Summary
Denna artikel kommer att visa hur man kan övervaka glutamin dynamik i levande celler med hjälp av bandet. Genetiskt kodade sensorer tillåter realtidsövervakning av biologiska molekyler på en subcellulär upplösning. Experimentell design, tekniska detaljer i experimentella inställningar, och överväganden för post experimentella analyser kommer att diskuteras för genetiskt kodade glutamin sensorer.
Abstract
Genetiskt kodade sensorer tillåter realtidsövervakning av biologiska molekyler på en subcellulär upplösning. En enorm mängd sådana sensorer för biologiska molekyler blev tillgängliga under de senaste 15 åren, varav några blev oumbärliga verktyg som används rutinmässigt i många laboratorier.
En av de spännande tillämpningar av genetiskt kodade sensorer är användningen av dessa sensorer att utreda cellulära transportprocesser. Egenskaper för transportörer såsom kinetik och substratspecificiteter kan undersökas på cellnivå, som ger möjligheter för cell-typspecifika analyser av transporter. I denna artikel kommer vi att visa hur lätt lastbil, dynamik kan observeras med hjälp av genetiskt kodade glutamin givare som exempel. Experimentell design, tekniska detaljer i experimentella inställningar, och överväganden för post experimentella analyser kommer att diskuteras.
Introduction
På grund av anmärkningsvärda framsteg i teknik som möjliggör undersökning av transkriptom och proteomet på cellulär nivå, har det nu blivit klart att biokemi och den resulterande flödet av metaboliter och joner är mycket celltypsspecifik. Till exempel, i däggdjurslever, är sekventiell glutamin nedbrytning och syntes genomfördes samtidigt av periportala celler och perivenös celler respektive matning ammonium till ureacykeln i fd celltyp samtidigt som den förbrukar överskott av ammoniak i det senare 1-3. I vissa fall är väsentlig biokemisk heterogeniteten detekterades även i ett enda "celltyp" 4, 5. Förutom sådana rumsliga specificitet, de cellulära nivåerna av metaboliter och joner är mycket dynamisk (t.ex. signalmolekyler såsom Ca2 + och cykliska nukleotider). De Spatiotemporal mönster av metaboliter och joner spelar ofta kritiska roller i signaltransduktion. MPPFÖLJNING cellulära dynamik metaboliter och joner dock skapa unika utmaning. I många fall är förändringen i koncentrationer är snabb och övergående, exemplifieras av fallet med signalmolekyler såsom Ca 2 +, som sönderfaller inom ~ 20 millisekunder hos Dendritutskotten 6. Dessutom uppdelning av biokemiska vägar inom och mellan cellerna gör det svårt att kvantifiera dynamik metaboliter och joner med hjälp av extraktion och kromatografi / masspektrometri teknik.
Genetiskt kodade sensorer för biologiska molekyler är nu allmänt används på grund av den höga Spatiotemporal upplösning som gör försöksledaren att studera kortlivade och / eller compartmentalized molekyldynamik (recenserade i 7, 8). Dessa genetiskt kodade sensorer kan grovt delas in i två kategorier; intensitetsbaserade sensorer och ratiometic sensorer. Intensitet-baserade sensorer består typiskt av en bindande domän och en influensaorescent protein (FPS), och det lösta ämnet som binder till den bindande domänen förändrar fluorescensintensiteten. Ratiometic sensorer, å andra sidan, ofta dra nytta av Foster resonansenergiöverföring (FRET) mellan två ramprogrammen som fungerar som en FRET-par. Dessa sensorer består av en bindande domän och två FP, och det lösta ämnet bindning inducerar förändringen i FRET-effektiviteten mellan två fps. Ett stort antal sensorer för biologiskt viktiga metaboliter och joner har utvecklats under det senaste decenniet 8, 9.
En av de spännande möjligheter som erbjuds av sådana genetiskt kodade sensorer är att de används i hög upplösning analys av membrantransportprocesser, som tidigare var inte lätt att upptäcka på cellnivå. Genetiskt kodade sensorer underlätta analysen av transportmekanismer, såsom substratspecificitet och pH-beroende 10, 11. Dessutom i kombination med de genetiska resources såsom bibliotek av RNAi-konstruktioner för modellorganismer, är det nu möjligt att utföra genomvida sökningar efter nya transport-processer med hjälp av genetiskt kodade sensorer. Faktum användning av genetiskt kodade sensor leder till upptäckten av tidigare uncharacterized transportörer i flera fall 12, 13.
Nyligen har vårt laboratorium utvecklat en serie av FRET-baserad sensor för glutamin. Vi har visat att cellulära glutaminnivåer kan visualiseras med användning av sådana FRET glutamin sensorer 10. Dessa sensorer består av ett FRET-givare (mTFP1) införd i en bakterie glutamin-bindande protein glnH och en FRET-acceptor (venus) vid C-terminalen av glnH (Figur 1). FRET-effektiviteten hos dessa sensorer minska vid bindning av glutamin, vilket resulterar i minskning av acceptor / donatorintensitetsförhållandet. Fininställning av glutamin transportprocesser är viktigt i biologiska processer såsom neurotransmissionen 14, 15 och upprätthållandet av ureacykeln i levern 1, 16, 17.
Här visar vi de metoder för analys av transportverksamhet med FRET sensorer för glutamin, med hjälp av ett brett fält fluorescensmikroskop set-up. Målet med experimenten som visas här är att avkänna transportör aktiviteter i en enda cell och att undersöka substratspecificiteten hos en transient uttryckt transportören.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Provberedning
OBS: I många fall perfusion experiment tvätta bort en betydande del av celler, vilket kan bli en frustrerande fråga. Även om det inte är nödvändigt för alla cellinjer, ytbeläggningstäckglasytor med poly-L-lysin (lägg 1,0 ml per 25 cm 2 av 0,01% lösning till ytan, inkubera> 5 min, tvättas två gånger med cellkulturgrad vatten, och torka i biosäkerhet skåpet) förhöjer celladhesion. Var också medveten om biosäkerhetsnivån (BSL) i cellinje som används, och följ det standardförfarande som godkänts av den lokala miljö-hälso-och säkerhetskontor. I detta experiment var COS7-celler användes på grund av låg endogen glutamin transportaktivitet (se figur 4).
- Seed COS7-celler vid ~ 70-80% konfluens i Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) + 10% kosmisk kalvserum och 100 U / ml penicillin / streptomycin, antingen på sterila 25 mm glastäckglas placerade i 6-brunnars odlingsmaträtt eller 8-brunnars glasbottnade bilder. Inkubera vid 37 ° C, 5% CO2, 100% fuktighet under 24 timmar.
- Utbyt tillväxtmediet till DMEM 10% kosmisk kalvserum (inga antibiotika), enligt tillverkarens protokoll. Grow O / N vid 37 ° C, 5% CO2 vid 100% fuktighet.
- Lägg 0,4 mg vardera av plasmid-DNA som kodar för glutamin sensorn (pcDNA3.1, bärande FLIPQTV3.0 sensor enligt CMV-promotorn 10) och mCherry-taggade ASCT2 10 till 50 ml serumfritt medium (Opti-MEM) och blanda försiktigt.
- Tillsätt 1 ml transfektion reagens till 50 ml serumfritt medium. Inkubera vid rumstemperatur under 5 min.
- Blanda de två lösningarna innehållande DNA (steg 1,3) och transfektion reagens (steg 1,4) och inkubera under 20 min.
- Försiktigt tillsätt transfektionsreagens ovanpå cellerna och blanda försiktigt genom att gunga kammaren. Inkubera under 24 h vid 37 ° C, 5% CO2, 100% fuktighet.
- Efter 24 tim, byta ut mediet till DMEM + 10% kosmisk kalvserum(CCS) + 100 enheter av penicillin / streptomycin.
- Celler avbildades 48-72 h efter transfektion.
2. Perfusion Experiment
Anm: COS7-celler användes i detta experiment, var perfusion medier och kammare som hölls vid rumstemperatur och omgivande CO 2-koncentration. Om emellertid de celler som används kräver högre temperatur och CO 2 koncentration kontroll för överlevnad, uppvärmd mikroskopställningen och / eller en miljökammare som skall användas.
- Förbered perfusionsbuffert AF (Se Lista över Materials). Bifoga kranarna till 50 ml sprutor, stänga kranarna sedan fylla dem med infusionsvätskor. Öppna kranen för en kort period för att fylla det övre utrymmet i kranen med bufferten.
- Slå på 8 kanaler, liggande kopp perfusion systemet med en perfusion penna, och välj sedan "manuellt läge" under väljaren alternativet. Placera en avfallsbehållare under perfusion penna.
- ManuelltAktivera portarna genom att trycka på motsvarande nummer och fylla slangarna med hjälp av 10 ml spruta som innehåller vatten, och sedan stänga porten. När portarna är fyllda med vatten, sätta sprutorna innehåller buffert AF på port 1-6 av perfusion systemet och öppna kranarna. Öppna portarna igen för att ersätta vattnet i slangen med buffertarna. Flödeshastigheten ska vara ca 0,8 ml / min.
- Tryck avbryta gång på perfusion ansvarige att gå tillbaka till menyn "Select Function". Växla till "Edit Program" alternativet, skriv sedan i perfusion protokoll som anges i tabell 1. Rädda perfusion programmet.
- Ta cellerna ur kuvösen. Tvätta två gånger med perfusionsbuffert, och ställ sedan in cellerna på scenen. Anslut perfusionssystemet till kammaren. Om en öppen kammare används, ställer upp en annan pump som tar bort perfusion lösningen från kammaren.
- Öppna Slidebook programvara. Starta en ny bild.
Obs!Följande procedur är specifik för Slidebook programvara, men andra program som MetaFluor och Nis-Element kan också användas för den typ av avbildning som beskrivs här. Teoretiskt experiment kan utföras med hjälp av något program som gör att tidsförlopp imaging, och bildsekvenser kan analyseras efter experimentellt med hjälp av program som ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/) eller Fiji (http:/ / fiji.sc / Fiji). Men, är programvara som gör realtidsövervakning av acceptor / givarförhållande mycket användbart. - Montera bilden på den fluorescerande mikroskop scenen. Hitta cellerna samuttrycker sensorn och ASCT-mCherry med lämpliga filteruppsättningar (se Lista över material) under "FOCUS"-funktion. Justera förstärkningen genom att klicka på "Camera"-fliken och skjuta skjutreglaget i "vinst". Också, justera filtret med neutral densitet inställning från neutral rullgardinsmenyn densitetsfilter. OBS: Om filter kuben inte innehåller ett öga filter, inte använda okular sedan schort-våglängd excitation ljus är skadligt för ögonen. Använd datorskärmen för att hitta cellerna istället.
- Förvärva bilder av celler with donor ( mTFP1) ex donor(mTFP1) em , donor ( mTFP1) ex acceptor(venus) em and acceptor ( mTFP1) ex acceptor(venus) em m channels (Filter specificeras i List of Materials). Klicka på "Bildinsamling", och sedan i förvärvet fönstret, ange vilka filter som kommer att användas. Klicka på "TEST"-knappen för att ställa in exponeringstiden genom att skriva in önskad exponeringstid i rutan bredvid filterinställningarna. Obs: Alla tre kanaler behöver utsättas för samma längd. Vid justering av avbildningsparametrarna, ta den förväntade FRET effektivitet förändring och vik öka beaktas: till exempel om den FRET effektivitet väntas gå upp 2 gånger under försöket, imaging parametrar bör justerasså att intensiteten i givar ex Acceptor em vid vilotillstånd bör vara <50% av det maximala värdet som kan registreras av instrumentet, så att kanalen inte blir mättad under experimentet. Signal från de märkta cellerna bör vara minst tre gånger högre än den i bakgrundsområdet.
- Rita en region av intresse med användning av regioner som verktyg i programvaran. Alternativt kan en mjukvarufunktion för att välja bildpunkter över viss intensitet användas, och sedan omvandlas till regioner. För att göra detta, klicka på mask - Segment, flytta sedan skjutreglaget för att markera de önskade områdena.
- Välj "time lapse" i Program rutan och ange intervallet (10 sek i detta experiment) och tidpunkter för experimentet.
- Rita en region i ett område utan några fluorescerande celler. Detta område används för bakgrunds subtraktion. Högerklicka på regionen dras, och sedan ställa in den som bakgrund. OBS: Helst celler som intet uttrycka sensorerna ska användas som bakgrund regionen för att beakta både den autofluorescens och bakgrunds blomningstid upptäcks av kameran. Om inga sådana celler finns i synfältet, åtminstone ett område utan att cellerna skall kunna användas för att redogöra för bakgrundsfluorescens.
- Välj önskat program under "Select Function - Kör program" alternativet. Växla till det sparade programmet (se steg 2.3), och då slå ENTER på perfusion controller. Nu programmet laddas, och trycka på valfri knapp startar perfusion.
- Se till perfusion och avbildningsexperiment startar samtidigt genom att klicka på "Start"-knappen i inspelningsfönstret samtidigt som du trycker på en knapp på perfusion controller.
OBS: Vi rekommenderar att spela in den tidpunkt då lösningarna utbyttes (detta kan göras med hjälp av "anteckningar" funktionen, som finns på fliken förvärv). - Utför samma perfusion protokoll USIng celler som uttrycker en sensor som förväntas vara antingen mättad eller obundna i experimentgruppen.
Anmärkning: Här FLIPQTV3.0_1.5μ, vilken är mättad under experimentella villkor, används som en kontroll, figur 6 Sådana kontrollexperiment är nödvändigt att bekräfta att effektiviteten förändring FRET beror på den faktiska förändringen i substratet och inte. på grund av förändringar i andra parametrar såsom cellulär pH.
3. Post-experiment Analys
- Undersök om prov drift har skett under experimentet. Rita områden av intresse (ROI) är på bilden tagen vid tidpunkt 0, flytta sedan skjutreglaget högst upp i bildfönstret och kontrollera om cellerna falla ut ur ROI i bilder tagna senare i experimentet.
- Om ja, sedan använda spårningsfunktionen för att korrigera för avdriften genom att först skapa masker runt cellerna genom att välja Mask - Segment, skjut sedan linjen som anger cutoff till highlight regionerna som innehåller celler. Spåra regionerna genom att klicka på mask - Partikelfilter spårning - Grundläggande partikelspårning.
- Att rita om ROI och bakgrundsområdet vid behov.
- Exportera den genomsnittliga intensiteten i ROI under loppet av experimentet. Klicka statistik - Export - Ratio / Timelapse uppgifter.
- När FRET effektivitet och kvantifiering av substratkoncentrationen inte är nödvändig, plotta tidsförloppet för intensitetsförhållandet (Donor ex Acceptor em / Donator ex Donor em) som en proxy för dynamiken hos substratet. För att bestämma den cytosoliska koncentration, beräkna maximal och minimal förändring förhållande (dvs vid mättande och frånvaron av substratet, respektive), Ar max - Ar min, genom icke-linjär regression av Δratio (Ar) med följande ekvation:
Ar = [S] / (Kd + [S]) x (Ar
där [S] är substratkoncentrationen i cytosolen. Använda Ar max - Ar min-värden som erhållits, mättnad (S) av sensorn vid en given Ar beräknas som
S = (Ar - Ar min) / (Ar max - Ar min)
S kan vidare omvandlas till substratkoncentrationen [S] med hjälp av följande ekvation:
S = [S] / (Kd + [S])
Notera: intensiteten i Acceptor ex Acceptor em kanal bör också ritas att undersöka om det experimentella tillståndet påverkat fluorescens acceptor direkt. - När en baslinjedrift grund av fotoblekning observeras, utför en baslinje korrigering. För att göra detta, plotta intensiteten hos donator och acceptor över tiden (figur 5A). Identifiera sedan tidpunkterna används för the baslinjen, beroende på förseningen i perfusionssystemet och transportverksamheten i viss cell (Figur 5B).
- Beräkna ett polynom passande som bäst beskriver baslinjen. Därefter normalisera rå intensitet från varje tidpunkt till baslinjen (figur 5C). Beräkna intensitetsförhållandet (Donor ex Acceptor em, / Donor ex Donor em) från de normaliserade donator och acceptor intensiteter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Typiska tidskurs experiment visas i Figur 2. Vid dessa experiment FRET glutamin sensorer med tillhörighet i 8 mM (FLIPQTV3.0_8m, figur 2A och 2B) och 100 ^ M (FlipQTV3.0_100 μ C och D) samuttrycktes med en obligatorisk aminosyra växlar ASCT2 18 i COS7-celler 10. Inflöde av glutamin detekteras som förändringen i fluorescensintensitetsförhållanden mellan donatorn (mTFP1) och acceptor (venus) (figur 2A och 2C). Utflödet av glutamin i närvaro av ett annat substrat (Ala) är också tydligt visats i dessa experiment. Med båda sensorerna, normaliserade fluorescensintensiteter ändra reciprokt (dvs går donator intensitet upp som acceptor intensiteten går ner, fig. 2B och 2D) i närvaro av substrat, vilket tyder på att förändringen förhållande observeras verkligen beror to förändringen i FRET-effektiviteten. Dessa experiment visar att de glutamin-koncentrationer i dessa celler fluktuerar mycket dynamiskt enligt det experimentella tillståndet; från detektionsområdet av 100 pM sensorn till nästan mättnadskoncentrationen för 8 mM sensor.
Substratspecificiteter av transportörer kan också undersökas med hjälp av sensorer, visat i figur 3. I dessa försök var cellerna förinstallerad med glutamin, och sedan olika aminosyror sattes till den extracellulära perfusatet för att undersöka om dessa aminosyror kan framkalla glutamin utflöde. Som förväntat, ASCT2 substrat (Ala, Ser, Cys, Thr, D-serin) inducerade glutamin efflux (fig. 3A), medan icke-substrat-aminosyror (Pro, His, Lys) inte gjorde det (Fig. 3B), vilket bekräftar med tidigare studier 18. Vanligtvis är substratspecificitet mättes genom konkurrensanalyser med användning av en radioisotopmärkt substrat blandades med konkurrerande substrat, Vilket är tämligen arbetskrävande och kräver en population av celler som är jämnt uttrycker transportören som skall studeras. Optisk avbildning exemplifieras här erbjuder en alternativ metod.
När inga FRET effektivitets förändringar observeras vid tillsats av substratet, kan flera skäl beaktas. En möjlig orsak är den låga upptagningsförmåga för substratet som skall testas och / eller höga aktiviteter av enzymer som upprätthåller koncentrationen i cellerna. Till exempel, glutamin koncentrationsförändringar var minimal i COS7 celler som inte uttrycker ASCT2 transportör under villkoret testas, även om denna cellinje tydligt kan växa i media där glutamin i huvudkvävekälla (Figur 4). Dessutom, om affiniteten hos sensorn är antingen för hög eller för låg jämfört med den intracellulära koncentrationen, de flesta av de sensor proteiner förblir konstitutivt bundet eller obundet respektive; därmed ingen FRET effektivitet förändring kommer vara detected.
Figur 1. Konfiguration av en FRET glutamin sensor. (A) Öppna (cyan) och slutna (gul) konforma glnH, glutamin-bindande protein från E. coli. Positionen där mTFP1 infogas markeras i magenta. (B) Schematisk representationer av FLIPQTV_3.0 sensorer.
Figur 2. In vivo-glutamin mätningar med FLIPQ-TV3.0_8m och 100μ sensorer. (A) Den venus/mTFP1 förhållande av COS7-celler som samuttrycker FLIPQ-TV3.0_8m sensor och ASCT2-mCherry. mCherry taggen användes för att identifiera de celler som uttrycker transporter utan att störa de mTFP1 eller venus utsläppskanaler. Cellerna perfuserades med HEPES-buffrad Hanks-buffert (pH 7,35). Tidpunkter då cellulära glutamin (röd) och alanin (blå) sattes till perfusion media anges som rutor ovanför grafen. Fasta och streckade linjer representerar två enskilda celler mätt i samma experiment. (B) De intensiteter av givare (mTFP1) och acceptor (venus) kanaler i det experiment som visas i (A). Värdena korrigerades för fotoblekning och normaliserad till baslinjen. (C) och (D) Ett liknande experiment som i (A) och (B), som utförs med COS7-celler som uttrycker FLIPQ-TV3.0_100μ sensor. (Figur modifierad från 10).
Figur 3. Eliminering av cell-glutamin through den ASCT2 transportör i närvaro av externa aminosyror, visualiserades med användning FLIPQ-TV3.0_8m sensor. (A) cytosoliska glutamin exporteras genom tillsats av extracellulär Ala, Ser, Cys, Thr, och D-Ser. Tidpunkter då cellulära glutamin (röda lådor) eller andra aminosyror (blå rutor) till perfusion media anges som rutor ovanför grafen. (B) Tillsats av Pro, Lys, Hans (svarta lådor) förändrar inte cytosolic glutamin koncentration , medan tillägg av Ala (blå lådor) främjar export av glutamin. Fasta och streckade linjer representerar två enskilda celler mätt i samma experiment. Alla aminosyror tillsattes vid 5 mm Utvändig koncentrationer. (Figur publicerades ursprungligen i 10).
Figur 4. The venus/mTFP1 förhållande av COS7-celler expressing FLIPQ-TV3.0_8m sensorn (A) och 100μ sensorn (B). Cellerna perfunderades med HEPES-buffrad Hanks buffert. Tidpunkter då cellulära glutamin (5 mM) sattes till perfusion media anges som röda boxar ovanför grafen. Fasta och streckade linjer representerar två enskilda celler mätt i samma experiment.
Figur 5. Korrigering för fotoblekning. (A) Raw intensiteter från två celler representerade i figur 2A och 2C. (B) datapunkter som valts för att beräkna baslinjerna. Polynom passande kurvor visas i figuren. (C) Intensiteter kanaler som visas i A, normaliserad mot baslinjen beräknas B. dataset som används i denna siffra är identical den som visas i figur 2A och 2C.
Figur 6. In vivo-glutamin mätningar med användning FLIPQ-TV3.0_1.5m sensor. (A) Den venus/mTFP1 förhållande av COS7-celler som samuttrycker FLIPQ-TV3.0_1.5m sensor och ASCT2-mCherry. mCherry taggen användes för att identifiera de celler som uttrycker transportören utan att störa de mTFP1 eller venus utsläppskanaler. Cellerna perfuserades med HEPES-buffrad Hanks-buffert (pH 7,35). Tidpunkter då cellulära glutamin (röd) och alanin (blå) sattes till perfusion media anges som rutor ovanför grafen. Fasta och streckade linjer representerar två enskilda celler mätt i samma experiment. (B) De stödnivåer för givare (mTFP1) och acceptor (venus) kanaleri experimentet som visas i (A). Värdena korrigerades för fotoblekning och normaliserade till baslinjen.
| Tid (min) | Lösning A | Lösning B | Lösning C | Lösning D | Lösning E | Lösning F | |||||||
| 0 | ventilen på | ||||||||||||
| 2 | ventil off | ventilen på | |||||||||||
| 4 | ventilen på | ventil off | |||||||||||
| 6 | ventil off | ventilen på | |||||||||||
| 8 | ventilen på | ventil off | 10 | ventil off | ventilen på | ||||||||
| 12 | ventilen på | ventil off | |||||||||||
| 14 | ventil off | ventilen på | |||||||||||
| 16 | ventilen på | ventil off | |||||||||||
| 18 | ventil off | ventilen på | |||||||||||
| 20 | ventilen på | ventil off | |||||||||||
| 22 | ventil off | ventilen på | |||||||||||
| 24 | ventilen på | ventil off | 26 | ventil off | ventilen på | ||||||||
| 28 | ventilen på | ventil off | |||||||||||
| 30 | ventil off | ventilen på | |||||||||||
| 32 | ventilen på | ventil off | |||||||||||
| 34 | ventil off |
. Tabell 1 Exempel på perfusionen protokoll som används i detta experiment Lösning A:. 9,7 g HANK salt (H1387), 0,35 g NaHCO 3, 5,96 g HEPES till en L pH justerades till 7,35 med NaOH Lösning B:. Lösning A + 0,04 mM Gin Lösning C:.. Lösning A + 0,2 mM Gin Solution D:. Lösning A + 1 mM Gin Lösning E:. Lösning A + 5 mM Gin Solution F: Lösning A + 5 mM Ala
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Framgången för imaging experiment beror på några kritiska faktorer. En av dessa faktorer är affiniteten av sensorer användas, såsom diskuterats ovan. Absoluta koncentrationen av substratet i subcellulär avdelning av intresse är emellertid ofta okänd. Därför rekommenderar vi försöker flera sensorer med förskjutna tillhörighet för att hitta en som fungerar bäst under önskad experimentell skick. Till exempel, i vårt fall vi transfekterades de COS7-celler med glutamin sensorer med 1.5μ, 100μ, 2m, och 8 (fig. 3 och data ej visade).
En annan viktig faktor är expressionsnivån av sensorproteiner. Uttrycksnivån som krävs för detektion varierar mellan, experiment, Till exempel, när en kortlivad händelse (t.ex. ett enskilt aktionspotential) måste observeras en högre expressionsnivå skulle kunna bli nödvändigt 19. Därför, i de flesta fall, den nivå som krävs måste vara empirically bestämdes. Om målet förekommer i mycket låg koncentration i cellen, kan störning av de endogena processer på grund av att rikta utarmning bli ett problem 20. En oberoende analys för att bedöma en sådan möjlighet, om sådana finns, är därför önskvärt. I experimenten som visas i denna artikel, var proteinexpression driven av CMV-promotorn visade sig vara tillräckligt. I situationer där tagare med mycket svagare aktiviteter måste användas, kan justeringar för att öka signalintensiteterna blir nödvändiga. Exempelvis kompromiss mellan signalintensitet och fotoblekning under exponeringen behöver nås. Förutom att förlänga exponeringstiden, kan faktorer som till exempel ljusstyrkan på fluoroforer, maximal intensitetsförändring hos sensorn, binning och känsligheten hos CCD-kameran kan ändras för att öka signalintensiteten.
När ingen utväxlingsändring observeras under försöksbetingelse, även om de två ovanstående kriterier kommer sannolikt attuppfyllas, är det möjligt att den cellulära homeostas för den givna metabolit eller jon är tillräckligt stark för att maskera aktiviteten transport (se resultatavsnittet). I sådana fall kan cellinjer med olika biokemiska aktiviteter krävas som en bakgrund för att detektera transportören aktiviteter 10, 21.
Även om dessa sensorer tillåter en att övervaka koncentrations dynamiken i underlaget vid mycket högre spatiotemporal upplösning än utvinning baserade metoder, bestämning av absolut koncentration kräver ytterligare experimentella åtgärder och överväganden. Vanligtvis är substratkoncentrationen beräknas med antagandet att sensorn affinitet, beräknas vanligen genom titrering av renat sensorprotein, är oförändrad, när den uttrycks i cellen. Koncentrationen beräknas med hjälp av följande enda bindande isoterm,
[S] = K ^ x (r - r min) / (r </ Em> max - r)
[S] är substratkoncentrationen, Kd är dissociationskonstanten bestämdes in vitro, r är acceptor / donator-förhållande observerades vid en given tidpunkt, Rmin är acceptor / donator-förhållande när sensorerna är i apo form och rmax är acceptor / donator-förhållande när alla sensorer är bundna till substratet. Rmin och Rmax påverkas av parametrar såsom koncentrationen av sensorer, avbildningsinställningar som används och sammansättningen för den cellulära milleu och följaktligen behöver mätas in situ . För att bestämma r min och r max värden, experimentella förhållanden som tillåter modifiering av intracellulära substratkoncentrationen blir nödvändig. Exempelvis selektiva jonoforer (t.ex. jonomycin för Ca 2 +) 22 eller en perforerande reagens såsom digitonin 23 kan användas för att jämvikta intracellulära substratkoncentration med den externa koncentration.
En av begränsningarna i den typ av experiment som demonstreras i detta protokoll är den låga genomströmningen; analysen är begränsad till att analysera en metabolit i en relativt liten (<10) antalet celler. Teknologiska framsteg görs dock för att övervinna dessa begränsningar. Till exempel, med framstegen i automatiserad, hög halt screening, är det nu möjligt att använda genetiskt kodade sensorer i kombination med liten molekyl eller RNAi-bibliotek; celler som uttrycker en biosensor kan odlas i en hög genomströmning format (t ex 96 - eller 384-brunnars), sedan individuella brunnar kan behandlas med antingen siRNA eller kemikalier och avbildas. Sådana experiment möjliggöra identifiering av siRNA konstruktioner eller kemikalier som stör den biologiska process som kan observeras av biosensor 24 25. En annan spännande nytt framsteg inkludes utvecklingen av en tidsupplöst microfluidic flödescytometer, som tillåter hög genomströmning detektion av FRET-effektiviteten förändring på cellnivå 26. Sådana tekniska framsteg kommer att hjälpa upptäckter av nya läkemedelskandidater och nya komponenter i biologiska processer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Det finns inget att lämna ut.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av NIH bidrag 1R21NS064412, NSF bidrag 1.052.048 och Jeffress Memorial Förtroende bidrag J-908.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Inverted fluorescent microscope | Olympus | IX81F-3-5 | An equivalent inverted fluorescent microscope from other suppliers would also be appropriate. |
| Excitation filter (mTFP1) | Omega Optical | 3RD450-460 | Band width 450-460 nm |
| Excitation filter (Venus) | Chroma | ET500/20 | Band width 490-510 nm |
| Emission filter (mTFP1) | Chroma | HQ495/30m | Band width 475-505 nm |
| Emission filter (Venus) | Chroma | ET535/30m | Band width 520-550 nm |
| Dichroic mirror (FRET channels) | Chroma | 470dcxr | Long pass, 470 nm cut off |
| Dichroic mirror (YFP channel) | Chroma | 89002bs | Passes 445-490 nm, 510-560 nm, 590-680 nm |
| mCherry filter set | Chroma | 49008 | Excitation 540-580 nm, long pass dichroic with 585 nm cut off, emission filter 595-695 nm |
| Light source | Olympus | U-LH100L-3-5 | LED- or halogen light source that produces stable light intensity, mercury lamps are not recommended |
| CCD camera | Qimaging | Rolera-MGi EMCCD | |
| Apochromatic fluorescence objective | Olympus | ||
| Perfusion system, ValveBank II | AutoMate Scientific | [01-08] | Other perfusion systems that allow fast solution exchange would also work |
| Laminar-flow chambers | C&L Instruments | VC-MPC-TW | Other larminar-flow chambers would also work. |
| Chambered slide | Lab-Tek | 154534 | For open-chamber experiments |
| Perfusion pump | Thermo Scientific | 74-046-12131 | For open-chamber experiments |
| Software supporting ratiometric measurements | Intellegenent Imaging Innovation | Slidebook 5.5 | |
| Laminar flow biosafety cabinet | ESCO | LA-3A2 | |
| Isotemp CO2 Incubator | Thermo Scientific | 13-255-25 | |
| Dulbecco's MEM (DMEM) | Hyclone | SH30243.01 | |
| Cosmic calf serum | Hyclone | SH3008703 | |
| Penicillin/streptomycin | Hyclone | SV30010 | |
| Serum-free medium for transfection (OPTI-MEM I) | Invitrogen | 31985 | Used with Lipofectamine 2000 |
| Poly-L-Lysine solution | Sigma | P4707 | |
| 25 mm circular glass cover slips | Thermo Scientific | 12-545-102 | In case VC-MPC-TW is used |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668027 | Other transfection reagents can also be used. |
| Solution A (Hank's buffer) | 9.7 g HANK salt (Sigma H1387), 0.35 g NaHCO3, 5.96 g HEPES to 1 L, pH adjusted to 7.35 with NaOH | ||
| Solution B | Solution A + 0.04 mM Gln | ||
| Solution C | Solution A + 0.2 mM Gln | ||
| Solution D | Solution A + 1 mM Gln | ||
| Solution E | Solution A + 5 mM Gln | ||
| Solution F | Solution A + 5 mM Ala |
References
- Haussinger, D. Regulation of hepatic ammonia metabolism: the intercellular glutamine cycle. Adv Enzyme Regul. 25, 159-180 (1986).
- Haussinger, D.
- Watford, M., Chellaraj, V., Ismat, A., Brown, P., Raman, P.
- Mustroph, A., et al. Profiling translatomes of discrete cell populations resolves altered cellular priorities during hypoxia in Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci USA. 106, 18843-18848 (2009).
- Sasagawa, Y., et al. Quartz-Seq: a highly reproducible and sensitive single-cell RNA sequencing method, reveals non-genetic gene-expression heterogeneity. Genome Biol. 14, R31 (2013).
- Sabatini, B. L., Oertner, T. G., Svoboda, K. The life cycle of Ca(2+) ions in dendritic spines. Neuron. 33, 439-452 (2002).
- Okumoto, S., Jones, A., Frommer, W. B. Quantitative imaging with fluorescent biosensors. Annu Rev Plant Biol. 63, 663-706 (2012).
- Newman, R. H., Fosbrink, M. D., Zhang, J. Genetically encodable fluorescent biosensors for tracking signaling dynamics in living cells. Chemical reviews. , 111-3666 (2011).
- Okumoto, S. Imaging approach for monitoring cellular metabolites and ions using genetically encoded biosensors. Curr Opin Biotech. 21, 45-54 (2010).
- Gruenwald, K., et al. Visualization of glutamine transporter activities in living cells using genetically encoded glutamine sensors. PLoS One. 7, e38591 (2012).
- Chaudhuri, B., et al. Protonophore- and pH-insensitive glucose and sucrose accumulation detected by FRET nanosensors in Arabidopsis root tips. Plant Journal. 56, 948-962 (2008).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499, 295-300 (2013).
- Jiang, D. W., Zhao, L. L., Clapham, D. E. Genome-Wide RNAi Screen Identifies Letm1 as a Mitochondrial Ca2+/H+ Antiporter. Science. , 326-147 (2009).
- Barnett, N. L., Pow, D. V., Robinson, S. R. Inhibition of Muller cell glutamine synthetase rapidly impairs the retinal response to light. Glia. 30, 64-73 (2000).
- Rothstein, J. D., Tabakoff, B. Alteration of Striatal Glutamate Release after Glutamine-Synthetase Inhibition. J Neurochem. 43, 1438-1446 (1984).
- Gu, S., Villegas, C. J., Jiang, J. X. Differential regulation of amino acid transporter SNAT3 by insulin in hepatocytes. J Biol Chem. 280, 26055-26062 (2005).
- Palmada, M., Speil, A., Jeyaraj, S., Bohmer, C., Lang, F. The serine/threonine kinases SGK1, 3 and PKB stimulate the amino acid transporter ASCT2. Biochem Bioph Res Co. 331, 272-277 (2005).
- Bröer, A., et al. The astroglial ASCT2 amino acid transporter as a mediator of glutamine efflux. J Neurochem. 73, 2184-2194 (1999).
- Wallace, D. J., et al. Single-spike detection in vitro and in vivo with a genetic Ca2+ sensor. Nature. 5, 797-804 (2008).
- Haugh, J. M. Live-cell fluorescence microscopy with molecular biosensors: what are we really measuring. Biophys J. 102, 2003-2011 (2012).
- San Martin, A., et al. A genetically encoded FRET lactate sensor and its use to detect the Warburg effect in single cancer cells. PLoS One. 8, e57712 (2013).
- Palmer, A. E., Tsien, R. Y. Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators. Nat Protoc. 1, 1057-1065 (2006).
- Ponsioen, B., et al. Detecting cAMP-induced Epac activation by fluorescence resonance energy transfer: Epac as a novel cAMP indicator. Embo Rep. 5, 1176-1180 (2004).
- Joseph, J., Seervi, M., Sobhan, P. K., Retnabai, S. T. High throughput ratio imaging to profile caspase activity: potential application in multiparameter high content apoptosis analysis and drug screening. PLoS One. 6, e20114 (2011).
- Jiang, D., Zhao, L., Clapham, D. E. Genome-wide RNAi screen identifies Letm1 as a mitochondrial Ca2+/H+ antiporter. Science. 326, 144-147 (2009).
- Ma, H., Gibson, E. A., Dittmer, P. J., Jimenez, R., Palmer, A. E. High-throughput examination of fluorescence resonance energy transfer-detected metal-ion response in mammalian cells. J Am Chem Soc. 134, 2488-2491 (2012).
