://segment.heiberg.se; Segment v1.8 R1430, Medviso, Oresunds region, Sweden | ||
| Matlab software | The Mathworks, Inc. Natick, MA | ||
| Computer-Unix operating system |
References
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